Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
им. В.И.ВЕРНАДСКОГО
Кафедра физиологии растений и биотехнологии
Методические материалы и задания
к лабораторным работам
по курсу «Общая микробиология»
для студентов 3 курса дневной и 4 курса заочной форм обучения
специальности 6.070400 «биология»
образовательно-квалификационного уровня «бакалавр»
профессионального направления подготовки
0704 «биология»
Составитель: И.П.Отурина
СИМФЕРОПОЛЬ 2001
Печатается по решению научно-методического совета ТНУ
от “ 15 ” мая 2001 г.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ…………….. 4
Организация микробиологической лаборатории и
рабочее место микробиолога………………………………… 4
Правила работы и техники безопасности
в микробиологической лаборатории………………………… 5
Неотложная медицинская помощь в лаборатории………….. 6
Занятие 1. СТЕРИЛИЗАЦИЯ. Методы стерилизации.
Подготовка посуды, инструментов, материалов к
стерилизации…………………………………………………. 6
Занятие 2. ПИЩЕВЫЕ ПОТРЕБНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ……… 13
Занятие 3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ. 24
Занятие 4. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО
ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ……………….. 27
Занятие 5. ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ. ДРОЖЖИ.
АКТИНОМИЦЕТЫ……………………………………………32
Занятие 6. МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ……………………. 34
Занятие 7. СТРОЕНИЕ МИКРОБНОЙ КЛЕТКИ……………36
Движение и кислотоустойчивость бактерий.
капсулы и эндоспоры………………………………………….38
Окраска бактерий по Граму………………………………….. 40
Включения микробной клетки………………………………. 42
Занятие 8. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ
МИКРООРГАНИЗМОВ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ
КУЛЬТУР………………………………………………………44
Занятие 9. УЧАСТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В
КРУГОВОРОТЕ УГЛЕРОДА…………………………………49
Занятие 10. УЧАСТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В
ПРОЦЕССАХ БРОЖЕНИЯ……………………………………51
Занятие 11. УЧАСТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В
КРУГОВОРОТЕ АЗОТА………………………………………54
Занятие 12. МИКРОФЛОРА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ….. 57
Занятие 13. ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ………….. 60
Занятие 14. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ……………………. 62
ОПИСАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ………………………………………. 64
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………66
Микробиология – наука о мельчайших существах – микроорганизмах, производящих чрезвычайно важные превращения в субстратах, на которых они развиваются, поэтому играющих в жизни природы и человека огромную роль. Изучение микроорганизмов, их морфологии, физиологии имеет очень большое и важное значение как для использования их в научно-практических целях, так и для своевременной и правильной борьбы с ними.
Бурное развитие микробиологии в последние десятилетия привело к дроблению этой науки на ряд специализированных направлений, большинство из которых все больше обособляются от исходной общей микробиологии, превращаясь в самостоятельные дисциплины со своими проблемами, методами.
Однако общая микробиология сохраняет свой предмет и значение как наука, изучающая все многообразие микроорганизмов различных профилей. Сведения по микробиологии необходимы каждому биологу, т.к. отдельные группы микроорганизмов порой различаются между собой больше, чем высшие растения и животные. Именно среди микроорганизмов можно найти наибольшее число типов метаболизма, связанных с существованием в разнообразных, иногда экстремальных условиях.
Для изучения микроорганизмов применяют ряд специфических методов, сущность которых определяется особенностями микробных леток. К числу этих особенностей относятся микроскопические размеры, одноклеточное строение, высокие скорости обмена веществ и размножения, высокая изменчивость и адаптационная способность, обусловленные широким спектром их ферментативной активности и разнообразием процессов метаболизма, свойство некоторых микробов вызывать заболевания человека, животных и растений. Микроорганизмы заселяют практически все естественные и искусственные субстраты, образуя смешанные популяции микробов. Поэтому исходными этапами любого микробиологического исследования являются: 1) выделение (изоляция) определенных видов (чистых культур) микроорганизмов из смешанных популяций; 2) культивирование (выращивание) чистых культур микроорганизмов в лабораторных условиях с целью изучения морфологии их клеток, культуральных, физиолого-биохимических и генетических свойств.
Лабораторные занятия по микробиологии дополняют теоретический курс, позволяют лучше усвоить его, знакомят с фактическим материалом на практике.
Данные методические указания предназначены для проведения лабораторного практикума по общей микробиологии для студентов биологических специальностей университетов и могут быть использованы для методических рекомендаций к выполнению научно-исследовательской работы студентов.
Организация микробиологической лаборатории и рабочего места микробиолога. Современная микробиологическая лаборатория представляет собой комплекс помещений, оборудования и приборов, позволяющих использовать различные приемы для выращивания бактерий, выделения их чистых культур, изучения морфолого-культуральных, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических свойств. Лаборатории включают комнаты для микробиологических исследований и подсобные помещения. В светлых и просторных рабочих комнатах стены на высоту до 170 см от пола окрашивают в светлые тона масляной краской или выкладывают кафельной плиткой, а пол покрывают линолеумом. Такого рода отделка позволяет проводить влажную уборку с применением растворов дезинфицирующих веществ. Для удобства дезинфекции столов, находящихся в лаборатории, их покрывают пластиком. Лабораторные помещения оборудуются шкафами и полками для хранения аппаратуры, посуды, красок и реактивов. Комнаты лаборатории должны хорошо проветриваться. В число рабочих помещений входят следующие комнаты: для посева микроорганизмов, термостатная, средоварочная, для микроскопии, центрифужная, для биохимических исследований и др.
К подсобным помещениям относятся: автоклавная или стерилизационная для стерилизации сред, посуды, уничтожения отработанного материала; моечная, оборудованная для мытья посуды; средоварочная для приготовления, разлива и хранения питательных сред; материальная для хранения реактивов, посуды, аппаратуры; виварий для содержания подопытных животных.
Для обеспечения стерильности работу с микроорганизмами лучше проводить в специальных стеклянных камерах-боксах, которые бывают разных размеров. В боксах вмонтированы ультрафиолетовые лампы-излучатели, уничтожающие микроорганизмы в воздухе и (или) спиртовые горелки. В настоящее время почти во всех лабораториях применяют газовые горелки Теклю.
Большое значение для успешной работы имеет правильная организация рабочего места микробиолога. Лабораторный стол должен быть хорошо освещен солнечным или искусственным светом. За каждым студентом за весь период практикума закрепляется постоянное рабочее место. В зависимости от темы занятия рабочее место оснащается необходимыми материалами и оборудованием: газовой горелкой или спиртовкой, штативом под пробирки, стерильными пробирками, бактериологической петлей и иглой, стеклянными шпателями, пипетками, градуированными и Пастера, ножницами, банкой с ватой, фильтровальной бумагой, набором красок и реактивов для окраски препаратов, предметными и покровными стеклами, установкой для окраски и промывания препаратов, микроскопом, флаконом с иммерсионным маслом, банкой с дезинфицирующим раствором, карандашами по стеклу и др.
Правила работы и техника безопасности в микробиологической
лаборатории:
При ранении стеклом нужно удалить его осколки из раны, смазать ее йодом и перевязать.
При термических ожогах обоженное место необходимо поместить под струю холодной воды, а затем присыпать гидрокарбонатом натрия или обработать примочками из свежеприготовленных растворов питьевой соды (2%) или перманганата калия (5%), или 100-960-ым этиловым спиртом, оказывающим обеззараживающее и обезболивающее действие.
При ожогах кислотами или щелочами пораженный участок быстро промывают большим количеством воды, затем на обожженное место накладывают примочку: при ожогах кислотой – из 2%-го содового раствора, при ожогах щелочью – из слабого раствора уксусной кислоты.
З а н я т и е 1. СТЕРИЛИЗАЦИЯ.
Методы стерилизации. Подготовка посуды, инструментов
и материалов к стерилизации
Цель занятия: ознакомиться с принципами и методами стерилизации, освоить правила подготовки посуды и инструментов к стерилизации.
Полное освобождение любого материала от живых микроорганизмов и их покоящихся форм называется стерилизацией, или обеспложиванием. В основу стерилизации положена способность определенных факторов вызывать гибель микроорганизмов и их спор. Агенты, вызывающие гибель микробных клеток, называются бактерицидными. В качестве стерилизующих используются прежде всего те из них, для которых не возникает необходимость последующего их удаления с обрабатываемого материала. К таким агентам относятся высокая температура, лучевая энергия, некоторые летучие химические соединения. Жидкости можно освободить от микробов фильтрованием.
Наиболее часто для стерилизации используют высокие температуры, вызывающие гибель клеток микроорганизмов. Действие на микроорганизмы низких температур (–190C в жидком азоте или при –252С в жидком кислороде) не вызывает значительных изменений в их клетках. Эффективность бактерицидного действия температурного фактора зависит от степени нагревания, продолжительности воздействия данной температуры, вида микроорганизма, а также от состава среды, в которой он находится. Для уничтожения вегетативных форм большинства микробов достаточно температуры в пределах 61,5-85С и экспозиции соответственно от 30 до 3 мин. Споры бактерий погибают при температуре выше 100 С. Следует помнить, что при снижении влажности устойчивость бактерий и их спор к высоким температурам повышается. Так, в условиях влажного жара споры гибнут при 110-120С в течение 20-30 мин, а в условиях сухого жара – при 180 С и экспозиции 45 мин.
Микроорганизмы существенно отличаются по чувствительности к действию температуры, что, по-видимому, можно объяснить различной организацией их клеток и, прежде всего, их оболочек. Так, необратимые процессы в клетках пневмококков начинаются при температуре 45-50 С, а в клетках стафилококков – при 60-70 С. В то же время ряд термофильных бактерий Methanobacterium thermoautotrophicum, Thermoactinomyces vulgaris и других вегетируют при температуре 60 – 700 С и даже при более высоких. Гибель микроорганизмов под действием высоких температур наступает вследствие денатурации клеточных белков. Помимо этого высокие температуры разрушают осмотический барьер клеток, нарушают равновесие ферментативных реакций и пр.
Стерилизация под действием высоких температур может осуществляться различными способами: прокаливанием в пламени горелки, кипячением, пастеризацией, сухим жаром, влажным жаром, насыщенным паром под давлением (автоклавирование).
ФЛАМБИРОВАНИЕМ (прокаливанием в пламени горелки) стерилизуют бактериологические петли, бактериологические иглы, кончики пинцетов, пробочные сверла и некоторые металлические предметы. В микробиологической практике часто пользуются бактериологической петлей, которая служит для забора микробного материала. Изготавливается бактериологическая петля из платиновой или нихромовой проволоки длиной 8-10 см, один конец которой загнут в виде круга, другой закрепляется в специальном металлическом держателе.
СТЕРИЛИЗАЦИЮ КИПЯЧЕНИЕМ производят в стерилизаторе на слабом огне, чтобы избежать разбрызгивания жидкости. Началом стерилизации считается момент закипания воды в стерилизаторе. По окончании кипячения воду сливают и инструменты берут стерильным пинцетом. Кипячением стерилизуют шприцы (в разобранном виде), металлические инструменты (ножницы, скальпели, пинцеты), резиновые перчатки и пробки и пр. Инструменты, содержащие металлические части, стерилизуют в 2%-м растворе гидрокарбоната натрия, который предупреждает появление ржавчины.
ПАСТЕРИЗАЦИЯ (неполная стерилизация) – это уничтожение в материале только вегетативных клеток микроорганизмов. С этой целью его подвергают воздействию температуры 75-80 С в течение 5-10 мин. Пастеризуют чаще всего продукты питания (молоко, соки, ягоды, фрукты, вина и т.д.), которые при воздействии высоких температур теряют свои вкусовые и пищевые качества. При пастеризации гибнут споры грибов, вегетативные клетки бактерий, в том числе и патогенных, тогда как бактериальные эндоспоры остаются жизнеспособными. Их прорастанию при хранении продуктов препятствуют низкие значения рН, высокие концентрации сахара, отсутствие кислорода и некоторые другие факторы.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ СУХИМ ЖАРОМ осуществляется в сушильных шкафах. Наиболее часто в лабораториях используется электрический сушильный шкаф 2В-151. Он состоит из корпуса, в котором находится цилиндрическая рабочая камера. В камере расположены съемные рабочие полки. Шкаф обогревается при помощи нагревательной проволоки, намотанной на термостойкую пластинку, находящуюся на наружной поверхности камеры. Пространство между стенками корпуса и рабочей камеры заполнено термоизоляционным материалом. В шкаф вмонтирован термометр. Обогрев регулируется при помощи автоматического терморегулятора.
Максимальная температура в сушильном шкафу достигает 200С. Горячим воздухом в сушильном шкафу чаще всего стерилизуют стеклянную посуду (пробирки, воронки, пипетки, стаканы, конические колбы Эрленмейера, колбы Бунзена, шприцы и т.д.). Перед стерилизацией посуду моют, сушат и заворачивают в бумагу, при этом пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками.
Продолжительность стерилизации при температуре 1600 С - 2 ч, при 1650 – 1ч, при 1800 – 40 мин, а при 2000 С – 10-15 мин. При стерилизации споры бактерий переносят высокую температуру в течение длительного времени.
Следует иметь в виду, что при температуре 1700 С бумага и вата желтеют, а при более высоких температурах – обугливаются. По окончании стерилизации сушильный шкаф выключают, но дверцы его не открывают до полного охлаждения, т.к. холодный воздух, поступающий внутрь шкафа, может вызвать образование трещин на горячей посуде.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ ВЛАЖНЫМ ЖАРОМ (текучим паром) или дробная стерилизация (тиндализация) производится в аппарате Коха или в автоклаве при открытом выпускном кране. Аппарат Коха представляет собой металлический полый цилиндр с двойным дном и электронагревательным устройством. Пространство между верхней и нижней пластинками дна заполняется на 2/3 водой. В крышке аппарата вмонтирован термометр и имеется отверстие для выхода пара. В аппарате Коха стерилизуют главным образом питательные среды, свойства которых изменяются при температурах выше 1000 С. Обработку материала текучим паром используют для проведения дробной стерилизации. При этом материал, чаще всего питательные среды, подвергается трех- или четырехкратной обработке влажным жаром в течение одного часа при температуре 56 – 750 С с интервалом 24 часа, в течение которых поддерживается температура, благоприятная для прорастания спор. Проросшие из спор вегетативные клетки быстро погибают при очередном нагревании материала.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ ВЛАЖНЫМ ЖАРОМ ПОД ДАВЛЕНИЕМ (АВТОКЛАВИРОВАНИЕ) основана на прогревании какого-либо материала насыщенным паром при давлении выше атмосферного. Известно, что температура насыщенного пара зависит от давления – с повышением давления его температура возрастает. В связи с тем, что с увеличением давления температура кипения жидкостей возрастает, появляется возможность стерилизовать их при 1000 С и выше, не допуская кипения и, следовательно, испарения и разбрызгивания. Продолжительность стерилизации паром под давлением зависит от химического состава стерилизуемого материала, видов микробов, находящихся в нем, а также от объёма (теплоёмкости) сосудов, в которых проводят стерилизацию. Условия повышенного давления насыщенного пара создают в специально герметически закрывающихся толстостенных аппаратах - автоклавах. Они бывают различной конструкции, но принципиальная схема их одна и та же. Эти две камеры – большая (рабочая или стерилизационная) и маленькая (водопаровая), сообщающиеся между собой трубопроводом с вентилем. Водопаровая камера сообщается также с внешней средой трубкой с водомерным стеклом, краном и воронкой, через которую она заполняется дистиллированной водой. Рабочая камера, в которую помещают стерилизуемый материал, снабжена краном для выхода воздуха, манометром для определения давления пара и предохранительным клапаном для выхода пара при чрезмерном повышении давления.
ПРАВИЛА РАБОТЫ С АВТОКЛАВОМ
В рабочую камеру помещают материал для стерилизации, а в водопаровую камеру наливают воду с таким расчетом, чтобы уровень ее в водомерной трубке был между верхней (максимальной) и нижней (минимальной) чертой. Крышку автоклава привинчивают к корпусу, завинчивая болты попарно во избежание перекоса крышки. Открывают краны и включают источник обогрева. Когда пар из выпускного крана начинает выходить непрерывной струей, кран закрывают и наблюдают за повышением давления по манометру.
Нагревание воды в водопаровой камере осуществляется с помощью вмонтированных в нее электродов и регулируется автоматически. Началом стерилизации считается тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. Это давление поддерживают путем регулирования подогрева. Между показаниями манометра и температурой кипения воды существует следующая зависимость:
Показатели манометра, атм: Температура кипения воды, 0 С:
0 (760 мм рт.ст.) 100
0,2 105
0,4 110
0,5 112
0,6 114
0,8 117
1,0 121
1,5 127
По окончании времени стерилизации подогрев прекращают. Необходимо дождаться, когда давление в автоклаве сравняется с атмосферным. Затем постепенно открывают кран, выводящий пар. Только после падения давления до нуля и выхода пара медленно отвинчивают болты крышки автоклава (снова крест-накрест), открывают крышку, ориентируя ее на себя для защиты от выходящего пара. Если во время стерилизации давление начинает подниматься выше заданного уровня, уменьшают нагрев или выпускают часть пара через предохранительный клапан. Для работы с автоклавом допускаются лица, прошедшие специальное обучение.
ПРОВЕРКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕПЛОВОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ. Поскольку при автоклавировании бактерицидное действие оказывают высокие температуры и насыщенный пар, а у большинства автоклавов (по соображениям простоты и безопасности) вмонтированы только манометры, каждый раз возникает необходимость убедиться в том, что материал подвергся воздействию стерилизующей температуры в течение достаточно длительного времени. Контроль температуры в автоклавах осуществятся при помощи специальных термоиндикаторов – термочувствительных красок, изменяющих окраску после воздействия стерилизующей температуры, или веществ (сера, сахар), плавящихся только при определенных температурах.
Контроль эффективности бактерицидного действия высоких температур осуществляют, помещая вместе с материалом, подлежащим стерилизации, полоски бумаги, на которые нанесены споры устойчивых к нагреванию бактерий, например, Bacillus subtilis или ампулы, содержащие споры В. stearothermophilus, которые относятся к числу наиболее термоустойчивых. После окончания стерилизации полоски бумаги или ампулы помещают в условия, благоприятные для прорастания спор.
Многие компоненты жидких питательных сред термолабильны и быстро разрушаются под воздействием высоких температур, поэтому жидкие питательные среды и другие жидкие материалы удобнее всего (значительно быстрее и эффективнее дробной стерилизации) стерилизовать фильтрованием. Впервые стерилизация жидкостей фильтрованием была проведена Шамберланом, учеником Пастера. Он изготовил фарфоровый фильтр, представляющий собой полый цилиндр, закрытый с одного конца и напоминающий свечу – свеча Шамберлана. Фильтр задерживает самые мелкие из всех известных бактерий. Для стерилизации питьевой воды используют фильтр Беркефельда – свеча Беркефельда. Стенки свеч Шамберлана и Беркефельда состоят из глинозема, фарфора или кизельгура. Эти материалы несут положительный электрический заряд, в то время как бактерии заряжены отрицательно. Таким образом, механизм фильтрации через свечи заключается не в «просеивающем» их действии, а носит адсорбирующий характер. К адсорбирующим относятся также фильтры, изготовленные из глины, асбеста и некоторых других материалов. Поры этих фильтров больше, чем размеры бактерий.
В настоящее время в микробиологической практике широко применяются асбестовые и стеклянные фильтры. Асбестовые фильтры представляют собой пластинки толщиной 3–5 мм и диаметром 35 и 140 мм. Для стерилизации используют отечественные фильтры марки «СФ» (стерилизующий фильтр). Перед употреблением асбестовые пластинки монтируют в специальный аппарат – прибор Зейтца, состоящий из двух частей: металлического или стеклянного полого цилиндра и нижней части с опорной сеткой. На опорную сетку кладут асбестовый фильтр и обе части аппарата соединяют винтами или зажимами. На трубку нижней части аппарата одевается резиновая пробка, посредством которой он вставляется в колбу Бунзена, приготовленный таким образом прибор Зейтца обертывают в бумагу и стерилизуют в автоклаве. Стерилизуемую жидкость наливают в цилиндр и соединяют боковой отросток колбы Бунзена с вакуум-насосом. В результате образующейся разности давлений жидкость проходит через асбестовый фильтр в приемник (колбу). В аппарат Зейтца могут монтироваться также стерилизующие стеклянные и мембранные фильтры.
Мембранные фильтры изготавливают из ацетата целлюлозы или нитроцеллюлозы, представляющие собой тесное переплетение нитроцеллюлозных волокон. Метод их изготовления позволяет контролировать максимальный размер частиц, проходящих через фильтр. Поры фильтров имеют неправильную форму и занимают примерно 80% его площади. Диапазон максимальных размеров задерживаемых частиц в зависимости от номера фильтра может варьировать от 0,01 до 8,0 мкм.
Вследствие малого размера пор и высокого поверхностного натяжения, возникающего при соприкосновении с жидкостью, с нитроцеллюлозными фильтрами работают, используя давление или разрежение. Чтобы уменьшить гидрофобность фильтров, в них вводят детергент (поверхностно-активное вещество), а во избежание высушивания обрабатывают глицерином.
Непосредственно перед применением мембранные фильтры стерилизуют кипячением. Их помещают в дистиллированную воду, подогретую до температуры 50-60 С, и, чтобы предупредить скручивание, кипятят на слабом огне в течение 30 мин, меняя 2–3 раза воду. При этом с пластинки фильтра удаляется глицерин. Стерильные фильтры во избежание их повреждения вынимают из стерилизатора фламбированным (стерильным) остуженным пинцетом с гладкими кончиками. Мембранные пластинки, как и асбестовые, монтируются в специальные фильтровальные аппараты, в том числе и аппарат Зейтца.
В настоящее время для стерилизации применяются также молекулярные фильтры, которые отделяют малые макромолекулы от больших и эффективно задерживают вирусные частицы. В качестве молекулярных фильтров используются мембраны «Диафло» или «Пелликон», выпускаемые американскими фирмами, а также отечественные ядерные фильтры (ядерные сита). Последние представляют собой тонкие лавсановые пленки с калиброванными тяжелыми ионами отверстиями, которые крепятся на более толстом поддерживающем слое с губчатой структурой. Диапазон молекулярных масс пропускаемых молекул варьирует от 500 до 100000 дальтон.
Стерилизация облучением
На клетки бактерий летальный эффект оказывают ультрафиолетовые, рентгеновские, гамма-, альфа-, бета-лучи и нейтроны. В лабораторных условиях обычно используют ультрафиолетовые лучи, источником которых являются бактерицидные лампы. Излучателем в них служит электрическая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления и испускающая линейчатый спектр в ультрафиолетовой области, более 80% энергии которого приходится на длину волны 253,7 нм. Бактерицидные лампы, применение которых ограничено из-за малой проникающей способности, используют для частичной стерилизации открытых поверхностей и воздуха помещений. Вегетативные формы более чувствительны к облучению, чем споры. Ультрафиолетовые лучи вызывают острое воспаление роговицы глаз, поэтому работают с кварцевыми лампами в защитных очках.
Химическая стерилизация (дезинфекция)
Дезинфекция представляет собой удаление или разрушение патогенных микроорганизмов, находящихся на неживых объектах, с помощью химических агентов – дезинфицирующих веществ. Она проводится, когда невозможно применить стерилизацию паром или другими физическими методами.
Бактерицидное действие химических агентов обусловлено активностью функциональных групп, концентрацией активного компонента вещества, длительностью контакта, рН, температурой, влажностью и присутствием органического вещества.
ГАЛОГЕНЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ (хлор, йод и др.). Основой хлорных дезинфицирующих веществ является гипохлорит натрия, широко применяются хлорамины, получаемые путем замещения хлором водорода аминовых или иминовых групп. Используются спиртовый раствор (настойка) йода или его производное (йодофор-вескодин). Хлор и йод активны против всех бактерий и их спор, но они активно соединяются с белком, поэтому в его присутствии их следует брать в избытке.
СОЕДИНЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ (ртути – хлорид ртути (II), оксицианид ртути, а также серебра, меди) в большей степени оказывают бактериостатическое действие.
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ (о-фенилфенол) эффективны против вегетативных клеток в больших разведениях, но часто неэффективны против бактериальных спор.
СПИРТЫ (этиловый, изопропиловый) содержат гидроксильные группы, придающие им бактерицидные свойства. Дезинфицирующие свойства спиртов увеличиваются прямо пропорционально концентрации от 50 до 700. Спирты не вызывают гибели спор и обладают медленным обеззараживающим действием.
МИКРООЦИДНЫЕ ГАЗЫ (формальдегид, окись этилена, пропиолактон). Формальдегид обладает выраженной спороцидной активностью, но острым раздражающим запахом и способностью образовывать на поверхности стерилизуемого органического материала слой свернувшегося вещества, защищающий находящиеся внутри микроорганизмы. Максимальный стерилизующий эффект отмечается при относительной влажности 70% и температуре 220 С. При низких температурах формальдегид теряет активность. Окись этилена, используемая в виде газовой смеси, в которой на ее долю приходится от 2 до 50%, а вторым компонентом является азот или углекислота, эффективно убивает вегетативные клетки и споры бактерий. Окись этилена не оказывает вредного действия на органические материалы, легко повреждающиеся при нагревании, поэтому ее применяют для стерилизации питательных сред, содержащих термолабильные компоненты. Окись этилена токсична, нестойкая и распадается в водных растворах, образуя этиленгликоль, а также взрывоопасна.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ
дезинфекции?
З а н я т и е 2. ПИЩЕВЫЕ ПОТРЕБНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Цель занятия: ознакомиться с потребностями микроорганизмов в питательных веществах и принципами составления питательных сред для выращивания микроорганизмов.
Микроорганизмам, как и всем другим организмам, необходим на бор различных химических элементов. Некоторых элементов – C, P, N, H, O, S, Ca, Mg, K, Fe требуется в относительно больших количе ствах и поэтому их относят к макроэлементам, а других – Zn, Mn, Co, Mo, B, I – достаточно наличия следов, поэтому их называют микро элементами. Кроме того, микроорганизмам нужны некоторые гото вые органические соединения, называемые факторами роста.
Микроорганизмы различаются по потребностям в химических элементах и возможностям их использования. Больше всего они различаются между собой по потребностям в источниках углерода и азота.
По отношению к источникам углерода микроорганизмы делят на две большие группы - автотрофы и гетеротрофы.
Автотрофы (от греч. autos – сам и trophe – питание) превращают не имеющую энергетической ценности углекислоту, в которой углерод находится в наиболее окисленной форме, в богатые энер гией органические соединения собственной клетки. Для восстановления СО2 до уровня органических компонентов клетки они используют разные источники энергии. На основании энергетических источников авто трофы делят на две группы: литотрофы (от греч. lithos – камень, минерал), которые используют энергию окисления минеральных веществ, и фототрофы (от греч. photos – свет), использующие энергию солнечного света.
Гетеротрофы (от греч. heteros – другой) не способны добывать энергию для ассимиляции углерода из СО2 путем окисления мине ральных веществ или солнечного света и поэтому нуждаются в гото вых органических соединениях, которые они используют и как ис точник углерода, и как источник энергии. Среди них есть такие, которые довольствуются всего одним органическим субстра том и самостоятельно строят из него все метаболиты собственной клетки, и есть организмы, нуждающиеся в большом наборе углево дов, готовых аминокислот и дополнительных факторов роста в виде сложных органических субстратов.
Большинство гетеротрофных организмов также используют небольшие количества углекислоты, но для них СО2 – только дополнительный источник углерода.
Усвоение микроорганизмами различных источников углерода и происходящие при этом энергетические процессы положены в основу классификации микроорганизмов по типам питания (табл.):
|
Источник энергии |
Окисляемый субстрат |
Источник углерода |
|
|
органические соединения |
углекислота |
||
|
свет |
органические соединения неорганические соединения |
фотоорганогетеротрофия фотолитогетеротрофия |
фотоорганоавтотрофия фотолитоавто-трофия |
|
органические соединения |
органические соединения |
хемоорганогетеротрофия |
хемоорганоавтотрофия |
|
неорганические соединения |
неорганические соединения |
хемолитогетеротрофия |
хемолитоавто-трофия |
Источником азота для микроорганизмов могут быть также различные органические и минеральные соединения. Многие организмы могут использовать органические азотсодержащие вещества (белки, аминокислоты), которые в этом случае являются для них одновременно источниками азота и источниками углерода. Поскольку азот входит в состав органических соединений в виде амино- и иминогрупп, т.е. в восстановленной форме, наиболее доступным минеральным источником азота являются аммиачные соли. Свободный аммиак мало пригоден, т.к. он создает повышенную щелочность. Менее доступны соли азотной кислоты – нитраты, т.к. азот нитратов должен быть предварительно восстановлен до аммиака в энергетически зависимой реакции. Соли азотистой кислоты – нитриты – для большинства микроорганизмов ядовиты. Они используются только специфическими группами микроорганизмов и в том случае, если их концентрация в среде очень мала.
На восстановление атмосферного азота до уровня аммиака организмы должны затрачивать много энергии. Поэтому усвоение такого азота доступно немногим микроорганизмам, составляющим группу азотфиксаторов.
Минеральные микроэлементы добавляются в среду для выращивания микроорганизмов в виде катионов неорганических солей. Микроэлементы чаще всего нет необходимости специально вносить в среду, т.к. большинство микроэлементов являются примесью солей макроэлементов или попадают в среду с частицами пыли, из стеклянной посуды или в составе водопроводной воды.
Для многих микроорганизмов нужны в малых дозах еще органические соединения, называемые факторами роста. К ним относятся вещества, способность синтезировать которые утрачена у некоторых микроорганизмов, и поэтому в среду для их выращивания факторы роста добавляются в готовом виде. Все другие организмы синтезируют эти соединения самостоятельно. Такими веществами для микроорганизмов являются отдельные аминокислоты, пурины, пиримидины, жирные кислоты, и др., а также соединения, хорошо известные как витамины для высших организмов; они необходимы микроорганизмам как составная часть простетических групп или активных центров различных ферментов.
Исходя из пищевых потребностей микроорганизмов для их выращивания в лабораторных условиях создают питательные (культуральные) среды, представляющие набор органических и минеральных веществ, обеспечивающих рост и развитие микроорганизмов.
Питательные среды имеют исключительное значение в микробиологии. Правильный подбор состава среды обеспечивает возможность выделения микроорганизмов из мест их обитания, получения чистых культур, изучения их морфологии и биохимических особенностей, способствует быстрой и правильной диагностике инфекционных заболеваний, дает возможность получать биомассу полезных для народного хозяйства микроорганизмов.
ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К ПИТАТЕЛЬНЫМ СРЕДАМ:
1. Среды должны содержать все необходимые для микроорганизма источники питания.
Обеспечить нормальный рост можно только создав сбалансированную смесь необходимых питательных веществ в оптимальных для данных микроорганизмов концентрациях. Недостаток или избыток питательных элементов неблагоприятны для роста микроорганизмов. Специфичность питательных сред определяется набором соединений, поставляющим клеткам углерод и азот. Менее разнообразны микроорганизмы по потребностям в минеральных веществах, поэтому минеральный фон сред для многих микроорганизмов бывает очень близким по составу.
Факторы роста чаще всего содержатся в некоторых неочищенных ингредиентах, применяемых для питательных сред. По мере необходимости их в незначительных (следовых) концентрациях добавляют в среды.
2. Среды должны содержать отдельные ингредиенты в определенных соотношениях, примерно соответствующих соотношению их в клетке. Для большинства гетеротрофных микроорганизмов применяют среды, содержащие в среднем 0,8–1,2 г/л амминного азота (в составе NH2), 2,5–3,0 г/л общего азота, 1% пептона и 0,5% хлоридов в пересчете на NaCl.
При длительном культивировании микроорганизмов может происходить значительное концентрирование жидких сред вследствие испарения содержащейся в них воды, что неблагоприятно для роста микробов. Поэтому в процессе длительного инкубирования микроорганизмов необходимо регулярно доводить культуральную жидкость стерильной водой до первоначального объема.
3. Среды должны иметь достаточную влажность, обеспечивающую возможность диффузии питательных веществ в клетку. Для грибов необходима 12%-ная влажность, для бактерий – не менее 20%.
4. Важным фактором является кислотность среды, величина которой различна для разных микроорганизмов. Активная кислотность среды определяется количеством находящихся в ней ионов Н+ и обозначается водородным показателем или рН, представляющим собой отрицательный логарифм концентрации водородных ионов. В нейтральной среде, (где количество ионов Н+ равно количеству ионов ОН–), рН = 7, в щелочной среде рН больше 7, а в кислой – меньше 7. Большинство микроорганизмов развивается при нейтральной или слабощелочной реакции среды. Грибы обычно развиваются в более кислой среде, чем бактерии. Есть среди бактерий кислотоустойчивые, например, молочнокислые и некоторые уксуснокислые бактерии и даже ацидофильные, например, Асеtobacter acidophilus или Thiobacillus thiooxidans, который может выдерживать рН меньше 1. При подкислении питательной среды до рН = 4 развитие большинства бактерий практически прекращается, в то время как грибы развиваются нормально. К колебаниям рН в пределах от 6 до 9 бактерии сравнительно мало чувствительны.
После стерилизации рН сред, как правило, изменяется. Чаще всего происходит подщелачивание среды в результате диссоциации (разрушения) карбонатов. Кроме того, в процессе культивирования микроорганизмов могут выделяться в среду метаболиты, изменяющие рН среды настолько, что рост микроорганизмов существенно замедляется или даже становится невозможным. Так, при сбраживании глюкозы могут накапливаться органические кислоты и среда резко подкисляется. Усвоение белков и аминокислот приводит к образованию аммиака, что подщелачивает среду.
