Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Вопрос 54. Методы ДНК-диагностики
ДНК-диагностика - это группа методов, которые основаны на выявлении ДНК возбудителя в забранном у пациента материале.
Методы ДНК-диагностики включают в себя такие методы, как ПЦР (полимеразная цепная реакция) и ЛЦР (лигазная цепная реакция). Для исследования методом ПЦР может быть забран практически любой материал. На анализ берут по особой методике соскоб из мочеиспускательного канала, влагалища и шейки матки. Также материалом для ПЦР могут служить кровь, моча, мокрота и т. п.
В ходе различных манипуляций, ДНК инфекции (если она присутствует в забранном материале) многократно удваивается, пока количество ДНК не станет равным 10 8 — 10 12 штук. Это количество ДНК становится заметным для оборудования, которое проводит диагностику. Таким образом, ПЦР позволяет обнаружить даже одного возбудителя, даже часть возбудителя в пробирке: если хоть один кусочек ДНК вредоносной инфекции есть, он будет «размножен».
Разновидности методов ДНК-диагностики.
В гуманной медицине используют прямые и косвенные методы ДНК-диагностики.
При прямой диагностике обнаруживают мутации клонированного гена, когда известна его экзон-интронная организация или нуклеотидная последовательность полноразмерной комплементарной ДНК.
Используя прямые методы ДНК-диагностики обнаруживают мутации, изменяющие длину разрезанных фрагментов ДНК, которые выявляют электрофарезом на каком-то из указанных выше геле.
Если мутации известны, то их выявляют с помощью ферментов-рестриктаз, которые распознают строго определённые нуклеиновые последовательности.
Использование ферментов бактериального происхождения – рестриктаз позволяет разрезать двойную нить ДНК в определённых последовательностях из 4-8 нуклеотидов. Разрезанные участки мутантной ДНК, отличающиеся по длине от нормальных участков. Разница в размерах мутагенных и нормальных участков ДНК выявляется методом электрофареза на агарозном или полиакриламидном геле.
Для выявления точечных мутаций используют аллельспецифическую полимеразную цепную реакцию, позволяющую многократно увеличивать уникальную последовательность ДНК с последующим выявлением мутации.
Косвенные методы ДНК-диагностики применяются в тех случаях, когда при наследственных заболеваниях ген не клонирован или заболевания сопровождается повреждением различных генов, либо молекулярная организация гена не позволяет использовать прямые методы.
Косвенная ДНК-диагностика в основном сводится к анализу полиморфных генетических маркеров. Такими маркерами могут быть участки ДНК, существующие в популяции в нескольких аллельных вариантах (по составу нуклеотодов, числу нуклеотидных поворотов). На основании изменчивости состава маркеровых участков ДНК дифференцируют материнское или отцовское происхождение конкретного варианта маркера, сцепленного с геном болезни (маркер и ген близко располагаются друг к другу).
При проведении косвенных методов ДНК-диагностики исследованных болезней осуществляют те же этапы подготовительных операций, что и при осуществлении прямых методов ДНК-диагностики. Методами ДНК-диагностики широко пользуются в зоотехнической практике.