Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Зміст
Вступ
1. Загальна теорія поглинання світла молекулами.
2.Апаратура для вимірювання поглинання у видимому та ультрафіолетовому світлі.
2.1Спектрофотометри.
3.Методика спектрофотометричних вимірювань.
4.Фактори, що впливають на абсорбціонні властивості хромофора.
4.1Ефект рН.
4.2Ефект полярності.
4.3Ефекти орієнтації.
5.Застосування абсорбційної спектроскопії у видимій і УФ-областях спектра.
5.1Приклад 1. Вимірювання концентрації.
5.2Приклад 2. Дослідження хімічних реакцій.
5.3Приклад3. Спектрофотометричне титрування білків.
5.4Приклад 4. Асоціація білка .
5.5Приклад 5.Пертурбація розчинником нуклеїнових кислот.
6.Поглинання поляризованого світла.
7. Інфрачервона спектроскопія .
7.1 Методика вимірювань.
7.2Інформація, що міститься в інфрачервоних спектрах.
8.Виявлення фальсифікації органічних лікарських речовин ,випробування на чистоту спектрофотометрією в ультрафіолетовому спектрі. Інфрачервоні спектри поглинання та їх застосування для ідентифікації лікарських речовин.
Висновки.
Список використаної літератури
Вступ
До фізичних та фізико-хімічних методів дослідження відносяться: визначення температур плавлення і кристалізації, а також температурних меж перегонки; визначення густини, показників заломлення (рефрактометрія), оптичного обертання (поляриметрія); спектрофотометрія - ультрафіолетова, інфрачервона; фотоколориметрія, емісійна та атомно-абсорбційна спектрометрія , флуориметрія, спектроскопія ядерного магнітного резонансу, мас-спектрометрія; хроматографія адсорбційна, розподільча, іонообмінна, газова, високоефективна рідинна; електрофорез (фронтальний, зональний, капілярний); електрометричні методи (потенціометричне визначення рН, потенціометричне титрування, амперометричне титрування, вольтамперометрія).
Спектрофотометрія– це сукупність методів визначення кількісних характеристик монохроматичного випромінювання. Спектральна фотометрія дає методи отримання спектрів випромінювання, відбивання, пропускання, поглинання і розсіювання. Вони виражаються графічними залежностями розподілення відповідних величин за довжинами хвиль або частотами випромінювання.
Спектрофотометрія (абсорбційна) фізико-хімічний метод дослідження розчинів і твердих речовин, заснований на вивченні спектрів поглинання в ультрафіолетовій (200-400 нм), видимої (400-760 нм) та інфрачервоній (> 760 нм) областях спектра. Основна залежність, яка вивчалася в спектрофотометрії залежність інтенсивності поглинання падаючого світла від довжини хвилі.
Спектрофотометрія широко застосовується при вивченні будови і складу різних сполук (комплексів, барвників, аналітичних реагентів тощо), для якісного і кількісного визначення речовин (визначення слідів елементів в металах, сплавах, технічних об'єктах, лікарських препаратах).
1.Загальна теорія поглинання світла молекулами.
Світлова хвиля складається із взаємно перпендикулярних електричного і магнітного полів ,амплітуди яких по мірі розповсюдження змінюються по синусоїді (рис 1-1).
Рис1-1.Розповсюдження електромагнітної хвилі в просторі. Вектори Е і Н взаємно перпендикулярні.
Енергія хвилі Е рівна:
де h- постійна Планки ,c швидкість світла , λ- довжина хвилі,v- частота .Коли хвиля стикається з молекулою вона може або розсіюватися або ж поглинатися .Якщо відбулося поглинання електромагнітної енергії світла ,то про молекулу говорять що вона збудженна , або перейшла в збуджений стан .Молекула або частина молекули ,яка може бути збуджена шляхом поглинання світла в видимій і ближній УФ- області ,називається хромофором .Зазвичай енергія збудження перетворюється в тепло (кінетичну енергію) в результаті зіткнення збудженої
молекули з іншою молекулою (наприклад, молекулою розчинника). У випадку деяких молекул вона знову випромінюється
У двох випадках інтенсивність світла, що пройшла через молекулу, що містить набір хромофорів, менше інтенсивності падаючого світла.
Збуджена молекула має набір дискретних квантових енергетичних станів, що описуються законами квантової механіки. Ці стани називаються енергетичними рівнями молекули. Головні енергетичні рівні визначаються можливим просторовим розподілом електронів і називаються електронними енергетичними рівнями; на них накладаються коливальні рівні, які вказують на різні типи коливань. Енергетичні рівні зазвичай описуються схемою енергетичних рівнів (рис. 1-2). Самий нижчий електронний рівень називається основним станом , а всі інші - збудженими. Поглинання енергії відбувається з найбільшою ймовірністю тільки в тому випадку, якщо кількість поглинальної енергії відповідає різниці енергій квантових станів .
Рис1-2 . Відстань між електронами і ядрами або між атомами в молекулі.
Типова схема енергетичних рівнів, на якій відображено основний стан (1) і перший збуджений стан (2). Тонкими горизонтальними лініями показані коливальні рівні (3).Довша стрілка вказує на можливий електронний перехід між основним станом і четвертим коливальним рівнем першого збудженого стану. Коротша стрілка означає перехід з одного коливального рівня на другий в межах основного стану. Зміна енергетичного стану при випущенні або
поглинанні кванта називається переходом .Спрощено перехід між електронними енергетичними рівнями відповідає енергії , необхідної для переміщення електрона з одної орбіталі на іншу. На схемі енергетичних рівнів переходи зображаються вертикальними стрілками. Залежність імовірності поглинання від довжини хвилі називається спектром поглинання . Завдання абсорбційної спектроскопії полягає в накопиченні та аналізі даних по поглинанню. Якби всі переходи відбувалися тільки між найнижчими коливальними рівнями основного стану та першого збудженого стану, тоді спектр поглинання складався б з вузьких, дискретних ліній. Однак, оскільки можливі переходи з основного стану на будь коливальний і обертальний рівні першого збудженого стану, а лінії мають кінцеву ширину, то спектр проявляється у вигляді відносно плавної кривої.Для більшості молекул довжини хвиль, відповідних переходів між основним станом і будь-яким коливальним рівнем
Рис 1-3.Частина електромагнітного спектра, використовувана для досліджень в області фізичної біохімії.
першого збудженого стану, лежать в ультрафіолетовій і видимій області спектра. Можливі також низькі за енергією переходи між коливальними рівнями в межах одного електронного рівня. Ці переходи відбуваються в результаті поглинання випромінювання в інфрачервоній області. На рис. 14-3 показана частина електромагнітного спектра на якій позначені переходи, які виникають при поглинанні випромінювання в різних діапазонах частот.
Імовірність переходу при одній довжині хвилі характеризується молярним коефіцієнтом поглинання при цій довжині хвилі. Щоб визначити цей параметр, розглянемо, як він вимірюється. Якщо світло інтенсивності I , проходить через розчин з товщиною шару d і концентрацією с, інтенсивність про ходячого світла I підкоряється закону Ламберта - Бера:
(3)
де - молярний коефіцієнт погашення .Результати вимірювання виражають або як відсоток пропускання (100х -), або, набагато частіше, як поглинання А (lg ). Коли d = 1 см, А називають ОD або оптичною щільністю,
Рис 1-4.
