Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
28
Харківський національний університет ім. В. Н. Каразіна
Іншина Наталія Миколаївна
УДК 577.151.04:57.546.95+612.118
5-Амінолевулінатсинтазна активність і вміст
деяких гемопротеїнів в печінці щурів
при дії гемолітичних агентів
03.00.04 –біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків - 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Харківському національному університеті
ім. В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Каліман Павло Авксентійович,
Харківський національний університет
ім. В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки
України, професор кафедри біохімії
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
Жуков Віктор Іванович,
Харківський державний медичний університет
Міністерства охорони здоров’я України,
завідувач кафедри біохімії, м. Харків
доктор біологічних наук
Мітряєва Наталія Андріївна,
Інститут медичної радіології ім. С. П. Григор’єва
АМН України, завідувач лабораторії радіаційної ендокринології, м. Харків
Провідна установа: Київський національний університет
ім. Тараса Шевченка (кафедра біохімії), м. Київ
Захист відбудеться “21” січня 2004 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. III-15.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий 19 грудня 2003 р.
Учений секретар Падалко В. І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. На теперішній час у зв’язку з розширенням уявлень про регуляторні властивості гему значно підвищився інтерес до вивчення його метаболізму [Cable E. E., 2000, Xie W., 2003]. Інтенсивно досліджується регуляція активності ключового ферменту біосинтезу гему - 5-амінолевулінатсинтази (5-АЛК-синтази) [Fraser D. J., 2002, 2003, Guberman A. S., 2003]. Встановлено, що надходження до організму людини і тварин різних хімічних сполук спричиняє індукцію 5-АЛК-синтази [Daniell W. E., 1997, Maines M. D., 1997, Калиман П. А., 2001]. Існує припущення, що за цих умов індукція 5-АЛК-синтази пов’язана з деградацією внутрішньоклітинних гемопротеїнів [Lim L.-K., 1980, Maines M. D., 1997].
Основним гемопротеїном клітин печінки є цитохром Р-450, що приймає участь у детоксикації ксенобіотиків. Деградація цитохрома Р-450 може бути зумовлена безпосередньою взаємодією токсичних сполук з гемом даного гемопротеїну [Jonen H. G., 1982, Moloney S. J., 1984], а також активацією процесів вільнорадикального окиснення внаслідок накопичення в клітинах прооксидантів, зокрема вільного гема [Maines M. D., 1997]. В роботах [Dailey H. A., 1990, Takami M., 1993] встановлено, що вміст вільного гему в клітинах печінки зростає за умов інтенсивного гемолізу. Незважаючи на значну кількість робіт, присвячених вивченню регуляції метаболізму гему, взаємозв’язок між вмістом гемопротеїнів і активністю 5-АЛК-синтази в печінці ссавців при дії гемолітичних агентів практично не досліджений.
Відомо, що деякі токсичні сполуки навколишнього середовища, зокрема солі важких металів і похідні гідразину, при надходженні до організму людини і тварин спричиняють гемоліз [Ершов Ю. А., 1989, McMillan D. C., 1998]. Враховуючи сучасний рівень забруднення довкілля токсичними сполуками, дослідження впливу гемолітичних агентів на біосинтез гему і вміст гемопротеїнів в печінці ссавців має важливе теоретичне і практичне значення.
Зв’язок роботи з науковими програмами. Дисертаційне дослідження було частиною держбюджетної теми, яка виконувалась на кафедрі біохімії Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна “Роль гему та гемопротеїнів в регуляції адаптації метаболізму при оксидативному стресі” (№ державної реєстрації 0100U003323).
Мета та задачі дослідження. Метою даної роботи було встановлення особливостей дії гемолітичних агентів різної хімічної природи на вміст деяких гемопротеїнів і активність ключового фермента біосинтезу гему - 5-АЛК-синтази в печінці щурів. У відповідності до мети були визначені основні задачі дослідження:
1. Дослідити динаміку 5-АЛК-синтазної, триптофан-2,3-диоксигеназної активностей та вмісту цитохрому Р-450 у печінці щурів за введення хлориду кадмію та хлориду меркурію.
. Дослідити вплив попереднього введення -токоферолу на вміст цитохрому Р-450 в печінці щурів за введення хлориду кадмію, а також на 5-АЛК-синтазну, триптофан-2,3-диоксигеназну активності за введення хлориду кадмію та хлориду меркурію.
. Дослідити динаміку 5-АЛК-синтазної, триптофан-2,3-диоксигеназної активностей та вмісту цитохрому Р-450 у печінці щурів за введення фенілгідразину.
. Дослідити динаміку 5-АЛК-синтазної, триптофан-2,3-диоксигеназної активностей та вмісту цитохрому Р-450 у печінці щурів за введення гліцеролу.
Об’єкт дослідження –роль біосинтезу гему в механізмах адаптації метаболізма при дії на організм ссавців пошкоджуючих факторів зовнішнього середовища.
Предмет дослідження –-АЛК-синтазна активність і вміст деяких гемопротеїнів в печінці щурів при дії гемолітичних агентів.
Методи дослідження –-АЛК-синтазну активність в печінці щурів визначали колориметричним методом, триптофан-2,3-диоксигеназну активність–спектрофотометричним методом. Вміст цитохрома Р-450 і цитохрома b в печінці щурів визначали методом диференційної спектрофотометрії. Отримані дані були статистично оброблені, оцінка значимості розходжень між групами отриманих даних була проведена з використанням непараметричного критерію U Манна-Уітні-Вілкоксона.
Наукова новизна. Вперше встановлені особливості дії гемолітичних агентів різної хімічної природи на активність ключового фермента біосинтезу гему –-АЛК-синтази і вміст деяких гемопротеїнів впечінці щурів.
