3 EMBED Eqution3 EMBED Eqution

Работа добавлена на сайт samzan.net:

PAGE 20

EMBED Equation.3

ЛАБОРАТОРНЫЕ РЕАГЕНТЫ.

В клинических лабораторных исследованиях используется широкий ассортимент различных химических реактивов, биологических препаратов, природных и синтетических веществ, от качества которых и соответствия их поставленным исследователем задачам зависит получение воспроизводимых, контролируемых, статистически достоверных и сравнимых результатов.

Требования к качеству реактивов

Качество реактивов зависит от чистоты, активности, стабильности, а также от способа приготовления и упаковки. Эти требования к качеству образуют комплексную систему зависящих друг от друга параметров.

Чистота.

Понятие “чистота” носит относительный и условный характер. На практике вещество считают достаточно чистым, если оно не содержит примесей такого рода и в таких количествах, которые мешают использованию этого вещества для данной конкретной задачи.

Классификация чистых веществ, действующая в нашей стране, базируется на использовании групп аналитических методов, различающихся своей чувствительностью:

класс А — вещества, содержание основного компонента в которых определяется прямыми методами, а примесей — химическими методами;
класс В — вещества, в которых непосредственно определяются только примеси, причем спектральными и физико-химическими методами;
класс С — вещества, анализ примесей в которых осуществляется методами наивысшей чувствительности (радиоактивационный, кинетический анализ и др.).

Для химических реактивов, т. е. веществ, используемых в аналитических и научно-исследовательских работах для качественного и количественного определения других веществ, принята следующая квалификация:

“чистый” (ч) — содержание основного вещества не менее 98%, допустимое содержание примесей в пределах 0,01—0,05%; реактивы квалификации “ч” используют, главным образом, для препаративных и учебных целей;
“чистый для анализа” (чда) — содержание основного вещества не менее 99%, содержание отдельных примесей не превышает допустимого предела, позволяющего проводить точные аналитические исследования;
реактивы квалификации “чда” используются в аналитической практике;
“химически чистый” (хч) — содержание основного вещества более 99%, содержание отдельных примесей в пределах 0,001—0,00001%.

Лимитируются те примеси, которые наиболее характерны для данного реактива или явно нежелательны в важнейших областях его применения. Следует помнить, что если содержание основного вещества, например, 99,8%, то это не значит, что содержание примесей составляет 0,2%. Здесь учитываются пределы погрешности при прямом определении вещества.

Для высокочистых веществ принята следующая квалификация:

“эталонно чистый” (вэч) — максимальное содержание основного вещества и предельно минимальное содержание нежелательных примесей устанавливаются в зависимости от назначения эталона;
“особо чистый” (осч) — минимальное содержание отдельных примесей (от 0,00001 до 0,00000000001%) и максимально допустимая сумма определяемых примесей.

Анализ малых концентраций примесей возможен только с помощью физических методов (эмиссионная спектроскопия, радиоактивационный анализ и др.). Содержание основного вещества в этих квалификациях нельзя определить прямым анализом, и его устанавливают по разности между 100% и суммой определяемых примесей, т. е. фактическое содержание основного вещества условно и зависит от полноты анализа примесей. Кроме квалификации, иногда указывают область применения или отсутствие какой-либо примеси (например, “для хроматографии”, “индикатор”, “фармакопейный” и т. д.).

Показатели качества отечественных реактивов приведены в соответствующих ГОСТах или ТУ на эти реактивы.

Квалификация реактивов, импортируемых из-за рубежа, указывается на латинском языке или языке страны. В большинстве каталогов реактивов приводятся градации чистоты, принятые данной фирмой, и их характеристика.

Наиболее часто встречаются следующие обозначения:

analitical grade, p. a., A. R. — реактивы для аналитических работ;
research grade, reinst. —лабораторные реагенты высокого качества для исследовательских и рутинных целей, а также коммерческие препараты, отвечающие фармакопейным требованиям;
pure, rein — очищенные коммерческие препараты с содержанием основного вещества около 95%, широко используемые в лабораториях;
puriss. — реагенты с содержанием основного вещества около 99%, предназначенные для проведения точных работ;
pract. — коммерческие препараты с содержанием основного вещества в пределах 90—95%, предназначенные, в основном, для синтеза;
tech. — технические реагенты.

Активность

В клинических лабораторных исследованиях широко используются ферменты (энзимы) — биологические катализаторы, являющиеся по химической природе белками. В молекулах ферментов имеются участки — активные центры — непосредственно взаимодействующие с субстратами. Критерием чистоты для ферментов является их специфическая (удельная) каталитическая активность с дополнительной информацией о каталитической активности загрязняющих ферментов, выраженной в процентах от специфической каталитической активности основного фермента.

Указания на “побочную активность” и кристаллическое состояние не являются критериями чистоты, а лишь характеристиками фермента.

В состав некоторых ферментов входят органические соединения небелковой природы — коферменты. Соединяясь с белковой частью фермента — апоферментом — они образуют каталитически активные комплексы.

Апоферменты определяют специфичность действия фермента и возможность регуляции его активности.

Чистоту коферментов и субстратов лучше определять методами энзиматического анализа в сочетании с определением катионов и воды.

Стабильность

Стабильность реагентов зависит от природы веществ, чистоты и условий хранения. Устойчивость твердых веществ значительно больше, чем их растворов. Одно и то же вещество в различных образцах может иметь различную стабильность, а различные компоненты в одном и том же образце имеют различную стабильность. Соблюдение условий хранения, обычно указанных на этикетках, обеспечивает неизменность качества реагентов в течение декларированного срока хранения.

Растворы

В лабораторной практике используются в основном растворы реагентов.

Раствор — устойчивая однофазная система переменного состава, состоящая из двух или более компонентов (растворителя и растворенных веществ). Растворы занимают промежуточное состояние между механическими смесями и химическими соединениями.

Количественный состав раствора определяется его концентрацией.

Основные способы выражения концентрации:

Весовые проценты — число весовых частей растворенного вещества в 100 весовых частях раствора

Моляльность — число молей растворенного вещества, содержащихся в 1 кг растворителя

Молярность — число молей растворенного вещества, содержащихся в 1 л раствора

Нормальность — число грамм-эквивалентов растворенного вещества в 1 л раствора

Титр — количество граммов растворенного вещества, содержащегося в 1 см3 раствора

Для приготовления растворов в клинической химии используют воду.

Для получения чистой воды используют различные методы:

фильтрование — удаляются только нерастворимые примеси;

дистилляция — перегонка для удаления растворенных веществ;

деминерализация — последовательное удаление содержащихся в вода катионов и анионов с помощью колонок, заполненных ионитами (чаще всего синтетическими ионообменными смолами — анионитами и катионитами).

В лабораториях используют чаще всего дистиллированную воду, иногда бидистиллированную, т. е. перегнанную дважды. Наиболее практична и экономична очистка воды с помощью коммерческих систем (например, “Mullipore System”, “Organic pure” от фирмы “Bamstead”, “Ultra pure water” от фирмы “Elga Group” и др.(рис. 1,2)).

Эти системы содержат фильтры из активированного угля для адсорбции органических веществ, смесь ионитов в виде шариков и мембранный фильтр для удаления микроорганизмов.