Позитивне і негативне відхилення від закону Бера та причини відхилень .
a - спектральний зсув, пов'язаний зі зростанням концентрації, часто в результаті
полімерезаціі . Зазначимо, що при довжині хвилі λ2 не спостерігається зміни молярного коефіцієнта погашення при зміні концентрації , б - крива, що показує відхилення від закону Бера. При відхилення позитивне (1), при λ3 - негативне (2). індекс λ вказує довжину хвилі, при якій проводиться вимірювання. Оптичною щільністю зручно користуватися, так як вона
дорівнює E*C.
2.Апаратура для вимірювання поглинання у видимому та ультрафіолетовому світлі.
2.1Спектрофотометри
Вимірювання поглинання в ультрафіолетовій і видимій областях проводиться на фотоелектричних спектрофотометрах. У Радянському Союзі випускалися однопроменеві, призмові , не регіструючі прилади СФ-4 і СФ-4А для вимірів в ультрафіолетовій, видимій та ближній інфрачервоній областях спектру (від 220 до 1100 нм), не регіструючий прилад з дифракційними решітками СФД-2 для вимірювань від 220 до 1100 нм, однопроменевий, призменний спектрофотометр СФ-5М для вимірювань від 380 до 1100 нм, і двопроменеві, призмові, реєструючі прилади СФ-2М і СФ-10 для вимірів у видимій частині спектру від 400 до 750 нм.
За кордоном і в сучасній Україні використовуються реєструючі спектрофотометри типу Бекман (США), Перкін-Елмер (США), Уніка (Англія), Хілгер-Увіспек (Англія), Цейс (НДР) та інші серійні прилади.
Основними частинами будь-якого спектрофотометра є :
1.джерело безперервного випромінювання;
2.монохроматор;
3.кювета для аналізованого розчину;
4. детектор ;
5. реєструючий пристрій.
Оптична схема найпростішого спектрофотометра наведена на рис. 2.:
Рис.2 Оптична схема простого спектрофотометра.
1.джерело випромінювання;2.дзеркало;3.вхіднаі вихіднащілини,4.дзеркало;5.призма;6.поворотнедзеркало,7.кювета,8.фотоелемент.
Як джерело випромінювання в приладах найбільш широко використовуються газорозрядна воднева лампа і вольфрамова лампа розжарювання.
Газорозрядна воднева лампа забезпечує суцільний спектр в ультрафіолетовій області і особливо зручна для вимірів від 200 до 350 нм.
Вольфрамова лампа розжарювання використовується для роботи в ближній ультрафіолетовій області, видимої та ближньої інфрачервоної області, тобто в межах від 320 до 3000 нм. Ртутні лампи забезпечують дуже високу інтенсивність в ультрафіолетовій і видимій областях, даючи інтенсивну лінію спектру ртуті і суцільне випромінювання. Ртутні лампи необхідно нагрівати протягом 15 хвилин, перш ніж вони почнуть давати постійне випромінювання. Недоліком є висока температура, яку ртутна лампа набуває при роботі.
Ксенонові розрядні лампи застосовуються в ряді приладів для вимірювань в області від 200 до 900 нм.
Монохроматор пристосування для ізолювання дуже вузької смуги випромінювання; з джерела світла. Змішане випромінювання проходить через щілину в монохроматор, в якому промінь розкладається на спектр за допомогою призми або дифракційної решітки. Цей спектр фокусується на вихід щілини. Шляхом обертання призми або дифракційної решітки можна виділити певну частину спектру, яка через щілину направляється в кюветне відділення, де знаходиться розчин досліджуваної речовини.
Кут відхилення між початковим напрямком променя і напрямом, в якому він проходить через призму, залежить від показника заломлення матеріалу, з якого зроблена призма. Показник заломлення будь-якого матеріалу змінюється в залежності від довжини хвилі, що визначається наступним рівнянням:
n = n0 + C / (λ — λ0),
де n — показник заломлення при визначеній довжині хвилі;
λ — довжина хвилі;
C; n0; — константи.
Отже, коли промінь немонохроматичним радіації входить у призму, які становлять його довжини хвиль відхиляються під різними кутами. Той же процес повторюється при виході променя з призми. Таким чином, виходить спектр, в якому короткі хвилі відхиляються від їх початкового напрямку більше, ніж довгі.
Кутова дисперсія - це зміна кута диспергованого променя зі зміною довжини хвилі. Дисперсія не змінюється лінійно залежно від довжини хвилі.
Роздільна сила призми визначається здатністю інструмента розділяти дві спектральні лінії, що відрізняються на довжину хвилі dλ.
R = λ / dλ = t * dn / dλ
де λ-середня довжина хвилі двох ліній, незначно відрізняються один від одного;
dλ - відмінність в довжинах хвиль двох ліній;
t - товщина основи призми;
n - показник заломлення призми.
Матеріал, з якого виготовляються призми, вибирається з розрахунком отримання максимальної дисперсії і хорошою пропускною здатністю в певній області спектра. Призми зі скла використовуються у видимій області, з кварцу - в ультрафіолетовій і ближній інфрачервоній області. Призми в порівнянні з дифракційними решітками забезпечують чистіший спектр.
Дифракційні гратки дешевші, ніж призми, і можуть бути використані для всіх областей спектра, так як пропускна здатність в даному випадку не має визначального значення. Дифракційна решітка складається з великої кількості паралельних ліній, нанесених на скло або на поверхню металу. Спектри, одержувані з дифракційними решітками, не так чисті, як призмові, тому, що утворюється спектр більш ніж одного «порядку».
Коли світло відбивається від дифракційної поверхні, спектри утворюються на обох сторонах перпендикуляра у відповідності з наступним рівнянням:
n * λ = d * (sin i + sin Θ),
де n - порядок спектра;
λ - довжина хвилі;
d - відстань між лініями дифракційної решітки;
i - кут падіння;
Θ - кут дифракції.
Дисперсія від дифракції залишається практично постійною при зміні довжини хвилі, а роздільна сила решітки визначається порядком спектра і числом ліній на освітленій частині дифракційної решітки.
R = n * N,
де R - роздільна сила решітки;
n - порядок спектра;
N - число ліній.
Роздільна сила також залежить від якості дифракційної решітки. Будь-які недоліки в точності нанесення ліній можуть привести до появи кілька зміщеного зображення ліній. Зазвичай отримують спектр дещо вищого порядку, ніж очікуваний.Для обох систем диспергування світла необхідні колімінуючі та фокусуючі лінзи або дзеркала, зазвичай комбіновані з диспергуючим пристроєм.У абсорбційній спектроскопії застосовуються кювети різних розмірів, виготовлені з кварцу або скла. Як і призми, кювети зроблені з матеріалу, що володіє високою пропускною здатністю в певної частини спектра. Кварцові кювети придатні для вимірювань як ультрафіолетової, так і у видимій області; скляні ж можуть бути використані тільки у видимій області.
Товщина шару в кюветах коливається від 0,1 до 10 см. Найчастіше вимірювання проводять в кюветах з товщиною шару 1 см. Важко робити кювети, абсолютно ідентичні за пропускною здатністю, тому одну і ту ж кювету зазвичай використовують тільки для розчинника. Поправка на різне поглинання кювет визначається шляхом порівняння поглинання обох кювет, наповнених чистим розчинником.Слід звертати увагу на чистоту кювет та стан їх оптичної поверхні, так як обидва ці чинники впливають на показання поглинання.Для вимірювання поглинання світла необхідно фотометричний пристрій. Застосовувані для цих цілей фотоелементи, фотоемісійні лампи і фотопомножувачі засновані на відомому ефекті переходу світлової енергії в електричну.Фотоелементи дають відносно сильний струм, який може бути визначений за допомогою гальванометра. Фотоелементи найчастіше застосовуються в фотоелектроколориметр.