Вперше встановлено, що підвищення 5-АЛК-синтазної активності є однією з причин накопичення вільного гему в печінці щурів в перші години дії фенілгідразину і гліцеролу та в пізні терміни після введення хлориду кадмію і хлориду меркурію.
Вперше встановлено, що хлорид кадмію, на відміну від хлориду меркурію, не спричиняє накопичення вільного гему в печінці щурів в перші години після дії. За введення хлориду кадмію зростання 5-АЛК-синтазної активності супроводжується накопиченням вільного гему в печінці щурів. Отримані дані про блокування -токоферолом підвищення 5-АЛК-синтазної і триптофан-2,3-диоксигеназної активностей при дії хлориду кадмію і хлориду меркурію дають підставу вважати, що активація 5-АЛК-синтази призводить до накопичення вільного гему в печінці щурів.
Вперше встановлено, що фенілгідразин спричиняє двохфазну зміну 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів: короткочасне зниження активності і подальше підвищення. Очевидно, однією з причин активації 5-АЛК-синтази за цих умов є деградація цитохрома Р-450.
Вперше встановлено, що зростання 5-АЛК-синтазної і триптофан-2,3-диоксигеназної активностей в печінці щурів за введення гліцеролу є результатом активації синтеза даних ферментів de novo. Показано, що блокування циклогексимідом зростання 5-АЛК-синтазної активності при дії гліцеролу супроводжується нормалізацією вмісту вільного гему в печінці щурів. Отримані дані дозволяють припустити, що індукція 5-АЛК-синтази є основною причиною накопичення вільного гему в печінці щурів протягом перших годин дії гліцеролу.
Теоретична і практична значимість роботи. Отримані дані свідчать, що при дії гемолітичних агентів підвищення 5-АЛК-синтазної активності призводить до накопичення вільного гему в печінці щурів.
Результати проведеного дослідження дозволяють припустити, що активація 5-АЛК-синтази за введення солей важких металів і фенілгідразину може бути пов’язана з деградацією основного гемопротеїна печінки - цитохрома Р-450.
Згідно з даними роботи попереднє введення -токоферола запобігає зниженню вмісту цитохрома Р-450 при дії хлориду кадмію, а також блокує підвищення 5-АЛК-синтазної та триптофан-2,3-диоксигеназної активностей в печінці щурів при дії хлориду кадмію та хлориду меркурію. Даний факт дозволяє розглядати попереднє введення -токоферолу як один з можливих засобів обмеження токсичної дії солей важких металів за рахунок збереження вмісту цитохрома Р-450, попередження активації 5-АЛК-синтази і запобігання накопиченню вільного гему в печінці ссавців.
Особистий внесок здобувача. Всі результати, приведені в рукопису, отримані здобувачем самостійно. Дисертантом особисто проведено вибір досліджуваних показників, статистично оброблені отримані результати і проаналізована література за темою дослідження. Аналіз отриманих даних автор роботи провів разом з науковим керівником.
Апробація роботи. Результати та основні положення дисертаційної роботи доповідались на: міжнародній Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії, Люблін, 2002 р.; на VIII Українському біохімічному з’їзді, Чернівці, 2002 р.; на 7-ій Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология –наука XXI века”, Пущино 2003 р.; на Каразінських читаннях, Харків 2003 р. Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей і 9 тез доповідей.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 135 сторінках і складається з 8 розділів: вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів та обговорень (3 розділи), узагальнення отриманих результатів і висновків та списку використаної літератури (250 літературних джерела, з яких 203 іноземних авторів). Робота містить 33 рисунка та 7 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Огляд складається з 4-х підрозділів. У підрозділах 1.1, 1.2, та 1.3 висвітлені сучасні уявлення про молекулярні властивості та основні принципи регуляції ключового фермента біосинтеза гему –-АЛК-синтази, гемзв’язувального білка –триптофан-2,3-диоксигенази (ТДО) і основного гемопротеїну клітин печінки –цитохрома Р-450. Особлива увага приділяється питанням регуляції активності 5-АЛК-синтази, ТДО та вмісту цитохрому Р-450 іонами важких металів та гемом. У підрозділі 1.4 обгрунтовано вибір напрямку досліджень та наведені способи вирішення задач, поставлених у роботі.
Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили на статево-зрілих щурах-самцях лінії Вістар вагою 150 - 200 г, яких утримували в стандартних умовах віварію. Солі металів, фенілгідразин та гліцерол вводили одноразово: CdCl вводили підшкірно в дозі 1,4 мг/100 г [Kikuchi G., 1983], HgCl–внутрішньочеревинно в дозі 0,7 мг/100 г [Maines M. D., 1977], фенілгідразин - внутрішньочеревинно в дозі 7 мг/100 г [Cаркисов Д. С., 1960], гліцерол (50 % водний розчин) –в дозі 0,75 мл/100 г по / дози в кожний стегновий м’яз [Nath K. A., 1998]. Ацетат -токоферолу вводили внутрішньом’язово в дозі 5 мг/100 г маси тіла [Дорошкевич Н. А., 1991] за 2 год до введення солей металів. Циклогексимід вводили внутрішньочеревинно в дозі 200 мкг/100 г [Гончаров Н.И., 1982] за 0,5 год до введення гліцеролу. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом через 0,5, 2, 6 та 24 год після введення CdCl, фенілгідразину та гліцеролу або через 1 і 18 год після введення HgCl.
Об’єктом досліджень була печінка щурів. Мікросомальну фракцію отримували з гомогенату печінки щурів методом диференційного центрифугування, як описано в роботі [Лемешко В. В., 1980]. 5-АЛК-синтазну активність визначали в гомогенаті печінки щурів колориметричним методом, як описано в роботі [Marver H. S., 1966], і виражали в нмоль АЛК/мг білка за 1 год.
