Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
1. Сущность искусственного осеменения и его значение в животноводстве
Искусственное осеменение в узком смысле слова означает введение спермы в половые пути самки при помощи специальных инструментов.
В широком понимании искусственное осеменение – это ряд технологических процессов и хозяйственных мероприятий, обеспечивающих отбор наиболее ценных производителей, сбалансированное кормление и оптимальный режим содержания и их полового использования, оценку и соответствующую обработку полученной спермы с целью последующего сохранения и рационального введения её в половые пути самки в наиболее подходящее время – в течение половой охоты.
Основное преимущество искусственного осеменения состоит в том, что оно позволяет получить от одного производителя больше потомков, чем при естественном осеменении. Используя искусственное осеменение, можно произвести замену низкопородного скота породистыми животными в 7-8 раз быстрее, чем при естественном осеменении. Во много раз ускоряется работа по выведению новых пород.
Искусственное осеменение используется при гибридизации: получение мулов, скрещивание коров и яков и других видов.
При искусственном осеменении исключается возможность заражения инфекционными и паразитарными заболеваниями.
Искусственное осеменение предупреждает некоторые разновидности бесплодия.
2. Получение спермы и использование племенных производителей. Научные основы и технология получения спермы на искусственную вагину
Физиологической основой данного метода является воздействие соответствующими раздражителями на чувствительные нервные окончания пениса.
Среди чувствительных нервных окончаний пениса различают:
- генитальные тельца, которые сосредоточены преимущественно в коже головки пениса, имеют вид колбочек, содержащих разветвления нервных волокон, воспринимают холод;
- тельца Мейсснера, расположенные также поверхностно и являющиеся осязательными рецепторами;
- тельца Фатер-Пачини, расположенные в толще ствола пениса, воспринимающие давление.
Эякуляция происходит под влиянием раздражения чувствительных к давлению нервных окончаний (тельца Фатер-Пачини). Наоборот, раздражение антагонистических рецепторов (воспринимающих холод и осязательных) тормозит эякуляцию. Следовательно, при получении спермы от производителей необходимо создавать условия для возбуждения рецепторов, воспринимающих давление, и устранять раздражение тормозных рецепторов (холодовых и осязательных).
Правильно подготовленная искусственная вагина должна иметь температуру в диапазоне 40-42°С, скользкую внутреннюю поверхность, давление 50-60 мм рт.ст. Даже незначительное понижение температуры (на 1-2°С) способно затормозить проявление половых рефлексов.
Методы получения спермы от производителей
Существуют следующие методы получения спермы от производителей:
1. Уретральные (сперму получают из мочеполового канала самца):
а) использование искусственной вагины;
б) фистульный метод;
в) метод мастурбации (раздражение полового член трением о препуциальный мешок);
г) массаж ампул спермиопроводов (у крупных животных);
д) метод элекроэякуляции.
2. Влагалищные (сперму собирают из влагалища самки после осеменения):
а) губочный метод (стерильную губку вводят во влагалище самки и извлекают после полового акта);
б) влагалищный (собирают сперму из влагалища при помощи специальных инструментов после полового акта).
Виды торможения половых рефлексов и способы их устранения.
При нарушении режима полового использования производителей могут возникать различные виды торможения половых рефлексов самцов.
Отрицательная индукция. Под влиянием постороннего, случайного раздражителя (новое место, присутствие посторонних лиц, неожиданный звук и пр.) появляется ориентировочная реакция на новое, неожиданное явление, вследствие чего половые рефлексы временно подавляются.
Профилактика. Необходимо заблаговременно приучать производителей к обстановке при получении спермы, не допускать присутствия посторонних лиц, соблюдать тишину.
Запредельное торможение наблюдается у сильно возбудимых производителей, долго не используемых. Вследствие чрезмерного полового влечения у них проявляется лишь обни-мательный рефлекс, а остальные тормозятся.
Профилактика. Следует выдержать производителя перед условным раздражителем в течение нескольких минут.
Дифференцировочное торможение возникает у производителей при нарушении правил получения спермы (низкая температура искусственной вагины, сухая внутренняя поверхность, неосторожные прикосновения к пенису и т.д.). Все эти погрешности ассоциируются у быков с присутствием техника по взятию спермы.
Профилактика. Необходимо сменить одежду техника или поручить взятие спермы другому лицу.
Торможение запаздывающего рефлекса возникает при чрезмерном промежутке между условным и безусловным раздражителями. Если производителя привести в манеж задолго до получения спермы, сначала наблюдается половое возбуждение, а затем он становится вялым и отказывается от садки. Поэтому нельзя преждевременно приводить производителей в манеж или откладывать получение спермы.
Профилактика. В случае вялого состояния назначить 10-15-минутную проводку.