Фотоемісійні лампи - це розріджені трубки, що містять два електроди, один з яких при опроміненні випускає електрони, так як покритий світлочутливим матеріалом (лужний метал, нанесений на шар окису срібла або сурми). Виникає при цьому струм дуже слабкий, тому необхідно застосовувати підсилювальні пристрої.
Емісійні лампи застосовують по наступних основних причинах. Внаслідок низького внутрішнього опору посилення струму в фотоелементі утруднено. В спектрофотометрі використовується більш вузький промінь світла, ніж у колориметрі, завдяки чому струм у фотоелементі був би занадто слабкий для вимірювання. Потік фотоелемента, який піддається постійному висвітленню, повільно знижується в часі. Нарешті, спектральна відповідь фотоелементів обмежується видимою частиною спектра, фотоелементи майже марні в ультрафіолетовій області.Природа покриття визначає область хвиль, в якій емісійна лампа може бути використана (від 300 до 500 нм для шару металевого натрію і від 200 до 700 нм для шару калію).Фотопомножувачі пристроїв є подальшим розвитком фотоемісійних ламп. Первинні електрони, що випускаються фоточутливим електродом, спрямовуються на наступний електрод, який в свою чергу випускає кілька електронів на кожен падаючий на нього електрон і т. д. Після низки таких етапів вдається значно посилити струм при збереженні дуже невеликої величини початкового струму.
3. Методика спектрофотометричних вимірювань
Існує два типи спектрофотометрів: однопроменеві і двопроменеві. У однопроменевий приладі промінь світла, що виходить з монохроматора, проходить через одну кювету і потім потрапляє в детектор. Визначення поглинання роблять у такий спосіб. Спочатку прилад встановлюють на нуль проникання(нескінченна величина поглинання) з детектором в темряві, що робиться для компенсації слабкого струму, який є навіть за відсутності випромінювання і виникає внаслідок емісії теплових електронів. Потім в промінь поміщають кювету, що містить розчинник, і прилад встановлюється для вимірювання в одиницях проникнення (нуль поглинання) при певній довжині хвилі. Після чого, кювету з розчинником замінюють кюветою з розчином досліджуваної речовини і виробляють вимір.За цією методикою вимірюють два фотоструми - один пропорційний інтенсивності променя, що пройшов через розчинник, і другий - пропорційний інтенсивності променя, що пройшов через розчин речовини. Щоб співвідношення цих струмів були еквівалентні проникності, треба джерело випромінювання і детектор залишати постійними в межах, коли проникність встановлена на одиницю і коли проникність зменшується при вимірюванні поглинання речовини. Отже, особливу увагу необхідно звертати на постійну напругу, що подається на лампу.У двохпроменевій спектрофотометрії ця проблема вирішена наступним чином. Випромінювання, що виходить з монохроматора, розділяється на два промені, що мають однакові інтенсивності і спектральні розподіли. Один з променів проходить через кювету з розчинником, інший - через кювету з досліджуваним речовиною. На відношення випромінювань, що виходять з обох кювет, величина джерела світла не робить ніякого впливу. Ставлення випромінювань може бути виміряна двома способами.Промені, що вийшли з кювет, спрямовуються на катоди двох фотоемісійних ламп або фотопомножувач. Виходи цих детекторів пов'язані серією опорів, посилюють різницю між двома фотоструму і реєструють величину поглинання. Зручністю двопроменевих приладів є можливість реєстрації показань.У приладах з одним детектором промені, що виходять з двох кювет, спрямовуються на ту ж частина катода однієї лампи. За допомогою обертового непрозорого диска промені розбиваються на окремі порції. Таким чином, на детектор падає випромінювання, інтенсивність якого змінюється в межах I і I0, і його вихід змінюється з тією ж швидкістю, що і швидкість обертання диска. Це створює напругу, амплітуда якого буде пропорційна різниці в інтенсивності двох променів. Подальше вимір напруги, відповідного інтенсивності променів, залежить від конструкції приладу.Зазвичай для отримання спектрів потрібно від 0,1 до 100 мг речовини в залежності від молярного коефіцієнта поглинання. Розчини, що застосовуються в спектрофотометрії, є дуже розведеними, що обумовлює необхідність точного зважування зразка і точного відмірювання розчину при наступних розведеннях. Підходящої для вимірювань концентрацією є та, яка забезпечує показання поглинання між 0,2 і 0,7, що відповідає проникнення від 65 до 20%.Певне підвищення точності спектрофотометричного аналізу досягається шляхом, так званої диференціальної фотометрії. Цей метод заснований на порівнянні поглинання невідомого розчину і поглинання стандартного розчину, останній підібраний таким чином, що різниця в поглинаннях буде знаходитися в межах, в яких вимір може бути виконано з достатньою точністю. Диференціальний спосіб прийнятий Скандинавської фармакопеєю в якості основного методу для спектрофотометричних визначень.Відповідно до одного з варіантів диференціального методу, званого іноді ДЕ або Δε методом, вимірювання проводиться шляхом порівняння. Невідомої речовини при певній величині рН до тієї ж концентрації речовини, але при іншій, відмінній від першої, величиною рН. Наприклад, для визначення фенолів розводять частина розчину лужним, буфером, а іншу частину кислотним буфером. Вимірюють поглинання лужного розчину, використовуючи для порівняння кислотний розчин. Розраховують вміст фенолів, застосовуючи ДЕ значення, знайдене для чистої речовини в тій же парі буферних розчинів.Таким чином визначається зміст гексахлорофен в рідкому милі по Фармакопеї США XVII. Так як ряд речовин не показує змін до спектральних характеристиках при зміні рН, диференційний метод для фенолів можна вважати більш специфічним, ніж хімічний метод.
4.Фактори, що впливають на абсорбціонні властивості хромофора.
Спектр поглинання хромофора визначається в першу чергу хімічною структурою молекули. Однак λ макс. і E зазнають помітних змін і під впливом оточення . Мається на увазі вплив рН, полярності розчинника або сусідніх молекул і відносна орієнтація сусідніх хромофорів. Саме ці фактори лежать в основі використання абсорбційної спектроскопії для характеристики макромолекул.
Вплив оточення полягає в наступному:
4.1Ефект рН. рН розчину визначає іонну форму іонізуючих хромофорів. На рис. 4-1 показаний приклад ,зображений вплив рН на спектр тирозину.
Рис.4-1.
Спектр поглинання тирозина при рН 6 і 13.Відмітим що, як λ Макс ,так і Е збільшується при дисоціації ОН-групи фенольного залишку
4.2Ефект полярності. У разі полярних хромофорів часто справедливо (особливо якщо молекула містить О, N або S), що λ макс спостерігається при більш коротких довжинах хвиль у полярних розчинниках , що містять гідроксил (Н2О, спиртах), ніж у
неполярних. Приклад наведено на рис. 4-2.
Рис 4-2.
Вплив полярності розчинника на спектр поглинання тирозина .
4.3Ефекти орієнтації. Величини λ макс. і Е істотно залежать від геометричних особливостей молекул. Найбільш відома гіпохромія нуклеїнових кислот, тобто зниження коефіцієнта погашеня нуклеотиду , за умови, що нуклеотид входить до складу одноланцюгового полінуклеотіду , в якому нуклеїнові основи зближені і розташовані один над одним . Подальше пониження Е спостерігається для двох спіральних полінуклеотидів , так як основи в цьому випадку ще більш впорядковані.