Всегда нужно использовать свежеприготовленную воду. Для некоторых анализов требуется вода, не содержащая СО2 (для рН-метрии). В этом случае бидистиллят кипятят в течение 5—10 мин, охлаждают без доступа воздуха и используют в течение нескольких часов.

Для методов флуорометрии воду получают путем дистилляции 20% раствора КмnО4. Марганцовка окисляет присутствующие в воде флуоресцирующие соединения.

Большинство сортов фильтровальной бумаги (исключая специальную бумагу для хроматографии) содержат примеси флуоресцирующих материалов и не должны использоваться для удаления твердых примесей.

Рекомендуется использовать пробки из силиконовой резины или полиэтилена.

Во избежание попадания загрязнений (аэробных бактерий, химических соединений, СО2 паров растворителей) растворы, как и реагенты вообще, следует хранить плотно закрытыми.

Стабильность растворов зависит от их концентрации. Основные растворы при хранении в холодильнике стабильны в течение нескольких недель до нескольких месяцев, в зависимости от природы растворенных веществ. Рабочие растворы используют обычно в течение одного или нескольких дней.

Для приготовления многих растворов в качестве растворителя используются буферные растворы — водные растворы, сохраняющие определенную концентрацию ионов Н+ (рН) при добавлении небольших количеств сильных кислот и щелочей.

Они представляют собой растворы слабой кислоты и ее соли, или слабого основания и его соли, взятых в определенном соотношении.

Буферные растворы также можно составлять из смеси солей многоосновной кислоты, константы диссоциации которой сильно отличаются друг от друга, например, из смеси одно- и двузамещенных фосфатов.

При разведении (до соотношения 1:100) рН буферного раствора практически не меняется, однако отражается на его емкости.

Буферная емкость — число молей сильной кислоты или сильного основания, добавление которого к буферному раствору изменяет его рН на единицу.

Буферная емкость тем больше, чем концентрированнее раствор. Буферные смеси не при всех соотношениях концентраций кислоты и соли проявляют свое буферное действие. Его оптимум отвечает той концентрации [Н+], при которой кислота является наполовину нейтрализованной.

Для приготовления буферных растворов необходимо использовать дважды перекристаллизованные реактивы квалификации “хч” и бидистиллированную воду; значение рН — контролировать потенциометрически.

Буферные растворы используются в тех случаях, когда анализ проводится при определенном значении рН, в частности в фотометрических методах, основанных на цветных индикаторных реакциях.

Индикаторами называются соединения, окраска которых изменяется в зависимости от изменения рН среды. Они принадлежат к различным типам органических соединений, но все — являются слабыми кислотами или слабыми основаниями. Их недиссоциированные молекулы окрашены иначе, чем диссоциированные. Но диссоциация не является единственной причиной изменения окраски. Согласно хромофорной теории индикаторов, окраска вещества, как и многие другие физические свойства, зависит от состава и строения молекулы.

Для получения окрашенных органических веществ необходимо присутствие в их молекуле определенных групп атомов — хромофоров. В таблице №1 представлены кислотно-основные индикаторы и области рН в которых они действуют.

Тип приготовления

Основные требования при выборе типа приготовления — максимальная простота в использовании реагента и гарантия наивысшего (по возможности) качества. Например, вещества в кристаллической форме легче взвешивать, чем лиофилизированные; использование готовых таблеток исключает взвешивание, но таблетки должны быстро и полностью растворяться. Гарантия качества связана с простотой приготовления, стабильностью и активностью. Растворы ферментов легче использовать, чем суспензию. Добавление к растворам консервантов исключает ежедневное приготовление, но консерванты не должны влиять на ход аналитического процесса.

Упаковка

Упаковочный материал для изготовления флаконов, ампул, пузырьков, пробок должен выбираться с учетом свойств реагентов. Ни один компонент упаковки не должен влиять на содержимое. Упаковка должна эффективно защищать от вредных внешних воздействий (свет, влага, атмосферный воздух и т. д.).

Готовые аналитические формы реактивов

Наборы реактивов

Набор реактивов —это два или более лабораторных материалов, упакованных вместе, предназначенных для выполнения определенной процедуры и снабженные инструкцией.

Основными преимуществами использования готовых наборов реактивов являются:

сокращение расхода реактивов;
сокращение времени анализа за счет исключения этапов приготовления реактивов;
гарантия высокого качества, так как производители используют тщательно контролируемые реагенты, дают информацию об ограничениях применения, об интерференции патологических метаболитов и лекарств, о внешней оценке качества набора, выполненной самим производителем и профессиональными организациями.

Таблица 1

Кислотно-основные индикаторы и области рН, в которых они действуют.

Индикатор	Область pн	Цвет
		в кислой среде	в основной среде
Бриллиантовый крезиловыи синий (кислота)	0,0-1,0	Красно-оранжевый	Синий
Крезоловый красный (кислота)	0,2-1,8	Красный	Желтый
Хинальдиновый красный	1,0-2,0	Бесцветный	Красный
Тимоловый синий (кислота)	1,2-2,8	Красный	Желтый
Тропеолиновый ОО	1,3-3,0	-«-	-«-
Метакрезоловый пурпурный	1,2-2,8	-«-	-«-
Бромфеноловый синий	2,8-4,6	Желтый	Синий
Метиловый жёлтый	2,9-4,0	Красный	Желтый
Метиловый оранжевый	3,1-4,4	-«-	-«-
Конго красный	3,0-5,0	Фиолетовый	Красный
Бромкрезоловый зелёный	3,8-5,4	Желтый	Синий
Метиловый красный	4,2-6,3	Красный	Желтый
Хлорфеноловый красный	4,8-6,4	Желтый	Красный
п-Нитрофеноловый	5,6-7,6	Бесцветный	Желтый
Бромкрезоловый пурпуровый	5,2-6,8	Желтый	Пурпуровый
Азолитмин (лакмус)	5,0-8,0	Красный	Синий
Бромтимоловый синий	6,0-7,6	Желтый	-«-
Нейтральный красный	6,8-8,0	Красный	Оранжевый
Феноловый красный	6,8-8,4	Желтый	Красный
Крезоловый красный (основание)	7,2-8,8	-«-	-«-
α-Нафтофталеин	7,3-8,7	-«-	Синий
Тимоловый синий (основание)	8,0-9,6	-«-	-«-
Фенофталеин	8,3-10,0	Бесцветный	Красный
Куркумовый	8,0-10,0	Желтый	Оранжевый
Тимолфталеин	8,3-10,5	Бесцветный	Синий
Ализариновый желтый R	10,1-12,0	Желтый	Красно-оранжевый
Бриллиантовый крезиловый - синий (основание)	10,8-12,0	Синий	Желтый
Тропеолин	10,8-12,0	Желтый	Оранжевый
Нитрамин	10,8-13,0	Бесцветный	Буро-оранжевый

Многие современные методы, используемые в клинической лабораторной диагностике, например, для определения гормонов, опухолевых маркеров и т. п., могут быть выполнены только с помощью готовых наборов, так как в условиях лаборатории невозможно приготовить все необходимые компоненты соответствующего качества для проведения анализа. Кроме того, приготовленные в лаборатории реагенты не пригодны для многих автоанализаторов.