Чтобы избежать изменения рН, в среду добавляют буферные системы. Используют фосфатные буферы, обладающие максимальной буферной емкостью в физиологически важном диапазоне около нейтрального значения рН. Фосфатные буферы малотоксичны для микроорганизмов и используются ими также в качестве источника фосфора.
Буферные растворы готовят из двух солей: слабокислой соли – одноосновного фосфата КН2РО4, которая нейтрализует сильное основание, и слабоосновной соли – двуосновного фосфата К2НРО4, нейтрализующей образование в среде кислоты. Раствор этих солей, в эквимолярных количествах создающий нейтральную кислотность, препятствует резкому изменению рН.
Бактерии и грибы могут выдерживать до 5 г фосфатов калия на 1 л среды. В более высоких концентрациях фосфаты подавляют рост микроорганизмов. В процессе стерилизации возможно образование осадка в результате формирования нерастворимого комплекса фосфатов с некоторыми катионами (с кальцием и железом). Во избежание этого следует отдельно готовить и стерилизовать растворы солей кальция и железа и добавлять их к уже простерилизованной и охлажденной среде.
Иногда в процессе метаболизма микробные клетки образуют кислоту настолько интенсивно, что добавление физиологически возможных количеств фосфатов оказывается недостаточным для сохранения нужного рН, и тогда в среду добавляют карбонаты, нейтрализующие избыточные количества ионов водорода. В присутствии ионов водорода карбонат превращается в бикарбонат, а бикарбонат – в угольную кислоту, которая спонтанно распадается на СО2 и воду.
Поскольку растворимые карбонаты обладают сильноосновными свойствами, то используют нерастворимые карбонаты, чаще всего мел. При выращивании кислотообразующих бактерий, снижающих рН, это соединение распадается с выделением СО2, и кислоты нейтрализуются за счет перевода их в кальциевые соли.
Труднее поддержать рН при выращивании микроорганизмов, подщелачивающих среды. Фосфатные буферы неэффективны в области рН от 7,2 до 8,5, в этих случаях периодически добавляют в среду сильную щелочь или кислоту.
В состав питательных сред входят вещества органической природы, обладающие буферными свойствами. Это аминокислоты, полипептиды и белки, относящиеся к амфотерным соединениям и способные соединяться как с кислотами, так и со щелочами, таким образом нейтрализуя их.
5. Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, определяющем насыщение их кислородом и обозначаемым rh2. По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначить любую степень аэробности: насыщенный кислородом раствор обозначают rh2 = 41, насыщенный водородом rh2 = 0. Анаэробные микроорганизмы размножаются при rh2 не выше 5, аэробные – не ниже 10.
6. Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Большинство бактерий довольно устойчиво к этому фактору и может расти на средах, содержащих от 0,1 % до 10 % NaCl. Исключение составляют некоторые галофильные микроорганизмы, не способные расти при концентрации соли ниже 1 %, например, некоторые обитатели соленых водоемов.
7. Среды должны быть стерильными, чтобы обеспечить рост чистых культур микроорганизмов. Постоянная микрофлора может влиять на рост изучаемого микроорганизма, изменять свойства среды, ее состав и др. Режим стерилизации среды определяется ее составом.
Поскольку потребности микроорганизмов чрезвычайно разнообразны, нельзя составить универсальную среду, оптимальную для роста всех микроорганизмов. Существуют различные по составу и технике приготовления питательные среды. Применяются всевозможные естественные и искусственные субстраты, начиная от простой водопроводной воды и солевых растворов до сложных экстрактов из зародышей животных и растений, от отбросов (навоз) до полноценных белков животных и человека.
По происхождению и составу питательные среды можно разделить на натуральные (или естественные), синтетические и полусинтетические.
1. Натуральные среды бывают растительного и животного происхождения. Они содержат в своем составе все ингредиенты, необходимые для роста и развития микроорганизмов. Состав этих сред точно не определен. Такими средами являются отвары злаков, трав, овощные и фруктовые соки, картофель, морковь, молоко, животные ткани, кровь, сыворотка, моча, отвары мяса, навоз, почва, вода морей, озер и минеральных источников, яйца птиц, их зародыши, шерсть, дрожжевой автолизат и т.д.
Примером наиболее часто применяемой натуральной среды является мясо-пептонный бульон (МПБ). Для его приготовления сначала готовят мясной отвар. С этой целью свежее мясо (говядину, телятину или конину) освобождают от костей, жира и сухожилий, рубят или пропускают через мясорубку. 500 г такого фарша кладут в кастрюлю, заливают 1 л водопроводной воды и оставляют в прохладном месте на 24 ч или в термостате при 300 С на 6 ч, а при 370 – на 2 ч для экстрагирования различных необходимых для питания микроорганизмов веществ. Затем мясо отжимают через марлю и полученный настой кипятят в течение 30 мин для свертывания белка, который отделяют фильтрованием.
После того, как настой остынет, его фильтруют через складчатый бумажный фильтр, предварительно смоченный водой, либо через фильтровальное полотно на стеклянной воронке.
Влажный бумажный фильтр очень не прочен, поэтому жидкость на него наливают, осторожно по стенке. Отфильтрованный настой стерилизуют. Стерильная мясная вода является основой для приготовления мясо-пептонного бульона. Для этого к 1 л мясной воды добавляют 10 г пептона и 5 г NaCl. После 10-15 мин кипячения его остужают, устанавливают необходимое значение рН, фильтруют и стерилизуют. Пептоны (продукты неполного разрушения белка, получаемые кислотным или ферментативным гидролизом мяса или молочного казеина) добавляют взамен свернувшегося мясного белка. Преимуществом этих источников аминокислот является то, что они легче усваиваются и при стерилизации не свертываются, поэтому стерильный бульон остается прозрачным. Рост микроорганизмов и таких средах легко отмечается визуально по появлению мутности. МПБ – богатая питательная среда, но в ней мало углеводов.
Для выращивания микроорганизмов в качестве питательной среды широко применяется также неохмеленное пивное сусло. Этот субстрат также, как и мясная вода, содержит большое количество питательных веществ (аминокислот, нуклеиновых кислот, витаминов, минеральных солей), но является более ценным, так как содержит большое количество углеводов, в том числе до 80% мальтозы. Для приготовления сусла используют проросшие ячменные семена (солод), в которых в таком состоянии активизируется протеолитические и амилолитические ферменты.
Дрожжевая среда используется для культивирования многих гетеротрофов. Готовится она из свежих или прессованных дрожжей.
Почвенная вытяжка применяется для выделения и культивирования почвенных микроорганизмов. Для этого 1 кг почвы заливают 1 л водопроводной воды, кипятят в течение 30-40 мин, дают вытяжке остыть, сливают надосадочную жидкость и центрифугируют. Проверяют рН фильтрата, разливают в сосуды и стерилизуют при 147 кПа (1,5 атм) 30 мин.
2. Синтетические среды готовятся из определенных химически чистых соединений в точно указанных концентрациях. В них можно учесть количество и качество поступающих в клетки веществ, изменение этих соединений под влиянием микроорганизмов, выявить метаболиты, выделяемые микробными клетками в процессе жизнедеятельности. Поэтому на таких средах изучают обмен веществ микроорганизмов. Преимущества синтетических сред заключаются также в том, что они точно воспроизводимы. В зависимости от потребностей микроорганизмов синтетические среды могут быть очень сложного состава или довольно простыми.
Примером синтетической среды является среда Чапека для плесневых грибов. Для ее приготовления на 1 л дистиллированной воды добавляют, г:
NaNO3 – 2,0 MgSO4 x 7H2O – 0,1
K2HPO4 – 1,0 FeSO4 – 0,1
KCl – 0,5 Сахароза –30,0
Для выделения азотофиксирующих микроорганизмов применяется синтетическая среда Эшби, при приготовлении которой в 1 л водопроводной воды вносят следующие ингредиенты, г:
Маннит –20,0 NaCl – 0,2
K2HPO4 – 0,2 K2SО4 – 0,1
MgSO4 x 7H2O – 0,2 CaCO3 – 5,0
3. Полусинтетические среды имеют сложный и неопределенный состав. Компонентами этих сред наряду с соединениями известного состава (углеводы, фосфаты, нитраты и др.) являются натуральные продукты неопределенного состава – мясной отвар, дрожжевой экстракт, пивное сусло. Такие среды часто применяются для выращивания микроорганизмов в лабораторных условиях и в промышленности.
Среды для одного и того же микроорганизма могут быть различными в зависимости от задач исследования. Например, среды для длительного поддержания культур микроорганизмов сильно отличаются от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена, когда требуется стимулировать отдельные стороны жизнедеятельности микроорганизмов.
По назначению среды делят на:
1. Общеупотребительные или среды общего назначения. На таких средах выращивают и накапливают биомассу многие микроорганизмы. Это МПА, МПБ, МПЖ и др.
2. Специальные среды или среды специального назначения. Эти среды предназначены для выявления тех или иных биохимических особенностей микроорганизмов или для получения культур микроорганизмов, обладающих особыми свойствами. Среди специальных сред различают элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические (индикаторные) среды.
Элективные среды (от лат. еlectus – избираю) подобраны таким образом, чтобы обеспечить наиболее благоприятные условия для выращивания определенных микроорганизмов. В них могут быть добавлены вещества, избирательно подавляющие развитие сопутствующей микрофлоры. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет избирательна. Такие среды применяют для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для получения накопительных культур. К ним относится среда Эшби для азотфиксирующих бактерий, в составе которой отсутствует связанный источник азота, среды с сывороткой или кровью для патогенных микроорганизмов, среды специального минерального состава для различных автотрофных микроорганизмов и др.
Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. Состав этих сред позволяет четко выявить наиболее характерные свойства изучаемого микроорганизма. К ним относятся среды с молоком, кровью, желатином, на которых выявляются протеолитические и гемолитические свойства микроорганизмов. Наличие желатиназы и других протеолитических ферментов определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.
В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят такие индикаторы, как нейтральный красный, феноловый красный, метиленовый синий, лакмусовая настойка и др. Изменяя окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления вводимого в среду субстрата. Примером таких сред является среда Эндо, применяемая для выделения и определения бактерий кишечной группы, в состав которой входит лактоза, насыщенный спиртовой раствор фуксина, обесцвеченный перед добавлением в среду 10 %-м водным раствором сульфита натрия (образуется бесцветная фуксин-сернистая кислота). Кишечная палочка при росте на такой среде ферментирует лактозу с образованием альдегидов, вследствие этого бесцветная фуксин-сернистая кислота переходит в альдегид-сернистое соединение с образованием фуксина, окрашивающего колонии кишечной палочки в красный цвет с металлическим блеском. Таким образом, на среде Эндо легко отделить кишечную палочку от других представителей микрофлоры кишок, т.к. только она образует колонии красного цвета с металлическим блеском.
Среды отличаются по консистенции. Используются жидкие, сыпучие и плотные среды. Физическое состояние сред корректируется задачами исследований.
Жидкие среды применяют для накопления биомассы или продуктов обмена микроорганизмов, для обновления долго хранящихся культур, для поддержания и хранения тех культур, которые плохо растут на плотных средах. На жидких средах легче выявляются физиолого-химические особенности микроорганизмов.
Сыпучие среды применяют в основном в промышленной микробиологии. Это разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропитанные питательным раствором.
Плотные среды необходимы для выделения и описания культуральных свойств чистых культур микроорганизмов, т.к. на них можно получить изолированный рост отдельных клеток, для хранения культур, определения ряда их свойств.
Плотные питательные среды готовят из жидких посредством добавления к ним агар-агара, геля кремнекислого или желатина.
Лучшим гелеобразующим средством является агар-агар, получаемый из водорослей. Это сложный полисахарид, образующий гель с точкой плавления 96-1000 С и температурой застывания около 400. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать микроорганизмы при любой температуре. Кроме того, агар-агар используется лишь немногими микроорганизмами в качестве питательного субстрата.
Плотные питательные среды получают при добавлении к жидким 1–2 % агар-агара. Таким образом из МПБ готовят МПА. Для получения более плотной среды иногда вносят 3 % этого продукта.
Среду с внесенным в нее агаром нагревают на водяной бане до полного расплавления последнего. Полученный горячий раствор фильтруют через гигроскопическую вату. Если для осветления недостаточно фильтрования, то можно добавить к среде белок куриных яиц. Тщательно отделенный от желтка и взбитый белок с двойным объемом холодной воды вливают в остуженную до 45 – 50 С среду, тщательно перемешивают и прогревают в кипящей водяной бане или автоклаве в течение часа. Белок свертывается, адсорбируя взвешенные в среде частицы. Среду отфильтровывают в горячем виде через вату. Осветление можно проводить также с помощью лошадиной сыворотки.
Агаризованные среды сохраняют свои свойства после неоднократного плавления и стерилизации. Однако при рН = 5,5 в процессе стерилизации агар частично гидролизуется. В таком случае его нужно стерилизовать отдельно от среды и добавлять, постепенно помешивая, в стерильную неостуженную среду.
Если требуется получить плотные среды, не содержащие органических компонентов, или синтетические среды с определенным количественным и качественным составом, применяют в качестве уплотнителя силикагель (кремнекислый гель). Наиболее быстрое застывание кремнекислого геля происходит, если после смешивания раствора силиката и соляной кислоты реакция смеси получается близкой к нейтральной. Желатин – это вещество белковой природы, получаемое из костей и хрящей животных при их вываривании. Его добавляют к средам в количестве 10–20 %. Желатин как уплотнитель применяется ограниченно. Это связанно с тем, что он разжижается под действием протеолитических ферментов, выделяемых многими микроорганизмами. Кроме того, образуемый желатином гель плавится при 23–25 С и застывает при 20 С, а большинство микроорганизмов развивается при 30–37, т. е. температуре, при которой желатин находится в расплавленном состоянии. Поэтому желатин используют главным образом для выявления протеолитической активности микроорганизмов, для получения гигантских глубинных колоний дрожжей, при их идентификации.
Промышленным способом изготовляются некоторые среды в виде сухих порошков. Преимущество таких сред в их стандартности, стабильности, простоте приготовления и удобстве при транспортировке. Сухие питательные среды представляют собой гигроскопические порошки, хранящиеся в специальных флаконах. В лаборатории из порошков готовят среды по прописи, указанной на этикетке. Чаще всего применяют сухие среды Эндо, сухой питательный агар, рыбный питательный агар и др.
Питательные среды сразу же после приготовления подвергают стерилизации. Режим и способ стерилизации определяется составом сред и их консистенцией. Обычно среды стерилизуются в автоклаве. Продолжительность стерилизации зависит от того, насколько хорошо и быстро прогревается среда в сосудах. Быстрота нагревания зависит от объема сосуда, исходной температуры, вязкости среды и от того, свободно ли проходит пар к стенкам сосудов и полностью ли удален воздух из автоклава.
Для того, чтобы достичь наилучших результатов, следует помещать питательную среду в небольшие сосуды и располагать их так, чтобы пар свободно проходил между ними.
Агаризованные среды лучше стерилизовать при давлении 98 кПа (1атм) – 20 мин. Желатиновые среды стерилизуют текучим паром три дня подряд, каждый день по 30–40 мин, или в автоклаве при 49 кПа (0,5 атм) – 30 мин. Жидкие питательные среды можно стерилизовать фильтрованием. Если в составе среды имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся между собой термостабильностью (например, почва), то такие среды обычно стерилизуют один раз при 147-196 кПа (1,5-2 атм) 2 ч или 2 дня подряд по 1 ч при том же давлении, а иногда при 196 кПа (2атм) 2 ч. К каждому сосуду со средой обязательно прикрепляют лист бумаги с обозначение среды и времени ее приготовления. Приготовленные к употреблению питательные среды проверяют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при 37 С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате сутки, простерилизованные текучим паром – 3 суток. Проросшие среды бракуются. Некоторые питательные среды можно готовить впрок на 2–3 недели. Создавать запасы на продолжительное время нецелесообразно, т.к. в результате долгого хранения среды высыхают и изменяют свои свойства. Сохраняются питательные среды в прохладном, защищенном от света и не слишком влажном помещении. В сырости ватные пробки пропитываются влагой и через них прорастает мицелий плесеней.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
Приготовить питательные среды: 1) картофельный агар; 2) пептонную воду; 3) рыбо-пептонный агар (по заводской прописи).
Для фильтрования агаровых сред применяют ватно-марлевый фильтр. Для его приготовления стеклянную воронку промыть марлевой салфеткой такой величины, чтобы концы салфетки были перекинуты через край воронки наружу, затем на марлю положить слой гигроскопичной ваты и смочить фильтр горячей дистиллированной водой. Агаризованную среду налить на фильтр в горячем виде. Процесс фильтрации вести в нагретом автоклаве.