Це показано на рис. 4-3.В результаті досліджень великої кількості біологічно важливих з’єднань і макромолекул, структура яких добре
відома для різних умов, зібраний ряд емпіричних фактів, які можуть бути названі робочими правилами абсорбціонної спектроскопії в біохімії. Вони наведені в табл. 1
Рис 4-3.
Спектри поглинання ДНК фага Т7 в двоколірній(1) і одноколірній(2) формах ,а також після гідролізу до вільних нуклеотидів (3),що показує пониження оптичної щільності .
ТАБЛИЦЯ 1.
Емпіричні правила інтерпретації спектрів поглинання біологічних
макромолекул
1. Якщо амінокислоти; триптофан, тирозин, фенілаланін і гістидін - переміщуються в менш полярне оточення, λ макс І Е зростають.
а. Якщо в знятому в полярному розчиннику спектрі амінокислоти, знаходяться у складі білка, спостерігаються великі λ макс і Е, чим ті ж величини для вільної амінокислоти в тому ж розчиннику, то ця амінокислота знаходиться у внутрішній області білка («схована ») і оточена неполярними амінокислотами.
б. Якщо спектр білка чутливий до зміни полярності розчинника, амінокислота, для якої спостерігаються зміни λ макс і Е, повинна розташовуватися на поверхні білка.
2. У разі амінокислот λ макс і Е завжди зростають, коли титруєма
група (наприклад, ОН тирозину і SH цистеїну) заряджена. Отже:
а. Якщо не спостерігається змін в спектрі однієї з цих амінокислот,
а рН таке, що мала б відбуватися іонізація вільної амінокислоти, то вона повинна бути захована в неполярній області молекули білка.
б. Якщо значення рК іонізуючої групи амінокислоти, визначене за зміни спектра при зміні рН, таке ж, як для вільної амінокислоти в розчині, то ця амінокислота знаходиться на поверхні білка.
в. Якщо значення рК, визначене за зміни спектра при зміні рН, істотно інше, то ця амінокислота, ймовірно, знаходиться в дуже полярному оточенні (наприклад, тирозин, оточений карбоксильними групами).
3. Величина Е пуринів і піримідинів знижується у міру того, як плоскості їх кілець стають паралельними і кільця зближуються один з другим . Величина Е знижується в наступному ряді : вільна основа > основа в складі одноланцюгового полінуклеотида, що не має сгекінга > основу в складі одноланцюгового полінуклеотиду зі стекінгом > основа у складі двохланцюгового полінуклеотида.
5.Застосування абсорбційної спектроскопії у видимій і УФ-областях спектра.
Вимірювання поглинання проводиться для багатьох цілей: визначення концентрації речовини, аналізу деяких хімічних реакцій, ідентифікації речовин та визначення структурних параметрів макромолекул. Всі ці галузі застосування розглядаються в наступних прикладах.
5.1Приклад 1. Вимірювання концентрації.
Найбільш часто через вимірювання поглинання проводять для визначення концентрації .Це можна робити, якщо відомий молярний коефіцієнт погашення і дотримується закон Бера. Наприклад, для двохланцюгового ДНК D260 = 1 відповідає 50 мкг / мл (ця величина залежить від нуклеотидного складу) . Оскільки закон Бера дотримується
принаймні до D = 2 (яка наближається до межі для більшості спектрофотометрів), легко підрахувати концентрацію, а саме: D, рівна 0,5, відповідає 25 мкг / мл, D, рав-_
ная 0,1, відповідає 5 мкг / мл і т. д.
Іноді досліджуваний матеріал складається з частинок, поглинаючого світла і утворюють швидше суспензію, ніж розчин; наприклад : у разі бактеріофагів, поглинання майже цілком визначається вмістом у них ДНК .Бактеріофаги не тільки поглинають , але також й розсіюють світло (релляївське розсіювання) і,
отже, можуть мати штучно завищене поглинання. Однак, вимірюючи поглинання при ряді довжин хвиль, далеких
від λ макс, можна зробити поправку на розсіювання. Так як розсіяння змінюється пропорційно λ -4, можна побудувати залежність вимірюваного поглинання від λ -4 і, екстраполюючи лінійну частину цієї кривої (де все спостережуване поглинання обумовлене розсіюванням) до λ макс, внести поправку в вимірюване поглинання, що дорівнює величині, обумовленої розсіюванням. Приклад такої поправки зображений на рис. 5.
Рис. 5.
Це зручний метод визначення вмісту нуклеїнової кислоти в бактеріофага; враховується також те, що D260 (з поправкою на розсіювання) = 1
відповідає концентрації ДНК 50 мкг / мл.
Концентрацію бактерій також часто визначають спектрофотометричним методом , хоча при використовуваних довжинах хвиль все поглинання обумовлено розсіюванням. У цьому випадку замість поправки на розсіювання проводиться співставлення спостережуваної оптичної щільності з кількістю життєздатних клітин
і будується калібрувальна крива. Таким шляхом, як показано на рис. 5-1, вдається точно визначити концентрацію клітин або сухої маси на одиницю об'єму.
Рис .5-1.Концентрація бактерій , визначена шляхом вимірювання оптичної щільності .
5.2Приклад 2. Дослідження хімічних реакцій.
В ході реакції має змінюватися поглинання одного із реагентів. Розглянемо вимір активності ферменту-галактозидази. Ця методика широко використовується в молекулярній біології при вивченні функціонування лактозного оперону. Цей фермент розщеплює 0-нітрофенілгалактозид (ОНФГ) з утворенням о-нітробензолу, який можна визначити за його поглинання при 420 нм. Так як, в деякому інтервалі, швидкість реакції пропорційна концентрації ферменту, з нахилу кривої залежності D від часу гідролізу (рис. 5-2) можна визначити кількість
ферменту.
Рис. 5-2 .Час після додавання стимулятора.
Вивчення синтезу -галактозидази шляхом вимірювання D420 продукту гідролізу о-нітрофенілгалактозида (ОНФГ). Три культури : Lac-,Lac+ і диплоїд ,містить дві копії генів lас, вирощувалися в гліцерин-сольовому середовищі.При t = O був доданий стимулятор синтезу -галактозидази. Через відмінні проміжки часу брали проби і обробляли толуолом для того,щоб вбити клітини і відокремити фермент, потім був доданий ОНФГ. Через тридцять хвилин була виміряна D420. У результаті цього досвіду показано, що клітини Lac-не продукують фермент, а диплоїд продукує приблизно в два рази більше, ніж гаплоїди.
5.3Приклад 3. Спектрофотометричне титрування білків.
При багатьох дослідженнях структури білків виникає необхідність визначення величини рК дисоціації протонів іонізуючих бічних груп амінокислот, оскільки ці величини вказують на локалізаuію амінокислоти у білку (правило 2 в табл. 14-2). Це часто можна зробити спектрофотометрично, так як при дисоціації часто змінюється спектр одного з хромофорів (наприклад, у випадку тирозину).Розглянемо гіпотетичний тирозиновмістимий білок і для визначеня числа зовнішніх тирозинових залишків скористаємося правилом 2 (табл. 14-2). Припустимо, що в цьому білку міститься п'ять тирозинових залишків. Якщо всі вони розташовані на
поверхні і іонізуются при збільшенні рН, спектр, відповідаючим залишками тирозину, буде наближатися до спектру вільного тирозину при високих значеннях рН, (правило 2 б). Іншими словами, залежність D295
(λ макс для іонізованої форми) від рН буде виглядати, як
крива А на рис.5-3. Коли ж, навпаки, три тирозинових залишки розташовані всередині в неполярному оточенні, отримана крива аналогічна кривій Б (правило 2а); відношення величини першого плата до кінцевої величини ,що дорівнює 2 / 5. Зазначимо, що при дуже високих рН на кривій видно велике зростання D295. Це вказує на те, що внутрішні тирозинові залишки стали доступні розчиннику, тобто білок денатурувував.