Основные требования к наборам реактивов

При промышленном производстве готовых наборов реактивов необходимо соблюдать баланс между стоимостью, качеством и надежностью получаемых результатов, удобством применения (практичностью) и низкой интерференцией.

Практичность применения и низкая интерференция зависят от выбора метода, качество и надежность результатов — от качества и стабильности реагентов и их растворов.

Срок хранения набора при определенных условиях (например, в холодильнике) должен быть не менее 6 мес. со дня выпуска.

Стабильность рабочих растворов должна сохраняться в течение недели (если возможно) и, по крайней мере, в течение рабочего дня.

Виды наборов

Простейший вид набора — каждый реактив в виде порошка, гранул, таблеток, лиофилизатов или раствора упакован в отдельный флакон (рис.3). В случае использования растворов к ним добавляются консерванты, стабилизаторы (например, глицерин или этиленгликоль для ферментов). Такие наборы сокращают лишь время на взвешивание реактивов.

Дальнейшее упрощение состава набора — использование комбинации таких компонентов, которые не реагируют друг с другом, т. е. приготовление стабильных смесей. Это позволяет сократить число пипетирований и связанных с этим ошибок.

В настоящее время созданы наборы, которые содержат в одном флаконе все необходимые реагенты в сухом или растворенном виде. Однако в ряде случаев в зависимости от свойств реагентов и принципа реакции такая комбинация невозможна. Например, в наборах для определения активности аминотрансфераз α-кетогаутарат, используемый в качестве стартера, фасуется отдельно.

В состав многих наборов, например, наборов для определения метаболитов, включается калибровочный раствор.

Для проведения анализов с помощью готовых наборов часто требуются дополнительные реагенты, не включенные в состав набора (например, растворы кислот и щелочей). В прилагаемых к набору инструкциях содержатся соответствующие указания.

Стабилизация реактивов в наборах достигается различными способами — иммобилизацией реагентов путем фиксации на бумаге, стенках пробирок, магнитных частицах.

В наборах реактивов, основанных на методах иммуноферментного анализа (ИФА), антигены и антитела связываются ковалентно или другим способом с внутренней поверхностью пробирок или лунок планшета (рис. 4). Преимуществом такой процедуры является то, что все интерферирующие компоненты образца и реакционной смеси вымываются после реакции связывания, а чистый комплекс антитело-антиген остается на поверхности пробирки.

Пробирки с нанесенными на их внутреннюю поверхность окислительными агентами представляют собой другой пример связывания реагента с поверхностью пробирки. Преинкубация образцов мочи в таких пробирках позволяет определить те компоненты мочи, на которые влияют восстанавливающие вещества, как, например, аскорбиновая кислота.

Специальная бумажная технология применяется в наборах реактивов типа “Перидохром” (Peridochrom), в состав которых входит буферный раствор и бумажные полоски с нанесенными на них реагентами, адсорбированными на различные зоны. В таких наборах все реагенты отделены друг от друга, что исключает их взаимную интерференцию, хорошо стабилизированы, так как зафиксированы на бумаге в оптимальных для них условиях.

На практике реагенты готовятся к употреблению путем погружения полоски в соответствующую аликвоту буфера.

Наборы типа “Перидохром” выпускала, например, фирма “Берингер Маннхайм”(ныне “Рош Диагностике”) для определения холестерина и мочевой кислоты.

Другой тип готовых аналитических форм — диагностические полоски, основанные на принципах “сухой химии” (см. соответствующий раздел).

Наборы реактивов, предназначенные для ручного выполнения, могут быть адаптированы к открытым автоматизированным системам, чаще всего путем пропорционального уменьшения объемов пробы и реактивов.

Для закрытых аналитических систем, представляющих собой комбинацию прибора и реагентов, выпускаются специальные наборы реактивов, и другие реактивы не могут использоваться в таких системах.

Например, в анализаторах ACA-System ofDu Point de Nemours, США, используется принцип колоночной хроматографии. Исследуемый образец пропускают через маленькую готовую к употреблению колонку, интерферирующие вещества остаются на ионообменной смоле или молекулярном сите.

В системе “Parallel” фирмы “American Monitor” используется трехволновая процедура измерения для подсчета концентрации интерферирующего хромогена, что позволяет скорректировать результаты.

Многие фирмы выпускают готовые наборы реактивов для различных типов анализаторов, в том числе и в крупных фасовках (для высокопроизводительных анализаторов).

Требования к качеству готовых наборов реактивов

Использование готовых наборов в повседневной практике лабораторий имеет свои преимущества только в случае гарантии их качества, за которое отвечают производители наборов. Качество наборов реактивов обеспечивается:

контролируемым на всех этапах технологическим процессом их приготовления;
соответствующей маркировкой;
использованием методик, позволяющих определить степень чистоты исходных материалов, промежуточных и конечных продуктов;
системой контроля за всеми стадиями разработки и доставки, начиная с поставки сырья и до отправки готовой продукции.

Контроль качества исходных материалов

Все реактивы и биопрепараты, используемые для производства, должны быть проанализированы на соответствие спецификациям (определение чистоты, физических параметров, тест на идентичность, содержание примесей) с использованием различных аналитических методик и функциональных тестов.

Контроль качества упаковочных материалов

Упаковочные материалы, находящиеся в контакте с реагентами, должны проверяться на физические параметры (внешний вид, чистота, размеры, растяжение). Кроме того, необходимо удостовериться, что никакие веществ, способные загрязнить реактивы, не могут выделиться из упаковки.

Контроль процесса производства

В процессе производства необходим контроль за тем, чтобы все ингредиенты добавлялись в требуемом количестве и в соответствии с инструкцией.

Окончательный контроль качества

Он включает следующие этапы:

контроль репрезентативной выборки из различных флаконов, входящих в один набор;
визуальный контроль набора, флаконов и маркировки;
проверка содержимого различных флаконов;
проверка идентичности всех ингредиентов;
проверка количественного содержания всех основных компонентов набора;
оценка аналитической надежности теста с использованием контрольных сывороток и сывороток пациентов, проверка линейности и обнаружения;
проверка стабильности.

Маркировка реагентов и наборов реактивов

Общие принципы и рекомендации по маркировке клинических лабораторных материалов, наборов, компонентов наборов, калибраторов, референтных материалов, контрольных материалов разработаны Всемирной организацией здравоохранения (WHO). В нашей стране маркировка реактивов производится в соответствии с ГОСТ “Правила приемки, отбор проб, фасовка, упаковка и маркировка”.

Маркировка включает этикетки и инструкции по применению. Для химических и биологических материалов этикетка должна содержать следующие сведения: наименование продукта и его назначение, квалификацию, количественные характеристики (вес, объем, концентрация, активность и т. д.), номер партии, предприятие (фирма)—изготовитель и его адрес, условия и срок хранения, а также, при необходимости, предупреждающие надписи (“Огнеопасно”, “Беречь от воды”, “Ядовито” и т. п.).

Для наборов реактивов этикетка на контейнере должна содержать дополнительно: номер партии или контрольный номер (в том числе на каждом компоненте в составе набора); срок хранения, который зависит от срока хранения самого неустойчивого компонента в наборе, состав набора.