Сонное торможение развивается у быков при длительном и частом получении спермы в однообразной обстановке. Такие быки долго стоят около подставного животного, обнюхивают и лижут его, иногда кладут голову на животное и впадают в полусонное состояние. Объясняется это тем, что в однообразной обстановке возбуждаются одни и те же нервные клетки коры больших полушарий, в связи с чем условный рефлекс начинает разрушаться.
Профилактика. Рекомендуется сперму получать через значительные промежутки времени (3-5 дней); чередовать садки с холостыми приводами быка; вводить новые раздражители путем перенесения места получения спермы; подкармливать производителя на месте получения спермы небольшим количеством концентратов.
Угасательное торможение проявляется отказом быка делать садку на животное, с которым он находится рядом в помещении. Это происходит потому, что при совместном содержании вид и запах подставного животного вызывает возбуждение условных половых рефлексов, но они не подкрепляются безусловными (садка) и постепенно угасают.
Профилактика. Необходимо сменить подставное животное на другое, которое находится в бычатнике, возможно, дальше.
Влияние кормления и содержания на половую активность производителей и качество спермы.
На состояние здоровья, половую активность, уровень спермопродукции и качество спермы производителей большое влияние оказывают уровень и полноценность кормления, условия содержания, сезон года, метеорологические факторы.
Кормление производителей по энергетическому уровню должно быть таким, чтобы они постоянно находились в заводской кондиции. Во избежание ожирения или, напротив, снижения упитанности их ежемесячно взвешивают.
Рационы для производителей должны быть полностью сбалансированы по протеину и незаменимым аминокислотам, легкоусвояемым углеводам, витаминам, макро- и микробиогенным элементам.
Половая система самцов весьма чувствительна к дефициту протеина. Для поддержания половой потенции и высокого уровня сперматогенеза на 1 корм. ед. должно приходиться 135-150 г переваримого протеина.
На половую функцию большое влияние оказывает обеспеченность незаменимыми аминокислотами (лизин, метионин, триптофан).
В целях поддержания достаточно высокого уровня протеина и восполнения недостающих аминокислот в рационы производителей, наряду с высокобелковыми растительными кормами (соевый и подсолнечниковый шрот, горох, бобы), включают корма животного происхождения: молоко, яйца, мясокостную и рыбную муку.
Дополнительным источником полноценного протеина могут служить продукты микробиологической промышленности: гидролизные и углеводородные дрожжи (эприн, паприн).
Для нормальной половой функции важно определенное соотношение между протеином и легкоусвояемыми углеводами (0,8-1,0:1,0). В качестве источника легкоусвояемых углеводов целесообразно использовать молодую траву злаковых, тыкву, свеклу, кормовую патоку.
Для оптимизации половой функции производителей большое значение имеет обеспеченность жирорастворимыми витаминами (A, D, Е). Даже незначительный их дефицит может повлечь нарушение сперматогенеза и ухудшение качества спермы. Потребность в них удовлетворяется летом за счет молодой травы, зимой – травяной муки, моркови, витаминной тыквы, кормовых дрожжей. В случае недостатка этих кормов назначают водные эмульсии витаминов A, D, E путем дачи внутрь.
Из минеральных элементов питания организм производителей нуждается в кальции, фосфоре, магнии, сере, натрии, калии, железе, меди, кобальте, марганце, цинке, йоде. Они входят в состав биологически активных веществ (ферменты, гормоны, витамины), участвуют в регуляции осмотического давления, кислотно-щелочного равновесия, нервно-мышечной возбудимости.
Для покрытия недостающего количества минеральных веществ в кормах и питьевой воде применяют премиксы в виде брикетов, гранул, водных растворов.
При составлении рационов для производителей важно также соблюдать оптимальное соотношение между грубыми, сочными, концентрированными кормами. Одностороннее кон-центратное кормление ведет к заболеванию кетозом. Относительный избыток сочных и грубых кормов также нежелателен, поскольку рацион становится слишком объемистым, а это снижает половую активность и уровень спермопродукции.
Быков-производителей зимой содержат в специальных помещениях (бычатниках), в стойлах на привязи. Размер стойл: длина – 2,5 м, ширина – 2,0 м.
Пол в стойлах делают деревянным, керамзитобитумным или резинобитумным. Животных привязывают за толстый ременный ошейник двухконцевой цепью. Запрещается привязывать быков за носовое кольцо.
Весной, летом и осенью быков держат на свежем воздухе под навесом, оборудованном кормушками и поилками. Рядом с навесом устраивают из металлических труб индивидуальные выгульные дворики. Большое оздоровительное значение имеет пастьба быков на долголетних культурных пастбищах.
Быков ежедневно чистят щеткой или пылесосом, загрязненные места обмывают водой. Летом на территории племпред-приятия желательно иметь душевые площадки для быков. Дважды в год пpoизвoдят чистку и обрезку копыт. При этом для фиксации быков применяют станки специальной конструкции, благодаря чему исключается необходимость их повала.