Криві титрування тирозина при будуванні яких використовували Е295.Гипотетичний білок складається з 5 тирозинових залишків.
А-всі 5 залишків находяться на поверхні ; Б-2 залишки на поверхні ,а 3 в середині ,в неполярному оточенні ;В-3 внутрішніх залишки знаходяться в полярному оточенні і доступні розчиннику.Якби три внутрішніх тирозинових залишки були в полярному оточенні, то отримали б криву, схожу на криву В, яка вказує, що ці три залишки мають значення рК (правило 2в).
5.4Приклад 4. Асоціація білка .
Зміна спектрів в процесі асоціації білка можуть бути викликані тим ,що хромофори розташовані на поверхності попали в площину зєднання і стали недоступні розчиннику .По спектральним випромінюванням можна контролювати наявність взаємозв’язку молекул білка і визначати умови ,кінетику цього процесу.
Рис .5-4.
Цей процес можна вивчати з допомогою диференціальної спектроскопії; в цьому випадку для отримання диференціального спектра використовують два розчини ,які ідентичні у всьому ,крім концентрації.
5.5Приклад 5.Пертурбація розчинником нуклеїнових кислот .
Заміна води на 50%-ну D2Oпризводить до характерних змін в спектрах мононуклеотидів ,та не впливає на спектри пар оснований .Таким чином ,зміни в спектрі НК в 50%-ній D2O можна використати для оприділення долі основаній ,які не беруть участі в утворенні пар .Це важливо при вивченні таких молекул ,як транспортна РНК (тРНК).В тРНК послідовність основаній така що не всі вони утворюють вуглецеві зв’язки ; можна побудувати просторові моделі,в яких реалізується частина вуглецевих зв’язків (рис.5-5).Згідно різним моделям потрібно щоб різне число основаній було зв’язане вуглецевими зв’язками ;спектральні дані дозволяють виключити деякі можливі моделі .
Рис.5-5.
Дві із декількох можливих структур алланінової тРНК ,збудованих таким чином ,що більша частина основ бере участь в утворенні вуглецевих зв’язків .Вуглецеві зв’язки пари G*C позначена суцільною лінією ,пари А*U – точками ,більш слабшими ніж вуглецеві зв’язки ,другі пари позначенні хвилеподібною лінією .
6.Поглинання поляризованого світла.
Площина поляризації електромагнітної хвилі визначається як площина вектора Е (мал. 14-1, див. також гл. 16, де більше повно описується поляризація і виникнення плоскополяризованого світла). Звичайний промінь світла не поляризований, тому що його можна представити як набір хвиль з випадково орієнтованими площинами поляризації. Однак плоскополяризоване світло можна отримати, або пропускаючи світло через різні речовини, або шляхом відображення від поверхні під критичним кутом. Всі хромофори мають принаймні одну вісь, вздовж якої переважно поглинається плоскополяризоване світло. Наприклад, ймовірність поглинання світла гексаметилбензолом, являючи собою симетричне плоске кільце максимальне, коли вектор Е знаходиться в площині кільця, і дорівнює нулю, коли він перпендикулярний цій площині. Якщо в молекулі є осі симетрії різної довжини, як у випадку плоскої молекули нафталіну,то поглинання відбувається тільки тоді, коли вектор Е лежить в площині кільця. Цей ефект називається дихроїзмом ; він визначає різні значення величини Е для окремих напрямів. Його зручно використовувати, визначаючи орієнтацію молекул в біологічних системах. При дослідженнях макромолекул він найбільш часто використовується в інфрачервоній спектроскопії для визначення орієнтації окремих зв'язків по відношенню до осі молекули.
7. Інфрачервона спектроскопія
В результаті поглинання світла в ІЧ-області (від 103 до 105 нм)(Рис. 14-3) відбуваються переходи між коливальними рівнями основного стану молекули. Коливальні рівні і ІЧ.-спектри виникають за рахунок характеристичних рухів (розтягування зв'язків , зміни величини кутів між зв'язками і більш складних типів рухів) різних функціональних груп (наприклад, метильної, карбонільної, амідної і т. д.). Цінність спектрального аналізу в ІЧ-області обумовлена тим, що вид коливань кожної групи дуже чутливий до змін хімічної структури, конформації і оточення, і в цьому сенсі ІЧ-спектроскопія не відрізняється від спектроскопії у видимому й ультрафіолетовому світлі. Цей метод може застосовуватися для вивчення хімічних груп, які не можна досліджувати з допомогою абсорбційної спектроскопії в ультрафіолетовому і видимому світлі.
7.1 Методика вимірювань
Підготовка зразка для аналізу є найбільш важливим моментом при визначеннях в інфрачервоній області спектра. Адже розчинники мають характерне інфрачервоне поглинання, дещо ускладнює методику. Однак тверді речовини, які внаслідок розсіювання світла непридатні для ультрафіолетової і видимої області, широко застосовуються для інфрачервоної спектрофотометрії.
Енергія інфрачервоних фотонів на відміну від ультрафіолетової і видимої енергії незначна і структурні зміни під їх впливом зустрічаються дуже рідко.
Вимірювання поглинання в інфрачервоній області зазвичай проводять з розчинами, суспензіями в парафіновому маслі або з твердими речовинами у вигляді дисперсії з лужними галоідами.
Рідини вносять в прилад у вигляді капілярної плівки між двома пластинками кам'яної солі або в чистому вигляді в кюветі товщиною 1 мм або менше.
Тверді речовини та рідини можуть також вимірюватися в розчинах. Сірковуглець і чотирихлористий вуглець є найбільш придатними речовинами. Ці розчинники також мають свої характерні смуги поглинання, проте, якщо комбінувати різні розчинники, можна отримати спектр речовини по всій його області. З інших розчинників можуть бути рекомендовані хлороформ, тетрахлоретилен, метиленхлорид.
Для зменшення поглинання розчинника воліють використовувати концентровані розчини та кювети від 1 до 0,05 мм.
Розчинники, окрім хорошої пропускаємості, природно, не повинні взаємодіяти з розчиненою речовиною та з матеріалом, з якого зроблено кювету.
Якщо речовина має низьку температуру плавлення, кілька кристалів поміщають на пластинку солі і нагрівають в шафі. Коли речовина розплавиться, його накривають другою платівкою і, таким чином, отримують тонку плівку речовини. Залежно від температури, при якій підтримується кюветноє відділення приладу, можна отримати спектр речовини в рідкому або твердому стані.
Іноді концентрований розчин речовини в летючому розчиннику, ефір, хлороформ, спирт і т. п. наносять по краплях на платівку кам'яної солі. Після випаровування розчинника на платівці залишається плівка твердої речовини.
Найчастіше готують завись речовини в рідкому парафіні або дисперсію у вигляді дисків (таблеток) в лужному галоида.
Тверді речовини розтирають з невеликою кількістю парафіну (спектроскопічного якості) до отримання гомогенної суміші, яку потім поміщають між пластинками хлориду натрію і проводять вимір. Розсіювання світла при цьому залежить від розміру частинок речовини і відмінності в коефіцієнті заломлення досліджуваного речовини і парафінового масла. Підвищення гостроти і висоти смуг поглинання зростає зі зменшенням розміру частинок. В області вище 7 мкм для частинок розміром 3 мкм впливом цього чинника можна знехтувати. Найбільшому впливу розсіювання світла піддаються сильно виражені смуги поглинання.
Складові компоненти суспензії повинні мати. Близькі зміни коефіцієнта заломлення в інфрачервоній області, інакше близько смуги поглинання може виникнути асиметрична смуга поглинання зі зміщенням.
Недоліком вимірювань в рідкому парафіні є той факт, що поглинання вуглеводнів маскує смуги зв'язків С-Н досліджуваної речовини. Якщо необхідно вивчати специфічно цю область, рекомендують використовувати перфтор-гас або гексахлорбутадієн. Крім того, потрібен певний навик для отримання суспензій з низьким ступенем розсіювання і чіткістю смуг поглинання.
Для отримання дисперсії речовину розтирають з сухим дрібно подрібненим бромідом калію або хлоридом калію (спектроскопічної якості) стосовно до лужного галоіда 1:200. Частина суміші переносять в спеціальну матрицю, піддають дії вакууму (для видалення повітря) і пресують. Отриманий прозорий диск-таблетку поміщають у спеціальний утримувач і проводять вимірювання.
Слід бути обережним при оцінці спектрів твердих речовин, що існують у вигляді декількох кристалічних модифікацій, так як різні кристалічні форми мають різні інфрачервоні спектри. В деяких випадках існує також можливість фізичних або хімічних змін при розтиранні з парафіновим маслом або з лужним галоідом.
Труднощі, пов'язані з поліморфізмом, можуть бути подолані приготуванням розчинів стандарту і випробуваного речовини у відповідному розчиннику. Потім розчинник видаляють випарюванням, готують для кожного залишку нові диски, які потім піддають вторинному дослідженню.
Методика визначень з суспензіями або дисперсіями в лужному галоіда найчастіше використовується для поточного фармацевтичного аналізу.
При вивченні структур, однак, рекомендують проводити вимірювання в розчинах.
Інфрачервоні спектрофотометри реєструють на папері відсоток пропускання або поглинання по відношенню до хвильовому числу або довжині хвилі. Техніка вимірювань практично не відрізняється від подібної в ультрафіолетовій області.
Двопроменеві прилади забезпечують свідчення, вільні від впливу парів води і поглинання вуглекислого газу, і дають можливість компенсації поглинання розчинника при роботі з розчинами.
При диференціальних вимірах можна отримати спектр окремих смуг поглинання, менш помітних при звичайних визначеннях. Для цього основний компонент за аналогією з вимірюваннями в ультрафіолетовій області поміщають в контрольну кювету і в результаті компенсації основних показників спектру отримують спектр окремих вторинних функціональних груп.
Методика диференціальних визначень може бути застосована для випробування на чистоту, тому що при компенсації основних компонентів будь-яка домішка за умови, що в контрольній кюветі знаходиться більше очищене речовина, буде помітна на спектрі. Таким чином, можна виявити і кількісно виміряти до 0,05% домішок.
Той же спосіб можна застосувати для кількісного визначення лікарських форм, з яких важко витягти діючу речовину. Наприклад, при аналізі масляних розчинів, застосовуючи в якості контролю масло, можна отримати і виміряти смугу поглинання, характерну для досліджуваної речовини. Однак цей метод має обмежену цінність для фармакопейного аналізу внаслідок необхідності потрібно мати речовину певної якості для порівняння.
Труднощі, що виникають при диференціальних вимірах, обумовлені тим, що при сильному поглинанні в обох променях (вивчення структурних особливостей) цей метод може бути надзвичайно корисним.
7.2Інформація, що міститься в інфрачервоних спектрах
По-перше, необхідно відмітити що при зображені ІЧ-спектрів використовується хвильові числа 1/ λ або частоти v ,а не довжини хвилі. У термінах частот кожна, лінія в ІЧ-спектрі може бути охарактеризована частотою максимума поглинання (v-макс) ,шириною лінії на половині висоти v1/2 оптичної щільності ліній , отриманих коли електричний вектор світлової хвилі паралельний і перпендикулярний осі молекули . В результаті численних досліджень мономерів відомої структури тепер точно встановлено ,якій групі і якому типу коливання відповідає кожна полоса в спектрі. В випадку простих простих з’єднань ІЧ-спектрів відрізняються від спектрів в видимому і ультрафіолетовому світлі тим ,що вони складаються із вузьких ліній .(рис.7-2).Проте в випадку макромолекул настільки велике число типів зв’язків і так багато різних конформацій ,що кожна лінія зміщується в тій або іншій степені в залежності від положення відповідної групи в молекулі ,так що всі лінії перекриваються і внаслідок цього в спектрі знаходиться декілька відносно широких ліній .
рис.7-2.
ІЧ- спектри ДНК (1) і стеаринової кислоти (2).
8.Виявлення фальсифікації органічних лікарських речовин ,випробування на чистоту спектрофотометрією в ультрафіолетовому спектрі. Інфрачервоні спектри поглинання та їх застосування для ідентифікації лікарських речовин.
Спектрофотометрія в ультрафіолетовій області є одним з основних загальних методів аналізу лікарських речовин та їх препаратів, включених в будь-яку сучасну фармакопею.
Встановлення залежності між будовою речовин і їх електронними спектрами є складною проблемою, розгляд якої знаходиться поза межами даної роботи. Слід, однак, зупинитися на деяких закономірностях, що визначають характер спектрів.
Поглинання в ультрафіолетовій і видимій частинах спектра зазвичай пов'язують з наявністю в молекулі речовини певних груп - хромофорів. До них відносяться подвійні і потрійні вуглецеві зв'язки, карбонильна, карбоксильна, азо-, нітро-та інші групи. Відомо також, що деякі групи, не будучи хромофорною, збільшують інтенсивність забарвлення речовини - такі групи називають ауксохромними, або ауксохромами. Типовими прикладами ауксохромів можуть бути гідроксильна та аміногрупи.
Вплив різних замісників на характер поглинання зручно спостерігати при розгляді спектрів простих молекул. Інтерпретація спектрів органічних речовин, що мають складну будову, утруднена через присутність в молекулі більш ніж однієї хромофорної і ауксохромної групи. Часто певні групи хромофорів проявляються спектрально як єдиний комплекс. Так, наприклад, структура бензолу має характерні смуги поглинання при 200 і при 255 нм.
Якщо введення нової групи в молекулу речовини не зачіпає наявні хромофорної структури, то не станеться якоїсь значної зміни спектра. Тому ряд фармакопейних речовин (фенамін, ефедрин і лідол) мають типову смугу поглинання бензолу при 257 нм.
При введенні в бензольне ядро фенольної групи смуга поглинання зміщується до області 280 нм, де особливо зростає вплив розчинника, тому що є можливість утворення ауксохрома у вигляді - ВІН (кисла і нейтральне середовище) або О-(лужне середовище). Типовими прикладами одноатомних фенолів є морфін і естрадіол, і двоатомних фенолів - адреналін і ізопреналін.
Інтенсивне поглинання багатьох кетостероїдів повністю залежить від пов'язаною системи Золото А. Інші групи в молекулі не роблять впливу на характер спектра. Тому ряд стероїдів (преднізон, преднізолон, прогестерон, дезоксикортикостерону, гідрокортизон, кортизон і метилтестостерон) має подібний спектр з максимумом близько 240 ім.