Содержание инструкции к набору

1. Наименование и назначение.

2. Химический, физический или биологический принцип, в том числе уравнения реакций, ссылки на литературный источник.

3. Указания по технике безопасности при работе с набором (если необходимо).

4. Стабильность. Если возможно, приводятся физические, биологические или химические признаки нестабильности и порчи реактивов.

5. Для каждого компонента набора должны быть указаны: наименование, количество (концентрация или активность), источник, специфичность, чувствительность или другие характеристики, влияющие на выполнение теста. Любые добавки, не участвующие в реакции (например, буфер, консервант, стабилизатор), которые могут повлиять на тест, должны быть идентифицированы и охарактеризованы; описание процедуры растворения и смешивания.

6. Оборудование. Описание любых специальных требований к оборудованию, чтобы пользователь мог сделать соответствующий выбор.

7. Способ отбора исследуемого образца, подготовка пациента, рекомендуемые добавки (антикоагулянты, консерванты), рекомендации по хранению, транспортировке образца, интерферирующие вещества.

8. Детальное описание процедуры выполнения теста, включая:

специальную обработку образца, который может содержать известные интерферирующие вещества;
растворение, разведение, смешивание и другие необходимые этапы, включая условия и сроки хранения растворов;
процедуру калибровки, включая выбор и приготовление калибрато-ра, использование холостой пробы, построение калибровочной кривой;
процедуру контроля качества, включая рекомендации по выбору контрольных материалов;
перечень экспериментальных условий для выполнения теста:
температура, время, необходимое для проведения различных этапов, длина волны измерения, стабильность финальной реакционной смеси;
_ способ расчета результатов, включая объяснение каждого фактора и этапа расчета (могут быть приведены примеры расчета);
технические указания, позволяющие более эффективно выполнить процедуру;
литературные ссылки.

9. Преимущества, ограничения применения набора, оценку аналитической надежности, включающую воспроизводимость, правильность (сравнение с референтным методом, если возможно), специфичность, пределы обнаружения, линейность, чувствительность, ограничения метода (например, возможность перекрестных реакций).

10. Наименование и адрес изготовителя.

11. Дату (месяц, год) выпуска инструкции.

12. Нормальные значения.

Принципы выбора наборов реактивов

В условиях рыночной экономики клинико-диагностические лаборатории имеют возможность широкого выбора готовых наборов реактивов отечественного и зарубежного производства. Достоверность результатов лабораторных исследований зависит от аналитической надежности метода (правильности, воспроизводимости, специфичности, чувствительности) и его практичности (время анализа, технологические требования, стоимость и т. п.).

Надежность и практичность могут вступать в конфликт в отношении стоимости. Всегда следует отдавать предпочтение надежности метода.

При выборе набора реактивов следует в первую очередь учесть принцип метода, положенный в основу набора, и его надежность. Если критерии аналитической надежности подтверждены, необходимо оценить практичность набора, особенно с точки зрения экономии времени анализа и сокращения числа этапов исследования.

Практичность зависит от:

стоимости;
времени анализа;
числа пипетирований;
необходимости депротеинизации;
необходимости нагревания (времени инкубации);
необходимости постановки холостой пробы, пробы на сыворотку;
зависимости от типа оборудования;
возможности автоматизации;
наличия реактивов, их стабильности, необходимости в дополнительных реактивах;
необходимости и наличия калибратора;
объема исследуемого образца;
безопасности (агрессивность веществ);
линейности и диапазона определения;
числа определений, на которое рассчитан набор;
срока и условий хранения набора и рабочих реагентов.

РАСТВОРЫ: ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЕ, СПОСОБЫ ВЫРАЖЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ, ИСПРАВЛЕНИЕ

Переход химических веществ в состояние раствора является обязательным условием протекания различных метаболических процессов в организме и выполнения многих видов клинико-лабораторного исследования.

Раствор — это жидкая, газообразная или твердая гомогенная система, состоящая из двух или более компонентов, относительные количества которых могут быть произвольно изменены в довольно широких пределах.

Жидкие растворы бывают водные и неводные. Те и другие представляют собой однородную физико-химическую дисперсную систему, в которой равномерно по отношению друг к другу распределены частицы растворенного вещества, растворителя и продукты их взаимодействия. Обычно растворителем считают тот компонент, который в чистом виде существует в таком же агрегатном состоянии, что и полученный раствор. Если обе составные части системы до растворения находились в одинаковом агрегатном состоянии (например, спирт и вода), то растворителем считается жидкость, взятая в большем количестве.

В зависимости от размера частиц распределенного вещества выделяют три класса дисперсных систем:

ионно-молекулярные (истинные растворы): размеры частиц распределенного в них вещества не превышают 1 нм;
коллоидные системы (коллоидные растворы) с размерами частиц до 100 нм; для такой системы характерно рассеивание проходящего через нее света — феномен Тиндаля;
грубодисперсные системы, содержащие частицы твердого (суспензии) и жидкого (эмульсии) вещества диаметром более 100 нм.

Все вещества обладают определенной, присущей им растворимостью в воде. Она выражается числом граммов вещества, которое, будучи растворенным при определенной температуре в 100 г растворителя, дает насыщенный раствор; иначе говоря, растворимость — это максимальное количество вещества (в г), которое может быть растворено в 100 г растворителя определенной температуры.

При нагревании растворимость твердых веществ в воде, как правило, повышается, а газов — уменьшается. На ухудшении растворимости с понижением температуры раствора основано выделение вещества (обычно в виде кристаллов определенной структуры) и очистка его от примесей. Этот процесс называется кристаллизацией. Началу кристаллизации способствует встряхивание раствора или внесение в него кристаллика растворенного вещества. Процесс кристаллизации идет тем быстрее, чем выше исходная концентрация раствора. Завершается кристаллизация установлением динамического равновесия между двумя противоположными процессами: растворения и перехода вещества из раствора в структуры кристаллов. После достижения такого состояния раствор является насыщенным (в нем не может быть растворено дополнительное количество вещества при данной температуре). В момент установления динамического равновесия между процессами растворения и кристаллизации количество вещества, перешедшего в раствор, не изменяется, и растворение практически прекращается.

Если в растворе вещества находится меньше, чем в насыщенном, он именуется ненасыщенным. При создании определенных условий могут быть получены пересыщенные растворы. Некоторые вещества особенно склонны к образованию пересыщенных растворов, что следует иметь в виду при выполнении биохимических исследований. Так, в процессе определения ионов калия химическим методом, основанным на реакции образования купрумгексанитрита калия свинца К2Рb [Cu(NО2)6], получается пересыщенный раствор, для осаждения из которого сформированной комплексной двойной соли требуется длительное потирание стеклянной палочкой о внутренние стенки пробирки (с целью образования центров кристаллизации). В противном случае могут возникнуть ложно заниженные результаты.