Триптофан-2,3-диоксигеназну активність визначали спектрофотометричним методом, як описано в роботі [Badawy A. A.-B., 1984]. В печінці щурів ТДО існує у двох формах: у вигляді апофермента, зв’язаного з гемом (холофермента) та вільного апофермента [Badawy A. A.-B., 1984]. Активність холофермента ТДО визначали без додавання, а загальну активність з додаванням у середовище інкубації екзогенного геміну і виражали в нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год. Насичення гемом ТДО розраховували як відношення активності холофермента до загальної активності і виражали у відсотках [Kaliman P. A., 1991].
Вміст цитохрома Р-450 визначали у гомогенаті і мікросомальній фракції печінки щурів, вміст цитохрома b- у мікросомальній фракції печінки щурів методом диференційної спектрофотометрії, як описано в роботі [Карузина И. И., 1977] і виражали в нмоль/мг білка. Вміст білка визначали методом Лоурі в модифікації Міллера [Miller G. L., 1959].
Оцінку значимості різниці між групами отриманих даних проводили з використанням непараметричного критерію U Манна-Уітні-Вілкоксона [Гублер Е. В., 1973].
Основні результати роботи та їх обговорення
5-Амінолевулінатсинтазна, триптофан-2,3-диоксигеназна активності та вміст цитохрома Р-450 в печінці щурів за введення солей металів, а також за введення солей металів на фоні попереднього введення -токоферолу. В роботі встановлено, що CdCl спричиняє двохфазну зміну 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів: зниження активності через 2 год після введення та підвищення через 6 год. Через 24 год спостерігається подальше зростання активності фермента (табл. 1).
Двохфазна зміна 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів за введення CdCl також встановлена в роботі [Kikuchi G., 1983]. Згідно з даними літератури підвищення активності 5-АЛК-синтази в печінці щурів за введення солей важких металів є наслідком активації синтеза фермента de novo [Maines M. D., 1984, Калиман П. А., 1986]. Зниження активності 5-АЛК-синтази при дії солей важких металів може бути пов’язане як з безпосередньою дією іонів металів на активність фермента, так і з накопиченням в клітинах печінки вільного гему [Maines M. D., 1984, Калиман П. А., 1999]. В роботі [Калиман П. А., 1999] було показано, що зниження 5-АЛК-синтазної активності протягом перших годин дії хлориду меркурію зумовлене надходженням до печінки гему із кров’яного русла внаслідок гемолізу.
В даній роботі в якості показника вмісту вільного гему в печінці щурів використовували насичення гемом цитозольного гемзв’язувального білка –ТДО. Встановлено, що активність холофермента, загальна активність і насичення гемом ТДО в печінці щурів не змінюються протягом перших годин дії CdCl (табл. 1). Через 6 год після ін’єкії CdCl активність холоферменту і насичення гемом ТДО підвищуються, при цьому загальна активність ТДО не відрізняється від контрольних значень (табл. 1). Через 24 год спостерігається подальше зростання активності холофермента та підвищення загальної активності ТДО, що призводить до нормалізації насичення фермента гемом.
Враховуючи короткий період напівжиття ТДО (2,3 год) [Badawy A. A.-B., 1984], можна припустити, що підвищення загальної активності ТДО за введення CdCl зумовлене активацією синтезу апофермента ТДО de novo. Останнє може бути наслідком зростання в клітинах печінки вмісту вільного гему [Ren S., 2000] і/або секреції глюкокортикоїдів за умов розвитку стрес-реакції [Голиков П. П., 1988].
Таблиця 1
5-АЛК-синтазна активність, активність і насичення гемом ТДО в гомогенаті печінки щурів в різні терміни після введення CdCl (M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Час після дії |
|
0,5 год |
год |
год |
год |
|
|
5-АЛК-синтазна активність (нмоль АЛК/мг білка за 1 год) |
||||
|
0,118±0,010 |
,115±0,010 |
,037±0,007* |
,214±0,010* |
,372±0,050*# |
|
Активність холофермента ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||||
|
3,12±0,23 |
3,46±0,16 |
3,22±0,25 |
,88±0,18* |
,03±0,24*# |
|
Загальна активність ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||||
|
7,95±0,32 |
8,51±0,88 |
,84±0,56 |
,85±0,38 |
,06±0,51* |
|
Насичення гемом ТДО (%) |
||||
|
41,45±0,72 |
,88±0,50 |
,40±0,68 |
,14±0,77* |
,29±0,55 |
* - р0,05 відносно контролю, # - р0,05 відносно 6 год
Отримані експериментальні результати свідчать, що вміст вільного гему в печінці щурів не змінюється протягом перших годин дії і підвищується тільки через 6 год після введення CdCl. Беручи до уваги цей факт, а також дані роботи [Cтрельченко К. В., 2003] про значне накопичення іонів кадмію в печінці щурів вже через 0,5 год після введення CdCl, можна висловити припущення, що зниження 5-АЛК-синтазної активності зумовлене безпосередньою дією на активність ферменту іонів кадмію, а не вільного гему.
В роботах, виконаних на кафедрі біохімії ХНУ, було встановлено, що HgCl спричиняє двохфазну зміну 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів: зниження активності через 0,5 год та подальше підвищення [Калиман П. А., 1999]. Згідно з результатами, отриманими в даній роботі, 5-АЛК-синтазна активність не відрізняється від контрольних значень через 1 год і підвищується через 18 год після ін’єкції HgCl (табл. 2).
Встановлено, що HgCl спричиняє підвищення активності холофермента і насичення гемом ТДО в печінці щурів через 1 год після введення (табл. 2). Через 18 год спостерігається подальше зростання активності холофермента і підвищення загальної активності ТДО, що супроводжується нормалізацією насичення фермента гемом.
