Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
PAGE 9
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
|
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» |
Кафедра инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы
С2.Б.11 ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Лабораторная работа: Лабораторная диагностика эшерихиозов и
сальмонеллезов.
Направление подготовки 111801 Ветеринария
Профиль подготовки
Специализация Ветеринарная фармация
Квалификация выпускника - специалист
Уфа 2013
Лабораторная работа №7
Лабораторная диагностика эшерихиозов и салъмонеллезов.
Цель занятия: Изучить морфологию, культурально-биохимические свойства возбудителей колибактериоза и сальмонеллеза, а также лабораторную диагностику и средства специфической профилактики данных заболеваний.
Оборудование и материалы. Культуры Е. coli и сальмонелл на МПА, средах, Левина, Симмонса; пластины ПБДЭ с результатами тестирования ферментативной активности Е. coli; пробирки цветного ряда с культурой Е.coli (лактоза, глюкоза, индол, среда с мочевиной); наборы агглютинирующих антиадгезивных и О - коли-сывороток, биопрепараты; культуры сальмонелл на МПА, МПБ, агаре Эндо, агаре Плоскирева, среде Олькеницкого или Ресселя, ПБДЭ- пластинках; набор сальмонеллезных сывороток, О-комплесных и монорецепторных О- и Н- агглютинирующих для экспресс-идетификации сальмонелл в реакции агглютинации на стекле.
1 Общие сведения
Семейство энтеробактерий (Enterobacteriaceae) включает 12 родов бактерий, имеющих сходство по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам и отличающихся по биохимическим признакам. Наибольшее значение для ветеринарной практики имеют бактерии родов Escherichia и Salmonella, вызывающие у животных заболевания колибактериоз и сальмонеллез.
1.1 Возбудитель колибактериоза (эшерихиоза) - кишечная палочка Escherichai coli. Колибактериоз - остропротекающее инфекционное заболевание молодняка разных видов животных (включая птиц и пушных зверей). Заболевание характеризуется, как правило, диареей (профузным поносом), обезвоживанием, депрессией, нарастающей слабостью и летальным исходом. Колибактериоз протекает в трех формах: септической, энтеротоксемической и энтеритной. Последние две формы не сопровождаются сепсисом. Восприимчивы телята в первые часы и дни после рождения. Поросята заболевают как в период новорожденности, так и после отъема. Ягнята заболевают с первых дней после рождения до 5...6-месячного возраста. Птицы поражаются в основном в первые 2...3 мес жизни. Взрослые животные колибактериозом не болеют, но являются бактерионосителями патогенных Е. coli. Кишечная палочка может быть также возбудителем мастита и эндометрита.
Морфология. Микроскопически Е. coli - представляют собой короткие палочки с закругленными краями, грамотрицательные, длиной 1...3 мкм и шириной 0,8 мкм, споры не образуют. В мазках расположение одиночное. Бактерии подвижны, перитрихи или неподвижны. Капсулу не образуют, за исключением отдельных штаммов серогрупп (08, 09, 0101).
Материал для исследования. Для бактериологического исследования в лабораторию направляют патологический материал: отрезок кишечника, кусочек печени, селезенки. При вскрытии трупа в лаборатории помимо патматериала исследуют также кровь из сердца и головной мозг. Если в лабораторию не представляется возможным в кратчайший срок доставить материал, его консервируют: фекалии — раствором стерильного глицерина с NaCl (глицерин — 250 мл, поваренная соль — 5 г, дистиллированная вода - 750 мл), кусочки внутренних органов — 30%-м водным раствором глицерина или 10%-м раствором NaCl. При бактериологическом исследовании учитывают особенности возбудителя.
Выделение чистой культуры. Определение культурально-биохимических свойств. Посев производят на среды Эндо (или Левина), МПБ и МПА. По типу дыхания Е.coli - аэроб. Растет на всех обычных питательных средах. Оптимальная температура 37...38°С, рН среды 7,0...7,2. На МПА через 18...20 ч вырастают влажные круглые колонии с ровными краями и гладкой поверхностью. В жидкой среде рост кишечной палочки проявляется равномерным помутнением с образованием осадка. Некоторые штаммы Е.coli обладают гемолитическими свойствами. Для дифференциации Е.coli от других представителей семейства Enterobacteriaceae определяют ее биохимические свойства. На среде Эндо Е. coli образует три типа колоний:
1) малиновые с металлическим блеском;
2) малиновые с розовым блеском;
3) розовые.
