Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Московский Государственный Технический Университет им. Н. Э. Баумана
Отчет по лабораторной работе №2
«Исследование характеристик биологических микрообъектов с помощью поляризационно-интерференционного микроскопа»
Выполнили:
Анцыгина А.
Добровольский Д.
Ким И.
Комаров А.
Краснов Е.
Куликов И.
Тюрин И.
г. Москва 2012 г.
Теоретическая часть.
Цель работы ─ изучение принципа работы биологического поляризационно-интерференционного микроскопа и проведение качественных и количественных исследований биологических микрообъектов с помощью изученных методов.
Микрообъектами считаются объекты с угловыми размерами менее 1΄. Такое значение связано с биологическим пределом разрешения органа зрения человека, задаваемым поперечным размером рецепторов (колбочек) на сетчатке глаза (около 2…2,5 мкм). Соответствующий угол ψ определяется как отношение этого размера к фокусному расстоянию f усредненного глаза (по Гульстранду). Если f 15 мм, то оценка предельного угла дает значение min 1,510-4 рад, или около 30´´. Но реальное предельное значение следует брать примерно вдвое бόльшим, поскольку при усредненной оценке полагают достаточно большим уровень видимой яркости наблюдаемого объекта, а также сосредоточение его изображения в области центральной ямки на сетчатке, образующей круг радиусом около 0,2 мм. Очевидно, что такие условия на практике почти никогда не выполняются. Линейный размер объекта, различаемого под углом 1´ с расстояния наилучшего зрения 250 мм, составляет примерно 0,07…0,1 мм (толщина лезвия от безопасной бритвы).
Таким образом, микрообъектом считается объект, размеры которого невозможно оценить невооруженным глазом из-за слишком малого угла зрения.
Рис.1.
Метод Цернике, заключающийся во введении в заднюю фокальную плоскость объектива тонкой пластинки, вызывающей отставание или опережение фазы в нулевом порядке дифракции относительно остальных порядков на четверть периода. В результате области объекта с большей оптической толщиной кажутся либо более темными, либо более светлыми по сравнению с общим фоном (темный или светлый фазовый контраст).
Модификация метода Цернике называется методом фазового кольца. Этот метод вполне применим для анализа биологических микрообъектов, но он вносит значительную инструментальную погрешность, практически не позволяющую определять количественные характеристики объекта по наблюдаемому изображению.
2.Принцип работы поляризационно-интерференционного
микроскопа (ПИМ)
Расстояние L от заднего фокуса объектива до переднего фокуса окуляра, почти равное при этом расстоянию от выходной линзы объектива до промежуточного изображения, называется оптической длиной тубуса микроскопа.
Увеличение, при котором выходной зрачок прибора и входной зрачок глаза совпадают, называется нормальным.
Нормальное увеличение микроскопа составляет
(2)
где α ─ входной апертурный угол со стороны объектива, n ─ показатель преломления среды в пространстве между образцом и объективом.
Увеличение микроскопа, при котором реализуется максимальное разрешение, называется полезным.
на основании критерия Рэлея из дифракционных соображений:
(3)
где dмин определяется по формуле Аббе:
(4)
Известно, что предельно разрешаемый угол зрения ψmin, определяемый физиологически, с точностью до справедливости модели усредненного глаза по Гульстранду совпадает с предельным разрешаемым углом зрения, определяемым из дифракционных соображений согласно критерию Рэлея. Глаз при этом рассматривается как аналог объектива телескопической системы. В то же время предельно разрешаемое микроскопом расстояние dмин по формуле Аббе (4) также определяется по критерию Рэлея. Отсюда следует, что дифракционная оценка предельного разрешения приводит к совпадению значений Nнорм = Nпол, хотя требования нормальности и полезности увеличения выдвигаются из принципиально различных соображений.
Оптические схемы поляризационно-интерференционного (б)
при выделении фазовых искажений, вносимых прозрачным объектом, необходимо создавать плоский волновой фронт, т.е. применять схему освещения по Кёлеру (см. рис. 2, б).
Коллектор Кол проецирует источник света Z (спираль лампы имеет малые размеры, моделируя точечный источник) в плоскость апертурной диафрагмы D , расположенной в фокусе конденсора К. Конденсор К проецирует в плоскость объекта В диафрагму поля зрения Dp, расположенную вплотную к коллектору Кол. Тем самым достигаются как квазипараллельность пучка, пронизывающего объект, так и равномерность освещения объекта за счет ограничения диаметра пучка диафрагмой поля зрения Dp.