На племпредприятиях с ограниченной земельной территорией применяют принудительный моцион быков-производителей.
Существует несколько способов принудительного моциона:
- в кольцевом коридоре шириной 1 м с ограждением из металлических труб;
- при помощи механического водила по кругу;
- при помощи электромеханического агрегата монорельсом;
- проводка за трактором (к прицепу трактора привязывают 4-6 быков, которые движутся со скоростью 2-3 км в час).
Нормы использования производителей при естественном и искусственном осеменении.
При естественном спаривании за одним жеребцом закрепляются 40-50 маток, за быком – 50-60, за бараном – 50-60, за хряком – 15-20 маток.
При искусственном осеменении оптимальным является следующий режим взятия спермы на искусственную вагину:
- для быков – 1 раз в 3-4 дня дуплетом;
- для баранов – до 2-3 садок в день;
- для хряков – 1 садка в 4-5 дней;
- для жеребцов – 1 садка в день, шесть дней подряд, затем 1 день отдыха.
Ветеринарно-зоотехнический контроль при отборе, содержании и эксплуатации производителей на племпредприятиях и пунктах искусственного осеменения животных.
Предприятие искусственного осеменения относится к объектам строгого ветеринарного контроля; его задачи – гарантировать благополучие по инфекционным и инвазионным болезням, сохранить здоровье и высокую половую потенцию.
Современное предприятие по искусственному осеменению функционирует по закрытому режиму. Его производственная территория разделена на зоны, имеющие сплошное ограждение, а вход оборудован санпропускником. Для посещения предприятия посторонними лицами требуется специальное разрешение ветеринарной службы. Персонал, занятый уходом за производителями, регулярно проходит медицинское обследование.
На территории предприятия запрещается содержать маточное поголовье других видов. Корма для животных предприятия заготавливают в местности, благополучной по заразным болезням животных.
Ремонтный молодняк для комплектования племпредприя-тий выращивают на специальных станциях (элеверах), в строго изолированных условиях.
Совершенно недопустим ввод на территорию предприятия взрослых, бывших в эксплуатации производителей.
По прибытии на предприятие ремонтный молодняк выдерживают 30 суток в специальном карантинном помещении; за это время проводят комплекс диагностических исследований на инфекционные и инвазионные болезни.
При дальнейшем содержании производителей на предприятии проводят диагностические исследования:
- быков на туберкулез, бруцеллез, лейкоз, лептоспироз, трихомоноз, кампилобактериоз – дважды в год;
- баранов на листериоз, вирусный аборт, инфекционный эпидидимит – один раз в год;
- хряков на туберкулез и бруцеллез – один раз, лептоспи-роз – два раза в год;
- жеребцов на сап, случную болезнь – один раз в год. Помещения, в которых находятся производители, а также
предметы ухода и инвентарь содержат в чистоте и периодически дезинфицируют свежегашеной известью, едким натром и другими антисептиками.
Один раз в месяц проводят санитарный день. В случае подозрения на заразное заболевание производителя немедленно переводят в изолятор, а место, где он содержался, подвергают тщательной дезинфекции.
3. Физиология, биохимия и биофизика спермы
Химический состав спермы.
Сперма содержит 90-98% воды и 2-10% сухого вещества. Около 60% сухого вещества представляет белок. Главные составные части спермы – белки и липиды. В состав белка входят аминокислоты, содержащие серу.
Сперма быка и барана богата сахарами, из которых преобладает фруктоза. В сперме содержатся лимонная кислота, свободные аминокислоты, сорбитол, инозитол.
В сперме широко представлены биологически активные вещества: ферменты (кислая и щелочная фосфатаза, гиалурони-даза, глюкозидаза, амилаза, липазы, протеазы, оксидазы и др.), антагглютинины, простагландины, гормоны (андрогены, эстрогены), витамины (аскорбиновая кислота, тиамин, рибофлавин, ретинол).
В сухом веществе спермы содержится около 1% золы. Зольная часть содержит фосфор, кальций, магний, калий, натрий, хлор, цинк, железо, медь и ряд других элементов.
Строение спермиев.
Спермий имеет микроскопически малую величину. Общая длина спермия составляет 60-70 мкм.
Различают 5 поперечных участков спермия: головку, шейку, тело (средняя часть), жгутик (хвост) и концевой участок жгутика. Головка имеет длину 8-10 мкм, шейка – 1, средняя часть – 8-10, жгутик – 35-50, концевой участок жгутика – 3 мкм. На головку приходится 49% массы спермия, тело – 15, хвост – 36%. Головка является носителем генетического материала; шейка, тело и хвост – двигательная (локомоторная) часть спер-мия.