Таблиця 2
5-АЛК-синтазна активність, активність і насичення гемом ТДО в гомогенаті
печінки щурів через 1 і 18 год після введення HgCl (M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Час після дії |
|
1 год |
год |
|
5-АЛК-синтазна активність (нмоль АЛК/мг білка за 1 год) |
|
0,096±0,009 |
0,088±0,013 |
0,209±0,039* |
|
Активність холофермента ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||
|
3,16±0,33 |
4,22±0,33* |
5,63±0,44* |
|
Загальна активність ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||
|
7,60±0,07 |
7,96±0,68 |
,76±0,33* |
|
Насичення гемом ТДО (%) |
||
|
40,40±1,54 |
53,62±2,72* |
,11±3,20 |
* - р0,05 відносно контролю
Таким чином HgCl, на відміну від CdCl, вже в перші години після дії спричиняє накопичення вільного гему в печінці щурів. Останнє може бути наслдком надходження до печінки гему лізованих еритроцитів із кров’яного русла шляхом неспецифічного транспорту [Сокол О. А., 2001, Стрельченко К. В., 2003].
В пізні терміни після введення HgCl зростання вмісту вільного гему в печінці щурів може бути пов’язане з активацією 5-АЛК-синтази і накопиченням гему, синтезованого de novo. При дії HgCl підвищення 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів корелює зі зростанням активності холофермента ТДО (коефіцієнт кореляції=0,9).
За введення CdCl гем із кров’яного русла надходить до печінки шляхом рецептор-опосередкованого транспорту, про що свідчить зростання вмісту загального гему без підвищення вмісту вільного гему в печінці щурів [Стрельченко К. В., 2003]. Гем, що надійшов до печінки за механізмом рецептор-опосередкованого транспорту, не накопичується в цитозолі гепатоцитів, а за допомогою внутрішньоклітинних гемзв’язувальних білків транспортується до мембран ендоплазматичного ретикулума, де руйнується в гемоксигеназній реакції [Dailey H. A., 1990]. За введення CdCl накопичення вільного гему в печінці щурів, очевидно, пов’язане з активацією ключового фермента біосинтеза гему –-АЛК-синтази, а не з транспортом гему із кров’яного русла. При дії CdCl зростання 5-АЛК-синтазної активності корелює з підвищенням активності холофермента ТДО (коефіцієнт кореляції = 0,9).
Підвищення 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів при дії CdCl і HgCl може бути спрямоване на відновлення вмісту пошкоджених внутрішньоклітинних гемопротеїнів. Відомо, що надходження до організму солей важких металів призводить до активації процесів вільнорадикального окиснення і, як наслідок, деградаціїї внутрішньоклітинних гемопротеїнів [Maines M.D., 1984]. Вважають, що гем, вивільнений зі зруйнованих внутрішньоклітинних гемопротеїнів, може поповнювати цитозольний пул вільного гему гепатоцитів [Maines M.D., 1997].
Отримані дані свідчать, що вміст цитохрома Р-450 і цитохрома b в печінці щурів знижується через 24 год після введення CdCl (табл. 3).
Таблиця 3
Вміст цитохрома Р-450 і цитохрома b в мікросомальній фракції печінки щурів через 24 год після введення CdCl (нмоль/мг білка, M±m, n = 4-6)
|
Показник |
Контроль |
СdCl |
|
Цитохром Р-450 |
0,621±0,037 |
0,294±0,035* |
|
Цитохром b |
0,265±0,017 |
,180±0,012* |
*- р0,05 відносно контролю
В паралельних експериментах було встановлено, що введення CdCl призводить до активації процесів перекисного окиснення ліпідів в печінці щурів [Филимоненко В. П., 2002]. З огляду на це можна припустити, що деградація цитохрома Р-450 і цитохрома b за введення CdCl зумовлена активацією вільнорадикальних процесів.
Попереднє введення -токоферолу запобігає зниженню вмісту цитохрома Р-450 в печінці щурів через 24 год після ін’єкції CdCl (табл. 4).
Таблиця 4
Вміст цитохрома Р-450 в гомогенаті печінки щурів через 24 год після введення CdCl
на фоні попереднього введення -токоферолу (нмоль/мг білка, M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Варіант досліду |
|
|
CdCl |
-токоферол+ CdCl |
|
|
0,145±0,010 |
,088±0,013* |
,125±0,027 |
*- р0,05 відносно контролю
В роботах, виконаних на кафедрі біохімії ХНУ, було встановлено, що попереднє введення -токоферолу попереджує зниження вмісту цитохрома Р-450 через 24 ч год після ін’єкції HgCl [Калиман П. А., 2001]. Однак вплив попереднього введення -токоферолу на індукцію ключового фермента біосинтезу гему –-АЛК-синтази при дії солей важких металів не досліджений.
Як свідчать експериментальні дані, представлені в табл. 5, попереднє введення -токоферолу не запобігає зниженню 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів через 2 год після введення CdCl, але повністю блокує зростання активності фермента через 24 год.
Таблиця 5
5-АЛК-синтазна активність в гомогенаті печінки щурів через 2 і 24 год
після введення CdCl на фоні попереднього введення -токоферолу
(нмоль АЛК/мг білка за 1 год, M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Час після дії |
|||
|
2 год |
год |
|||
|
CdCl |
-токоферол+ CdCl |
CdCl |
-токоферол+ CdCl |
|
|
0,072±0,002 |
,037±0,001* |
,029±0,002* |
0,234±0,034* |
,060±0,001 |
*- р0,05 відносно контролю
-Токоферол також запобігає зростанню 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів через 18 год після введення HgCl (табл. 6). В роботі встановлено, що введення -токоферолу не впливає на рівень базальної активності 5-АЛК-синтази.