Похідні барбітурової кислоти проявляють максимум при рН 7 внаслідок виникнення хромофорної групи:
Для ідентифікації невідомої речовини в органічній аналітичній хімії спектр досліджуваної речовини зазвичай порівнюють з отриманим при тих же умовах спектром речовини, будова якого відома.
Встановлення автентичності речовини по ультрафіолетового спектру є цінним доповненням до хімічних і фізико-хімічних методів фармакопейного аналізу. Далі ми розглядаємо деякі випадки поглинання в ультрафіолетовій області, використовувані поруч фармакопей для визначення автентичності органічних лікарських речовин.
Вказівка довжин хвиль при максимумах поглинання є лише орієнтовною характеристикою, так як не дає можливості судити про вид спектра.
0,002% розчин препарату в 0,01 Н розчині соляної кислоти в області від 220 до 350 нм має максимум поглинання близько 251 нм (Имизин, ГФХ).
В даному випадку, очевидно, слід або цілком проміряти зазначену область, що за відсутності реєструючого приладу вимагає значного часу, або зробити ряд вимірювань в області, близької до 251 нм, наприклад ± 10 нм, і встановити максимум.
Найчастіше призводять максимуми і мінімуми при певних довжинах хвиль і відповідні величини поглинання.
Ультрафіолетовий спектр розчину в 0,1 Н соляній кислоті має два максимуми - при 241 нм і при 291 нм, поглинання 0,001% розчину при товщині шару 1 см при 241 нм, близько 0,50 і при 291 нм, близько 0,67. (Антазоліна гідрохлорид, Міжнародна фармакопея, Друге видання).
Іноді величину поглинання виражають у вигляді питомої показника поглинання, Е (1%, 1 см).
Питомий показник поглинання, Е (1%, 1 см), при довжині хвилі 278 нм 290-305 (0,002% водний розчин) (Левоміцетин, ГФХ).
Якщо крива поглинання змінюється в залежності від pH розчину, вказують значення pH, при якому проводиться вимірювання.
Ультрафіолетовий спектр розчину в фосфатному буфері, pH 7,5, має максимум тільки при 252 нм, поглинання 0,0005 розчину при товщині шару 1 см близько 0,4 (Сульфафуразол, Міжнародна фармакопея, Друге видання).
Розчин в 0,01 н. їдкому натре має максимум при 326 нм, Е (1%, 1 см) - близько 65, і мінімум при 294 нм, Е (1%, 1 см) - близько 35.
Розчин в суміші 10 обсягів 0,1 Н соляної кислоти і 40 об'ємів 95% спирту, доведених водою до 100 мл, має максимум при 300 нм, Е (1%, 1 см) - близько 50, і мінімум при 275 нм, Е (1 %, 1 см) - близько 40 (Левотироксин-натрій, Скандинавська фармакопея).
Деякі фармакопеї замість абсолютних величин поглинання приймають ставлення адсорбції при максимумі до абсорбції при мінімумі, що дає можливість до певної міри судити про наявність поглинаючих домішок.
0,001% розчин препарату в 0,1 Н розчині їдкого натра має максимуми поглинання при 256, 283 і 365 нм. Відношення D при 256 нм до D при 365 нм становить 2,8-3,0 (Фолієва кислота, ГФХ).
Для феноксіметілпеннціілліна за тією ж фармакопеї проводять вимірювання наступним чином.
Близько 0,1 г препарату (точна наважка) розчиняють у 4 мл 5% розчину гідрокарбонату натрію, розводять водою до 500 мл і визначають оптичну щільність (D) при довжині хвилі 268 нм і при довжині хвилі 274 нм в кюветі з товщиною шару 1 см . Контрольним розчином служать 4 мл 5% розчину гідрокарбонату натрію , розведені водою до 500 мл.
Відношення D при довжині хвилі 268 нм до D при довжині хвилі 274 їм повинно бути не менше 1,21 і не більше 1,24.
У разі стандарту ідентифікація речовин зводиться до порівняння двох спектрів поглинання, отриманих при одних і тих же умовах.
Ультрафіолетовий спектр 0,0005% розчину у спирті має максимуми і мінімуми яри тих же довжинах хвиль, що н розчин стандарту, однакової концентрації і одночасно виміряний; відповідні величини поглинання, розраховані на суху речовину, при максимумі поглинання близько 281 нм не відрізняються більш ніж на 3% (Егінілестрадіол, Фармакопея США XVII).
Останній метод забезпечує найбільш достовірні результати і має бути рекомендований для фармакопейних випробувань на справжність.
Випробування на чистоту спектрофотометрією в ультрафіолетовому спектрі.
Метод спектрофотометрії в ультрафіолетовій області успішно використовується як для ідентифікації та кількісного визначення, так і у випробуваннях на чистоту.
Застосування ультрафіолетової спектрофотометрії для перевірки доброякісності фармакопейних препаратів є найбільш цінним у випадках, коли домішки або продукти розкладання поглинають в області, відмінній від досліджуваного речовини. Таким чином визначають зміст адреналона, що має максимум при 310 нм, в адреналіні, максимум поглинання при 278 нм.
Вказуються у фармакопейних статтях величини поглинання, що визначають граничний вміст домішки , встановлюються емпіричним шляхом.
3-оксіфенілтріметіламмоній бромід, супутній неостігміну броміду, має максимум при 294 нм.
Поглинання 0,05% розчину в 0,1 М карбонат натрію при 294 нм не більш 0,03 - межа вмісту 3 мг на 1 г (Неостнгмнн бромід, Скандинавська фармакопея).
Аналогічно визначається зміст гітоксін в дигітоксин з Міжнародної фармакопеї Другого видання.
Розчиняють близько 5 мг препарату (точна наважка) в 1 мл метилового спирту і доводять гліцерином або концентрованою соляною кислотою до обсягу 25 мл. Поглинання цього розчину після години стояння при 352 нм близько 0,28 (не більше 5%).
Межа змісту поглинаючих домішок може бути встановлена за величиною відносин абсорбції при різних максимумах. При аналізі ціаіокобаламіна по Державній фармакопеї X видання визначають оптичну щільність (D) розчину, приготованого для кількісного визначення в кюветі з товщиною шару 1 см при довжинах хвиль 278, 361 і 548 нм.
Відношення D при 361 нм до D при 548 нм повинно бути від 3,0 до 3,4.
Відношення D при 361 нм до D при 278 нм повинно бути від 1,7 до 1,88.
Вивчення ультрафіолетових спектрів є цінним при випробуваннях на чистоту і при дослідженнях стабільності лікарських засобів, якщо зміни в характері спектра дозволяють судити про зміни і перетвореннях речовини.
Інфрачервоні спектри поглинання та їх застосування для ідентифікації лікарських речовин.
Оцінення інфрачервоних спектрів поглинання є більш складною, ніж ультрафіолетових, внаслідок великої кількості смуг, що в той же час складає основу ідентифікації речовини (рис. 8).
рис.8 ІЧ –спектр метилтестостерона ,дисперсія в броміде.
Для інтерпретації спектрів зазвичай використовують наявні дані про зв'язок між інфрачервоними смугами поглинання і структурними елементами молекул. Такі дані зводяться, як правило, у вигляді кореляційних таблиць-діаграм.