Головка представляет собой выпукло-вогнутую пластинку. Форма головки у барана и быка суживается к шейке, у хряка и жеребца – равномерно овальная. Головка состоит из акро-сомы (в виде двухслойного колпачка, прикрывающего передние 2/3 головки); системы перекрещивающихся фибрилл, образующих каркас оболочки; бокаловидной капсулы; кольцевого основания. Свыше половины массы головки составляет ядро. Хроматиновый материал ядра сконцентрирован преимущественно в нижней части головки.
Шейка является связующим звеном между головкой и средней частью. Это наиболее слабая, легкоповреждаемая часть спермия. В ней расположена проксимальная центриоль (центросома), исполняющая роль локомоторного центра. От нее берет начало осевая нить, состоящая из двух прочно спаянных между собой фибрилл. Осевая нить проходит по всей длине локомоторной части спермия, постепенно истончаясь.
Проксимальная центриоль окружена двумя базальными гранулами, имеющими вид колец элипсоидной формы. От каждой базальной гранулы отходит по 9 тонких волоконец – фибрилл, причем фибриллы наружного кольца в несколько раз толще соответствующих им фибрилл внутреннего кольца. Фибриллы соединены между собой и с осевой нитью тонкими нитями – спицами.
Кольцевые фибриллы содержат сократительные белки (скантин, спермозин), сходные по своему составу с актомиози-ном. При сокращении фибрилл хвост изгибается, причем одни фибриллы изгибают хвост вправо, другие – влево.
Фибриллы опоясаны спиральными элементами. Тело плотно обвито двойной спиралью; последняя заканчивается кольцевой центриолью, расположенной на границе тела и хвоста спермия. Хвост по всей длине, за исключением концевой части, опоясан тройной спиралью. Спиральные элементы придают жгутику прочность, не лишая его гибкости. В области тела они имеют митохондриальное происхождение. В митохондриях сосредоточены ферменты гликолитического и окислительного характера, участвующие в выработке энергии для движения спер-миев.
Спермии покрывает цитоплазматическая мембрана. Благодаря наличию в ее составе серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) она устойчива к протеолитическим ферментам, щелочным и кислым растворам.
Спермии обладают подвижностью, которая необходима для достижения ими места оплодотворения и проникновения в глубь яйцеклетки.
Движение спермиев осуществляется в результате последовательных сокращений и расслаблений боковых фибрилл. Эти движения координируются импульсами, поступающими через осевую нить от проксимальной центриоли. В результате хвост спермия совершает хлыстообразные удары. При каждом ударе хвоста головка, обладая неустойчивостью в поперечном направлении, совершает поворот вокруг оси, что обеспечивает винтообразное движение спермия по прямой линии.
Скорость поступательного движения спермиев зависит от температуры, рН, вязкости среды и других факторов. При оптимальных условиях спермий движется со скоростью 5-6 мм/мин.
Важная особенность спермиев – способность к реотаксису, т.е. ориентированному движению против тока жидкости. Реотаксис играет большую роль в механизме сближения спермиев с яйцом.
Энергетика спермиев.
Главное отличие спермиев от других клеток – их способность к энергичному, активному движению за счет энергии движения и гликолиза.
Спермии являются факультативными анаэробами, т.е. могут жить и двигаться как в присутствии кислорода, так и в бескислородной среде.
Дыхание – основной биохимический процесс, обеспечивающий спермиев необходимой энергией для движения. Около 90% всей энергии спермии получают за счет дыхания. В процессе дыхания под влиянием кислорода окисляются углеводы, ли-пиды, белки и жиры. Прежде всего, окисляются простые сахара: фруктоза, глюкоза, затем другие вещества.
В результате дыхания образуются углекислота, вода и аммиак (при окислении белков), и выделяется большое количество энергии. При распаде одной грамм-молекулы фруктозы выделяется 680 тыс. малых калорий.
При отсутствии кислорода источником энергии является сахар (фруктоза и глюкоза), который усваивается путем гликолиза и фруктолиза.
Конечным продуктом фруктолиза является молочная кислота. За счет фруктолиза спермии получают около 10% энергии. Таким образом, фруктолиз служит лишь вспомогательным источником энергии.
Действие факторов внешней среды на спермии (температура, осмотическое давление, рН среды, химические вещества, свет и др.)
Повышение температуры до 40°С заметно активизирует спермиев, но при этом резко сокращается срок их жизни. При температуре 45°С спермии утрачивают оплодотворяющую способность вследствие инактивации ферментных систем, а при температуре 48°С погибают.
Постепенное понижение температуры замедляет движение спермиев, поскольку тормозятся дыхание и фруктолиз. При температуре 15°С движение становится колебательным, а после охлаждения до 5°С оно прекращается (температурный анабиоз).