На среде Левина дает рост в виде колоний темнофиолетового цвета. Глюкозу и лактозу сбраживает с образованием кислоты и газа (некоторые лактозонегативные варианты не сбраживают лактозу, сбраживает маннит, дульцит, арабинозу). Обесцвечивает метиленовую синь в молоке, молоко свертывает, образует индол. Реакция с метилротом положительная, проба Фогеса - Проскауэра - отрицательная.
Две последние реакции ставят с двухсуточными культурами на специальной среде Кларка следующего состава: пептон - 5 г, глюкоза - 5 г, К2НРО4 - 5 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Среду стерилизуют текучим паром или автоклавируют при 50 кПа в течение 15 мин. В одну пробирку с культурой после инкубирования в данной среде пипеткой добавляют 5 капель индикатора метилрота (метилрот - 0,01 мл, 96%-й спирт-ректификат - 30 мл, дистиллированная вода - 20 мл), после чего пробирки встряхивают. Розово-красное окрашивание учитывают как положительный результат, желтое окрашивание - как отрицательный, что связано с изменением рН культуры вследствие ферментации глюкозы. В другую пробирку с культурой в среде Кларка добавляют 0,2 мл 40%-го раствора КОН и 0,5 мл 6%-го спиртового раствора α-нафтола. Учет производят через 3...5 мин. При положительном результате появляется розовое окрашивание вследствие реакции индикатора и образовавшегося в среде ацетилметилкарбинола при
расщеплении глюкозы. При отрицательном результате – желтое окрашивание. На средах Козера (жидкая) и Симмонса (агаровая с индикатором бромтимолблау) Е.coli не растет, так как не усваивает цитратно-аммонийные соли. Среда Козера синтетическая бесцветная, состоит из кислого фосфата натрий-аммония (NaNH4HPO4 • 4Н2О) — 1,5 г, однозамещенного фосфата калия (КН2РО4) — 1 г, сульфата магния (MgSO4 • Н2О) — 0,2 г, цитрата натрия (№зС6Н5О7 • 2Н2О) — 3 г, дистиллированной воды — 1000 мл. Раствор этой смеси пропускают через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, стерилизуют при 120°С в течение 15...20 мин.
Помутнение среды после двухсуточного культивирования в термостате указывает на рост бактерий; при отсутствии роста бактерий среда остается без изменений. На среде Симмонса цитрато-аммонийнопозитивные бактерии растут с изменением цвета среды в ярко-синий. Микроорганизмы, не усваивающие цитратные и аммонийные соли, на среде Симмонса не растут: цвет ее не изменяется.
Основываясь на морфологических и культурально-биохимических свойствах, проводят межродовую дифференциацию. Но биологические свойства бактерий разных штаммов одного и того же вида могут быть неодинаковыми, что объясняется их различной вирулентностью и антигенной структурой, установление которых входит в комплекс микробиологических диагностических исследований. Выделенную чистую культуру типируют в РА, используя типоспецифические агглютинирующие коли-сыворотки.
Антигенная структура. Клетка кишечной палочки имеет три типа антигенов - О (соматический), К (оболочечный, капсульный) и Н (жгутиковый). О-антиген - термостабильный, расположен в клеточной стенке, состоит из липидо-полисахаридо-протеинового комплекса: липид определяет токсичность (эндотоксин), полисахарид – серологическую специфичность, протеин - носитель антигенного свойства. К-антигены - поверхностные, оболочечные; это кислые полисахариды, редко протеины. По своим свойствам их подразделяют на три типа: В, L, А. Тип В - термолабильный: инактивируется при 100°С в течение 1ч. Тип L - термолабильный: инактивируется при 60°С в течение 1 ч. Тип А - термостабильный, имеется у слизистых капсулообразующих штаммов: разрушается при 120°С в течение 2,5 ч. Н-антиген — белковой природы, термолабильный, представлен несколькими десятками серологических разновидностей. Антигенное строение принято выражать формулой – за буквенным обозначением каждого антигена следуют арабские цифры, отделенные двоеточием, например 0111 : В4 : Н2 или 055 : В5 : НЮ. Цифры обозначают порядковый номер антигена в диагностической антигенной схеме, созданной Кауффманом с сотр. Антигеном каждого типа гипериммунизируют кролика и получают специфические агглютинирующие сыворотки для диагностических целей. Биологическая промышленность выпускает сыворотки к О-антигенам, поэтому в лабораториях проводят
серологическую типизацию серогрупп кишечной палочки. Наиболее частыми возбудителями колибактериоза служат бактерии серогрупп 078, 086, 015, 08, 09, 0119, 0137, 0115, 041, 0141, 0149 и др.