Таблиця 6
5-АЛК-синтазна активність в гомогенаті печінки щурів через 18 год
після введення HgCl на фоні попереднього введення -токоферолу
(нмоль АЛК/мг білка за 1 год, M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Варіант досліду |
|
|
HgCl |
-токоферол+ HgCl |
|
|
0,072±0,002 |
0,234±0,034* |
0,060±0,001 |
*- р0,05 відносно контролю
Отримані дані про блокування -токоферолом зниження цитохрома Р-450 і підвищення 5-АЛК-синтазної активності при дії CdCl і HgCl дозволяють припустити, що нормалізація 5-АЛК-синтазної активності за цих умов зумовлена збереженням вмісту основного гемопротеїна печінки - цитохрома Р-450.
Встановлено, що -токоферол попереджує зростання активності холофермента та загальної активності ТДО через 24 год після введення CdCl (табл. 7). Ці дані підтверджують висловлене припущення про те, що активація 5-АЛК-синтази при дії CdCl є однією з причин накопичення вільного гему в печінці щурів і, як наслідок, підвищення триптофан-2,3-диоксигеназної активності.
Таблиця 7
Активність і насичення гемом ТДО в гомогенаті печінки щурів через 24 год після введення CdCl на фоні попереднього введення -токоферолу (M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Варіант досліду |
|
|
CdCl |
-токоферол+ CdCl |
|
|
Активність холофермента ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||
|
3,12±0,04 |
,15±0,18* |
3,39±0,09 |
|
Загальна активність ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||
|
7,65±0,07 |
12,32±0,14* |
8,20±0,23 |
|
Насичення гемом ТДО (%) |
||
|
40,74±0,33 |
41,80±0,55 |
,69±0,16 |
* - р0,05 відносно контролю
Встановлено, що -токоферол не запобігає зростанню активності холофермента і насичення гемом ТДО в печінці щурів через 1 год, але повністю блокує підвищення триптофан-2,3-диоксигеназної активності через 18 год після ін’єкції HgCl (табл. 8). Згідно з експериментальними даними, отриманими в паралельних дослідах, попереднє введення -токоферолу не запобігає лізису еритроцитів через 1 год після введення HgCl [Стрельченко К. В., 2003]. Отже, в перші години після введення HgCl основним джерелом накопичення вільного гему в печінці щурів є гем зруйнованих еритроцитів, тоді як в більш пізні терміни –гем, синтезований de novo, за умов активації 5-АЛК-синтази.
Таблиця 8
Активність і насичення гемом ТДО в гомогенаті печінки щурів через 1 і 18 год після введення HgCl на фоні попереднього введення -токоферолу (M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Час після дії |
|||
|
1 год |
год |
|||
|
HgCl |
-токоферол+ HgCl |
HgCl |
-токоферол+ HgCl |
|
|
Активність холофермента ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||||
|
3,16±0,33 |
4,22±0,33* |
,98±0,31* |
5,63±0,44* |
,26±0,27 |
|
Загальна активність ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||||
|
7,60±0,07 |
7,96±0,68 |
,55±0,56 |
,76±0,33* |
7,55±0,42 |
|
Насичення гемом ТДО (%) |
||||
|
40,40±1,54 |
53,62±2,72* |
,08±2,66* |
,11±3,20 |
,06±1,93 |
* - р0,05 відносно контролю
Таким чином HgCl, на відміну від CdCl, спричиняє накопичення вільного гему в печінці щурів вже в перші години після введення, що пов’язане з надходженням до цього органу гему лізованих еритроцитів за рахунок неспецифічного транспорту. За введення CdCl гем із кров’яного русла надходить до печінки шляхом рецептор-опосередкованого транспорту і не накопичується в цитозолі гепатоцитів.
Активація ключового фермента біосинтезу гему –-АЛК-синтази і деградація цитохрома Р-450 призводять до підвищення вмісту вільного гему в печінці щурів в пізні терміни після введення CdCl і HgCl.
5-Амінолевулінатсинтазна, триптофан-2,3-диоксигеназна активності та вміст цитохрома Р-450 в печінці щурів за введення фенілгідразина. Фенілгідразин є класичним гемолітичним агентом, що виявляє сильні окиснювальні властивості [Саркисов Д. С., 1960, Ciccoli L., 1994]. Згідно з даними літератури метаболізм фенілгідразину здійснюється в печінці за участю цитохрома Р-450 [Ohars A., 1982]. Взаємодія фенілгідразину з гемом цитохрома Р-450 призводить до інактивації і деградації даного гемопротеїну [Jonen H. G., 1982, Moloney S. J., 1984]. Незважаючи на значну кількість робіт, присвячених вивченню механізмів дії фенілгідразину на активність і вміст внутрішньоклітинних гемопротеїнів, вплив даного агента на активність ключового фермента біосинтезу гему –-АЛК-синтази в печінці ссавців до цього часу не досліджений.
В даній роботі встановлено, що фенілгідразин спричиняє короткочасне зниження 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів через 0,5 год після введення і подальше підвищення через 2 і 6 год (табл. 9). Через 24 год після ін’єкції фенілгідразину 5-АЛК-синтазна активність не відрізняється від контрольних значень.
Таблиця 9
5-АЛК-синтазна активність і вміст цитохрома Р-450 в гомогенаті печінки щурів в різні терміни після введення фенілгідразину (M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Час після дії |
|
0,5 год |
год |
год |
год |
|
|
5-АЛК-синтазна активність (нмоль АЛК/мг білка за 1 год) |
||||
|
0,085±0,004 |
,049±0,008* |
,232±0,016* |
,154±0,030*# |
0,098±0,005 |
|
Вміст цитохрома Р-450 (нмоль/мг білка) |
||||
|
0,124±0,010 |
- |
,089±0,085* |
,082±0,004* |
,098±0,005* |
* - р0,05 відносно контролю, # - р0,05 відносно 2 год
Згідно з даними роботи [Lim L. R., 1980] активація 5-АЛК-синтази за введення порфіриногенних сполук може бути наслідком деградації цитохрома Р-450.