Спермии не обеспечены защитными средствами против действия света. Прямые солнечные лучи убивают их за 20-40 мин. Неблагоприятен и сильный электрический свет. Рассеянный свет не оказывает вредного воздействия.
Свежеполученная сперма быка и барана имеет нейтральную или близкую к нейтральной (рН 6,7-7,0) реакцию, хряка и жеребца – слабощелочную (рН 7,2-7,6).
Накопление водородных ионов тормозит процессы жизнедеятельности спермиев. При рН 6,3-6,4 наступает кислотный анабиоз. Дальнейшее увеличение кислотности вызывает гибель спермиев.
Сдвиг рН в щелочную сторону вначале активизирует спермиев, но при рН 7,8-8,0 наступает их гибель.
У сельскохозяйственных животных осмотическое давление спермы находится в пределах от 7,6 до 9,0 атм. (695 кПа).
Спермии, помещённые в среду с меньшим осмотическим давлением (гипотонические растворы), набухают, помещенные в среду с повышенным осмотическим давлением (гипертонические растворы) – сморщиваются; в том и другом случаях быстро наступает их гибель.
Ионы электролитов, находящиеся в плазме и в самих спермиях, могут оказывать на спермиев разнообразное действие: уплотнять или разрыхлять оболочку спермия; нейтрализовать электрический заряд; изменять проницаемость мембран, тормозить или, наоборот, активизировать метаболические процессы.
Электролиты состоят из катионов и анионов. Одно- и двухвалентные катионы существенно не изменяют выживаемость спермиев.
Анионы оказывают более сильное влияние, чем катионы, причем действие анионов зависит от валентности. Анионы хлоридов разрыхляют оболочку спермиев и разрушают липопроте-идный покров. Анионы фосфатов, сульфатов, цитратов, наоборот, уплотняют оболочку спермиев и стабилизируют электрический потенциал.
Большинство химических соединений для спермиев токсичны. Из неорганических веществ особенно ядовиты соли и окислы тяжелых металлов (ртуть, свинец), поскольку они блокируют ферментные системы спермиев. Вредно действуют на спермиев окислы цинка, алюминия, железа, меди, серебра; поэтому в практике искусственного осеменения пользуются стеклянными, пластмассовыми, хромированными, никелированными инструментами.
Пары летучих органических веществ (лизол, креолин, скипидар, формалин, нашатырный спирт, эфир, йодоформ, ксероформ) губительно действуют на спермиев даже на расстоянии.
Чрезвычайно сильно действуют на спермиев детергенты (моющие средства), неорганические кислоты (серная, соляная, азотная), ряд органических кислот (уксусная, молочная, масляная), окислители (йод, хлор, калия перманганат, перекись водорода).
Температурный шок спермиев и меры его предупреждения.
Если сперму быстро охладить, то произойдет гибель значительной части спермиев. Такое явление носит название «хо-лодовый шок спермиев». Он начинает проявляться уже при охлаждении спермы от 40°С до 30°С, но наиболее выражен в диапазоне температур от +5°С до +15°С.
При холодовом шоке повреждаются мембраны спермия, митохондрии, фибриллы, нарушается ионное равновесие, синтез АТФ.
Наиболее эффективным защитным средством от температурного шока спермиев является желток куриного яйца. Механизм защитного действия желтка состоит в том, что содержащийся в нем лецитин легко адсорбируется на поверхности спермия, что делает цитоплазматическую мембрану более прочной и менее поддающейся деформации при воздействии резких температурных перепадов.
Дополнительным средством предупреждения температурного шока спермиев может служить медленное охлаждение спермы до +2…+4°С, при этом спермии успевают адаптироваться к более низким температурам.
Естественный и искусственный анабиоз спермиев
Неподвижное состояние спермиев, при котором они сохраняют жизнеспособность, называется анабиозом.
В хвосте придатка семенника поддерживается слабокислая реакция среды (рН 6,3-6,4), благодаря чему спермии находятся в состоянии естественного анабиоза. Длительному сохранению жизни спермиев, помимо этого, способствуют пониженная температура, вязкий секрет канала придатка, плотное расположение спермиев, обильное снабжение питательными веществами и быстрое удаление продуктов метаболизма. В хвосте придатка спермии сохраняют подвижность до 2 месяцев, оплодотворяющую способность – в течение 1 месяца.
Благодаря анабиозу расход энергетических ресурсов на процессы жизнедеятельности спермиев и накопление продуктов метаболизма резко тормозятся, что увеличивает срок их жизни вне организма.
Это явление широко используется в искусственном осеменении. Достаточно сказать, что все существующие способы кратковременного и длительного хранения спермы основаны на создании и поддержании анабиоза. В настоящее время известно несколько методов создания искусственного анабиоза спермиев:
- понижение температуры до +2…+4°С;
- глубокое охлаждение спермиев (до -196°С);
- снижение рН спермы до 6,3-6,4 применением органических кислот (угольная, лимонная и др.);
- применение химических ингибиторов метаболических процессов в спермиях (хелатон и др.).