При одновременном наблюдении картины полос и раздвоенного изображения искажения выглядят как смещение полос в противоположных направлениях (метод интерференционных полос). Измеряя это смещение и сравнивая его с расстоянием между неискаженными полосами, можно определить толщину микрообъекта t. Одновременно можно определить поперечные размеры объекта аналогично тому, как это делается при работе с обычным микроскопом
В силу малости расхождения обыкновенной и необыкновенной волн такая разновидность метода однородного цвета называется дифференциальным методом. Этимология этого названия может быть объяснена как малостью расхождения волн, так и фиксацией цветовых различий объект-фон, составляющей основу метода.
Второй метод борьбы с раздвоенностью изображений при однородном цвете как бы противоположен дифференциальному ─ «обыкновенное» и «необыкновенное» изображения не сливаются, а, напротив, раздвигаются настолько, чтобы заведомо друг на друга не накладываться (метод однородного цвета с большим раздвоением изображения).
Практическая часть.
1. Подготовили к работе микроскоп и препараты;
2. Провели сравнительное качественное исследование микрообъектов дифференциальным и обычным (светополным) методом;
Цена деления микрометрической шкалы окуляра 12Х для микроскопа типа BIOLAR, измеренная с помощью микрометрической плитки по п. 3.2.4.
(в зависимости от увеличения объектива)
|
Объектив |
Число измерений |
Цена деления (мкм) |
|
10Х |
6 |
6,250±0,000 |
|
20Х |
7 |
3,343±0,002 |
|
40Х |
6 |
1,647±0,003 |
|
100Х |
10 |
0,669±0,023 |
Таблица 2.
Межполосное расстояние (в мкм) для микроскопа типа BIOLAR
(ориентировочные данные для измерения по п. 3.2.5)
|
Межполосное расстояние h (мкм) |
Свет от источника |
ДПП № 1 (дифференциальная) |
ДПП № 2 (с полосами) |
|
Зеленый (λ = 546 νм) |
2500 |
190 |
|
|
Оранжевый (λ = 590 нм) |
2750 |
205 |
|
|
Белый (λср = 550 нм) |
2550 |
193 |
3. Измерение методом полос.
Искомая разность хода Ψ определяется по формуле:
=1/7х205=29,28 нм
λ=205 нм
4.Произвели калибровку микроскопа для количественного анализа (согласно пп. 3.2.4, 3.2.5);
5. Установили вместо окулярной насадки видеонасадку с Web-камерой (см. п.3.3). Получили изображение микрообъекта на экране компьютера и произвели подстройку в рамках приложения Quick Cam. Привели в соответствие характеристики изображения с данными калибровки
6. Определили поперечные размеры, геометрическую толщину и показатель преломления исследуемого объекта.
20 мкм Объектив 100Х
Картинка 1 Картинка 2
|
Dэл1 =8 мкм |
Dэл1 =8.3 мкм |
|
|
Dэл2 =8.5 мкм |
Dэл2 =8.6 мкм |
|
|
Dэл3 =7.8 мкм |
Dэл3 =8.5 мкм |
|
|
Dэл4 =8.5 мкм |
Dэл4 =8.1 мкм |
|
|
Dэл5 =8 мкм |
Dэл5 =7.9 мкм |
|
|
Dэл6 =8.3 мкм |
Dэл6 =8.5 мкм |
|
|
Dэл7 =8.2 мкм |
Dэл7 =8.2 мкм |
|
|
Dэл8 =7 мкм |
Dэл8 =7.8 мкм |
|
|
Dср =8.0375 мкм |
Dср =8.2375 мкм |
|
|
Dср =8.14 мкм |
Дисперсия
_______
σ= ∑(хn-x)2 = 0.398
√ (n-1)
7. Hесколько типичных картин, наблюдаемых на дисплее
Рис.1
Рис.2
Рис.3
Рис.4
Рис.5
Биологические микрообъекты
Структурные компоненты клеток (мембраны, ядро, органеллы
и т. д.)
субклеточный уровень
Одиночные клетки
(элементы крови, бактерии, простейшие микроорганизмы и т. д.)
клеточный уровень
Тканевые и мультиклеточные структуры
(фрагменты биотканей, колонии клеток и т. д.)
тканевый уровень
ол