В роботі встановлено, що вміст цитохрома Р-450 в печінці щурів знижується вже через 2 год після введення фенілгідразину і залишається на низькому рівні протягом доби (табл. 9). Зниження вмісту цитохрома Р-450 за введення фенілгідразину спостерігається також в мікросомальній фракції печінки щурів (табл. 10). Вміст цитохрома b при дії фенілгідразину не змінюється (табл. 10).
Таблиця 10
Вміст цитохрома Р-450 і цитохрома b) в мікросомальній фракції печінки щурів через 24 год після введення фенілгідразину (нмоль/мг білка, M±m, n = 4-6)
|
Показник |
Контроль |
Фенілгідразин |
|
Цитохром Р-450 |
0,621±0,037 |
0,333±0,013* |
|
Цитохром b |
0,265±0,017 |
,256±0,036 |
*- р0,05 відносно контролю
Зниження вмісту цитохрома Р-450 при дії фенілгідразину є наслідком деградації даного гемопротеїну в результаті модифікації гему у його молекулі [Jonen H. G., 1982, Moloney S. J., 1984].
Встановлено, що зниження вмісту цитохрома Р-450 корелює з підвищенням 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів за введення фенілгідразину (коефіцієнт кореляції = -0,7). Очевидно, активація 5-АЛК-синтази в печінці щурів при дії фенілгідразину зумовлена зростанням потреб клітин печінки у гемі для синтезу нових молекул цитохрома Р-450.
Встановлено, що фенілгідразин спричиняє підвищення вмісту вільного гему в печінці щурів через 2 год після введення, про що свідчить зростання насичення гемом ТДО (табл. 11). При цьому спостерігається підвищення активності холофермента і загальної активності ТДО. Через 6 год після ін’єкції фенілгідразину насичення ТДО гемом нормалізується. Активність холофермента і загальна активність ТДО через 6 і 24 год достовірно нижчі за відповідні показники через 2 год, але перевищують контрольні значення.
Таблиця 11
Активність і насичення гемом ТДО в гомогенаті печінки щурів в різні терміни
після введення фенілгідразину (M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Час після дії |
|
0,5 год |
год |
год |
год |
|
|
Активність холофермента ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||||
|
2,98±0,13 |
3,13±0,14 |
,08±0,21* |
3,51±0,05*# |
,99±0,45*# |
|
Загальна активність ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||||
|
7,27±0,20 |
7,47±0,34 |
,46±0,35* |
8,30±0,08*# |
,60±0,60*# |
|
Насичення гемом ТДО (%) |
||||
|
40,88±1,00 |
41,96±0,76 |
,14±1,09* |
,35±0,88 |
,06±1,23 |
* - р0,05 відносно контролю, # - р0,05 відносно 2 год
Зростання загальної активності ТДО, очевидно, зумовлене активацією синтеза апофермента ТДО de novo внаслідок накопичення вільного гему в печінці щурів [Ren S., 2000] і/або секреції глюкокортикоїдів у відповідь на дію стресорного фактора [Danesch U., 1983, Голиков П. П., 1988].
За введення фенілгідразину підвищення активності холофермента ТДО в печінці щурів корелює зі зростанням 5-АЛК-синтазної активності (коефіцієнт кореляції = 0,9). Очевидно, основним джерелом накопичення вільного гему в печінці щурів за цих умов є гем, синтезований de novo, а не гем пошкодженого цитохрома Р-450, оскільки апофермент ТДО зв’язує тільки нативний, але не модифікований гем [Badawy A. A.-B., 1984]. Таким чином за введення фенілгідразину, як і за введення CdCl і HgCl активація 5-АЛК-синтази, що спрямована на відновлення вмісту цитохрома Р-450, є однією з причин накопичення вільного гему в печінці щурів.
5-Амінолевулінатсинтазна, триптофан-2,3-диоксигеназна активності та вміст цитохрома Р-450 в печінці щурів за введення гліцеролу. Відомо, що основним пошкоджуючим фактором в гліцерольній моделі рабдоміолізу є накопичення в кров’яному руслі гему і гемвмісних сполук з їх подальшим надходженням до різних органів, в тому числі печінки [Vanholder R., 2001, Akmal M., 1990]. Метаболізм гему в печінці ссавців за гліцерольної моделі рабдоміолізу практично не досліджений.
В даній роботі встановлено, що гліцерол спричиняє зростання 5-АЛК-синтазної активності в печінці щурів через 0,5 і 2 год після введення (табл. 12). Через 6 год після ін’єкції гліцеролу 5-АЛК-синтазна активність не відрізняється від контрольних значень.
Таблиця 12
5-АЛК-синтазна активність в гомогенаті печінки щурів в різні терміни
після введення гліцеролу(M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Час після дії |
|
0,5 год |
год |
год |
год |
|
|
5-АЛК-синтазна активність (нмоль АЛК/мг білка за 1 год) |
||||
|
0,085±0,004 |
,229±0,022* |
,217±0,023* |
0,086±0,006 |
,096±0,004 |
|
Активність холофермента ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||||
|
2,98±0,13 |
3,11±0,12 |
,02±0,37* |
6,11±0,34* |
,66±0,20*# |
|
Загальна активність ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||||
|
7,27±0,20 |
7,27±0,27 |
,16±0,85* |
11,53±0,46* |
,78±0,62*# |
|
Насичення гемом ТДО (%) |
||||
|
40,88±1,00 |
42,72±0,45 |
,83±1,68* |
,89±1,80* |
,90±0,74 |
*- р0,05 відносно контролю, # - р0,05 відносно 6 год
Встановлено, що гліцерол спричиняє підвищення активності холофермента, загальної активності і насичення гемом ТДО через 2 год після введення (табл. 12). Через 6 год досліджувані показники залишаються на високому рівні. Через добу після ін’єкції гліцеролу активність холофермента і загальна активність ТДО достовірно нижчі за відповідні показники через 6 год, але при цьому перевищують контрольні значення; насичення ТДО гемом нормалізується.