Макроскопическая оценка спермы (объем, цвет, запах, консистенция).
Оценка качества свежеполученной спермы проводится по нескольким показателям. Определяют цвет, запах, консистенцию и объем эякулята (табл. 1). Если какой-либо показатель не соответствует норме, эякулят выбраковывают.
Оценка качества свежеполученной спермы
Таблица 1
|
Производитель |
Макроскопическая оценка |
|||
|
цвет |
запах |
консистенция |
объем мл |
|
|
Баран |
Белая с желтоватым оттенком |
Без запаха или с запахом жиропота |
Сметанообразная |
1-3 |
|
Бык |
Белая или желтоватая |
Без запаха или с запахом парного молока |
Сливкообразная |
3-10 |
|
Хряк |
Молочно-белая с сероватым оттенком |
Без запаха |
Водянистая |
100-1000 |
|
Жеребец |
Серовато-белая |
Без запаха |
Водянистая |
30-200 |
Микроскопическая оценка спермы (густота, активность, концентрация, процент патологических форм спермиев)
Применяют метод визуальной оценки эякулята по густоте. В этом случае сперму относят к одной из следующих категорий: густая, средняя или редкая. К исследованию допускается сперма быков, хряков и жеребцов с оценкой густая (Г) и средняя (С), сперма баранов только густая (Г).
Оценку на подвижность (активность) проводят в раздавленной капле, для чего на чистое подогретое предметное стекло наносят каплю свежеполученной спермы, накрывают ее покровным стеклом. Стекло помещается на электрообогревательный столик, установленный на предметном столике микроскопа. Визуальную микроскопическую оценку проводят в затемненном поле зрения при увеличении в 140 или 280 раз. При этом определяют не активность отдельных спермиев, а процент спермиев с прямолинейным поступательным движением (ППД) во всем поле зрения микроскопа. Результаты оценки выражают в баллах. Принята 10-балльная оценка, причем каждый балл соответствует 10% спермиев с ППД.
Свежеполученная сперма считается пригодной, если её подвижность: не менее 8 баллов – для барана и быка, 7 баллов – для хряка и 6 баллов – для жеребца.
Концентрация спермиев определяется в каждом эякуляте, эти данные необходимы для расчета кратности разбавления спермы, которая устанавливается с таким расчетом, чтобы в каждой дозе разбавленной спермы было предусмотренное ГОСТом число спермиев.
Концентрацию спермиев можно определить несколькими методами: подсчетом в камере Горяева, по оптическому стандарту, при помощи фотоэлектроколориметра, электронным счетчиком частиц.
Достаточно точным методом определения концентрации спермиев является подсчет в камере Горяева. Однако он утомителен и требует много времени – 15-20 мин. на оценку каждого эякулята. Поэтому в настоящее время он используется лишь как вспомогательный. Применение оптического стандарта основано на том, что чем больше мутность исследуемой спермы, тем выше концентрация спермиев. Этот метод легко и быстро выполним, но по точности значительно уступает прямому подсчету спермиев. Применение фотоэлектроколориметра (ФЭК-56 или КФК-2) позволяет оценить концентрацию спермиев за 1-2 мин.
Концентрация спермиев определяется в млрд в 1 мл спермы. Допускается для использования сперма со следующей концентрацией: быка – 1-2 млрд/мл, барана – 2-4 млрд/мл, хряка и жеребца – 0,15-0,4 млрд/мл.
Содержание патологических форм спермиев определяют периодически. На предметном стекле к капле спермы добавляют краситель (1-10%-ный водный или спиртовой раствор эозина) в соотношении 1:2 или 1:3. Смесь спермы с краской выдерживают 3-5 мин., после чего делают три мазка и просматривают их под микроскопом с иммерсионной системой.
Подсчитывают 100-200 спермиев, выделяя патологические формы и определяя их процентное содержание. К ненормальным формам относят спермии с измененными головкой (уменьшенная, круглая, несимметричная, укороченная, асимметричная, заостренная, двойная, без чехла), шейкой (двойная или ломаная, наклоненная к телу), телом (изогнутое, ломаное, удвоенное, свернутое) или хвостом (изогнутый, двойной, с извитым и оголенным концом, скрученный).
Максимальный процент патологических форм спермиев: у барана – 14, быка – 18, хряка – 20, жеребца – 25.
4. Разбавление, хранение и транспортировка спермы. Значение и необходимость разбавления спермы
Во время эякуляции к содержимому эпидидимиса примешиваются секреты придаточных половых желез. Они изменяют рН среды, насыщают плазму электролитами (соли натрия, калия, магния); последние вызывают разрушение липопротеидного покрова спермиев. Отмеченные сдвиги обуславливают переход спермиев из анабиоза в активное состояние; это, в свою очередь, приводит к быстрой их гибели.