После фильтрования питательные среды разлить в сосуды. Наливать стоит не выше двух третей высоты сосуда. Посуду необходимо тщательно вымыть, высушить, закрыть ватно-марлевыми пробками, которые предохраняют среду от заражения микроорганизмами, находящимися в окружающем воздухе. Поэтому пробки должны быть достаточно плотными, с равномерным распределением волокон ваты. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизоваться в автоклаве, целлофаном или другими материалами, не пропускающими пар. Пар должен обязательно проникать через пробку в сосуд, иначе среды не нагреются до нужной температуры и не простерилизуются.
Посуду необходимо простерилизовать, если налитые в нее среды стерилизуют текучим паром или при давлении не более 49 кПа (0,5 атм). Если же питательные среды стерилизуют под давлением выше 98 кПа (1атм), то предварительная стерилизация посуды необязательна.
Для разливки питательных сред пользуются воронкой или бюреткой. Нужно следить за тем, чтобы края пробирок или флаконов не были смочены питательной средой, т.к. ватно-марлевые пробки, приклеиваясь к стеклу во время стерилизации, трудно вынимаются, осложняя тем самым процесс работы, оставляют в просвете отверстия сосуда ворсинки ваты, которые, попадая в среду, могут вызывать загрязнение ее посторонней микрофлорой.
Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы следует надеть бумажный колпачок и надписать название питательной среды и дату ее приготовления.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ
З а н я т и е 3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель занятия: освоить технику разлива питательных сред и способы выращивания на них микроорганизмов.
ТЕХНИКА РАЗЛИВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД. Микроорганизмы в лабораторных условиях культивируют на различных питательных средах, которые разливают в стерильные пробирки, чашки Петри, колбы, матрацы и др. Разлив среды производят стерильно около пламени: сосуд берут в правую руку, держа пробку между мизинцем и ладонью левой руки, вращательным движением вынимают из сосуда, края которого обжигают в пламени спиртовки. При разливе в чашки Петри свободными пальцами левой руки приоткрывают крышку чашки в сторону пламени, выливают в нее 15-20 мл среды, слегка покачивая чашку.
Плотные питательные среды в колбах или пробирках плавят на водяной бане, сняв с сосуда бумажный колпачок. Затем среду охлаждают до 600 С.
При разливе агаризованных сред в пробирки для получения скошенного столбика сосуд берут в правую руку, а стерильную пробирку – в левую. Мизинцем левой руки вынимают пробку из сосуда, а мизинцем правой руки – из пробирки. В обеих руках пробки удерживают между ладонью и мизинцем, а свободными пальцами держат сосуд и пробирку в зоне стерильности. В пробирку среду наливают на 1/3. Для получения столбика пробирку оставляют в вертикальном положении, а для получения скошенной поверхности пробирку оставляют в наклонном положении.
Жидкие среды разливают в пробирки или колбы с помощью стеклянных пипеток: в левую руку берут завернутую в стерильную бумагу пипетку, правой рукой вращением разрывают бумагу, снимают ту половину, которая находится на конце, закрытом ватой. Правой рукой держат пипетку за открытый край, левой снимают оставшуюся обертку и проводят пипетку через пламя спиртовки. В левую руку берут сосуд с питательной средой, возле пламени мизинцем правой руки открывают пробку. Края сосуда обжигают в пламени, вводят пипетку в сосуд и отбирают нужное количество среды.
СПОСОБЫ ПОСЕВА МИКРООРГАНИЗМОВ (инокуляция). Перед посевом на пробирке пишут название микроорганизма и дату посева, который производят бактериологической иглой, петлей или пипеткой.
При пересеве из пробирки в пробирку одну пробирку с культурой пересеваемых микроорганизмов и другую с питательной средой помещают на ладонь левой руки, придерживая их большим пальцем. При этом должна быть видна поверхность засеваемой среды и поверхность среды с микроорганизмами. Пробирки держат параллельно друг другу в наклонном положении пробками в сторону спиртовки. Большим, указательным и средним пальцами правой руки берут бактериологическую петлю, держа ее как карандаш, стерилизуют в пламени. Для этого сначала петлю вводят в нижнюю часть пламени, а затем переводят ее в вертикальное положение, накаливая проволоку петли докрасна, петледержатель слегка обжигают. Мизинцем правой рук вращательным движением вынимают обе пробки из двух пробирок, и обжигают их края. Петлей, охлажденной касанием поверхности среды, с твердой среды снимают небольшое количество клеток, с жидкой среды – количество клеток, образующих пленку на петле. Петлю с клетками вводят в пробирку с чистой средой, не касаясь ее стенок. Посев на твердую питательную среду производят легким втиранием материала в поверхность среды. При посеве на скошенную поверхность агара петлю с посевным материалом вносят в конденсационную воду и скользящими движениями растирают штрихом снизу вверх. При посеве в столбик среды иглой с посевным материалом прокалывают столбик по центру. После посева петлю или иглу вынимают из пробирки, обжигают горлышко пробирки и пробку и закрывают пробирку. Затем прокаливают петлю сначала на участке, примыкающем к петледержателю, для подсыхания микробной массы во избежание ее разбрызгивания, а затем петлю в вертикальном положении прокаливают докрасна.
В случае загорания ватной пробки ее быстро вводят в пробирку или зажимают пальцами.
При посеве в жидкую питательную среду петлю погружают в среду или материал, растертый на стенке сосуда, смывают жидкой средой при встряхивании пробирки.
Пересев из жидкой среды в жидкую производят стерильной градуированной или пастеровской пипеткой, которые освобождают от обертки, правой рукой проводят через пламя, опускают в пробирку с культурой и набирают определенное количество материала. Затем закрывают отверстие в пипетке указательным пальцем и переносят в пробирку с питательной средой. Использованные пипетки помещают в дезинфицирующий раствор.
Посев на поверхность питательной среды в чашках Петри производят аналогично: небольшое количество микробных клеток втирают штрихами у края чашки, дно которой поддерживают средним и безымянным пальцами левой руки, а крышку, фиксированную большим и указательным пальцами, приоткрывают в сторону пламени спиртовки на столько, чтобы в образовавшуюся щель можно было ввести петлю. Для получения большого количества микроорганизмов производят сплошной посев «газоном» с помощью шпателя, для чего посевной материал вносят с помощью петли или пипетки на поверхность среды у края чашки или в центре ее, а затем шпателем растирают его по всей поверхности среды.
При посеве в толщу питательной среды в чашках Петри в стерильную пустую чашку вносится 0,1–1 мл бактериальной суспензии, наливается 10–20 мл расплавленной и охлажденной до 50-550 С среды. Чашку покачивают для перемешивания микробных клеток со средой. Можно предварительно смешать в стерильной пробирке расплавленную и остуженную плотную питательную среду с небольшим количеством материала, а затем быстро вылить эту смесь в чашку Петри. Чашки Петри после застывания среды переворачивают вверх дном и ставят в термостат.
Для получения большого количества клеток используются стеклянные матрацы, в которых питательная среда распределяется на одной из широких плоскостей. Засев матрацев производят бактериальной суспензией, приготовленной в физиологическом растворе или в водопроводной воде.
Если микробных клеток мало, их концентрируют на тонкопористых мембранных фильтрах из коллодия, ацетата, целлюлозы и др. Для этого жидкость с микробными клетками в стерильных условиях фильтруют, а затем фильтр с осажденными на нем клетками накладывают на питательную среду в чашках Петри. Можно проводить посев путем отпечатка фильтра.
Засеянные среды выдерживают в условиях, обеспечивающих жизнедеятельность микроорганизмов: определенный температурный режим, создаваемый в водяных или воздушных термостатах, влажность, аэрация, свет и пр. Продолжительность культивирования различна: грибы выращивают при 29-300 С в течение 5–7 суток, актиномицеты – при той же температуре 8–10 суток, бактерии – 8-24 (48) часов.
КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ. Характер роста на плотных питательных средах связан с образованием скопления клеток – колонии (см. методичку «Культуральные признаки микроорганизмов»). У большинства микроорганизмов колонии двух типов: гладкие – S, образующиеся если микробные клетки после деления располагаются, соприкасаясь своими поверхностями (при пересевах на жидкие среды такие микроорганизмы вызывают равномерное помутнение среды), и шероховатые с неровными краями – R, образующиеся если клетки после деления сохраняют цитоплазматические мостики и образуют цепочки, накладывающиеся друг на друга (при пересевах на жидкие среды такие микроорганизмы дают зернистый осадок). Существуют и переходные формы колоний.
Характер роста на жидких питательных средах менее разнообразен: рост с равномерным помутнением (у факультативных анаэробов); придонный рост с образованием осадка – обильного или скудного, крошковидного, гомогенного, волокнистого, в виде крупных хлопьев, по консистенции вязкого, слизистого, хрупкого, пастообразного (у анаэробных микроорганизмов); пристеночный рост в виде рыхлых комьев или компактных зерен (у актиномицетов); поверхностный рост с образованием пленки различной плотности и консистенции – нежной и тонкой, исчезающей при встряхивании, как у Bac. subtilis, или плотной, сухой, кожистой, как у грибов.
Рост на полужидких питательных средах используется для определения способности микроорганизмов передвигаться. Подвижные микробы при посеве в столбик 0,2–0,5 %-го агара вызывают равномерное по всей толще среды помутнение, а неподвижные растут только по ходу укола.
При выращивании микроорганизмов в питательной среде происходит постепенное ее истощение, но при регулировании скорости притока свежей среды можно поддерживать микробные клетки в любой фазе роста. Такое культивирование, обычно проводимое в промышленных масштабах, называется проточным или непрерывным.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 4. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО
ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель занятия: ознакомиться с устройством и принципом работы светлопольного микроскопа, освоить методики приготовления препаратов микроорганизмов и технику микроскопирования.
Все современные микроскопы устроены принципиально одинаково и состоят из механической и оптической частей. Механическая часть: штатив, коробка с микромеханизмами, макрометрический (для грубой) и микрометрический (для тонкой фокусировки) винты, тубусодержатель, моно- или бинокулярная насадка, револьвер для объективов, кронштейн конденсора. На правой рукоятке микровинта – барабан со шкалой, разделенной на 50 делений ценой 0.002 мм. Один полный оборот барабана соответствует перемещению тубуса на 0,1 мм. Общая величина перемещения тубуса от упора рукояткой макровинта обеспечивается в пределах 50 мм, а микровинта – 2,2-2,4 мм. Крайнее положение тубуса определяется штрихами, нанесенными на коробке микромеханизма: на подвижной части – один штрих, на неподвижной части – два штриха, соответствующие двум крайним положениям тубуса. При вращении макро- и микровинтов по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, при вращении против часовой стрелки – поднимается. Оптическая система микроскопа: окуляр, объективы, (главная часть, от которой зависят разрешающая способность, собственное увеличение и четкость изображения), осветительное устройство.
Разрешающая способность микроскопа (d) – это наименьшее расстояние между раздельно воспринимаемыми деталями объекта, прямо пропорциональное длине волны и обратно пропорциональное числовой (нумерической) апертуре (А), определяемой как произведение показателя преломления оптической среды, находящейся в пространстве между исследуемым объектом и фронтальной линзой объектива (n), и апертурным углом объектива микроскопа (половина отверстного угла, образуемого крайними лучами света, которые еще могут попасть в фронтальную линзу объектива). При освещении объекта светом с длиной волны 550 нм, к которому наиболее чувствителен глаз, d для сухой системы (воздух) равна около 300 нм, т.к. световые лучи, проходя через неодинаковые по оптической плотности среды (n стекла = 1,52, воздуха – 1,0), отклоняются и на границе этих сред рассеиваются, не попадая полностью в объектив, в результате чего поле зрения микроскопа освещается недостаточно. Разрешающую способность можно увеличить использованием оптически прозрачных иммерсионных жидкостей: глицерин (n = 1,0), вода (n = 1,3), кедровое масло (n = 1,52).
Полезное увеличение микроскопа (Уп) – это такое увеличение, при котором в изображении появляются новые, до этого не просматриваемые детали, т.е. это отношение линейных размеров изображения к линейным размерам объекта. Максимальные размеры изображения, разрешаемые глазом человека, 0,25 мм, если разрешающая способность микроскопа 0,0002 мм, то Уп = 1250 раз.
Собственное увеличение объектива находтся в обратной зависимости от фокусного расстояния фронтальной линзы. Сильные объективы имеют фокусное расстояние 1,5-2,0, средние – 5-12, слабые – 18-25 мм. Биологические микроскопы оснащены тремя смешанными объективами с увеличением 8Х или 20Х, 40Х (сухие) и 90Х (иммерсионные).
Четкость изображения объекта зависит от степени устранения в объективах хроматической (сложный белый свет при прохождении через линзу, представляющую собой систему призм, раскладывается в спектр и формируемое изображение становится цветным) и сферической (лучи света, попадая на различные точки двояковыпуклой линзы преломляются неодинаково, т.к. толщина линзы по диаметру меняется, в результате чего проекция – изображение точки возникает не в виде точки, а в виде шара рассеивания) аберраций, устраняемых с помощью коррекционных линз. По степени устранения оптических дефектов объективы разделяют на ахроматы (6 коррекционных линз, устраняющих хроматическую аберрацию), апохроматы (10-20 коррекционных линз, устраняющих оба типа аберраций) и планахроматы, устраняющие кривизну поля зрения и использующиеся при микрофотографировании.
Окуляры микроскопа служат для рассматривания изображения объекта, увеличенного с помощью объектива, увеличивая изображение в 5, 7, 10, 15 и 20 раз. Окуляры, состоящие из двух плосковыпуклых линз (собирающей и глазной), называются простыми (окуляр Гюйгенса или Рамсдена). Окуляры, содержащие кроме этих двух линз несколько коррегирующих, называются компенсационными, их применяют при работе с апохроматами.
Зеркало предназначено для улавливания лучей света и направления их на объект или в конденсор. Плоскую поверхность зеркала используют при сильном дневном освещении, когда интенсивность падающего света равна интенсивности света отраженного, а вогнутая поверхность концентрирует отраженный свет, поэтому ее используют при искусственном освещении. В микроскопах с конденсором используют только плоское зеркало, т.к. конденсор сам фокусирует лучи на объекте.
Ирисовая диафрагма, находящаяся перед нижней линзой конденсора, регулирует величину светового пучка, поступающего в конденсор, который представляет собой систему из двух плосковыпуклых линз, вмонтированных в коническую металлическую оправу. Он фокусирует лучи света на объекте, расположенном на предметном стекле. Конденсор под предметным столиком перемешается с помощью кремальеры. Плоская сторона верхней линзы конденсора может быть поднята вверх до упора, так, что между ней и предметным стеклом остается щель шириной приблизительно 0,1 мм. Конденсор характеризуется числовой апертурой (Ак), которая должна соответствовать числовой апертуре объектива (Ао). При работе с сухими системами Ак больше Ао, чтобы устранить часть рассеянного света, нужно прикрыть ирисовую диафрагму. Чем ниже положение конденсора, тем меньше освещенность препарата. При работе с иммерсионным объективом конденсор устанавливается в крайнее верхнее положение.
ПРАВИЛА РАБОТЫ СО СВЕТЛОПОЛЬНЫМ МИКРОСКОПОМ
Микроскопия в темном поле предназначена для исследования малых и слабо контрастных живых объектов. Для этого используется специальный конденсор темного поля (ОИ-13), центр которого затемнен, в связи с чем центральный пучок световых лучей не попадает в объектив и поле зрения остается темным. Объект освещается лучами, попадающими на него под углом, и становится видимым как светящаяся точка на темном поле.
Фазово-контрастная микроскопия, предназначенная для изучения живых не окрашенных объектов, основана на том, что фазовая скорость света обратно пропорциональна показателю преломления. Фаза луча, проходящего через объект с более высоким показателем преломления, чем у окружающей среды, будет запаздывать по сравнению с фазой того луча, который проходит только через среду. Глаз не способен воспринимать фазовые изменения света, поэтому прозрачные, неконтрастные объекты остаются невидимыми. Специальный конденсор и особо устроенный объектив регулируют изменения фазы световых волн и превращают разность фаз в разность интенсивностей света, благодаря чему детали строения объекта становятся доступными для глаза. Система колец в конденсоре и объективе отделяет те лучи, которые дифрагировали на объекте от тех, которые не отклонились. Дифрагировавшие лучи, проходя через фазовую пластинку объектива, вносящую сдвиг по фазе, рекомбинируются с недифрагировавшими лучами, что резко повышает контраст клетки.