Попереднє введення циклогексиміду блокує зростання 5-АЛК-синтазної активності, активності холофермента, загальної активності і насичення гемом ТДО в печінці щурів через 2 год після ін’єкції гліцеролу (табл. 13).
Таблиця 13
5-АЛК-синтазна активність, активність і насичення гемом ТДО в гомогенаті печінки щурів через 2 год після введення гліцеролу на фоні попереднього введення циклогексиміду (M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Варіант досліду |
|
|
гліцерол |
циклогексимід + гліцерол |
|
|
5-АЛК-синтазна активність (нмоль АЛК/мг білка за 1 год) |
||
|
0,099±0,009 |
,207±0,047* |
,122±0,014 |
|
Активність холофермента ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||
|
2,63±0,18 |
,88±0,07* |
,16±0,27 |
|
Загальна активність ТДО (нмоль кінуреніна/мг білка за 1 год) |
||
|
6,52±0,42 |
,52±0,16* |
7,79±0,39 |
|
Насичення гемом ТДО (%) |
||
|
40,41±1,59 |
,82±1,71* |
,40±2,21 |
*- р0,05 відносно контролю
Отримані дані свідчать, що підвищення 5-АЛК-синтазної і триптофан-2,3-диоксигеназної активностей є наслідком активації синтезу даних ферментів de novo. Індукція 5-АЛК-синтази за введення гліцеролу може бути пов’язана з порушенням функціонування мітохондрій, що характерно для гліцерольної моделі рабдоміолізу [Narth K. A., 1998]. Індукція апобілка ТДО при дії гліцеролу, очевидно, є наслідком зростання вмісту вільного гему в печінці щурів [Ren S., 2000].
Відомо, що накопичення в клітинах вільного гему призводить до активації процесів вільнорадикального окиснення і окисного пошкодження клітинних компонентів [Maines M. D., 1997]. В паралельних експериментах встановлено зниження вмісту відновленого глутатіону та активності деяких антиоксидантних ферментів в печінці щурів за введення гліцеролу [Стрельченко К. В., 2003].
В даній роботі встановлено зниження вмісту цитохрома Р-450 в печінці щурів через 24 ч після ін’єкції гліцеролу (табл. 14).
Таблиця 14
Вміст цитохрома Р-450 в гомогенаті печінки щурів в різні терміни після введення
гліцеролу(M±m, n = 5-7)
|
Контроль |
Час після дії |
|
0,5 год |
год |
год |
год |
|
|
0,124±0,009 |
- |
,105±0,013 |
,106±0,008 |
,073±0,004* |
*- р0,05 відносно контролю
Як свідчать дані роботи [Стрельченко К. В., 2003], гліцерол спричиняє зниження активності каталази в печінці щурів через 24 год після введення. Таким чином, в пізні терміни після введення гліцеролу джерелом накопичення вільного гему в печінці щурів може бути гем зруйнованих внутрішньоклітинних гемопротеїнів.
Крім того, за введення гліцеролу зростання вмісту вільного гему може бути зумовлене надходженням до печінки гему із кров’яного русла. Згідно з даними паралельних експериментів накопичення гемвмісних сполук в сироватці крові щурів спостерігається протягом доби після введення гліцеролу [Каліман П. А., 2003].
Результати проведеного дослідження свідчать, що циклогексимід блокує підвищення вмісту вільного гему, а також індукцію 5-АЛК-синтази за введення гліцеролу (табл. 13). В той же час циклогексимід не впливає на зростання вмісту загального гему в печінці щурів в перші години дії гліцеролу [Стрельченко К. В., 2003]. Отримані дані дають підставу вважати, що індукція 5-АЛК-синтази є основною причиною накопичення вільного гему в печінці щурів протягом перших годин дії гліцеролу. В пізні терміни після введення гліцеролу зростання вільного гему в печінці щурів, очевидно, є наслідком деградації внутрішньоклітинних гемопротеїнів.
ВИСНОВКИ
В результаті проведених експериментів встановлені особливості дії гемолітичних агентів різної хімічної природи на активність ключового фермента біосинтезу гему –-АЛК-синтази і вміст деяких гемопротеїнів впечінці щурів. За результатами дослідження зроблені наступні висновки:
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
АНОТАЦІЯ
Іншина Н.М. 5-Амінолевулінатсинтазна активність і вміст деяких гемопротеїнів в печінці щурів при дії гемолітичних агентів. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 –біохімія. –Харківський національний університет ім. В. Н. Каразіна. –Харків. –.
Дисертація присвячена вивченню особливостей дії гемолітичних агентів на активність ключового фермента біосинтезу гема –-амінолевулінатсинтази і вміст деяких гемопротеїнів в печінці щурів.
Встановлено, що при дії хлориду кадмію, хлориду меркурію, фенілгідразину та гліцеролу підвищення 5-амінолевулінатсинтазної активності є однією з причин накопичення вільного гему в печінці щурів. Попереднє введення -токоферолу запобігає підвищенню 5-амінолевулінатсинтазної і триптофан-2,3-диоксигеназної активностей в печінці щурів при дії хлориду кадмію і хлориду меркурію. За умов введення солей металів та фенілгідразину активація 5-амінолевулінатсинтази може бути пов’язана з деградацією основного гемопротеїну печінки –цитохрома Р-450.
Ключові слова: 5-амінолевулінатсинтаза, триптофан-2,3-диоксигеназа, цитохром Р-450, цитохром b, гем, печінка, хлорид кадмію, хлорид меркурію, фенілгідразин, гліцерол.
АННОТАЦИЯ
Иншина Н.Н. 5-Аминолевулинатсинтазная активность и содержание некоторых гемопротеинов в печени крыс при действии гемолитических агентов. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 –биохимия. –Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина. –Харьков. –.
Диссертация посвящена изучению особенностей действия гемолитических агентов различной химической природы на активность ключевого фермента биосинтеза гема –-аминолевулинатсинтазы и содержание некоторых гемопротеинов в печени крыс.
Эксперименты выполнены на половозрелых крысах самцах линии Вистар массой 150-200 г. В работе исследовали динамику 5-аминолевулинатсинтазной, триптофан-2,3-диоксигеназной активности и содержания цитохрома Р-450 в печени крыс при введении хлорида кадмия, хлорида ртути, фенилгидразина и глицерола. Исследовали влияние предварительного введения антиоксиданта - -токоферола на изменение перечисленных показателей при введении хлорида кадмия и хлорида ртути. Также исследовали влияние предварительного введения ингибитора белкового синтеза –циклогексимида на изменение 5-аминолевулинатсинтазной и триптофан-2,3-диоксигеназной активностей при введении глицерола.
Активность 5-аминолевулинатсинтазы определяли колориметрическим методом, активность триптофан-2,3-диоксигеназы –спектрофотометрическим методом. О содержании свободного гема в печени крыс судили по отношению активности холофермента к общей активности ТДО. Содержание цитохрома Р-450 и цитохрома b определяли методом дифференциальной спектрофотометрии. Оценку значимости различий между группами полученных данных проводили с использованием непараметрического теста Манна-Уитни-Вилкоксона.
В работе установлено, что повышение 5-аминолевулинатсинтазной активности приводит к накоплению свободного гема в печени крыс в первые часы воздействия фенилгидразина и глицерола и в более поздние сроки после введения хлорида кадмия и хлорида ртути. Результаты проведенного исследования позволяют предположить, что при введении солей тяжелых металлов (кадмия и ртути), а также фенилгидразина активация 5-аминолевулинатсинтазы является следствием деградации основного гемопротеина печени –цитохрома Р-450.
Согласно полученным данным хлорид кадмия, в отличие от хлорида ртути, не вызывает накопление свободного гема в печени крыс в первые часы после введения. Увеличение содержания свободного гема в первые часы воздействия хлорида ртути, по-видимому, обусловлено поступлением в печень гема лизированных эритроцитов из кровяного русла путем неспецифического транспорта. В поздние сроки после введения исследуемых солей металлов накопление свободного гема в печени крыс, очевидно, обусловлено повышением 5-аминолевулинатсинтазной активности и деградацией внутриклеточных гемопротеинов, в частности, цитохрома Р-450 и цитохрома b.
Полученные данные о способности -токоферола предотвращать снижение содержания цитохрома Р-450 и повышение 5-аминолевулинатсинтазной активности, вызванное введением хлорида кадмия и хлорида ртути, позволяют предположить, что деградация цитохрома Р-450 является одной из причин активации 5-аминолевулинатсинтазы при введении солей металлов. Сохранение содержания цитохрома Р-450 и предотвращение активации 5-АЛК-синтазы при введении хлорида кадмия или хлорида ртути на фоне предварительного введения -токоферола сопровождаются нормализацией триптофан-2,3-диоксигеназной активности в печени крыс.
В работе установлено, что фенилгидразин вызывает двухфазное изменение 5-аминолевулинатсинтазной активности в печени крыс: кратковременное снижение и последующее повышение. При введении фенилгидразина, как и при введении хлорида кадмия и хлорида ртути, активация 5-аминолевулинатсинтазы, направленная на восстановление содержания поврежденного цитохрома Р-450, приводит к накоплению свободного гема в печени крыс.
В глицерольной модели рабдомиолиза увеличение 5-аминолевулинатсинтазной и триптофан-2,3-диоксигеназной активностей в печени крыс обусловлено активацией синтеза данных ферментов de novo. Полученные данные свидетельствуют о том, что индукция 5-аминолевулинатсинтазы является основной причиной накопления свободного гема в печени крыс в первые часы после введения глицерола. В более поздние сроки воздействия глицерола одним из источников повышения содержания свободного гема в печени крыс может быть гем поврежденного цитохрома Р-450.
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что предупреждение накопления свободного гема в печени млекопитающих за счет сохранения содержания внутриклеточных гемопротеинов и предотвращения индукции 5-аминолевулинатсинтазы может рассматриваться как один из возможных способов ограничения повреждающего действия токсических соединений, в частности солей кадмия и ртути.
Ключевые слова: 5-аминолевулинатсинтаза, триптофан-2,3-диоксигеназа, цитохром Р-450, цитохром b, гем, печень, хлорид кадмия, хлорид ртути, фенилгидразин, глицерол.
Abstract
Inshina N. M. 5-Aminolevulinate synthase activity and content of some hemoproteines in rat liver during action of hemolytic agents. –Manuscript.
Thesis for the degree of candidate of biological science, speciality 03.00.04 –biochemistry. –V. N. Karazin Kharkov National University –Kharkov. –.
This thesis deals with the investigation of particularity of hemolytic agents action on activity of key heme biosynthesis enzyme - 5-aminolevulinate synthase and content of some hemoproteins in rat liver.
It has been established that an increase of 5-aminolevulinate synthase activity is one of the reasons of free heme accumulation in rat liver under action of cadmium chloride, mercury chloride, phenylhydrazine and glycerol. Pre-treatment by alpha-tocopherol prevents the increase of 5-aminolevulinate synthase and tryptophan-2,3-dioxygenase activities caused by cadmium chloride and mercury chloride. The increase of 5-aminolevulinate synthase activity may be linked with degradation of main hemoprotein of liver –cytochrome P-450.
Key words: 5-aminolevulinate synthase, tryptophan-2,3-dioxygenase, cytochrome P-450, cytochrome b, heme, liver, cadmium chloride, mercury chloride, phenylhydrazine, glycerol.