Непосредственными причинами сокращения срока жизни спермиев вне организма являются:
- истощение источников энергии в спермальной плазме и самих спермиях;
- интоксикация продуктами жизнедеятельности спермиев;
- разрушение липопротеидного покрова, набухание мембран и снятие электрического заряда;
- отрицательное действие находящихся в сперме и размножающихся в ней микроорганизмов;
- температурные перепады.
Следовательно, для продления срока жизни спермиев во внешней среде требуется:
- уменьшить активность спермиев;
- обеспечить их дополнительными источниками энергии;
- защитить мембраны спермиев от разрушения;
- предотвратить накопление токсических продуктов метаболизма;
- блокировать размножение находящихся в сперме микроорганизмов;
- повысить устойчивость спермиев к температурным перепадам и криогенным воздействиям.
Это достигается применением специальных разбавителей.
Помимо защитных функций, разбавление спермы облегчает дробление эякулята на порции (спермодозы). Это особенно существенно для животных с маточным типом естественного осеменения (свиньи, лошади), поскольку спермодоза наряду с нормативным числом подвижных спермиев должна быть достаточно объемной.
Синтетические и биологические среды для хранения спермы
Разбавители могут быть биологическими и синтетическими (искусственными) средами. Из биологических сред использовалось коровье молоко, кокосовое молоко, 7%-ный раствор пчелиного меда, а также томатный сок.
Применяемые в настоящее время разбавители спермы сельскохозяйственных животных относят к синтетическим средам.
Синтетическая среда обычно состоит из трех и более компонентов, например, глюкозо-цитратно-желточная среда (ГЦЖ).
Основные компоненты разбавителей и их роль
В состав большинства разбавителей входят следующие компоненты:
Сахара (глюкоза, лактоза). Служат источником энергии для спермиев. Помимо этого они участвуют в поддержании осмотического давления, понижают электропроводность среды, предохраняют спермии от потерь электрического заряда.
Цитрат натрия. Создает буферность среды, нейтрализует конечные продукты жизнедеятельности спермиев, связывая ионы кальция и тяжелых металлов.
Трис-буфер (2-амино-2-гидроксиметил-1, пропандиол). Устойчиво удерживает первоначальную рН среды, обладает осмотическим действием, устраняет явления дыхательного ацидоза в спермиях.
Трилон Б (хелатон, двунатриевая соль этилендиамин-тетрауксусной кислоты). Образуя временные связи с ионами кальция, тормозит активность протеаз, АТФаз и других ферментов, участвующих в метаболических процессах в спермиях.
ЭДТА (тринатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Подобно трилону Б, образует хелатные комплексы с ионами кальция, тем самым блокирует активность ферментных систем спермиев.
Сульфат аммония. Предохраняет от разрушения сульф-гидрильные группы в мембранах спермиев, задерживает выход электролитов в окружающую среду.
Глицерин. Обладает криопротекторными свойствами, легко проникает внутрь спермия, понижает температуру замерзания и препятствует образованию кристаллов связанной воды, что позволяет избежать повреждений клеточных структур. Благодаря высокой гидрофильности препятствует дегидратации цитоплазмы.
Желток куриных яиц. Содержит лецитин и липопротеины, которые создают на поверхности спермия адсорбционный слой, предохраняющий его от холодового шока.
Спермосан ППК. Комплексный антибактериальный препарат, состоящий из пенициллина, полимиксина, канамицина. Такая комбинация эффективно тормозит размножение микроорганизмов в сперме.
В состав некоторых разбавителей входят антиоксиданты (токоферол), загустители (гуммиарабик), свободные аминокислоты (гликокол, аргинин) и другие компоненты.
Санитарно-гигиенические требования к приготовлению сред и разбавлению спермы
Для приготовления сред и разбавления спермы отводят специально оборудованное лабораторное помещение со средствами стерилизации воздуха и предметов (бактерицидные лампы).
Колбы, мерные цилиндры, пипетки, бумажные фильтры и другие принадлежности накануне взятия спермы стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 130-150оС; перед использованием их переносят в термостат с постоянной температурой 37-36оС.
Для приготовления сред используют дистиллированную воду, имеющую рН 6,8-7,0. Пригодны только химически чистые и проверенные на безвредность для спермиев сухие компоненты. Их хранят в герметически закрытых стеклянных банках в темном месте. Яйца используют только свежие (со сроком хранения до 7 суток), полученные от здоровых кур при выгульном их содержании.
Хранение спермы при температуре +2…+5°С
Сперму, сохраняемую при +2…+5°С, разбавляют глюкозо-цитратно-желточной, молочно-желточной, глюкозо-цитратно-желточной с хелатоном и аргинином, гликокол-цитратно-жел-точной средами.