Люминесцентная (ультрафиолетовая, флуоресцентная) микроскопия основана на том, что некоторые структуры клетки, облученные световыми лучами сине-фиолетового спектра, начинают светиться, испуская лучи с большей длиной волны (фотолюминесценция). Некоторые химические соединения (флуорохромы) также способны к фотолюминесценции. Если такими веществами обработать клетки микроорганизмов или отдельные их структуры, а затем их облучить ультрафиолетом, то они будут светиться на темном фоне поле зрения. Люминесцентные микроскопы, имеющие ртутно-кварцевый источник света, конденсор – систему кварцевых линз, объектив, окуляр, а также сине-фиолетовый и желтый светофильтр, обладают большой разрешающей способностью, четкостью изображения, высокой специфичностью, возможностями изучения живых и фиксированных клеток, а также проведения количественных исследований.
В электронной микроскопии вместо световых лучей используется пучок электронов, обладающих волновыми свойствами. Пучку электронов высокой энергии (100 кВт) соответствует длина волны, равная 0,04 нм, что увеличивает разрешающую способность и полезное увеличение микроскопа. Пучок электронов движется в безвоздушном пространстве от раскаленной нити вольфрамовой пушки по направлению к флуоресцентному экрану, вызывая его равномерное свечение. Если на пути электронов поместить какой-либо объект, то в зависимости от его плотности электроны будут задерживаться и соответствующие места на экране окажутся более или менее затемненными.
В сканирующем электронном микроскопе пучок электронов сжимается в маленькое пятно, обегающее поверхность образца, покрытого толстым слоем тяжелого металла (золота). Из поверхности образца выбиваются вторичные электроны или рассеиваются падающие, которые затем регистрируются с помощью телевизионных систем
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В СВЕТЛОПОЛЬНОМ МИКРОСКОПЕ проводятся в живом (для изучения формы, размеров, структуры, подвижности, характера размножения, отношения клеток к различным химическим раздражителям) – препараты «раздавленная капля» и «висячая капля», или фиксированном окрашенном состоянии.
«Раздавленная капля»: на чистое обезжиренное стекло бактериологической петлей наносят исследуемую культуру. Если материал взят с плотной среды, его вносят в нанесенную предварительно на стекло каплю стерильной водопроводной воды, стерильного физиологического раствора или бульона. Из таких культур можно предварительно приготовить суспензию, для чего в пробирку с микроорганизмами вносят 4–5 мл стерильного физиологического раствора или водопроводной воды и, вращая пробирку между ладонями, смывают микробные клетки с поверхности среды. На предметное стекло на край капли опускают ребром под углом 450 покровное стекло и, осторожно наклоняя, кладут его на каплю так, чтобы в ней не образовались пузырьки воздуха. Капля должна заполнять все пространство между предметным покровным стеклом и не выступать за края покровного стекла.
“Висячая капля»: края стекла со шлифованной лункой смазать вазелиновым маслом. На покровное стекло стерильно нанести каплю исследуемого материала, предметное стекло перевернуть лункой вниз и поместить на покровное так, чтобы капля находилась в центре лунки, не соприкасаясь с ее краями. Предметное стекло легко прижать к покровному и перевернуть.
Приготовление фиксированного окрашенного препарата:
МИКРОСКОПИРОВАНИЕ МАЗКОВ
В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными оказываются клетки микроорганизмами. Все просмотренные под микроскопом препараты зарисовать, под каждым рисунком указать название объекта и увеличение микроскопа, при котором рассматривался препарат.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ
З а н я т и е 5. ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ. ДРОЖЖИ.
АКТИНОМИЦЕТЫ
Цель ханятия: ознакомиться с морфологическими отличиями плесневых грибов, дрожжей и актиномицетов.
Грибы, относящиеся к эукариотам, отличаются от бактерий более сложным строением и более совершенным способом размножения. В микробиологии изучаются некоторые плесневые и одноклеточные грибы (дрожжи), используемые в народном хозяйстве.
Колонии грибов – сплетения большого количества ветвящихся гифов диаметром 5–50 мкм, образующих септированный или несептированный мицелий (субстратный, врастающий в питательную среду, и воздушный) – по размерам превосходят дрожжевые и бактериальные, закрывая своей массой всю поверхность питательной среды. По консистенции грибные колонии войлокообразные, кожистые, реже крошковатые., их поверхность может быть пушистой, бархатистой, мучнистой, кожистой, гладкой.
Среди плесеней хозяйственное и медицинское значение имеют головчатые (мукоровые из класса Zygomycetes), леечные (аспергиллевые) и кистевики (пеницилловые) грибы из класса Ascomycetes.
На плотных питательных средах колонии мукоровых грибов образуют войлочный налет. Их вегетативное тело – разветвленный многоядерный несептированный мицелий, от которого отходят плодоносящие гифы-спорангиеносцы. При созревании спорангий разрывается и на спорангиеносце остается колонка с воротником в нижней части.
У пенициллов и аспергиллов мицелий септированный, неокрашенный. На концах развивающихся из клеток мицелия конидиеносцов пенициллов, составляющих около половины всех плесневых грибов, образуются короткие клетки-стеригмы, каждая их которых несет цепочку из окрашенных конидий. От мицелия аспергиллов отходят несептированные вертикальные конидиеносцы с булавовидными расширениями на вершинах, на поверхности которых вырастают многочисленные стеригмы. От них отшнуровываются располагающиеся по радиусу вершины цепочки пигментированных конидий с шипиками, напоминая струи льющейся из лейки воды.
Дрожжи – представители различных классов грибов – не образуют истинного мицелия. Растут в виде мягких колоний, не врастающих в субстрат, на средах с кислым рН. Форма дрожжевых клеток диаметром 8–12 мкм округлая, яйцевидная, эллиптическая, овальная, цилиндрическая, удлиненная, лимоновидная. Размножаются дрожжи бинарным делением (как Schizosaccaromycetes), спорами или почкованием, как дрожжи рода Sacсharomyces (сахаромицеты). К аспорогенным ложным дрожжам, неспособным к половому размножению, относятся представители родов Candida, Rhodotorula, Pullularia и др. Крупные, округлой или овальной формы клетки этих дрожжеподобных грибов могут вытягиваться в длину, обьединяясь в цепочки-псевдомицелий. Молочная плесень (Oidium lactis) может расти в виде длинных до 500 мкм длиной нитей, размножающихся делением. Часто эта плесень образует овальные клетки, размножающиеся почкованием, напоминая обыкновенные дрожжи.
Актиномицеты – Actinomyces (Streptomyces) (ветвящиеся бактерии или лучистые грибки) представляют собой одну клетку, разрастающуюся в виде нитчатого ветвящегося под прямым углом мицелия, диаметр гифов которого – 0,1–1,5 мкм. На плотных питательных средах формируют три типа мицелия (субстратный, надсубстратный и воздушный), образующего пушистые, бархатистые или мучнистые колонии, отличающиеся хрящевой плотностью и трудно снимающиеся с агара, при посеве на жидкую среду бульон остается прозрачным, а на стенке или дне сосуда образуются плотные комочки из войлокообразных гиф. Многие актиномицеты выделяют различные пигменты. Размножаются фрагментами воздушного мицелия, спороносными ветками или спорами. Мицелий представителей родов Proactinomyces, Nocardia распадается на отдельные участки, палочки или кокки. Растут в виде плотных колоний, не срастающихся с субстратом.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
Промикроскопировать клетки дрожжей Saccaromyces cerevisiae в препарате “раздавленная капля” и провести их прижизненую окраску метиленовым синим.
Рассмотреть колонии грибов Mucor mucedo, Aspergillus niger, Penicillium sp., Fusarium culmorum, Botrytis cinerea в микроскопе с объективом 8Х в открытой чашке Петри.
Приготовить препараты “раздавленная капля” названных плесневых грибов, изучить строение их конидиеносцев с объективом 40Х.
Мицелий грибов плохо смачивается водой, поэтому препарат готовят в смеси спирт + глицерин (1:1) или вода + уксусная кислота (1:1), перенося мицелий стерильной препаровальной иглой.
Приготовить препарат-отпечаток актиномицетов (Actinomyces sp.), промикроскоприровать его при увеличении 40Х и 90Х. Для этого покровное стекло наложить на поверхность колонии, слегка прижать, снять препаровальной иглой и поместить на предметное стекло отпечатком вверх. Отпечаток высушить, зафиксировать жаром, окрасить, как мазок бактерий. Отпечаток можно получить и на предметном стекле.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 6. МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ
Цель занятия: ознакомиться с морфологическим разнообразием бактерий.
Бактерии морфологически мало дифференцированы. Обычно различают три основные формы бактерий: 1) кокки – сферические или шаровидные клетки диаметром 1,5–2,5 мкм; 2) бактерии или бациллы – цилиндрические или палочковидные клетки; 3) извитые формы.
Кокковые формы не образуют спор, неподвижны (например, род Micrococcus). Если клетки делятся в одной плоскости и располагаются парами, образуются диплококки, иногда напоминающие вследствие изогнутости клеток кофейные зерна (возбудитель гонореи – Neisseria gonorrheae, возбудитель цереброспинального менингита – Neisseria meningitidis).
Если деление клеток происходит в одной плоскости, но кокки не отделяются друг от друга, образуя цепочки, они называются стрептококками (индикатор фекального загрязнения – Streptococcus faecalis, молочнокислые стрептококки – Streptococcus lactis, Str. cremoris).
Кокки, делящиеся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях, образуют группы по четыре кокка – тетрады, часто окруженные толстыми капсулами (Pediococcus, Aerococcus).
Кокки, делящиеся относительно равномерно в трех взаимно перпендикулярных плоскостях, образуя скопления кубической формы в виде пакетов из 8–16 клеток, называются сарцинами (Sarcina flava).
Некоторые кокки делятся неравномерно в нескольких плоскостях. Оставаясь вместе, они образуют скопления, напоминающие виноградную гроздь, и называются стафилококками (Staphylococcus aureus – возбудитель гнойных инфекций).
Самой многочисленной группой бактерий являются цилиндрические (палочкообразные) формы. Палочки, не способные образовывать споры, называют бактериями (сокращенно Вact. или В.), а палочки, способные к спорообразованию, обозначают как бациллы (Вас.). Различают коккобациллы, длина которых равна диаметру клетки, диплобациллы (парные клетки), стрептобациллы в виде цепочек. Типичными представителями неспороносных палочек являются Рseudomonas, Escherichia coli (кишечная палочка), Serratia marcescens (чудесная палочка), Salmonella, Shigella и др. Представителями спорообразующих палочек являются Сlostridium, Bacillus.
Изогнутые палочки, представляющие собой лишь часть спирали, называются вибрионами (Vibrio cholerae отличается полиморфизмом). Спирально извитые, состоящие из одного или многих витков, называются спириллами (патогенный Spirillum minus).
Изгибающиеся сильно извитые спирали называются спирохетами (Treponema pallidum – возбудитель сифилиса, Spirochaeta dentium).
Некоторые бактерии в зависимости от условий могут изменять свою форму, т.е. обладают плеоморфизмом (коринебактерии, например, Arthrobacter, риккетсии – облигатные внутриклеточные паразиты, возбудители лихорадок, сыпного тифа, микоплазмы). Форма некоторых бактерий напоминает кольцо (Microcyclus), звезду (Stella) и пр. Существуют стебельковые (Сaulobacter), нитчатые формы (Beggiatoa, Thiothrix) и др.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
Приготовить фиксированные мазки различных культур бактерий, промикроскопировать их с иммерсионной системой, зарисовать их форму.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 7. СТРОЕНИЕ МИКРОБНОЙ КЛЕТКИ
Цель занятия: ознакомиться со строением клеток бактерий, овладеть методами выявления капсулы, клеточной стенки, включений, окраски по Граму, а также обнаружение движения, эндоспор и кислотоустойчивости у микроороганизмов.
Использование разных способов, методов и приемов выявления структур микробной клетки определяется задачей исследований.
Применяются разные способы выявления отдельных структур и компонентов клеток: 1) микроскопия живых клеток (методы 2раздавленной» и «висячей капли», микрокамер, негативное контрастирование; 2) прижизненная (витальная) окраска микроорганизмов; 3) приготовление фиксированных окрашенных препаратов, метод отпечатков; 4) комбинированные методы (негативное контрастирование и прижизненная окраска), 5) приготовление ультратонких срезов микроорганизмов для электронной микроскопии.
Несмотря на внешнюю простоту организации, строение микробной клетки довольно сложное. Цитоплазма окружена оболочками, находящимися в постоянном функциональном взаимодействии и определяющими форму клетки (клеточная стенка), ее биохимическую активность (цитоплазматическая мембрана и мембранные образования), антигенные свойства (капсула, клеточная стенка), участвующими в обмене веществ между клеткой и окружающей средой, защищающими клетку от внешних факторов окружающей среды, обусловливающими многие поверхностные свойства клетки (поверхностное натяжение, электрический заряд, осмотическое состояние) и т.д. Различают цитоплазматическую мембрану, клеточную стенку и капсулу.
Химический состав и структура клеточных стенок определяют окраску по Х.Граму, предложенную в 1884 г. для выявления бактерий в гистологических срезах. По отношению к окраске по Граму все микроорганизмы делятся на окрашивающиеся по Граму – грамположительные (грампозитивные, Г+, фирмакутные) и неокрашивающиеся по методу Грама – грамотрицательные (грамнегативные, Г–, грациликутные). Есть грамвариабельные микробы, у которых отношение к окраске по Граму меняется в течение роста и развития клеток (коринеподобные бактерии). Сущность этого метода: краски трифенилметанового ряда (генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиловый фиолетовый) в комплексе с йодом удерживаются Г+ клетками при обесцвечивании спиртом, окрашивая их в сине-фиолетовый цвет. Г– бактерии обесцвечиваются и их дополнительно окрашивают контрастной краской (водным фуксином). В окраске по Граму основную роль играет клеточная стенка, т.к. протопласты Г+ бактерий становятся грамотрицательными. Сферопласты (клетки с нарушенной целостностью клеточной стенки), а также мертвые клетки грамотрицательные. Большинство коков, спорообразующих палочек грамположительные, кроме родов Neisseria, Methylococcus, Veillonella (паразиты, обитающие в ротовой полости, пищеварительном тракте и дыхательных путях человека и животных). Извитые формы, неспорообразующие палочки – грамотрицательные, кроме молочнокислых бактерий рода Lactobacillus, которые с возрастом, а также при повышенной кислотности среды превращаются в Г–, и некоторых других. Окраска по Граму является диагностической только в отношении прокариотов, обладающих клеточной стенкой, и не может быть использована в таксономии микоплазм и эукариотических микроорганизмов. Для окраски по Граму берут клетки молодых 8–24-часовых культур бактерий, т.к. с возрастом в бактериальной популяции возрастает количество мертвых клеток. В среднем соотношение жизнеспособных и нежизнеспособных бактерий 4 : 1.
Цитоплазматические включения полисахаридов, жироподобных веществ, полифосфатов (волютин), являющихся внутриклеточными запасными веществами, образование которых зависит от условий культивирования микробов, в микробной клетке выявляют разнообразными микрохимическими методами, учитывая их химический состав.
Морфология ядерного аппарата бактерий – бактериальной хромосомы или нуклеоида – меняется в зависимости от фазы роста культуры, от условий культивирования бактерий. Наблюдать его можно при помощи электронной микроскопии, в светлопольном микроскопе при специальных способах окраски (реакция Фельгена, состоящая в определении с помощью реактива Шиффа присутствия гидрооксилевулинового альдегида, образующегося при гидролизе дезоксирибозы, или окраска по Романовскому – Гимза).
Подвижность бактерий наблюдают при исследовании их в живом состоянии, но при этом невозможно длительно наблюдать за отдельной клеткой, т.к. она перемещается в поле зрения микроскопа. Подвижность микробов проявляется у молодых культур, лучше в жидкой среде (например, МПБ) в препарате «раздавленная» или “висячая капля”. Необходимо четко отличать активную подвижность клеток бактерий от броуновского движения, присущего неподвижным клеткам. С этой целью к капле бактериальной суспензии под покровное стекло в препарате “раздавленная капля” подслаивают (протягивают фильтровальной бумагой – фильтровальную бумагу прижимают к краю покровного стекла, противоположного к пипетке с вносимым раствором) каплю 5 %-го водного раствора фенола или 0,1 %-го раствора сулемы. При этом активное движение прекращается, а броуновское – сохраняется.
Наиболее распространенным у бактерий является движение с помощью жгутиков, наблюдать которые можно разными методами: 1) темнопольной микроскопией; 2) фазово-контрастной микроскопией; 3) электронной микроскопией; 4) с использованием специальных методов окраски с применением протравы, увеличивающей диаметр жгутиков. Жгутики – органы локомоции, имеющие приспособительное значение, – очень хрупкие образования, они легко отрываются от клетки, поэтому при приготовлении препарата для окраски жгутиков соблюдают ряд условий: 1) используют только молодые 12–18-часовые культуры бактерий, выросшие при оптимальных температурных условиях на плотной питательной среде, содержащей не более 1,5 % агар-агара, либо на свежей жидкой питательной среде; 2) взвесь бактерий готовят на 2 мл стерильной водопроводной воды, предварительно подогретой до температуры выращивания культуры. Клетки осторожно берут петлей, переносят в пробирку с водой, погружают в нее, не встряхивая; 3) берут чистые, хорошо обезжиренные предметные стекла из смеси Никифорова, проводят их 2–3 раза через пламя спиртовки и охлаждают; 4) суспензию бактерий на поверхность стекла наносят пастеровской пипеткой или бактериологической петлей в виде 5 маленьких отдельно расположенных капель ближе к одному из концов стекла. Капли высушивают при комнатной температуре и препарат окрашивают по методу Леффлера в одной из модификаций (например, Рыжковой). Характер расположения жгутиков, их количество, длина и конфигурация имеют диагностическое значение, особенно при идентификации палочковидных грамотрицательных бактерий.
