Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
|
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» |
Кафедра инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы
С2. Б.11 ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Лабораторная работа. Лабораторная диагностика бруцеллеза
Направление подготовки 111801 Ветеринария
Профиль подготовки
Специализация Ветеринарная фармация
Квалификация выпускника - специалист
Уфа 2013
Лабораторная работа №9
Лабораторная диагностика бруцеллеза
Цель занятия: Изучить свойства возбудителя и лабораторную диагностику бруцеллеза, ознакомиться с биопрепаратами.
Оборудование и материалы. Вакцинный штамм возбудителя бруцеллеза, единый бруцеллезный антиген, антиген для кольцевой реакции с молоком, розбенгал антиген, позитивная бруцеллезная сыворотка, негативная сыворотка, физиологический раствор, 0,5%-й раствор фенола, серологические пробирки, штативы, мерные пипетки, красители для окрашивания по Граму, Козловскому (Стампу), пробы молока.
1 Общие сведения
Возбудитель бруцеллеза впервые был открыт и описан Брюсом (1886), в честь которого этот микроорганизм получил родовое название Brucella, а семейство — Brucellaceae.
Резервуар и источник инфекции — домашние животные (овцы, козы, коровы, свиньи, реже собаки). Человек — вторичный хозяин; заболевания людей, исключая случаи лабораторного заражения, возникают на фоне эпизоотии. Бактерии передаются от животного к животным и человеку через контакт с зараженными фекалиями, мочой, молоком и мясом. Как правило, каждый из патогенных для человека видов бруцелл избирательно инфицирует специфических животных; Brucella abortus чаще вызывает бруцеллез у крупного рогатого скота (болезнь Банга), В. melitensis — у коз и овец (иногда кур), В. suis — у свиней. Резервуар отдельных биотипов последнего вида — также зайцы, а в районах Крайнего Севера РФ, на Аляске (США), северозападных территориях и Юконе (Канада) источником заражения могут быть геверные олени (карибу).
Возбудитель характеризуются повышенной устойчивостью - выдерживают во влажной среде температуру 60°С в течение 30 мин, 100°С - несколько секунд; при низких температурах (в почве, снегу) сохраняются до 4-5 мес; в молоке выживают до 45 дней, в мясе - до 3-5 мес.
1.1 Бруцеллез - хроническая (контагиозная) инфекционно-аллергическая болезнь животных и человека. Протекает латентно, клинически проявляется абортами и последующими осложнениями: задержанием последа, эндометритами, а также возможно воспаление суставов, эрхиты. Чаще заболевание протекает бессимптомно.
Род Brucella, включает 6 основных видов:
Br. melitensis - возбудитель бруцеллеза у коз и овец.
Br. abortus - возбудитель бруцеллеза у крупного рогатого скота.
Br. suis - возбудитель бруцеллеза у свиней, северных оленей.
Br. ovis - возбудитель инфекционного эпидидимита баранов и абортов у овец.
Br. canis - возбудитель бруцеллеза у собак.
Br. neotomae - возбудитель бруцеллеза у крыс (пустынных и древесных).
В патологии животных имеют значение Brucella melitensis, Вr. abortus, В. suis. Названные виды бруцелл имеют культурально-морфологическое сходство, общие антигены. При гибели, разрушении бруцелл освобождаются эндотоксины. Особой патогенностью для человека (и мелкого рогатого скота) обладает В.melitensis. Основные методы диагностики бруцеллеза: бактериологический (особенно при наличии абортов), серологический и аллергический.
Морфология (микроскопия). Brucella — бактерии представляют собой мелкие (0,5-0,7x0,6-1,5 мкм) неподвижные палочки или коккобациллы. В мазках обычно расположены одиночно, реже парами, короткими цепочками, небольшими группами. Легко окрашиваются анилиновыми красителями, грамотрицательны. Полноценного биполярного окрашивания обычно не обнаруживают. Настоящих капсул не имеют, спор не образуют. Неподвижные, жгутиков не образуют. По методу Козловского (или Шуляка) красятся в красный цвет; остальные микробы - в зеленый (или синий) цвет. В препарате располагаются изолированно или небольшими скоплениями.
Метод окраски по Козловскому. Препараты, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают свежеприготовленным горячим 2%-м раствором сафранина (если раствор остыл, его наливают на препарат и подогревают снизу до появления паров в течение 3...5 мин. Затем краску сливают и докрашивают 1%-м водным раствором малахитовой (или бриллиантовой) зелени (около 1 мин). По методу Шуляка фиксированный мазок окрашивают 2 мин карбол-фуксином (1: 5), слегка промывают и докрашивают 2%-м водным раствором метиленовой сини - 3...5 мин.
Материал для исследования. При жизни животного посылают абортированный плод (или перевязанный с двух сторон желудок плода с содержимым), истечение из родовых путей, плодные оболочки или кусочек плаценты, околоплодную жидкость, молоко. Посмертно (после убоя) в лабораторию направляют трубчатую кость (костный мозг), кусочки печени, почки, селезенки, молочной железы, лимфатические узлы, матку. По мере необходимости отправляют также пробы воды, почвы, подстилки. При взятии материала от животных необходимо соблюдать правила асептики и личной гигиены. Кусочки тканей можно консервировать в 30 %-м глицерине.
Определение культурально-биохимических свойств (выделение и идентификация культуры возбудителя).
Из различных участков патологического материала пипеткой производят посев на жидкие и плотные питательные среды: глюкозо-печеночные, сывороточные, на картофельные среды с добавлением глицерина, глюкозы; рН среды 7,0...7,2. В первичных посевах рост бруцелл проявляется медленно при длительном инкубировании в термостате при 37°С. Учитывая, что одни виды бруцелл аэробы, а другие — микроаэрофилы (Br.abortus), для получения первичных культур посевы помещают в термостат в обычных условиях, другую часть — сначала в эксикатор с повышенным содержанием диоксида углерода (до 10...20 %), а затем уже в термостат. Рост появляется спустя 30...40 сут, самое раннее - на 7...10-е сутки. По мере адаптации к искусственным средам бруцеллы растут более быстро (1...2 сут).
На МППА рост проявляется мелкими прозрачными колониями с ровными краями, с голубоватым оттенком, которые впоследствии сливаются и образуют сплошной мутный сероватый налет. Колонии — S- и R-формы. На картофеле нередко колонии пигментированы (коричневого цвета). Типичные колонии пересевают па специальные питательные среды. Полученную чистую культуру проверяют на биохимическую активность, а также проводят серологическую идентификацию посредством РА на стекле со специфической сывороткой в разведении 1:2...1:50.
В МПБ рост вначале в виде равномерного помутнения, в дальнейшем образуются пристеночное кольцо и небольшой осадок. Для получения чистой культуры бруцелл из загрязненного материала следует сделать посев на селективную среду Козловского (МППА с глюкозой, генцианвиолетом и малахитовой зеленью).
Биохимические свойства выражены слабо. Желатину и свернутую сыворотку бруцеллы не разжижают, индол не образуют. Сероводород и аммиак образуют лишь в зависимости от вида и штамма. Вr. suis обильно продуцирует сероводород, а Вr. abortus - менее интенсивно. Молоко не свертывают.
Биопроба, осуществляется заражением морских свинок, которых предварительно подвергают серологическому контролю. В случае отрицательного результата животным инъецируют подкожно 1...2мл суспензии из тканей присланного материала - свинка не погибает. Через 8...10 сут у зараженной свинки берут кровь (в случае отрицательного или сомнительного результата кровь берут повторно через 20...30 сут), исследуют в РА в разведении 1 : 5...1 :10 (до 1: 80). Положительный результат РА в разведении 1:6...1:10 указывает на инфицированность морской свинки. По истечении 30...45 сут после заражения свинку убивают и исследуют бактериологически. При отрицательном результате РА морских свинок убивают спустя более длительный период (6...8 нед) и бактериологически исследуют их ткани и органы. Обязательно делают посев из паховых, подчелюстных, шейных, брыжеечных лимфоузлов, печени, селезенки, почек, костного мозга.
Методы дифференциации видов бруцелл. Для дифференциации используют чистые культуры бруцелл, образующие S-форму колоний.
Проба с трипафлавином. Бактериологической петлей берут микробную массу 48-часовой агаровой культуры и эмульгируют на предметном стекле в капле трипафлавина, разведенного физиологическим раствором NaCI 1: 500. Если культура диссоциирована, быстро наступает агглютинация с образованием хлопьев. Недиссоциированная культура при эмульгировании в капле образует гомогенное помутнение; хлопья не выпадают.
Окраска колоний кристаллвиолетом. В культуру, выросшую в чашке Петри, пастеровской пипеткой вносят краску в разведении 1: 2000, приготовленную ех tempore. Через 5 мин после отсасывания краски из чашки колонии просматривают под лупой. Диссоциированные R-формы бруцелл окрашиваются от темно-фиолетового до светло-синего цвета, S-формы – в светло-желтый или светло-зеленый цвет.
Реакция термоагглютинации. В пробирке 2...3-миллиардную взвесь бруцелл (смыв с агаровой культуры) прогревают в водяной бане при 90°С в течение 45 мин и оставляют при комнатной температуре. Результат учитывают через 30 мин, затем через 1ч и окончательно через 24ч. В диссоциированной культуре четко заметна агглютинация. Если колонии типичны (S-формы), их пересевают в пробирки на скошенный МПА. Выросшую культуру идентифицируют по следующим показателям: 1) отношение к диоксиду углерода — Вr. abortus для своего роста нуждается в повышенном содержании СО2 (до 10 %.), Br. melitensis и Вr. suis хорошо растут в обычных условиях; 2) образование сероводорода — наиболее интенсивно и более продолжительное время проявляется у Вr. suis, в меньшей степени - у Вr.abortus. Вr. melitensis, как правило, не продуцирует.
Бактериостатический метод. Дифференциация видов бруцелл основана на отношении к растворам красок, добавленных к питательным средам.
В пробирки с красками (каждой в отдельности) — фуксин (1:25 000), тионин (1: 50 000... 1:100 000), добавленными к МППА,— высевают чистую культуру бруцелл. На среде с фуксином не растет Вr. suis, на среде с тионином не растет Вr. abortus. Вr. melitensis хорошо растет в присутствии этих красок.
Серологическая диагностика. В лабораторию направляют сыворотку крови. Последнюю исследуют с бруцеллезным антигеном методами РА и РСК. В производственных условиях в настоящее время используют методику исследования сывороток по методу Кумбса. Все шире используют метод флуоресцирующих антител.
Аллергическая диагностика. В хозяйствах основана на применении аллергенов - бруцеллизата, бруцеллогидролизата, бруцеллина. Последние в дозе 0,2 мл вводят внутрикожно и через 24...48 ч учитывают местную реакцию.
Биопрепараты. Живая сухая вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма №82: отличается слабым серологическим ответом с быстрым снижением уровня гуморальных антител, что позволяет при помощи серологических реакций дифференцировать вакцинированных животных.
Высокоэффективна новая вакцина 75/79 АВ.
Единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК из культуры вакцинного штамма № 19.
Антиген для кольцевой реакции с молоком: микробную массу культуры Вr.abortus (штамм №19) готовят, как для единого бруцеллезного антигена, инактивируют, устанавливают необходимую концентрацию микробных клеток, протравливают сульфатом железа, окрашивают в синий цвет гематоксилином, контролируют на стерильность, специфичность и активность.
Роз-бенгал антиген представляет собой суспензию бруцелл в буферном растворе (рН 3,6), инактивированных нагреванием и фенолом, окрашенных бенгальским розовым в малиново-розовый цвет.
Флуоресцирующая бруцеллезная сыворотка: готовят из позитивной бруцеллезной сыворотки, глобулины которой метят флуоресцеинизотиоцианатом.
Позитивная бруцеллезная сыворотка: получают гипериммунизацией животных-продуцентов. Используют для контроля при постановке серологических реакций (РА, РСК и др.), а также серологической идентификации бруцелл.
Диагностический аллерген бруцеллин представляет собой стерильную, прозрачную, желтоватого цвета жидкость, содержащую продукты жизнедеятельности бруцелл и вещества, извлеченные из них
Диагноз на бруцеллез ставят на основании микробиологического и серологического (РА, РСК, РДСК, РБП) исследований с учетом эпизоотических, клинических и патологоанатомических данных.
Диагноз на бруцеллез можно поставить также аллергическим методом: бруцеллизатом у овец и коз. Препараты (аллергены) вводят внутрикожно. На месте инъекции у больных животных появляется припухлость - реакция на введение аллергена.