Понятия «насыщенный» и «ненасыщенный» не следует отождествлять с понятиями «концентрированный» и «разбавленный». Концентрированный раствор отнюдь не обязательно должен быть насыщен. Например, раствор, содержащий 20 г селитры KNO3 в 100 г воды, является концентрированным, но если температура его 20°С, то он еще далеко не насыщен. Для получения насыщенного раствора при этой температуре нужно было бы взять 31,5 г селитры на 100 г воды. С другой стороны, и насыщенный раствор может быть разбавленным (если вещество мало растворимо). Так, насыщенный раствор гипса при 20°С содержит всего лишь 0,21 г вещества в 100 г раствора. Представление о количественном содержании вещества в растворе выражается понятием концентрации.

Концентрацией раствора называется массовое (г, кг) или объемное (мл, л) содержание вещества в определенном количестве или объеме раствора.

В зависимости от способа выражения концентрации растворы делят на приблизительные и точные.

Согласно требованиям Международной системы единиц (SI), содержание вещества в приблизительных растворах в настоящее время выражается размерностью массовой концентрации, массовых и объемных отношений, заменивших соответствующие выражения отдельных видов процентной концентрации.

Под процентной концентрацией принято понимать определенное количество вещества (г или мл), содержащееся в 100 г или 100 мл раствора. Это общее определение включает несколько вариантов. В зависимости от размерности единиц объема или массы, используемой для обозначения количества растворенного вещества и раствора, различают массовую (весовую), массо-объемную (весо-объемную), объемную, объемно-массовую (объемно-весовую) процентную концентрацию.

Массовая (весовая) процентная концентрация (%) показывает, сколько граммов вещества содержится в 100 г раствора: % = , где α — количество растворенного вещества, b — количество растворителя в граммах (в сумме составляют 100 г).

Например, 38% раствором соляной кислоты называют такой раствор, в 100 г которого содержится 38 г хлористого водорода и 62 г воды. Для получения раствора этого вида процентной концентрации навеску вещества вносят в химический стакан, в который затем вливают 62 мл воды (масса 1 мл воды комнатной температуры составляет примерно 1 г). При приготовлении растворов различных химических реагентов удобно использовать массовую концентрацию.

Массо-объемная процентная концентрация (г%) представляет собой отношение количества растворенного вещества в граммах к 100 мл раствора. Размерность этого вида процентной концентрации — г/мл (масса/объем). Например, 10 г% раствор хлористого натрия содержит 10 г соли в 100 мл раствора. Для его получения навеску соли (10 г) вносят в мерный цилиндр или мензурку и доливают водой до метки. В случае водных растворов одинаковой (по численному обозначению) массовой и массо-объемной процентной концентрации различия в количественном содержании вещества в единице объема практически не выявляются, или же ими можно пренебречь. Однако при использовании неводных растворов они могут быть весьма значительны. Так, в 10% растворе жира в тетрахлорметане, или, что то же самое, четыреххлористом углероде (жидкости плотностью 1,6 кг/л) на 10 г жира приходится около 90 мл растворителя, тогда как в 10 г% растворе значительно меньше: 56 мл.

Объемная процентная концентрация (об% или градус) есть отношение объема количества (мл) растворенного вещества к 100 мл раствора. Размерность этого вида процентной концентрации — мл/мл (объем/объем). Например, 5 об% (5°) раствор этилового спирта содержит 5 мл абсолютного (безводного) спирта и 95 мл воды. Следует, правда, иметь в виду, что при смешивании разных жидкостей, бесконечно растворяющихся друг в друге (как, например, в случае этилового спирта и воды), в силу явления контракции (т. е. взаимного проникновения молекул одного вещества в промежутки между молекулами другого) конечный объем раствора может составлять менее 100 мл.

Объемно-массовая процентная концентрация отражает количество (мл) вещества, содержащегося в 100 г раствора. Она редко используется в клинико-лабораторной практике.

Многие химические реактивы поступают в лабораторию (приобретаются) в виде кристаллогидратов. Растворы процентной концентрации приготовляют из них двумя способами: точным и условным.

Для приготовления раствора процентной концентрации требуется прежде всего рассчитать навеску кристаллогидрата, содержащую заданное количество вещества. Если необходимо получить 10% раствор сернокислой меди из кристаллогидрата соли состава CuSО4 x 5Н2О, для определения соответствующей навески кристаллогидрата исходят из того, что на одну молекулу сернокислой меди приходится пять молекул воды. Молекулярная масса кристаллогидрата сернокислой меди, составляющая 245 г, складывается из 155 г чистой соли и 90 г воды (18 х 5), где 18 — молекулярная масса воды. Путем решения пропорции:

245 г CuSО4 х 5Н2О содержат 155 г CuSО4

Х г CuSО4 х 5Н2О - 10 г CuSО4

находят требуемую навеску кристаллогидрата (X):

На этикетке бутыли, в которой хранится такой раствор, должно быть написано: «10% (или 10 г%) раствор CuSО4». Это значит, что в 100 г (или 100 мл) раствора содержится 10 г сернокислой меди, а не ее кристаллогидрата.

Условный способ выражения процентной концентрации базируется на использовании для получения раствора кристаллогидратов веществ. Например, для приготовления 10% раствора медного купороса (CuSО4 х 5Н2О) отвешивают 10 г кристаллической соли и приливают воду до объема 100 мл. Поскольку такой раствор не является десятипроцентным, на этикетке сосуда, в котором он хранится, должна быть надпись: «10% (или 10 г%) раствор CuSО4 х 5Н2О».

При использовании кристаллических солей важно быть уверенным в полном соответствии действительного (фактического) состава соли ее химической формуле. При неправильном хранении препаратов кристаллогидратов (в разгерметизированной посуде) может происходить частичная потеря кристаллизационной воды (выветривание), из-за чего часть вещества, особенно на поверхности кристаллов, переходит в аморфное состояние. Такой реактив не пригоден для приготовления растворов ни первым, ни вторым способом. В данном случае требуется предварительно перекристаллизовать его (т. е. восстановить кристаллическую структуру реагента) или, если это позволяют химические свойства вещества, прокалить, переведя его таким образом в аморфное состояние.

Поскольку в соответствии с требованиями международной системы единиц в качестве единицы массы и объема раствора используются «кг» и «л» (соответственно), для получения необходимых показателей размерности значения отдельных видов процентной концентрации требуется умножить на 10. При этом массовая и объемная процентные концентрации преобразуются в массовое и объемное отношения с размерностью г(кг)/кг, мл(л)/л, массо-объемная процентная концентрация — в массовую концентрацию с размерностью г(кг)/л.

Для приготовления неточных растворов используются технохимические (технические), аптекарские весы и неточная мерная посуда (цилиндры, мензурки). В случае, 1 если возникает потребность в получении приблизительных растворов путем разбавления более концентрированных, можно воспользоваться простым и быстрым способом, именуемым правилом «креста».

Если требуется получить 5% (50 г/л) раствор хлористого аммония из более концентрированного 15% (150 г/л), составляют первую запись:

где 15 — показатель концентрации взятого раствора, 0 — вода и 5 — требуемой концентрации. Из 15 вычитают 5 и полученное значение записывают в правом нижнем углу. Вычитая же 0 из 5, записывают цифру в правом верхнем углу. После этого схема принимает вид:

Это означает, что для получения 5% раствора нужно 5 объемов 15% раствора смешать с 10 объемами воды.