Кислотоустойчивость микроорганизмов, обусловленная особенностями химического состава клеточных стенок бактерий, высоким содержанием фосфолипидов, в частности, наличием миколовых кислот, – это способность клеток, окрашенных карболовым фуксином Циля, при нагревании прочно удерживать краситель при последующей обработке их раствором минеральных кислот.
Для некоторых бактерий характерно спорообразование, имеющее общебиологическое значение для выживания и сохранения вида в неблагоприятных условиях. В клетке образуется только одна эндоспора с высоким показателем преломления, слабой проницаемостью для основных красителей, с несколькими оболочками и кортексом, высокой термоустойчивостью. Спорообразование – наследственно закрепленный процесс, но не обязательный этап жизненного цикла. Споры разных бактерий различаются по форме (круглые, овальные, эллипсовидные) размерам, расположению в клетке (бациллярное, клостридиальное или плектридиальное положение). Эндоспора – это покоящаяся форма, попадая в благоприятные условия, она прорастает, образуя вегетативную клетку. В природе значительно больше в количественном и видовом отношении неспорообразующих бактерий. При простых методах окраски эндоспоры не окрашиваются.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
ДВИЖЕНИЕ И КИСЛОТОУСТОЙЧИВОСТЬ БАКТЕРИЙ.
КАПСУЛЫ И ЭНДОСПОРЫ.
которую налить карболовый фуксин Циля;
Метод Пешкова
Метод Пешкова–Трухильо
Метод Омелянского
Метод Гинса
Метод Антони
ОКРАСКА БАКТЕРИЙ ПО ГРАМУ
Промикроскопировать и зарисовать клеточную стенку у Saccharomyces cerevisiae и Azotobacter chroococcum, окрашенных по методу Гутштейна:
Окрасить по Граму различные виды бактерий.
1 способ
II способ
Модификация Хукера
Модификация Г.П.Калины
Раствор I
Кристаллический фиолетовый
(бриллиантовый зеленый) – 0,5 г;
Этиловый спирт, 960 – 100 мл.
Раствор II
0,5 %-й спиртовый раствор йодида калия – 96 мл;
0,5 %-й спиртовый раствор основного фуксина – 2 мл;
5 %-й спиртовый раствор йода – 2 мл.
ВКЛЮЧЕНИЯ МИКРОБНОЙ КЛЕТКИ
1. Выявить микрохимически гранулезу в клетках маслянокислых бактерий культуры накопления в препарате “раздавленная капля”:
2. Выявить гранулы гликогена в клетках Saccharomyces cerevisiae и B. megaterium реакцией с более концентрированным раствором йода таким же образом, как и гранулезу в препарате «раздавленная капля». В поле зрения гликоген виден в виде гранул красновато-коричневого цвета.
3. Промикроскопировать и зарисовать включения жира в клетках Saccharomyces cerevisiae одним из методов:
Метод Омелянского
Метод Нейссера
Раствор 1 Раствор 2
Метиленовый синий – 0,1 г; Кристал. фиолетовый – 1г;
Этиловый спирт, 960 – 2 мл; Этиловый спирт, 960 – 10 мл;
Ледяная уксусная Дистиллир. вода – 300 мл.
кислота – 5 мл;
Дистиллир. вода – 100 мл.
Количественный учет микрофлоры воздуха
|
Место посева |
Количество колоний, шт. |
|
|
в чашке Петри |
в воздухе |
|
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 8. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ МИКРООРГАНИЗМОВ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР
Цель занятия: ознакомиться с методами исследования микрофлоры почвы, воды, воздуха, организма человека. Выделить микроорганизмы из предложенных образцов, описать их культуральные и морфологические свойства. Освоить методы выделения чистых культур микроорганизмов и определения их чистоты.
Микроорганизмы, развиваясь на поверхности плотных сред, образуют характерные для данного вида колонии. При описании колонии отмечают следующие признаки:
Край и структуру колонии определяют при малом увеличении микроскопа: чашку Петри помещают на предметный столик крышкой вниз. Консистенцию колонии устанавливают прикосновением к ее поверхности бактериологической петлей.
Описание колонии часто дополняют описанием роста микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной плотной питательной среды. Отмечают интенсивность роста: скудный, умеренный, обильный, и его особенности: налет сплошной с ровным или волнистым краем, четковидный в виде цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоидный. Характеризуют оптические свойства штриха, его цвет, поверхность и консистенцию.
Рост микроорганизмов в жидких питательных средах (на МПБ) при стационарных условиях культивирования (на 4–7 сутки) характеризуется большим единообразием по сравнению с ростом на плотных питательных средах. Он сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Отмечают интенсивность роста: скудный, умеренный, обильный. Помутнение среды может быть однородным, хлопьевидным или с шелковидной волнистостью. Особенности пленки: кольцеобразная или сплошная, тонкая или толстая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая, сухая или слизистая, всползающая или опадающая. При образовании осадка характеризуют его свойства: скудный или обильный, рыхлый, плотный, хлопьевидный, зернистый или слизистый.
Популяцию микроорганизмов, состоящую из клеток одного вида, называют чистой культурой. Выделение чистых культур необходимо для правильного представления об их морфолого-культуральных и физиологических свойствах для определения видовой принадлежности микробов.
В процессе выделения чистой культуры проводят три этапа исследования: 1) получают накопительную культуру микроорганизмов; 2) выделяют чистую культуру из накопительной; 3) определяют чистоту выделенной культуры.
Накопительной называют культуру микроорганизмов, в которой преобладает какая-либо определенная группа микробов. Для ее получения создают избирательные, или элективные условия, способствующие преимущественному развитию тех микроорганизмов, которые нужно выделить, например, подбирая определенный состав питательных сред, или добавляя вещества, избирательно подавляющие или стимулирующие рост тех или иных микробов, или подкисляя среду, или кратковременно прогревая среду, что обеспечивает рост спорообразующих бактерий. Лучший материал для получения накопительных культур микроорганизмов – пробы из тех мест, где естественные условия обитания способствуют развитию искомых микроорганизмов. Если в посевном материале присутствуют различные штаммы с одинаковым типом обмена, отличающиеся по скорости роста, то рассеивают смешанную популяцию микробов по поверхности плотной элективной среды.
Выделение чистой культуры можно проводить непосредственно из исследуемого материала. Чистая культура – потомство одной клетки – может быть получена путем механического разобщения микроорганизмов, или методами, использующими их биологические особенности.
Чистые культуры в жидких средах получают методом разведения, для чего смесь микроорганизмов последовательно разводят стерильной средой и из каждого разведения делают высев в несколько пробирок с той же средой.
Метод выделения чистой культуры из отдельной колонии, предложенный Р.Кохом, заключается в рассеве материала по поверхности плотной среды таким образом, чтобы произвести высев единичной клетки и получить при ее росте колонию чистых микроорганизмов. Чашки со средой для рассева обязательно хорошо подсушивают, чтобы образующиеся колонии не расползались по влажной поверхности агара. Для посева используют накопительные культуры, предварительно разведенные в стерильной водопроводной воде. Посев проводят последовательно в несколько чашек. Сначала на поверхность среды первой чашки наносят каплю разведения накопительной культуры и осторожно растирают ее стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности. Затем этим же шпателем засевают поверхность второй чашки, затем третьей и т.д. Можно пользоваться одной чашкой, разделив ее на секторы, и последовательно засевать ее штрихом (метод истощающего штриха). Для этого материал берут петлей и проводят ею ряд параллельных штрихов сначала по поверхности первого сектора, а затем последовательно засевают другие секторы. В первых секторах получается сплошной рост, а вдоль последующих штрихов вырастут обособленные колонии.
Выделение можно проводить методом глубинного посева, для чего готовят последовательные разведения посевного материала в отдельных пробирках, смешивают их с расплавленной и охлажденной до 45–500 С агаризованной средой, затем содержимое пробирок выливают в стерильные чашки Петри и дают им застыть. В глубине агара образуются изолированные колонии.
Отдельные клетки микроорганизмов можно выделить методами, осуществляемыми под контролем глаза.
Для выделения чистых культур патогенных микроорганизмов проводится заражение восприимчивых животных.
Чистоту выделенной культуры проверяют визуально (рост в виде однородного штриха, образование однородных по морфологии, консистенции и пигментации колоний), микроскопическим контролем (готовят препарат фиксированных клеток, окрашивают по Граму и исследуют с иммерсионной системой – чистая культура должна быть морфологически однородна, допустимо лишь незначительное варьирование размеров клеток) и высевом на ряд питательных сред (МПА, сусло, картофельный агар и др.) с целью выявления сопутствующих микроорганизмов, отличающихся по физиологическим признакам.
Исследование распространения микроорганизмов в окружающей среде теснейшим образом связано с проблемами экологии, охраны окружающей среды, микробиологическим производством, позволяет выявить источники и установить пути распространения возбудителей инфекционных заболеваний.
Почва является основной средой обитания микроорганизмов, количественный состав которых зависит от содержания в них органических и минеральных соединений, ее физико-химической структуры, влажности, плотности, аэрации, времени года и т.д. Особенно многочисленны и разнообразны микроорганизмы в зоне ризосферы. В почве обитают бактерии и грибы родов Bacillus, Pseudomonas, Cellvibrio, Myxococcus, Clostridium, Azotobacter, Rhizobium, Trichoderma, Aspergillus, Streptomyces и др. Микрофлору почвы изучают методом прямого подсчета клеток под микроскопом на фиксированных окрашенных мазках, разработанным С.Н.Виноградским, с помощью пластинок обрастания, методом высева почвенной болтушки на плотные питательные среды и др.
Воздух, не являясь жизненной средой для микроорганизмов, играет главную роль в их распространении. Количество микробов в атмосфере коррелирует с ее загрязненностью. Наиболее часто в воздухе обнаруживаются споры дрожжей, конидии и обрывки мицелия грибов, споры бактерий и актиномицетов, неспоровые бактерии. В открытом воздухе почти нет болезнетворных микробов, в то время как в атмосфере закрытых помещений много патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Метод осаждения, используемый для количественного и качественного изучения микрофлоры воздуха, дает возможность определить только 30–60 % микробов воздуха.
Вода является экологической нишей для многих микробов и служит средой их распространения. Количественный и качественный состав микрофлоры воды зависит, прежде всего, от наличия органических веществ. Основным показателем фекального загрязнения воды является группа кишечных палочек (Г– неспоровые палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при 370 С в течение 1–2 суток, не обладающие оксидазной активностью. Степень загрязнения воды бактериями этой группы выражают в виде коли-индекса, т.е. количестве бактерий этой группы в 1 л воды. Наименьшее количество воды, в котором обнаруживается одна бактерия этой группы, называется коли-титром. Коли-индекс на практике чаще всего определяют титрационным методом, определяющим размножение кишечных бактерий при посевах различных объемов жидкости в среду накопления (лактозо-пептоная среда) с индикатором и бродильными трубками. Определение общего количества микроорганизмов в воде проводят путем прямого подсчета клеток микробов под микроскопом или путем высева ее на плотные питательные среды.
Многие микроорганизмы временно или постоянно обитают в полостях тела человека и животных или на его поверхности. Макроорганизм и его микрофлора, состав которой у различных видов и особей специфичен и относительно постоянен в данный промежуток времени, рассматривают как единую экологическую систему. Под нормальной микрофлорой подразумевают открытый биоценоз микробов, встречающихся у здоровых людей и животных. Эта микрофлора состоит из характерных для данного вида микроорганизмов, т.е. индигенной микрофлоры, и из случайной, временной. От стабильности сложившегося в ходе эволюции баланса между микроорганизмом и его микрофлорой и равновесия внутри микробных ассоциаций существенно зависит ход разнообразных процессов в организме. Содержание и состав микрофлоры экологических ниш макроорганизма во многом зависит от его физиологического состояния, особенностей питания и пр.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 9. УЧАСТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
В КРУГОВОРОТЕ УГЛЕРОДА
Цель работы: ознакомиться с морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими особенностями микроорганизмов, участвующих в разложении клетчатки.
Целлюлоза (клетчатка) – главная составляющая часть клеточных стенок растений. Синтез ее по своим масштабам превосходит синтез всех прочих природных соединений. Разложение клетчатки происходит в аэробных и в анаэробных условиях, при щелочной и кислой реакции среды, низкой и высокой влажности, разной температуре. Все микроорганизмы, участвующие в минерализации клетчатки, хемоорганогетеротрофы. Они имеют фермент целлюлазу, катализирующий расщепление целлюлозы до целлобиозы и глюкозы. Образовавшиеся соединения микробы используют в качестве источника углерода и энергетического материала.
В аэробных условиях целлюлозу гидролизуют миксобактерии, некоторые представители неспоровых и споровых бактерий, актиномицеты и грибы.
Миксобактерии (роды Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium, Cellvibrio) – это мелкие (0,3–0,4 х 0,7–10 мкм), слегка изогнутые, часто с заостренными концами палочки, имеющие очень тонкую оболочку, и слабее окрашивающиеся красителями, чем многие другие бактерии. На твердом субстрате обладают скользящим движением, связанным с неравномерным выделением слизи всей поверхностью клетки, у некоторых бактерий имеются жгутики. Многие миксобактерии имеют сложный цикл развития: с возрастом палочки утолщаются и превращаются в крупные овальные или сферические покоящиеся клетки (микроцисты), более устойчивые к неблагоприятным воздействиям, чем вегетативные клетки, но менее устойчивые, чем эндоспоры. У некоторых миксобактерий микроцисты собраны в группы (цисты), скопления которых образуют ложные плодовые тела, видимые невооруженным глазом. Живут в слабокислых, нейтральных и слабощелочных почвах. Мезофилы. На поверхности субстрата растут в виде слизистых, неопределенной формы, расплывчатых налетов, бесцветных, желтых, оранжевых или красных. Клетки миксобактерий прилегают к фибриллам клетчатки и осуществляют ее гидролиз только при непосредственном контакте с ней. В качестве источника углерода могут использовать и крахмал, источник азота – нитраты.
В кислых почвах целлюлозу разлагают грибы родов Chaetomium, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus, Botritys и др.
В анаэробных условиях клетчатку разлагают мезофильные и термофильные виды родов Clostridium и Bacillus, устойчивые к кислотности среды. На средах, содержащих простые сахара, развиваются слабо. Энергетическим процессом у этих бактерий является маслянокислое брожение, сопровождающееся образованием уксусной, масляной, муравьиной, молочной и янтарной кислот, этанола, СО2 и Н2. В качестве источников азота используются аминокислоты, соли аммония и нитраты. Анаэробные бактерии, разрушающие клетчатку, распространены повсеместно: в почвах, навозе, компостах, илах, сточных водах.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 10. УЧАСТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
В ПРОЦЕССАХ БРОЖЕНИЯ
Цель работы: ознакомиться с морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими свойствами некоторых возбудителей различных видов брожения, провести микроскопический контроль продуктов, полученных с участием микроорганизмов. Ознакомиться с методами идентификации и выделения микробных метаболитов.
Брожение – это наиболее древний и примитивный способ получения энергии в анаэробных условиях. Основные типы брожений (спиртовое, молочнокислое, маслянокислое) открыты Л.Пастером (1861). В качестве исходного субстрата в процессах брожения микроорганизмы используют углеводы, спирты, органические кислоты, аминокислоты, пурины, пиримидины. Конечными продуктами брожений являются органические кислоты (молочная, уксусная, янтарная и др.), спирты (этиловый, пропиловый, бутиловый), ацетон, СО2 и Н2. В процессе брожения выделяют окислительную, ведущую к образованию пировиноградной кислоты (СН3СОСООН), и восстановительную стадии.
В микробиологической промышленности для получения ценных метаболитов (лизергиновой кислоты, эфедрина, инозина, различных ферментов, ацетона, глицерина, этанола, бутанола, лимонной, молочной и уксусной кислот, аминокислот, нуклеотидов, полисахаридов, витаминов, антибиотиков, гормонов, белковых, лекарственных препаратов и пр.) используют тысячи производственных штаммов, способных синтезировать или превращать различные вещества, растущих на дешевых субстратах, быстро размножающихся, синтезирующих большие количества нужных и малые количества побочных продуктов, обладающих физиологической стабильностью в условиях производства, фагоустойчивых и безвредных для людей и окружающей среды. Все промышленные микроорганизмы выделены из природных источников и подвергнуты индуцированному мутагенезу и ступенчатому отбору. Наиболее высокопродуктивные штаммы микробов-продуцентов биологически активных веществ созданы методами генетической инженерии.
Микроорганизмы используются и для получения различных продуктов питания, например, кефира, сметаны, сыров, творога, а также вина и пива.
В процессе микробиологического производства регулярно осуществляется химический анализ образующихся метаболитов: экзопродукты идентифицируют, предварительно отделив клетки от культуральной жидкости центрифугированием или фильтрованием, а эндометаболиты получают при механическом разрушении клеток (дезинтеграции), автолизе или кислотном гидролизе. Микробиологическим методом определяют физиологически активные вещества, оказывающие на другие индикаторные микроорганизмы стимулирующее или ингибирующее действие. В качестве тест-культур используются ауксотрофы – мутанты, утратившие способность синтезировать тот или иной продукт. С целью определения различных органических метаболитов применяются различные химические и физико-химические методы (хроматография, электрофорез, гельфильтрация и пр.)
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
Исследовать микроскопическим методом микрофлору кефира, простокваши, огуречного рассола, культуры накопления маслянокислых и уксуснокислых бактерий, суспензию дрожжей.
Реакция с кристаллическим йодом
К жидкости, взятой из пробирки для пробы, прилить немного 10%-го раствора NaOH и пробирку с этой смесью подогреть на спиртовке, не доводя до кипения. Затем добавить несколько кристалликов йода и снова нагреть. При этом образуется йодоформ с характерным запахом, окрашивающий жидкость в желтый цвет.
Реакция с двухромовокислым калием
К испытуемой жидкости добавить кристаллик бихромата калия К2Cr2O7 и несколько капель концентрированной Н2SO4, нагреть смесь на спиртовке. При этом цвет жидкости изменится до зеленого вследствие восстановления хрома, выделяющийся уксусный альдегид ощутим по запаху:
K2Cr2O7+ 4H2SO4 + 3C2H5OH = K2Cr2(SO4)4 + 3CH3COH + 7H2O
Масляную кислоту можно выявить в реакции с хлоридом железа (FeCl3), для чего к 4–5 мл исследуемой жидкости добавить 2 мл 5 %-го FeCl3, смесь подогреть до специфического коричневого цвета.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 11. УЧАСТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
В КРУГОВОРОТЕ АЗОТА
Цель работы: ознакомиться с морфолого-культуральными признаками микроорганизмов, участвующих в круговороте азота, определить их роль в биогенной миграции атомов.
Азот – основной элемент, необходимый для развития растений и определяющий урожай сельскохозяйственных культур. Круговорот азота на Земле осуществляется благодаря жизнедеятельности микроорганизмов.
Азот атмосферы связывается азотфиксаторами, строящими из него все азотсодержащие соединения клетки. Этим свойством обладают различные виды родов Rhizobium, Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, фототрофные, метанообразующие и сульфатвосстанавливающие бактерии, некоторые микобактерии, актиномицеты и грибы, цианобактерии и др.
Свободноживущий аэробный азотфиксатор Azotobacter chroococcum образует слизистые, выпуклые или растекающиеся темно-бурые или черные колонии, Az. agilis, Az. vinelandii формируют прозрачные слизистые колонии, которые выделяют желтовато-зеленоватый или сине-зеленый пигменты, проникающие в среду.
Молодые клетки азотобактера – перитрихи в виде одиночных или соединенных в пары палочек с округлыми концами длиной от 2–3 до 4–6 мкм. Постепенно палочки превращаются в крупные, неправильной формы округлые или овальные образования, при этом теряются жгутики, клетки покрываются слизистой капсулой, плазма приобретает зернистость и обогащается включениями, некоторые виды образуют цисты. Гетеротрофы, в качестве источника углерода используют различные углеводы, спирты, органические кислоты. Источники азота для них – молекулярный азот, соли аммония, нитраты, нитриты, аминокислоты. Чувствительны к фосфору, кальцию, молибдену и бору. Развиваются при рН выше 6 (Az. indicum растет в среде с рН около 3,0), нуждаются в большом количестве влаги.
Из анаэробных азотфиксаторов наиболее активно связывает азот Clostridium pasteurianum. Это крупные одиночные или соединенные в короткие цепочки палочки длиной до 8,0 мкм, в молодых культурах – перитрихи, образующие эндоспоры клостридиального или плектридиального расположения, выдерживающие нагревание при 800 в течение 10 мин. Старые клетки неподвижны. Облигатные анаэробы, хемоорганогетеротрофы. Энергию получают в результате сбраживания углеводов (сахаролитичесие клостридии – Cl. butyricum, Cl. pasteurianum, Cl. cellobioparum) или белков, аминокислот, пуринов, пиримидинов (протеолитические клостридии – Cl. putrificum, Cl. sporogenes, Cl. histolyticum), осуществляя маслянокислое и ацетонобутиловое брожение. В качестве источника азота используют соли аммония, нитраты, азотсодержащие органические вещества, молекулярный азот усваивается при дефиците этих соединений. Встречается в кислых и щелочных почвах.
К симбиотическим азотфиксаторам относятся клубеньковые бактерии, входящие в симбиоз с бобовыми растениями. Это бактерии рода Rhizobium, представленные в молодой культуре подвижными палочковидными клетками, по мере роста теряющими подвижность и переходящими в стадию опоясанной палочки, которая затем переходит в стадию азотфиксирующей единицы – бактероида, приобретая форму коралла. Хемоорганогетеротрофы, источником углерода для них являются углеводы, органические кислоты, многоатомные спирты, источником азота – соли аммония, нитраты, аминокислоты. Проявляют высокую специфичность в отношении бобового растения-хозяина.
Аммонификация – процессы разложения белка и других органических соединений азота с образованием аммиака. Большинство аммонификаторов – полифаги., выделяющие протеолитические экзоферменты, осуществляющими гидролиз белков до аминокислот, которые используются в конструктивных и энергетических процессах. В аэробных условиях азотсодержащие органические соединения разлагают виды родов Bacillus (Bac. subtilis – сенная палочка, Bac. cereus var. mycoides, Bac. megaterium, Вас. mesentericus – картофельная палочка, Bac. polymyxa, Bac. brevis) и Pseudomonas (Ps. fluorescens, Ps. putida, Ps. ovalis), Proteus vulgaris, представители семейства Enterobacteriaceae (E. coli), различные актиномицеты и мицелиальные грибы. Анаэробную аммонификацию осуществляют некоторые виды род Clostridium (Cl. putrificum – подвижная одиночная или соединенная в цепочки палочка размером 7–9 мкм с плектридиальным спорообразованием, Cl. sporogenes – подвижная одиночная или соединенная в цепочку палочка размером 3–5 мкм с клостридиальным спорообразованием, образующая большое количество сероводорода).
Нитрификация – окисление аммиака до азотной кислоты, сопровождающееся ассимиляцией углекислоты и осуществляемое хемолитоавтотрофами в аэробных условиях. Нитрификация идет в две стадии. Первую – окисление аммиака до нитритов – осуществляют Nitrosomonas, Nitrosocystis – кокки диаметром 1,5 мкм, образующие зооглеи и встречающиеся в океанах, Nitrosospira – спираллевидные клетки длиной до 15–20 мкм, Nitrosococcus, Nitrosolobus. Все эти микроорганизмы сходны между собой в физиолого-биохимическом отношении. Представители рода Nitrosomonas – не образующие эндоспор мелкие (0,5–1,5 мкм) эллипсовидные клетки, в жидкой культуре проходящие две основные фазы: подвижную (монотрихи) и зооглейную. Наиболее изучен Nitrosomonas europea. Вторую стадию, связанную с окислением азотистой кислоты до азотной, осуществляют Nitrobacter winogradskyi, N. agilis, Nitrospira gracilis, Nitrocoсcus mobilis. Клетки нитробактера полиморфны (округлые, палочковидные, бобовидные, яйцевидные, грушевидные), размером 1,0–1,2 мкм, монотрихи или неподвижные. В неблагоприятных условиях может образовывать зооглеи.
Денитрификация – процесс восстановления нитратов до молекулярного азота с сопряженным окислением до СО2 и Н2О органических кислот, сахаров, спиртов, происходящий в аэробных и более интенсивно в анаэробных условиях. Ее осуществляют бактерии родов Pseudomonas (Ps. aeruginosa, Ps. denitrificans, Ps. fluorescens), Achromobacter (Achr. stutzeri), Micrococcus (M. denitrificans), Bacillus (Bac. licheniformis). Они хемоорганогетеротрофы, факультативные анаэробы (аэробы).
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
1. Приготовить препарат Azotobacter chroococcum при простом методе окраски фиксированного жаром мазка водным раствором фуксина. Микроскопировать с иммерсией.
2. Приготовить препарат «раздавленная капля» накопительной культуры Clostridium butyricum, добавив в суспензию бактерий, взятую пастеровской пипеткой, каплю йода. Накрыть покровным стеклом, микроскопировать с объективом 90Х.
3. Приготовить препарат клубеньковых бактерий рода Rhizobium, для чего раздавить клубенек между двумя предметными стеклами, высушить полученные мазки, зафиксировать их жаром, окрасить 2–3 мин водным раствором фуксина, микроскопировать с иммерсией.
4. Приготовить фиксированные жаром, окрашенные 2–3 мин метиленовым синим или фуксином препараты суспензии аммонифицирующих бактерий, взятой пастеровской пипеткой из пленки, глубины культуры и осадка. Микроскопировать с объективом 90Х, зарисовать микроскопическую картину, описать морфологические особенности наблюдаемых клеток, отмечая наличие или отсутствие спор. Выделение аммиака обнаруживают по запаху и посинению красной лакмусовой бумаги, а выделение сероводорода – по почернению полоски фильтровальной бумаги, смоченной 10 %-м раствором уксуснокислого свинца.
5. Приготовить фиксированные жаром и окрашенные метиленовым синим или фуксином мазки нитрифицирующих бактерий 1-ой (Nitrosomonas europea) и 2-ой (Nitrobacter winogradskyi) фаз нитрификации. О ходе процесса нитрификации судят по изменению состава питательной среды. В колбе со средой для 1-й фазы проверяют образование азотистой кислоты по реакции с реактивом цинк-йод-крахмал, к трем каплям которого прибавляют одну каплю раствора серной или соляной кислоты и одну каплю исследуемой жидкости, которая в присутствии азотистой кислоты синеет. В колбе со средой для 2-ой фазы проверяют наличие азотистой кислоты реактивом цинк-йод-крахмал и образование азотной кислоты по реакции с дифениламином, для чего к 3–4 каплям концентрированной серной кислоты добавляют кристаллик дифениламина и после его растворения приливают одну каплю исследуемой среды. При наличии азотной кислоты среда окрашивается в темно-синий цвет.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 12. МИКРОФЛОРА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Цель занятия: ознакомиться с морфологическими особенностями микрофлоры пищевых продуктов (сыра, яиц, рыбы, мяса).
Физические свойства и химический состав большинства продовольственных товаров таковы, что позволяют активно на них развиваться микробам. Однако микрофлора разных пищевых продуктов неодинакова.
Основная роль в сыроделии принадлежит молочнокислому и пропионовокислому брожениям. Большое влияние на качество сыров оказывает качество молока и степень обсемененности его нежелательными микроорганизмами. Свертывание молока (коагуляцию казеина) проводят, заквашивая его молочнокислыми бактериями и вводя сычужный фермент (кисломолочные сыры). По степени разложения казеина сычужные сыры делятся на мягкие и твердые (в растворимое состояние превращается только 1/3 казеина), которые, в свою очередь, делят на крупные с более длительным периодом созревания (6–9 месяцев), например, швейцарский сыр, и мелкие (срок созревания – 1–2 месяца, например, голландский, костромской сыры). В закваску для крупных сыров входят молочнокислые палочки Lactobacillus casei, Lactobac. helveticus, в меньшей степени молочнокислые стрептококки Streptococcus lactis, ароматообразующие стрептококки, пропионово-кислые палочки, сбраживающие лактат до летучих органических кислот (пропионовой, уксусной) и СО2, что обусловливает появление в сыре глазков. В мелких сырах глазки образуются в первые дни ферментации в процессе жизнедеятельности ароматообразующих стрептококков.
Пороки сыра: раннее вспучивание вследствие образования большого количества СО2 и Н2, вызываемого бактериями группы кишечной палочки, в период, когда в сыре еще недоиспользована лактоза; позднее вспучивание, вызываемое бактериями рода Clostridium, сбраживающих молочную кислоту в масляную с выделением СО2 и Н2; изъязвление корки сыра, вызываемой плесневыми грибами, хотя некоторые из них принимают участие в созревании сыров, придавая им характерный вкус (Penicillium glaucum – зеленый сыр, Pen. roqueforti – сыр рокфор, Pen. camamberti – сыр камамбер).
Яйца еще при снесении обсеменяются с поверхности различными микроорганизмами, внутреннее же их содержимое стерильно, т.к. наружные оболочки (скорлупа и др.), а также естественный иммунитет препятствуют проникновению микробов. При продолжительном хранении постепенно нарушается целостность оболочек, снижается активность защитных факторов. Основным процессом при бактериологической порче яиц является гниение. Микробы, попавшие в яйцо, развиваются около места внедрения, образуя скопления колоний в виде темных пятен, обнаруживаемых при овоскопии. Одновременно сбраживаются сахара, гидролизуются жиры, выделяются газообразные продукты (H2S, NH3). Возбудителями порчи яиц являются бактерии группы кишечных палочек, протей, стафилококки, плесневые грибы. В испражнениях больных птиц, особенно водоплавающих, могут содержаться сальмонеллы. Продукты переработки куриных яиц (особо скоропортящийся меланж, яичный порошок) также содержат микрофлору.
Рыбные товары менее стойки к воздействию микробов, чем мясные вследствие специфики ее холодолюбивой микрофлоры, которая, попадая в условия более высокой температуры после вылова рыбы, начинает интенсивно размножаться. Много микроорганизмов на поверхности рыбы, покрытой слизью, а также в кишечнике, быстро развиваются микробы, находящиеся в жабрах. Мышечная ткань здоровой живой рыбы не содержит микробов. Обильно обсеменяется рыба при ее разделке, переработке, хранении. В состав микрофлоры рыбы входят микрококки, сарцины, споровые и бесспоровые палочки, в том числе гнилостные. В мороженной рыбе микробиологические процессы крайне замедлены, но на ее поверхности могут развиваться единичные точечные колонии плесневых грибов. При выработке вяленой и копченой рыбы значительная часть микрофлоры погибает, однако выделение гнилостными бактериями токсинов не прекращается. Икра рыб стерильна, но обсеменяется в процессе технологической обработки: в 1 г пастеризованной икры обнаруживаются сотни споровых палочек и кокков, для подавления развития которых в икру вводят поваренную соль и антисептики (0,3 % буру или 0,1 % уротропин).
Мясо здорового скота стерильно. Мясо павших больных и переутомленных животных содержит гнилостные аэробные и анаэробные микроорганизмы. Бактерии, попавшие на поверхность мяса, проникают вглубь тем быстрее, чем выше температура хранения (при 2–40 С бактерии проникают через 30 дней на глубину 1 см), ниже упитанность туш, чем меньшая площадь их покрыта жиром. Проникновению микробов препятствует корочка подсыхания на поверхности мяса (при хорошей корочке туша может храниться при 00 С около 8 недель). Бактерии вызывают появление на мясе красных или желтых пятен, придают ему синюю окраску, способствуют ослизнению с поверхности в условиях высокой влажности, что становится заметным при содержании 5–10 млн. клеток на 1 см2 поверхности. Ослизнение не затрагивает глубинные слои мяса, мало влияя на его пищевую ценность, но существенно ухудшает его товарный вид. На поверхности мяса могут развиваться плесневые грибы (даже при –80 С), повышая рН мяса, тем самым способствуя развитию гнилостных бактерий. По степени свежести мясо подразделяется на доброкачественное (корочка подсыхания сухая бледно-красного цвета, на разрезе мясо плотное, эластичное, ямка после надавливания исчезает), мясо сомнительной свежести (корочка плотная, темно-красная, ослизненная, консистенция мяса мягкая, несколько дряблая, образующаяся при надавливании пальцем ямка не исчезает) и мясо, непригодное в пищу (поверхность ослизненная, липкая, на разрезе мясо зеленого цвета, консистенция дряблая, мажущаяся, жир слизистый, с прогорклым запахом).
Микрофлора мясного фарша богаче микрофлоры целого куска мяса, что обусловлено обсеменением при переработке, наличием воздуха. Порча становится ощутимой при содержании 5–10 млн. клеток бактерий в 1 г фарша.