В області від 2,5 до 6,5 мкм за допомогою таблиць по сильному та середньому поглинанню можна з певною точністю ідентифікувати певну функціональну групу. Інфрачервоні смуги поглинання, що відповідають валентним коливанням С-Н, знаходяться в області 3,3 мкм, для аліфатичних сполук характерні смуги лежать від 3,3 до 3,7 мкм; для ароматичних речовин - від 3,2 до 3,3 мкм. Вільна гідроксильна група матиме слабку, але чітко виражену смугу при 2,75 мкм, водневий зв'язок значно збільшить її інтенсивність і викличе зміщення порожнини до 2,85 або до 3,0 мкм.
Наявність смуг валентних коливань = С - Н при 3,3 мкм і коливань в області від 6,1 до 6,25 мкм вказує на присутність речовини, що має структуру ароматичного типу. Положення смуг поглинання певної функціональної групи не є постійним в застосуванні до різних молекул внаслідок впливу сусідніх атомів і груп. Наприклад, положення карбоніла, С = 0, при 5,75-5,8 мкм, характерно для альдегідів і кетонів; при 6,0 - 6,1 мкм - для кислот; при 5,75 - 5,85 мкм - для ефірів ; ангідриди мають дві смуги поглинання: при 4,9 - 5,05 мкм і при 5,60 - 5,75 мкм.
Нижче 6,25 мкм, проте, співвідношення між характерними частотами діаграми і спостережуваними при досвіді частотами не дотримується, тому що в цій області проявляються характеристики не окремих функціональних груп, а всієї молекули. Це явище пояснюється частково тим, що тут існує багато смуг для більшості молекул і що немає простого способу встановлення відповідності смуг поглинання певним коливанням і положення смуг в більшій мірі піддається непередбачуваних змін. Насамперед залежність характеру спектра поглинання від будови певної молекули може бути пов'язана з фактом, що існують багато коливаннь, що мають приблизно однакову частоту, і що ці коливання взаємодіють один з одним.
Область від 8 до 15 мкм носить іноді назва області «відбитків пальців» (finger print), так як саме ця частина спектру обумовлює унікальність спектру окремої речовини.
Існує кілька можливостей опису фармакопейних випробувань на справжність з допомогою інфрачервоних спектрофотометричних вимірювань.
Насамперед це видання збірників інфрачервоних спектрів для речовин, включених до фармакопею, з тим, щоб згодом ці спектри використовувалися для порівняння з відповідним спектром досліджуваної речовини. Колекції інфрачервоних спектрів постійно публікуються і розширюються. Описано спектри стандартних речовин, включених до Фармакопею США XVI.
Інша можливість представляє вказівка довжин хвиль, при яких спостерігаються смуги поглинання, і вираз їх інтенсивності як сильної, середньої, слабкої і змінної.
Інфрачервоні спектри, будучи унікальним засобом ідентифікації речовини, в той же час, як було показано вище, схильні до впливу багатьох чинників. Спектри можуть бути різними в двох різних спектроскопів. Якість розчинників, умови приготування зразка для аналізу, кристалічні форми речовини складають короткий перелік факторів, що впливають на спектр. У зв'язку з цим у фармакопейному аналізі основним правилом для інфрачервоної ідентифікації є отримання спектра стандартної речовини в той же час і за тих же умов, що і спектр зразка, з подальшим порівнянням двох спектрів.
Британська фармакопея 1968 р. і Міжнародна фармакопея Другого видання описують визначення інфрачервоного поглинання для встановлення автентичності стероїдів, глікозидів і напівсинтетичних пеніцилінів. У розділі загальних методів аналізу викладаються методики вимірювань у вигляді суспензії і у вигляді дисперсії з лужним галоїдів.
До Державної фармакопеї X видання вперше включена інфрачервона спектрофотометрія для аналізу натрієвих солей метициліну та оксациліну і фторотан (галотан).
Інфрачервоний спектр препарату має ті ж максимуми поглинання, що і стандартний зразок натрієвої солі метициліну (метициліну натрієва сіль, ГФХ).
Розчиняють 50 мг речовини в 25 мл води або збовтують еквівалентну кількість порошку таблеток або вмісту капсул з 25 мл 0,01 Н соляної кислоти протягом 10 хвилин. Переносять рідину в ділильну воронку, фільтруючи, якщо необхідно, і промиваючи фільтр і залишок невеликими порціями води. У другій ділильної воронки розчиняють 50 мг стандарту в 25 мл води. Потім кожен розчин обробляють таким чином: додають 2 мл 10% розчину їдкого натра і 4 мл сірковуглецю і струшують протягом 2 хвилин. Центрифугують, якщо необхідно зробити прозорою нижню фазу, і фільтрують її через сухий фільтр, збираючи фільтрат в невелику колбу з притертою пробкою. Визначають спектри поглинання обох відфільтрованих розчинів без затримки, в кюветі 1 мм в області від 7 до 15 мкм у відповідному спектрофотометрі, застосовуючи в якості контрольного розчину сірковуглець. Спектр розчину, отриманий з зразка, має всі найважливіші смуги поглинання, що й розчин стандарту. Якщо спектр зразка має смуги, що відрізняються від стандарту, зразок може бути підданий очищенню і досвід повторений.
Для інших речовин в Фармакопеї США XVII описується визначення з дисперсією препарату в броміді калію.
Висновки
Спектрофотометрія - оптичний метод дослідження газоподібних, рідких і твердих речовин, заснований на визначенні інтенсивності поглинання світла речовиною (абсорбційна спектрофотометрія) або інтенсивності випромінювання їм світла (емісійна спектрофотометрія) залежно від довжини хвилі.
Отримані при цьому (за допомогою спеціальних приладів - спектрофотометрів) абсорбційні та емісійні спектри є характерними для кожного даної речовини.
Розрізняють спектрофотометрію в ультрафіолетовій (УФ), видимій та інфрачервоній (ІЧ) областях спектру.
Спектрофотометрія широко застосовується в клінічних, біохімічних, санітарно-гігієнічних, судово-медичних і фармацевтичних лабораторіях для якісного та кількісного аналізу різного роду об'єктів біологічного походження (сироватка крові, спинномозкова рідина, сеча та ін), лікарських засобів, продуктів харчування і т. д .
Спектрофотометрія в ультрафіолетовій області є одним з основних загальних методів аналізу лікарських речовин та їх препаратів, включених в будь-яку сучасну фармакопею.
Для ідентифікації невідомої речовини в органічній аналітичної хімії спектр досліджуваного речовини зазвичай порівнюють з отриманим при тих же умовах спектром речовини, будова якого відомо.
Встановлення автентичності речовини по ультрафіолетового спектру є цінним доповненням до хімічних і фізико-хімічних методів фармакопейного аналізу.
Метод спектрофотометрії в ультрафіолетовій області успішно використовується як для ідентифікації та кількісного визначення, так і у випробуваннях на чистоту.
Список використаної літератури:
1.Сенов П.Л. Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии 2010.
2.Фрайфелдер Физическая биохимия .м.: «Мир» 2009
3.Максютина Н.П., Каган Ф.Е., Митченко Ф.А. и др. Методы идентификации
лекарственных препаратов 2007
4.Крючкова Г.М., Любина А.Я., М.Э. Полеес. Руководство у практическим
занятиям по технике лабораторных работ 2005
5.Державна Фармакопея України .-1-е вид.-Харків :РІРЕГ,2011.-с.58-68.
6.Булатов М.И. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа - 5-е изд. / Булатов М.И. ,Калинкин И.П. – Л.: Химия ,2006. -432 с.