Если смешивать два исходных раствора одного и того же вещества для получения раствора промежуточной концентрации, то из схемы устраняется «О». Пусть смешиванием 35% и 15% раствора требуется приготовить 25%. В этом случае схема примет вид:

Следовательно, для приготовления 25% раствора нужно взять по 10 объемов обоих исходных растворов.

Приведенными схемами можно пользоваться только тогда, когда не требуется достижения особой точности приготовления растворов.

1. ТОЧНЫЕ РАСТВОРЫ

Характеризуются размерностью молярной (моль/л), моляльной (моль/кг), нормальной (гэкв/л) концентрации и титра. Для получения растворов точной концентрации применяют исходные вещества (т. е. реактивы квалификации «х. ч.», строго отвечающие своей химической формуле, устойчивые к воздействию света и воды, негигроскопичные, не взаимодействующие с углекислым газом воздуха, обладающие большой молекулярной массой, что позволяет свести к минимуму техническую ошибку взвешивания), фиксаналы, точную мерную посуду и весы для очень точного взвешивания (аналитические, полумикрохимические, микрохимические). Поскольку не всегда удается получить точный раствор нужной концентрации путем растворения приготовленной навески вещества или содержимого некоторых ампул (фиксаналов), его приходится проверять путем титрования, находить коэффициент поправки и при необходимости исправлять.

1.1. Способы исправления растворов

Базируются на расчете коэффициента (фактора) поправки. Коэффициент поправки — это число, которое показывает, во сколько раз данный раствор отличается от близкого к нему по концентрации точного раствора определенной нормальности (0,1 N, 0,01 N и др.).

Определение коэффициента поправки К дает возможность получить нужную концентрацию раствора добавлением к анализируемому воды или реактива. Коэффициент поправки чаще всего устанавливают по отношению объемов взаимодействующих точного определенной нормальности и испытуемого растворов.

СПОСОБЫ ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ
КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Качество выполнения лабораторного исследования во многом определяется правильно выбранной и осуществленной методикой оценки полученных при работе с фотометрической аппаратурой результатов. Она базируется на использовании градуировочного графика (таблицы), факторов пересчета, а также формулы, учитывающей значения абсорбции (экстинкции) и концентрации стандартных проб, обрабатываемых параллельно с опытными в одинаковых с ними условиях.

1. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ПО КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ

Градуировочная (калибровочная) кривая отражает тесную зависимость между абсорбцией А, называемой также оптической плотностью D, экстинкцией Е (а в отдельных случаях, например, в процессе осуществления пламенной фотометрии, флюориметрии — интенсивностью излучения света) и концентрацией С вещества в сериях стандартных растворов (рис. 78).

Рис. 78. Схема построения калибровочной кривой

К построению калибровочной кривой можно приступить лишь после того, как будет достигнута уверенность в том, что метод лабораторного исследования достаточно хорошо отработан. В противном случае точность расчета по калибровочной кривой оказывается неудовлетворительной из-за неадекватности условий и техники обработки стандартных и опытных проб.

При построении градуировочного графика следует стремиться к тому, чтобы калибровочные растворы помимо стандартного вещества содержали если не все, то основные (сказывающиеся на течении реакции) компоненты биологической жидкости. Это достигается применением стандартных сывороток водных растворов, содержащих и другие ингредиенты плазмы, способные интерферировать с определяющими веществами, в количестве, примерно соответствующем таковому в исследуемой биологической жидкости. Так, при определении содержания билирубина в плазме (сыворотке) крови стандартные растворы должны содержать белок (альбумин), поскольку он не только предохраняет билирубин от окисления, но и усиливает интенсивность окраски получаемых в процессе реакции азопигментов. При определении концентрации ионов калия в плазме крови стандартные его растворы должны заключать в себе также ионы натрия и кальция (в концентрации, соответствующей содержанию этих ионов в анализируемой биологической жидкости), так как они влияют на интенсивность свечения ионов калия в пламени газовой горелки пламенного фотометра.

Стандартные растворы должны готовиться с особой тщательностью из навески, полученной на весах для очень точного взвешивания (аналитических и других). При этом следует обратить внимание на то, чтобы стандартные вещества строго отвечали своей химической формуле, имели высокую степень чистоты и достаточную стабильность, не были гигроскопичны и не взаимодействовали с газами воздуха. Навеска должна быть достаточно большой для уменьшения технической ошибки взвешивания. Последнему способствует взвешивание стандартного вещества не в обычном тяжелом (массивном) бюксе, а на листочке целлофана (либо полиэтиленовой пленки) с последующим количественно полным перенесением вещества в соответствующую стеклянную мерную посуду. Как правило, оно перед взвешиванием должно быть высушено до постоянной массы в сушильном шкафу при 110°С.

Используемую для получения стандартных растворов градуировочную мерную посуду нужно предварительно тщательно обезжирить и вымыть. Не рекомендуется сушить мерную посуду (в частности мерные колбы) в сушильном шкафу, так как при высокой температуре меняется ее объем и нарушается градуировка.

Построение калибровочной кривой начинается с приготовления арифметического ряда разведении с последующей обработкой стандартных растворов аналогично опытным пробам. В отдельных случаях стандартные вещества можно использовать на конечном этапе исследования, например, путем их нанесения на электрофореграмму (либо хроматограмму), что несколько усложняет расчет результатов и привносит погрешность за счет неучтенных потерь анализируемого вещества в процессе его выделения (экстракции и других процедур).

Разведения стандартного вещества должны охватывать диапазон физиологических концентраций и выходить за пределы их минимальных и максимальных величин (до значений, могущих иметь место при встречающихся формах патологии). Так, например, при исследовании содержания общего белка в сыворотке (плазме) крови концентрация стандартного вещества (альбумина) должна быть в интервале от 40 до 120 г/л (при физиологической концентрации общего белка 65—85 г/л).

В большинстве случаев ряд калибровочных растворов получают путем разбавления основного, маточного раствора (как это имеет место, например, при определении содержания общего белка плазмы или сыворотки крови). Известно, что чем концентрированнее раствор стандартного вещества, тем оно дольше сохраняется в нем. Многие низкомолекулярные соединения (гистамин, серотонин) допускают возможность хранения их растворов в замороженном состоянии. После оттаивания из основного раствора стандарта нередко делают промежуточные разбавления (одно или несколько).

Для каждой рабочей концентрации стандартного вещества нужно сделать 3—5 фотометрических или других (например денситометрических) определений. Всего используют 2—3 серии окрашенных растворов, в результате чего обычно выполняется 6—12 исследований каждого рабочего разведения стандарта.

Суть построения градуировочной кривой сводится к тому, что определенные объемы растворов серии стандартных проб обрабатываются в условиях, полностью идентичных таковым при анализе исследуемого материала (опытных проб).