Патогенность (биопроба). В лабораторных условиях определяют внутрибрюшинным заражением белых мышей. В большинстве случаев Е. coli, выделенные из трупа или фекалий больных коли-инфекцией животных, патогенны для мышей. Культуры Е coli, выделенные от здоровых животных, обычно непатогенны. Патогенность для белых мышей зависит от вирулентности штамма, дозы вводимых бактерий, массы (возраста) мышей, метода заражения и индивидуальной иммунологической реактивности, условий их содержания и кормления. Белые крысы мало чувствительны к Е coli, щенки, котята в 2...3-месячном возрасте восприимчивы при оральном заражении. Для биопробы можно использовать куриные эмбрионы, гибель которых наступает через 24...48 ч после заражения единичными бактериями Е. coli.
Одним из важных факторов вирулентности кишечной палочки является ее способность продуцировать токсины двух типов: термолабильный экзотоксин и термостабильный эндотоксин (поли-сахаридо-липидо-протеиновый комплекс). Некоторые штаммы Е.coli продуцируют антибиотические вещества - колицины, подавляющие рост отдельных штаммов кишечной палочки и не действующие на бактерии других видов. Колицины термостабильны. Могут продуцироваться как патогенными, так и непатогенными штаммами.
Помимо общепринятого микробиологического исследования существуют также дополнительные методы диагностики. Люминесцентно-серологический метод используют как ориентировочный для определения патогенных серотипов Е. coli при массовых вспышках желудочно-кишечных заболеваний. Этот метод позволяет за короткий срок получить предварительные результаты.
Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации и реакция нейтрализации - ускоренные методы, позволяющие обнаружить в фекалиях больных животных возбудителя и установить его концентрацию.
Биопрепараты. Вакцина поливалентная гидроксидалюминиевая формолтиомерсаловая против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят, вакцина поливалентная против сальмонеллеза и колибактериоза пушных зверей; колипротектан ВИЭВ; сыворотка поливалентная против колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных; сыворотки О-коли агглютинирующие; колиадгезин-тест: антиадгезивные коли-сыворотки К 88, К 99, 987 Р, А 20, F 41.
1.2 Возбудители сальмонеллезов. У животных заболевания вызывают главным образом следующие виды рода сальмонелл: Salmonella enteritidis, S.choleraesuis (Suipestifer), S. tyhpimurium, S. pullorum, S. abortus equi, S. abortus ovis. Бактерии данного рода впервые описал Салмон (1885), в честь которого они получили родовое название Salтопеllа. Сальмонеллезы у молодняка разных видов животных протекают в острой септической форме: у телят в возрасте от 3...4 нед до 4...5 мес с явлениями лихорадки и профузного поноса; у поросят - до 4 мес; у овец всех возрастов (возможно внутриутробное инфицирование); у жеребят, как правило, происходит внутриутробное инфицирование. У конематок заболевание характеризуется абортами. Аборты отмечают и у овцематок.
Морфология (микроскопия). Из тканей органов готовят препараты-отпечатки и окрашивают их по Граму. Сальмонеллы — грамотрицательные палочки величиной 2...4 мкм; споры и капсулы не образуют, располагаются одиночно, иногда попарно.
Материал для исследования. Для бактериологического диагноза направляют от абортировавших овцематок и кобыл плод или плодовые оболочки, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей, желудок плода, органы плода. В остальных случаях (при септической форме) посылают труп целиком либо трубчатую кость, долю печени с желчным пузырем, селезенку, почку, брыжеечные лимфоузлы. Для прижизненной диагностики исследуют фекалии больных (редко прибегают к получению гемокультуры). Порядок бактериологического исследования материала от разных видов животных: все виды рода Salmonella обладают многими общими свойствами, поэтому предварительно при исследовании выделенной культуры проводят родовую дифференциацию, а затем - видовую (внутри рода).