Колбасный фарш по сравнению с мясным более обсеменен микрофлорой, т.к. готовится из хранившегося длительное время мяса: в 1 г его содержится до 90 млн. клеток микроорганизмов. Значительное количество споровых микробов попадает в фарш со специями. Термическая обработка колбас уничтожает не всех микробов, количество которых возрастает при хранении особенно в вареных и ливерных колбасах, в зельцах и студенях, имеющих повышенную влажность и изготавливающихся из сильно обсемененного сырья (субпродуктов и пр.).
Обсемененность мяса птицы может быть очень высокой, одной из причин которой может быть предубойное голодание, облегчающее технологию обработки птицы, но приводящее к общему ослаблению организма, в результате чего сальмонеллы и другие микробы из желудочно-кишечного тракта проникают во внутренние органы и ткани.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
1. Приготовить препарат свежего сыра (например, голландского): фламбированным ножом срезать место, где будет взята проба, затем срезать тонкий кусочек сыра, плотно сдавить его между двумя сухими чистыми предметными стеклами, стекла осторожно разъединить и удалить сыр. Полученный на стекле отпечаток высушить на воздухе, зафиксировать в смеси Никифорова в течение 5–7 мин, окрасить метиленовым синим 7–10 мин, препарат промыть, высушить, микроскопировать с иммерсией.
2. Приготовить высушенные и зафиксированные в смеси Никифорова в течение 5–7 мин мазки из белка свежего и несвежего куриного яйца. Окрасить 3–5 мин фуксином. Промытые высушенные мазки микроскопировать с иммерсионной системой.
3. Приготовить препараты свежего и несвежего мяса: на предметных стеклах делают два мазка-отпечатка – один с поверхностного, другой из глубинного слоя каждого сорта. Для этого из поверхностного слоя стерильными ножницами вырезают кусочек (0,5–1 г) и прикладывают срезанной стороной к поверхности обезжиренного, фламбированного предметного стекла. Для приготовления мазка-отпечатка из глубоких слоев поверхность мяса прижигают нагретым шпателем, стерильным ножом делают надрез и берут из глубины небольшой кусочек (0,5–1 г), который прикладывают к стеклу. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют смесью Никифорова, окрашивают фуксином 3–5 мин, микроскопируют с иммерсией, отмечая форму микроорганизмов. Препарат-отпечаток свежего мяса окрашивается плохо: в поверхностных слоях единичные палочки и кокки, в глубоких – они отсутствуют. Препарат-отпечаток несвежего мяса окрашивается удовлетворительно: особенно много микробов в поверхностном слое, преобладают палочки. При разложении мяса кокки в отпечатках отсутствуют. Среди гнилостных бактерий преобладают микрококки, кишечная палочка, флуоресцирующие бактерии, споровые формы, аэробные формы представлены бациллами, факультативно-анаэробные – протеем, анаэробные – клостридиями.
4. Приготовить препарат-отпечаток из мясного (колбасного) фарша, микроскопировать с иммерсией, отметить морфологические особенности выявленных микроорганизмов.
5. Приготовить препараты-отпечатки с поверхностных и глубоких слоев рыбы. Микроскопировать с объективом 90Х, отметить преобладающие формы микроорганизмов.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 13. ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель занятия: ознакомиться с методами выявления модификаций у микроорганизмов.
Микроорганизмам присуща изменчивость. Наследственная (модификационная) изменчивость – это массовые однонаправленные изменения, возникающие и исчезающие при действии определенных условий на клетки генетически однородной культуры. Модификации – это результат предшествующей эволюции организмов, возникшие как приспособительный механизм, позволяющий клетке перенести временные изменения в среде обитания. Обычно при устранении специфических воздействий, вызывающих образование модификаций, последние исчезают.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
Выявить и получить модификации у микроорганизмов под влиянием условий внешней среды.
Температура. На скошенную поверхность МПА, разлитого в две пробирки, засеять штрихом односуточную культур Proteus vulgaris. Одну пробирку поместить в термостат при 370 С (контроль), вторую – при 420 (опыт). Культивировать в течение суток. Произвести учет опыта: приготовить фиксированные мазки, окрасить 3–5 мин водным раствором фуксина и микроскопровать, используя иммерсионную систему. В поле зрения видны нормальной морфологии клетки контрольной культуры, а при микроскопии культур, выросших при 420 С, наблюдаются изменения морфологии клеток, появляются инволюционные (необычно измененные) формы, чаще всего длинные нитевидные клетки, образовавшиеся в результате нарушения процесса деления клеток при сохранении функции роста.
Свет. На скошенную поверхность МПА, разлитого в две пробирки, засеять штрихом односуточную культуру Serratia marcescens. Одну пробирку завернуть в черную светонепроницаемую бумагу и обе пробирки поместить в термостат при 370 С на сутки. Через 24 ч культивирования пробирки оставить при комнатной температуре на свету на сутки (черную бумагу не снимать). Произвести учет опыта, определяя визуально наличие пигментации и ее интенсивность у культур, выросших на рассеянном свете и в темноте.
Осмотическое давление. На скошенную поверхность МПА с разной концентрацией NaCl – 0,5 % (контроль); 2,5; 5,0; 7,5; 10 % (опыт), разлитого в пробирки, засеять штрихом односуточную культуру B. subtilis (B. mesentericus). Пробирки поставить в термостат при 370 С на сутки. Произвести учет опыта, визуально оценивая интенсивность роста и приготовив фиксированные препараты для микроскопии с объективом 90Х. В поле зрения видны клетки нормальной формы и размеров культуры, выросшей в контрольном варианте, и наблюдается постепенное уменьшение размеров клеток по мере возрастания концентрации NaCl в питательной среде.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
З а н я т и е 14. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель занятия: ознакомиться с методами определения антибиотической активности микроорганизмов, выделенных из естественных сред обитания, и чувствительность их к антибиотикам.
Особое место в изучении взаимоотношений между микробами занимают антагонистические взаимоотношения, характеризующиеся специфическим подавлением развития одних видов микробов другими с помощью вырабатываемых ими физиологически активных вторичных метаболитов – антибиотиков ( С.Я. Ваксман, 1943). Сейчас антибиотики, используемые для лечения заболеваний различной этиологии, получают промышленным способом. Слишком частое и не всегда обоснованное применение антибиотиков приводит к снижению их эффективности в связи с появлением антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов. Процесс получения новых антибиотиков состоит из нескольких этапов: 1. Поиск в природе и выделение чистых культур микробов-антагонистов. 2. Изучение антибиотических свойств выделенных антагонистов и количественное определение их антибиотической активности. 3. Предварительная идентификация антибиотика. 4. Выделение и химическая очистка активно действующего химического начала. 5. Изучение механизма действия химически чистого соединения. 6. Изучение биологической активности препарата на животных и человеке.
Определяющую роль в выявлении микробов-антагонистов играют тест-организмы, такие как Staphylococcus aureus, Sarcina flava, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyces griseus, Aspergillus niger и др. Определение антибиотической активности микророрганизмов чаще проводят на твердых питательных средах, основываясь на способности антибиотика диффундировать в агаризованную среду и оказывать бактерицидное или бактериостатическое действие на тест-организмы. Для этого используют метод агаровых блоков, метод перпендикулярных штрихов, метод желобка, метод бумажных дисков, метод серийных разведений и др.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАДАНИЯ
Изучить методом агаровых блоков антагонистическую активность актиномицетов (Actinimyces) и грибов (Penicillium) к тест-культурам Staph. aureus, E. coli, Sarcina flava и пр.
1) приготовить водные суспензии тест-культур, для чего в пробирку с тест-микроорганизмом, выросшим на скошенной агаровой поверхности, внести 5–7 мл стерильной воды и смыть микробные клетки с поверхности среды, встряхивая пробирку;
2) расплавленный МПА разлить по 15–20 мл в стерильные чашки Петри и дать ему остыть. Стерильной пипеткой перенести в чашку Петри на поверхность МПА 0,2–0,3 мл суспензии тест-микроба и равномерно распределить посевной материал по поверхности среды шпателем Дригальского;
3) стерильным пробочным сверлом вырезать по одному агаровому блоку в агаризованных средах с выросшими на них сплошным «газоном» микробами антагонистами и перенести на поверхность агаризованной среды, засеянной тест-культурой. Блоки расставить биомассой вверх. Чашки поместить в термостат при 370 С и инкубировать 18–20 ч;
4) провести учет опыта, отметив какие из исследованных микроорганизмов обладают антибиотической активностью и к каким тест-культурам. Измерить диаметр зон задержки роста (ДЗЗР) для каждого микроорганизма и заполнить таблицу:
|
Тест-микроорганизмы |
ДЗЗР, мм |
|
|
Actinomyces |
Penicillium |
|
|
Staph. aureus |
||
|
E. coli |
||
|
Sarcina flava и т.д. |
Изучить антагонистические свойства микроорганизмов методом подсева тест-микробов штрихом к антагонисту, выросшему на агаровой пластинке в чашке Петри.
1) приготовить водные суспензии тест-микроорганизмов, выросших в пробирках на скошенной поверхности агара;
2) в чашке Петри с плотной питательной средой, на которой сплошным «газоном» выросла культура микроорганизма, исследуемого на наличие антагонистических свойств, стерильным скальпелем вырезать и удалить половину агаровой пластинки. В свободную часть чашки Петри залить 10 мл МПА;
3) после застывания агаризованной среды на наружной поверхности дна чашки Петри провести перпендикулярно границе раздела агаровых пластинок параллельные линии на расстоянии 8–10 мм друг от друга, служащие трафаретом для подсева тест-микробов. Подсев водных суспензий тест-культур произвести штрихом, начиная подсев на расстоянии 2 мм от границы роста микроба-антагониста. Штрих каждого тест-микроба нумеруют;
4) чашки инкубировать при 370 С 18–20 ч;
5) отсутствие роста тест-микроорганизма на том или ином расстоянии от границы роста исследуемого на антибиотическую активность микроорганизма указывает на угнетение данного организма продуктами жизнедеятельности микроба-анатагониста. Если тест-микроорганизм развивается, начиная непосредственно от блока, это указывает на то, что изучаемый штамм микроорганизма не оказывает угнетающего действия на данный тест-организм.
Изучить чувствительность микроорганизмов к антибиотикам методом бумажных дисков.
1) на поверхность подсушенной агаризованной среды стерильной пипеткой нанести суспензию исследуемого тест-микроорганизма в объеме 0,2–0,3 мл и распределить ее равномерно с помощью шпателя Дригальского;
2) на засеянные тест-микробом чашки Петри с помощью стерильного остроконечного пинцета поместить на расстоянии 3–4 см друг от друга и на расстоянии 2–2,5 см от края чашки диски, пропитанные разными антибиотиками. Каждый диск прижать браншами пинцета так, чтобы он плотно прилегал к поверхности среды. Засеянные чашки поместить в термостат при 370 С вверх дном. Антибиотик из дисков диффундирует в агар, формируя вокруг него зону угнетения роста чувствительных к нему бактерий. Измерения диаметра зоны задержки роста (ДЗЗР) произвести с помощью миллиметровой бумаги. При ДЗЗР до 10 мм штамм расценивается как слабо чувствительный, при ДЗЗР более 10 мм – как чувствительный;
3) произвести учет опыта, отметив к каким антибиотикам чувствителен исследуемый тест-микроорганизм. Результаты внести в сводную таблицу:
|
Тест-микроорганизм |
ДЗЗР, мм |
|||
|
Pen- |
Strep- |
Nistat- |
Oletet- |
|
|
Staph. aureus |
||||
|
E. coli |
||||
|
Bac. subtilis и т.д. |
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
ОПИСАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Принципы классификации и идентификации разных групп прокариот и эукариотных микроорганизмов имеют существенные различия. Идентификация грибов до классов, порядков и семейств основана на характерных чертах строения и способах образования половых структур, используется характеристика бесполых спороношений, строение и степень развития мицелия, культуральные (колония) и физиологические признаки. Дифференциация родов внутри семейств и видов проводится с применением морфологических, физиологических и культуральных особенностей. Единого определителя для идентификации всех грибов не существует. Идентификация дрожжевых грибов основана на культуральных (макроморфологических), цитологических, физиолого-биохимических особенностях, характеристике жизненных циклов и полового процесса, специфических признаках, связанных с экологией.
Таким образом, идентификация эукариот базируется главным образом на особенностях их морфологии и циклов развития.
Идентификация прокариот, менее морфологически разнообразных, чем эукариоты, основана на использовании широкого спектра фенотипических и генотипических признаков, особенно функциональных особенностей. При описании и идентификации бактерий изучают их культуральные свойства, морфологию, организацию клетки, физиолого-биохимические особенности, химический состав клеток, содержание гуанина и цитозина (ГЦ) в ДНК и др. При этом необходимо соблюдать следующие правила: работать с чистыми культурами, применять стандартные методы исследования, использовать для инокуляции клетки, находящиеся в активном физиологическом состоянии.
Морфологические свойства (характерный особенности роста бактерий на плотных и жидких питательных средах) обычно используют для характеристики, но не для идентификации.
Морфологическая идентификация проводится по форме и размерам клеток, их подвижности, наличии жгутиков и типу жгутикования, способности к спорообразованию, окраске клеток по Граму, строению их клеточных стенок, выявлению в клетках характерных мембранных систем (хлоросом, аэросом, карбоксисом и пр.).
Физиолого-биохимические свойства включают установление способа питания, типа энергетического метаболизма, отношений бактерий к кислороду, температуре, рН среды, солености, освещенности и пр., потребность в витаминах и факторах роста, образование характерных продуктов метаболизма, для чего применяют специальные диагностические тесты, называемые рутинными. Их постановка требует значительных затрат времени, большого количества сложных сред и реактивов. Для ускорения идентификации разработаны различные тест-системы: Enterotube, Mycotube, Patho-Tec, СИБ и др. При идентификации симбиотических и патогенных бактерий устанавливают специфичность симбионта к хозяину, а также устойчивость к антимикробным веществам и фагам.
Для хемосистематики определяют состав клеток, в частности, состав клеточных стенок, липидный, жирнокислотный и пигментный состав, что особенно важно для тех групп бактерий, у которых морфологические и физиологические признаки широко варьируются. Состав клеточной стенки определяет и серологические свойства, что лежит в основе иммунохимических методов идентификации. Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть получена при изучении клеточных белков – продуктов трансляции генов (белковая таксономия). Спектры рибосомных белков относятся к числу наиболее стабильных и используются для идентификации бактерий на уровне семейства или порядка. Спектры мембранных белков могут отражать родовые, видовые и внутривидовые различия. Однако характеристики химических соединений клетки не могут использоваться для идентификации бактерий изолировано от данных, описывающих фенотип, т.к. нет критерия оценки значимости фенотипических признаков. Нередко при идентификации микроорганизмов используют метод нумерической (адансоновской) таксономии, согласно которой различные фенотипические признаки, поддающиеся учету, равноценны, что позволяет количественно выразить таксономические дистанции между организмами в виде отношения число положительных признаков к общему числу изученных. Сходство между двумя исследуемыми организмами определяется путем количественной оценки возможно большего числа (обычно не менее ста) фенотипических признаков, подбираемые так, чтобы их вари анты были альтернативными и могли обозначаться знаками «минус» или «плюс». Степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента сходства (S).
Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в результате успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе нуклеиновых кислот, дает возможность построить естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов. Для оценки генетического родства бактерий используется метод ДНК-ДНК гибридизации, разновидностью которого является метод генных зондов. Реакция гибридизации при этом ведется между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим генетический маркер, ответственный за определенную функцию, и ДНК изучаемой бактерии. Все чаще для идентификации бактерий предлагают дендрограммы, показывающие взаимоотношения между бактериальными родами, видами и штаммами на основании изучения последовательности нуклеотидов в рРНК, а также ДНК-ДНК и ДНК-рРНК гибридизации.
Идентификацию бактерий проводят с помощью определителя Берги (Bergey s Manual of Determinative Bacteriology). В последнем (9-м) издании (1993), все бактерии разделены на 35 групп по легко определяемым фенотипическим признакам. Более полная информация о таксономическом положении бактерий содержится в 4-томном Руководстве Берги по систематике бактерий (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 1984-1989). Для каждой группы бактерий дается описание входящих в нее родов и видов, в том числе с неясным таксономическим статусом.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Составитель: И.П.Отурина
Методические материалы и задания к
лабораторным работам по курсу «Общая микробиология»
для студентов 3 курса дневной и 4 курса заочной форм обучения
специальности 6.070400 «биология»
образовательно-квалификационного уровня «бакалавр»
профессионального направления подготовки 0704 «биология»
Редактор Н.А.Василенко
|
Подписано к печати Формат 60х84/16 Бумага тип ОП Объем 4,5 пл Тираж 50 экз Заказ - Бесплатно |
95007, г. Симферополь, ул. Ялтинская, 4
Таврический национальный университет им.В.И.Вернадского
3