Измерения оптической плотности начинают со стандартного раствора наименьшей концентрации. Усредненные (соответствующие отдельным концентрациям) значения оптической плотности (абсорбции, экстинкции) наносят на миллиметровую (калибровочную) бумагу. На оси абсцисс (горизонтальной) с соблюдением одинаковых интервалов в равномерно возрастающей концентрации откладывают показатели содержания вещества в стандартном растворе; на оси ординат (вертикальной) — соответствующие им величины абсорбции. Зависимость между двумя сопоставляемыми величинами отражается линией, построенной уже по трем точкам замера. Однако строить калибровочный график следует не менее чем по пяти точкам. Калибровочная кривая прокладывается (тонко отточенным карандашом, желательно с помощью прозрачной линейки) таким образом, чтобы по возможности большее число точек (например 3 из 5) лежало на линии, а остальные располагались близ нее, равномерно отклоняясь в ту и другую стороны. Отдельные точки, значительно смещающиеся от калибровочной кривой и обычно являющиеся результатом грубой ошибки в определении, исключаются из учета. Точки принято обозначать крестиками (точка не имеет ширины). Оси координат изображают в виде толстых («жирных») отрезков прямой (со стрелками), на их фоне калибровочная кривая должна представлять собой тонкую линию.

Расположение кривой определяют так, чтобы она исходила из нулевой отметки под углом ~ 45° к осям координат, при этом достигается наибольшая точность измерений, чему способствует также выбор оптимального, достаточно крупного масштаба. В правом верхнем углу калибровочного графика приводят: наименование калибровочной кривой, ссылку на метод исследования (например: «РАР» метод определения содержания глюкозы в сыворотке крови), номер светофильтра (или его конкретную физическую характеристику — максимум пропускания), длину оптического пути кюветы (в мм), дату построения кривой. При этом учитывают, что у большинства обычных фотоэлектроколориметров наиболее благоприятная область измерений лежит в пределах значений абсорбции 0,1—0,3 (максимум до 0,7).

Чтобы правильно построить калибровочную кривую, необходимо знать, какие условия оказывают влияние на расположение линии в системе координат.

Если абсорбция опытной пробы оказывается не скорригированной на экстинкцию контрольной, то часто не удается достигнуть совпадения нулевого значения оптической плотности с нулевым значением концентрации. Методы с таким построением калибровочного графика не рекомендуются для использования в клинико-диагностических лабораториях.

Известен ряд причин, вызывающих нарушение прямо пропорциональной зависимости между абсорбцией и концентрацией вещества в растворах. К ним относятся:

присутствие в среде посторонних электролитов, вызывающих деформацию молекул или комплексных ионов окрашенных веществ;
гидратация (сольватация), сказывающаяся на поглощении раствором светового потока: с изменением концентрации раствора этот процесс протекает неравнозначно;
неполное взаимодействие исследуемого вещества с реактивом при его разбавлении;
изменение взаимовлияния частиц при разбавлении раствора;
сдвиг рН раствора, влияющий на полноту образования и состав молекул окрашенного соединения;
изменение степени диссоциации вещества в растворе при разбавлении.

Основное значение в нарушении прямо пропорциональной зависимости между абсорбцией и концентрацией имеет то обстоятельство, что сопровождающаяся образованием окрашенного соединения химическая реакция протекает не строго стехиометрично, т. е. реакция не всегда бывает полной. Примером этому служит взаимодействие аммиака с реактивом Нессера.

Кроме причин, связанных с состоянием вещества в растворе, ряд физических факторов, в частности недостаточная монохроматизация светового потока, способны вызвать отклонения в прямо пропорциональной зависимости между оптической плотностью и концентрацией. В случае, если через абсорбируемый слой пропускается немонохроматический световой поток, то величина экстинкции может изменяться неравномерно с увеличением (уменьшением) толщины слоя раствора и концентрации вещества в нем, приводя тем самым к искривлению калибровочной линии.

1.1. Построение простой калибровочной кривой и ее проверка

Для построения простой калибровочной кривой приготовляют 5 разных разведений из концентрированного (основного) стандартного раствора. Абсорбцию каждой пробы, включая «холостую», определяют 3 раза. При этом в качестве раствора сравнения используют воду или соответствующий растворитель. Для каждого из 6 троекратных определений (5 исследований раствора стандарта и одно — «холостой пробы») вычисляют средние величины. Усредненный показатель «холостой пробы» вычитают из аналогичных величин стандартных проб.

Скорректированные таким образом средние значения абсорбции располагают на оси ординат калибровочного графика (величина экстинкции «холостой пробы» совпадает с нулевой точкой координат). Из соответствующих точек оси ординат проводят тонкие линии, параллельные оси абсцисс.

На оси абсцисс наносят значения концентрации. Из полученных точек восстанавливают перпендикуляры и через места их пересечений с перпендикулярами, восстановленными из соответствующих точек оси ординат, проводят калибровочную кривую.

Для проверки простой калибровочной кривой третья (средняя) концентрация определяется 20 раз, и из 20 полученных величин вычисляют Х (среднюю арифметическую) и S (среднеквадратическое, или стандартное, отклонение). После этого через нулевую точку и точку средней величины 20-кратного определения проводят прямую линию. Основные калибровочные точки должны быть расположены от этой прямой не дальше чем на +1,2 S. Если это условие выполнено, то калибровочная кривая может считаться прямолинейной и достаточно точной.

1.2. Пример построения калибровочной кривой

Пусть требуется построить калибровочную кривую для определения в сыворотке (плазме) крови концентрации вещества А. Если оно у практически здоровых людей составляет 60—80 г/л, то для построения калибровочной кривой используют растворы стандарта с концентрацией, охватывающей физиологические величины и выходящей за их пределы. Выбирают, например, интервал значений 20—120 г/л. Поскольку стандартное вещество — как правило, дефицитный реактив, а со временем техника выполнения анализа совершенствуется, то для сохранения стандарта и соблюдения одинаковых условий определения на протяжении всего периода исследований строить калибровочную кривую можно лишь после того, как возникает уверенность в том, что техника аналитических определений достаточно хорошо отлажена и в дальнейшем не будет изменяться. Об этом свидетельствует хорошая воспроизводимость результатов в серии и изо дня в день.

Сначала готовят основной раствор. Чем он концентрированнее, тем дольше сохраняется в нем стандартное вещество. Даже если концентрация основного стандартного раствора является неточной (процентной), готовить его следует, пользуясь весами для очень точного взвешивания и точной мерной посудой. Иногда приготовляют промежуточные разбавления (перед получением ряда рабочих растворов стандарта), но чаще всего из основного раствора сразу получают конечные разбавления. Из каждого разведения основного раствора стандарта с концентрацией 20, 40, 60, 80, 100 и 120 г/л отбирают, к примеру, по 0,1 мл раствора (ровно столько, сколько берется сыворотки или другого биологического материала для исследования) и вносят в первые три пробирки каждого из трех рядов их, размещенных в большом четырехрядном штативе. В последующем в пробирки добавляют «цветной» реагент известного объема. Определяют экстинкцию каждого из растворов, содержащих одинаковое количество стандартного вещества, и полученные значения абсорбции усредняют (если одно из трех «выскакивает», то его не учитывают: оно знаменует собой техническую ошибку взвешивания). Допустимо наносить (в виде крестика) каждое из трех определений в выбранной системе координат и в дальнейшем из них брать среднее по расположению в системе координат.

На миллиметровой (калибровочной) бумаге вычерчивают оси координат. На оси ординат откладывают значения абсорбции, на оси абсцисс — концентрации. Чтобы считываемые с калибровочной кривой значения были более точными, следует брать масштаб графика достаточно крупным.