Выделение чистой культуры. Определение культурально-биохимических свойств. Из патологического материала делают посевы на дифференциально-диагностические среды. Наиболее часто используют агар Эндо, среду Плоскирева или висмут-сульфит агар (модифицированная среда Вильсона - Блера); оптимальный рН среды 7,2...7,4. На средах Эндо и Плоскирева сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний; на висмут-сульфит-агаре - черных колоний. При посевах из органов трупа используют МПБ и МПА в пробирках. В МПБ рост диффузный, на МПА сальмонеллы формируют гладкие бесцветные прозрачные колонии с ровными краями. Сальмонеллы ферментируют глюкозу, не сбраживают лактозу, сахарозу, не свертывают молоко, не редуцируют метиленовую синь в молоке. Не образуют индола. Отдельные виды образуют сероводород. Реакция с метил-ротом положительная, а Фогес - Проскауэра — отрицательная.
При дифференциации видов сальмонелл внутри рода используют среды Биттера и Штерна. В состав среды Биттера входят: рамноза — 5г, двухосновный фосфат натрия — 0,5г, сульфат аммония — 1г, цитрат натрия (трехосновный) — 2г, NaCl — 0,5г пептон—0,05г и дистиллированная вода— 1000 мл. Глицерин-фуксиновый бульон Штерна состоит из МПВ (100 мл) с насыщенным раствором основного фуксина (5...6 капель), глицерина (1 мл) и 10 %-го водного раствора сульфита натрия (2 мл). Среды стерилизуют текучим паром 10... 15 мин. Положительный результат на средах Биттера и Штерна проявляется покраснением; при отрицательном результате — желтое окрашивание.
Серологическую типизацию выделенной культуры проводят с культурой, выросшей на скошенном агаре с конденсатом. Применяют пластинчатый метод РА. У сальмонелл различают соматический термостабильный О-антиген и жгутиковый термолабильный Н-антиген. Поскольку по О-антигену, общему для нескольких видов сальмонелл, последние подразделяют на группы (обозначенные заглавными буквами латинского алфавита), то вначале исследуемую культуру проверяют с групповыми (поливалентными) сальмонеллезными агглютинирующими сыворотками в РА на стекле. При положительном результате с групповой сывороткой проводят испытание той же культуры с монорецепторными О-сыворотками тех рецепторов, которые входят в данную группу. Кроме того, эти культуры еще испытывают с монорецепторными Н-сыворотками. Если культура типична по биохимическим свойствам, но не агглютинирует с О- и Н-сыворотками, следует испытать ее отношение к сальмонеллезному бактериофагу, чувствительность к которому свидетельствует о принадлежности к роду сальмонелл.
Возбудитель салъмонеллеза телят (S. enteritidis) открыт Гертнером в 1888 г. Реже сальмонеллез телят может быть обусловлен S.typhimurium, по антигенной структуре входящего в группу В. Этот микроб часто вызывает сальмонеллез у водоплавающей птицы, а варианты S.enteritidis dublin, rostock - заболевание у человека в виде гастроэнтерита вследствие пищевой токсикоинфекции. По антигенному строению S.enteritidis (и варианты) относятся к группе D. В эту же группу входит и возбудитель пуллороза (тифа кур) S.Pullorum, gallinarum. Пуллороз протекает остро, септически, с большой смертностью (до 100 %). В лабораторию направляют свежий труп. Взрослая птица болеет бессимптомно, хронически. Для выявления таких курбактерионосителей обследуют взрослую птицу в условиях хозяйства серологическим методом — кровяно-капельной РА с пуллорным антигеном.
Возбудители сальмонеллеза поросят (S. lyphisuis или S. choleraesuis) помимо заболевания у свиней могут вызвать пищевые токсикоинфекции у людей. Данная группа сальмонелл патогенна для белых мышей. По антигенной структуре принадлежит к группе С. Возбудителем сальмонеллеза у свиней может быть S.typhimurium. По О-антигену относят к группе В.
Возбудитель сальмонеллезного аборта кобыл (S. abortus eqvi) открыт в 1893г. Сбраживает маннит, глюкозу, арабинозу, дульцит; среду Штерна не изменяет. По О-антигену входит в группу В. Для бактериологической диагностики посылают абортированный плод от больного животного, остальное поголовье лошадей обследуют серологически (РА), фекалии исследуют для выявления бактерионосителей. Показателем развития инфекционного процесса у взрослых лошадей служит титр сыворотки в РА выше 1:400.
Лабораторный диагноз на сальмонеллез разных видов животных ставят на основании результатов бактериологического исследования патологического материала с обязательным изучением у выделенных бактерий морфологических, культурально-биохимических и антигенных свойств.
Биопрепараты. Концентрированная формолквасцовая вакцина против сальмонеллеза телят; вакцина против сальмонеллеза поросят. Готовят из трех штаммов в следующем соотношении: S. choleraesuis —50 %, S.typhimurium -25% S.dublin - 25%. Активность вакцины проверяют на голубях; ассоциированную (поливалентную) вакцину против сальмонеллеза, пастереллеза и диплококковой септицемии поросят готовят из штамма S. choleraesuis, четырех штаммов P. multocida и четырех штаммов диплококка. Иммуногенные свойства вакцины проверяют на голубях и белых мышах; формолтиомерсаловая вакцина против колибактериоза и сальмонеллеза пушных зверей, птиц, телят и поросят представляет собой инактивированную формалином и тиомерсалом суспензию эшерихий и сальмонелл. В качестве адъюванта применяют алюмокалиевые квасцы и хлорид кальция; сухую живую вакцину против сальмонеллеза свиней из штамма ТС-177 готовят из аттенуированного штамма S.choleraesuis ТС-177, зависимого по тиамину, с пониженной вирулентностью для белых мышей и морских свинок. Вакцину проверяют на чистоту роста, безвредность на белых мышах и морских свинках; вакцина против Сальмонеллеза телят из аттенуированного штамма S.dublin № 6; вакцина живая сухая против сальмонеллеза водоплавающей птицы; вакцина против сальмонеллеза свиней из супрессорного ревертанта; вакцина формолтиомерсаловая поливалентная против сальмонеллеза овец; поливалентная антитоксическая сыворотка против сальмонеллеза телят, поросят, ягнят, овец и птиц. Получают из крови волов-продуцентов, иммунизированных поливалентным антигеном, состоящим из четырех серотипов сальмонелл: S.dublin, S.typhimurium, S. abortus ovis, S. сholeraesuis.
Сыворотку проверяют на стерильность, безвредность и активность. Бактериофаг против сальмонеллеза и колибактериоза телят и бактериофаг против пуллороза (тифа птиц) готовят из фагов, выделенных от переболевших сальмонеллезом или колибактериозом животных. Сальмонеллезный антиген для серологической диагностики представляет собой гомогенную инактивированную суспензию сальмонелл (концентрация клеток 109/мл). Применяют для серологической диагностики сальмонеллезов в пробирочной РА.
Пуллорозный эритроцитарный антиген представляет собой 10 %-ю суспензию эритроцитов барана, сенсибилизированных полисахаридно-полипептидной фракцией S.gallinanim-pullorum. Применяют для прижизненной диагностики сальмонеллеза птиц реакцией непрямой гемагглютинации на стекле с каплей крови.
Цветной антиген для диагностики пуллороза птиц представляет собой гомогенную суспензию сальмонелл, убитых формалином и окрашенных кристаллвиолетом. Применяют в кровекапельной реакции агглютинации на стекле для прижизненной диагностики сальмонеллеза птиц.
Флуоресцирующие сальмонеллезы О-сыворотки получают из крови кроликов, иммунизированных формапинизированными антигенами. Сыворотки адсорбируют, осаждают сульфатом аммония глобулины и проводят люминесцентное мечение очищенных глобулинов флуоресцеинизотиоционатом. Выпускают сыворотки к сальмонеллам 5 серогрупп и комплексную сыворотку.
Наборы сывороток сальмонеллезных О-комплексных и моно-рецепторных О- и Н-агглютинирующих предназначены для экспресс-диагностики в РА на предметном стекле 33 групп сальмонелл, выделяемых от животных, из продуктов животного происхождения и объектов внешней среды.