После разбавления сперму расфасовывают в одноразовые стерильные полиэтиленовые ампулы, полиэтиленовые пробирки или во флаконы из-под антибиотиков; их обертывают теплоизолирующим материалом (для постепенного охлаждения), заключают в полиэтиленовый пакет. Пакеты с расфасованной спермой вкладывают в широкогорлый термос со льдом или помещают на полку бытового холодильника. Сперму быков и хряков используют в течение трех суток, барана – в течение суток.
Хранение спермы при температуре +16…+20°С
Вандемарк и Шарма из Иллинойского университета (США) в 1957 г. сообщили о разработанном ими методе краткосрочного хранения спермы быков без охлаждения. Для иммобилизации спермиев они применяли угольную кислоту, которую получали посредством насыщения углекислым газом специального разбавителя (ИВТ) до величины рН 6,3-6,35. Разбавленную сперму хранили в запаянных стеклянных ампулах, заполненных на 2/3 объема, при 18-20°С. Сперма была пригодна для осеменения в течение 3 суток.
В среде, предложенной А.А. Зальцманом (ТВТ-12), угольная кислота была заменена на лимонную кислоту.
Краткосрочное хранение спермы при плюсовых температурах путем блокирования метаболических процессов в сперми-ях основано на использовании трилона Б (хелатона). Среды с хелатоном получили широкое применение в практике искусственного осеменения свиней. Наиболее эффективной оказалась глюкозо-хелато-цитратно-сульфатная среда (ГХЦС-среда).
Разбавленную ГХЦС-средой сперму хранят и используют в течение 3 суток.
Замораживание и хранение спермы при температуре -196°С в жидком азоте
Для замораживания пригодна сперма быка с активностью спермиев не ниже 8 баллов и концентрацией их не менее 0,8 млрд в 1 мл.
Замораживают сперму быков в гранулах (0,1-0,2 мл). Эта расфасовка обеспечивает более эффективное использование сосудов Дьюара для хранения спермы, несколько лучшую выживаемость и оплодотворяющую способность спермиев. После оценки сперму разбавляют средой № 1 (11%-ный раствор лактозы – 63 мл, желтка – 30 мл, глицерина – 7 мл) в соотношении 1:1, затем средой № 2 (11%-ный раствор лактозы – 81,5 мл, желтка – 15 мл, глицерина – 3,5 мл), доводят степень разбавления до нужного показателя. Для замораживания спермы гранулами по 0,5-1 мл используют среду: вода дистиллированная – 100 мл, лактоза – 11,5 г, желток куриного яйца – 20 мл, глицерин – 5 мл.
После разбавления сперму охлаждают при +2…+5оС в течение 4-7 ч. Затем берут фторопластовую пластину, на которой с двух сторон имеется по 300-324 лунки для накапливания спермы, обеззараживают ее с помощью бактерицидных ламп, опускают в широкогорлый сосуд с жидким азотом и охлаждают до тех пор, пока прекратится кипение азота. Охлажденную пластинку приподнимают над поверхностью жидкого азота и при помощи шприца наносят разбавленную сперму объемом по 0,1 мл в каждую лунку. Спустя 2-3 минут после нанесения спермы в последнюю лунку, пластинку погружают в жидкий азот на 1-2 мин. После этого, вынув пластинку, замороженные гранулы собирают в пластмассовые коробочки с небольшими отверстиями (или в марлевые мешочки) и хранят их в жидком азоте. Главным недостатком замораживания спермы в гранулах является их незащищенность.
Под руководством Ф.И. Осташко разработана Харьковская технология замораживания спермы в облицованных (покрытых тонкой полимерной пленкой) гранулах. Во Франции предпочитают быстро замораживать сперму в пайетах («соломинках»), которые одновременно служат инструментом для осеменения коров. Для замораживания спермы в пайетах по французской технологии (профессор Кассу) используют среды «Лецифос» и «Криоцифос». Расфасовывают сперму в пайеты объемом 0,5 мл.
Для разбавления и замораживания спермы по Байсогаль-ской технологии (Литовская технология) используют среду ЛЦГЖС. Расфасовывают сперму в пайеты объемом 0,25 мл с расчетом, чтобы после оттаивания в дозе спермы содержалось не менее 15 млн подвижных спермиев.
Длительность хранения замороженной спермы в жидком азоте на племпредприятиях осуществляют в специальных помещениях (хранилищах), в которых установлены стационарные емкости ХБ-0,5 или КВ-6202.
Транспортируют сперму и хранят на пунктах искусственного осеменения в сосудах Дьюара различной емкости (от 4 до 50 л жидкого азота).
Азот доставляется на пункты искусственного осеменения в транспортных резервуарах, установленных на автомобилях высокой проходимости.