Опыт работы показывает, что масштаб калибровочного графика должен быть 20 см и более на общих осях. Чтобы кривая располагалась под углом ~ 45° к осям, берут максимальные значения концентрации и абсорбции, если между ними в пределах этих значений сохраняется прямо пропорциональная зависимость. В приведенном нами конкретном примере отрезок из 20 крупных (односантиметровых, десятимиллиметровых) клеток на оси абсцисс составляет 120 г/л, а на оси ординат максимальное из полученных для 6 определений значение абсорбции равно 0,6. На основании этих данных находят факторы калибровки по формулам (1) и (2).

(1)

(2)

где 6 г/л и 0,03 — значения концентрации и абсорбции, соответствующие масштабу 1 см (одна крупная клетка). Разделив 6 г/л и 0,03 на 10, находят цену 1 мм деления на осях абсцисс и ординат.

Через точки, обозначенные крестиками, проводят линию, пользуясь прозрачной линейкой, так, чтобы она проходила через большинство точек. Точки, не попавшие на линию, должны располагаться поблизости от нее, будучи равномерно удалены в ту и другую стороны.

Чтобы облегчить процедуру откладывания на оси ординат значений абсорбции стандартных и опытных проб, рекомендуется разделить величину экстинкции (например 0,2) на 0,03 (0,2/0,03). Полученное число (в данном случае 6,67) показывает, на каком удалении от нулевой точки в сантиметрах следует сделать отметку для восстановления из нее перпендикуляра: отмеряют отрезок в 6 крупных (1 см) клеток и 7 мм. Так же поступают со всеми остальными значениями, чтобы их разместить на вертикальной и горизонтальной осях. Из отложенных на осях значений восстанавливают перпендикуляры, места пересечения тонких линий обозначают крестиками; ориентируясь на них, проводят калибровочную кривую.

Помимо нахождения факторов, отражающих цену деления большой и малой клетки на горизонтальной и вертикальной осях, рассчитывают фактор пересчета по формуле: ƒ = С/А. При этом лучше всего найти соответствующий фактор для каждой из шести точек измерений и затем установить среднее значение этих показателей:

С помощью микрокалькулятора можно быстро определить концентрацию вещества в опытной пробе по формуле: С = ƒА, даже если число ƒ не круглое.

Цену деления на оси ординат можно найти и другим способом. Пусть А1 = 0,28; С1 = 60 г/л; А2 = 0,40; С2 = 80 г/л. Составляем пропорцию: 0,28 — 60, 0,01 — X.

На осях координат отмеривают одинаковые отрезки для соответствующих показателей абсорбции и концентрации.

1.3. Расчет результатов по градуировочной кривой

Для облегчения расчетов рекомендуется на основании калибровочной кривой составить калибровочную J(rpany-ировочную) таблицу. С этой целью всего лишь один раз находят концентрации вещества для каждого из значений абсорбции, взятого с интервалом 0,02 А (удобно пользоваться фактором пересчета). В подготовленной таблице 2 против каждого значения абсорбции приводят соответствующее значение концентрации. При промежуточных значениях абсорбции берут примерно соответствующие им (ориентировочные) показатели концентрации.

Таблица 2

Градуировочная таблица для нахождения концентрации анализируемого вещества
А	с	А	с
0,02	20	0,08	80
0,04	40	0,10	100
0,06	60	0,12	120

Калибровку (градуировку) следует проверять не менее 2 раз в год. Но при переходе на реактивы иной серии (квалификации), изменении юстировки лампы, замене каких-либо деталей в приборе необходимо строить новую калибровочную кривую. Недопустимо использовать калибровочные факторы, выведенные при пользовании другими фотометрами, даже если они того же типа. Использование калибровочных факторов, прилагаемых к описанию фотометров, также не рекомендуется. Они могут быть приведены только для сравнения и исключения грубых ошибок.

2. РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПО ФОРМУЛЕ

Помимо расчета результатов по калибровочной кривой, можно применять способ расчета с помощью стандарта по формуле. В некоторых случаях этот способ расчета является единственно допустимым (например при определении концентрации глюкозы ортотолуидиновым методом, поскольку даже небольшое изменение условий прогревания проб может существенно сказаться на результатах, получаемых с использованием калибровочной кривой). Рекомендуется ставить не одну, а несколько стандартных проб, притом не только с одинаковой концентрацией стандарта (как, например, в случае определения содержания неорганического фосфора унифицированным методом), а разной, в том числе более высокой (например при исследовании концентрации глюкозы у больных сахарным диабетом), поскольку результаты получаются более точными, если величины абсорбции сопоставляемых проб очень близки.

Несмотря на то, что процедуры обработки стандартной и опытных проб производятся каждый раз параллельно, наиболее точные результаты, считают, дает способ расчета по калибровочной кривой, поскольку исследование лишь одной или даже нескольких стандартных проб может привести к появлению грубой ошибки измерения. К тому же основывающаяся на допущении о всегда имеющей место прямой пропорциональной зависимости между абсорбцией и концентрацией концепция расчета по стандарту на практике оказывается не всегда верной.

Расчет результатов по формуле при выполнении исследований в режиме фиксированного времени (или кинетическом) приведен в Главе 8, Раздел 3.

3. РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ В УСЛОВНЫХ ЕДИНИЦАХ

Осуществляется в единицах оптической плотности или в единицах абсорбции, умноженных на 100 или 1000 в зависимости от точности, с которой устанавливаются значения: до второго или третьего знака после запятой. Этим способом обычно пользуются при невозможности получить вещество в чистом виде путем синтеза или выделения его из биологических жидкостей и тканей, например, при определении содержания апо-В-липопротеинов в сыворотке крови.

1. Чистая слобода города Новосибирска
2. Что такое perpetuum mobile Бертольд.
3. Реферат- технологическая практика ПрограммаShower-конвертор табличных файлов
4. Математичні методи в психології
5. МОДУЛЬНИЙ КОНТРОЛЬ 2 Семестр осінній Дисципліна Основи програмування і алгоритмічні мовиrdquo; К
6. К юношам о том, как получать пользу из языческих сочинений
7. Чукотско-камчатские языки.html
8. я или другими словами
9. Разобьем отрезок [;b] произвольным образом на части с длинами xk [~
10. Курсовая работа- Система подготовки квалифицированных рабочих в Болгарии
11. отец логики ученик и решительный противник Платона
12. град Балаклею вздовж р
13. Основные этапы и цели моделирования
14. УТВЕРЖДАЮ Проректор по учебной работе 200 г
15. Перечислите признаки классификации текстильных волокон
16. технического прогресса век космических скоростей
17. Оценка деятельности психологической службы на предприятии
18. Средневековая культура западной Европы
19. вариант Из аминокислот ЛЕЙ МЕТ СЕР ТИР ЦИС АРГ составьте полипептид гидролизуемый трипсином
20. I Il est midi ce mrdi et en ce moment j~ttends Je suis rriv~ il y une heure ~ onze heures l~heure de mon rendezvous vec l jolie employ~e de l~gence immobili~re qui doit me fire visite

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе