Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Глава 18
§ 1. Общая характеристика коринебактерий.
Коринебактерии являются грамположительными палочками с неравномерно окрашенными сегментами и иногда гранулами. Часто они имеют булавовидные утолщения на концах, в связи с чем они получили название “коринебактерии” (от лат. coryne - булава). В настоящее время таксономия рода Corynebacterium изменена. Установлено, что некоторые коллекционные штаммы состоят из большого количества различных видов. 13 видов рода, исключая патогенные для растений коринебактерии, перечислены в “Определителе бактерий Берджи”. Недавно было создано 5 новых видов: C. urealyticum, C. afermentans, C. propinquum, C. accolans и C. amycolatum. Некоторые виды (C. diphtheriae и C. afermentans) были разделены на подвиды и типы. Наиболее важным членом рода является C. diphtheriae - этиологический агент дифтерии. C. ulcerans, близкий к C. diphtheriae, может вызывать дифтериеподобные заболевания. Он напоминает тип gravis дифтерийной бактерии, но он растворяет желатин, медленно ферментирует трегалозу и не утилизирует нитраты до нитритов. C. ulcerans продуцирует 2 типа токсинов, один из которых почти идентичен дифтерийному токсину, а другой напоминает токсин C. pseudotuberculosis. Он вызывает заболевание у коров, которое может передаться человеку через коровье молоко. От заболевания инфекцией, вызванной C. pseudotuberculosis, может защитить дифтерийный антитоксин. Считают, что C. pseudotuberculosis больше похож на подгруппу дифтерийных бактерий, чем на отдельный вид.
Коринебактериями, имеющими значение в ветеринарной практике, являются C. pseudotuberculosis (бактерия Прайца-Нокарда), которая вызывает псевдотуберкулёз у овец и гнойный лимфаденит у лошадей, C. renale, вызывающая цистит и пиелонефрит у крупного рогатого скота, C. equi, изолированная при пневмонии у жеребят. Эритразма, локальная инфекция рогового слоя кожи, возникающая в аксиллярных участках и в паху у крупного рогатого скота, вызвана C. minutissimum. Эти липофильные бактерии растут только на средах, которые содержат 20 % сыворотки крови бычьих зародышей. C. tenuis вызывает развитие аксиллярного трихомикоза, который характеризуется образованием пигментированных узлов вокруг волосяных луковиц в паху и в аксиллярных участках. Коринебактерии, похожие на C. diphtheriae, встречаются в качестве нормальных комменсалов в глотке, на коже, конъюнктиве и на других участках. Их называют дифтероидами и иногда по ошибке принимают за дифтерийные бактерии. Дифтероиды окрашиваются более униформно, чем бактерии дифтерии, содержат мало или совсем не содержат метахроматических гранул и в мазке располагаются параллельно (“палисад”), а не под углом. Однако некоторые дифтероиды невозможно отличить от возбудителя дифтерии под микроскопом. Дифференцирование проводят с помощью биохимических тестов или тестов на вирулентность. Дифтероидами являются C. pseudodiphtheriticum (C. hofmannii), которые обитают в глотке и C. xerosis, найденные в конъюнктивальном мешке. C. parvum, которые часто используют в качестве иммуномодулятора, представляет собой смесь видов рода Propionibacterium.
Кроме представителей рода Corynebacterium, существует большое количество других родов коринеформных бактерий. Медицинское значение среди них имеют 3 вида рода Propionibacterium - P. acnes, P. granulosum и P. avidum, которые постоянно обитают на коже человека. Они являются анаэробными и аэротолерантными и хорошо растут на средах, которые содержат липиды. P. acnes часто изолируют при угревой сыпи, но его патогенная роль не доказана.
§ 2. Corynebacterium diphtheriae.
Дифтерия известна с давних времен. Аретей в ИИ в. н.э. описал египетскую или сирийскую язву, которую большинство современных медицинских историков идентифицирует как дифтерию. Заболевание впервые было описано как совокупность клинических признаков в 1826 г. Бретонне, который назвал его “дифтеритом” (от греческого слова diphtheros - кожа) вследствие того, что при этом заболевании образовывалась характерная жесткая кожеподобная пленка. Впервые бактерия дифтерии была выделена и описана Е. Клебсом в 1883 г., но впервые ее смог культивировать Ф. Леффлер в 1884 г., в связи с чем эту бактерию часто называют бактерией Клебса-Леффлера. Э. Ру и А. Иерсен получили дифтерийный экзотоксин и доказали его патогенность в 1888 г., антитоксин был изготовлен Э. фон Берингом в 1890 г.
Морфология. Коринебактерии дифтерии - это тонкие плеоморфные палочки длиной 3-6 мкм, шириной 0,6-0,8 мкм с булавовидными утолщениями на одном или обоих концах. Они не образуют спор и капсул, неподвижны, грамположительные, но легко обесцвечиваются. Клетки часто образуют септы, часто наблюдают разветвления. Внутри клеток расположены полиметафосфатные гранулы, которые лучше окрашиваются по Граму, чем остальная бактериальная клетка. При окраске по Леффлеру метиленовым синим гранулы приобретают лазурно-пурпурный цвет, в связи с чем они получили название метахроматических гранул (или волютиновых, или зёрен Бабеша-Эрнста). Часто они расположены на полюсах бактерий и их называют полярными телами. Специальные методы окраски (по Альберту, Нейссеру и Пондеру) позволяют чётко продемонстрировать их наличие. В мазках коринебактерии дифтерии располагаются достаточно характерно - парами или небольшими группами, под острым или прямым углом, в виде латинских букв V и L. Подобное расположение часто называют “китайскими буквами” или “клиновидным”. Это происходит вследствие неполного отделения дочерних клеток после бинарного деления.
Культивирование. Коринебактерии дифтерии плохо растут на обычных средах; для культивирования нужны среды, обогащены кровью, сывороткой или яйцами. Оптимальной температурой для роста является 37ºC (от 15 до 40ºC), оптимальной рН - 7,2. Бактерии являются аэробами и факультативными анаэробами.
Средами, которые используют для культивирования дифтерийных бактерий, являются скошенный сывороточный агар Леффлера и теллуритовый кровяной агар. Бактерии очень быстро растут на агаре Леффлера с образованием первых колоний через 6-8 часов, задолго до того, как вырастают другие бактерии. На первых порах колонии имеют вид небольших круглых белых непрозрачных дисков, но при продолжении инкубации увеличиваются в размерах и приобретают характерный жёлтый оттенок. Теллурит (0,4 %) угнетает рост большинства других бактерий, выступая в качестве селективного агента. Дифтерийные бактерии редуцируют теллурит до металлического теллурия, который входит в состав колоний и окрашивает их в серый или чёрный цвет. На теллуритовой среде рост бактерий дифтерии может замедлиться и колонии могут появиться только через 2 дня.
Токсинообразование. Вирулентные штаммы дифтерийных бактерий продуцируют очень мощный экзотоксин, который предопределяет их патогенность. Почти все штаммы gravis и intermedius (95-99 %) являются токсигенными, тогда как штаммы mitis - только в 80-85 % случаев, но это зависит от происхождения культуры: штаммы весь трех типов одинаково вирулентны при выделении их от больных острыми формами, а невирулентные штаммы обычно выделяют от переболевших дифтерией лиц, носителей и людей, которые имели контакты с больными. Интенсивность продукции токсина также различна у разных штаммов, но химический состав токсинов одинаковый. Штамм, универсально используемый для продукции токсина, называют штамм Park Williams 8, был описан разными исследователями как mitis и intermedius.
Дифтерийный токсин является белком с молекулярной массой около 62000. Он очень сильный, летальная доза для морской свинки массой 250 г составляет 10-14 мг. Он состоит из двух фрагментов - А и В с молекулярной массой, соответственно, 24000 и 38000. Для токсического действия необходимы оба фрагмента. При выделении бактериями токсин является неактивным в связи с тем, что активный участок на фрагменте А замаскирован. Активация происходит за счёт действия протеаз, присутствующих в среде культивирования и инфицированных тканях. Вся ферментативная активность токсина расположена в фрагменте А. Фрагмент В отвечает за связывание токсина с клетками; антитела к фрагменту В препятствуют контакту токсина с клетками макроорганизма. Токсин нестойкий, продолжительное хранение, инкубация при 37ºС в течение 4-6 недель, обработка 0,2-0,4 % раствором формалина или кислая среда превращают его в анатоксин. Токсигенность дифтерийных бактерий зависит от наличия в них симбионтного бактериофага (бета-фага), выступающего в качестве генетической детерминанты, контролирующей продукцию токсина. Нетоксигенные штаммы могут быть превращены в токсигенные путем инфицирования их бета-фагами или некоторыми другими tox+-фагами (явление лизогении или фаговой конверсии). Токсигенность сохраняется столько, сколько бактерии являются лизогенными.
На продукцию токсина также влияет концентрация железа в питательной среде. Оптимальным уровнем железа, необходимым для продукции токсина, является 0,1 мг/л, тогда как концентрация 0,5 мг/л угнетает образование токсина. Дифтерийный токсин угнетает синтез белков: фрагмент А специфически угнетает элонгацию цепи в присутствии никотинамид динуклеотида путем инактивации фактора элонгации. Он имеет особую аффинность к определенным тканям, таким, как миокард, надпочечные железы и нервные окончания.
Антигенная структура. Коринебактерии дифтерии являются антигенно-гетерогенными. По феномену агглютинации все штаммы gravis разделены на 13 типов, intermedius - на 4 и mitis - на 40. Штаммы ИИ типа распространены во всем мире. Не выявлено связи между типоспецифичностью и другими признаками.
Классификация. На основе изучения морфологии колоний, которые выросли на теллуритовой среде и других свойств, Маклеод выделил 3 типа дифтерийных бактерий: gravis, intermedius и mitis, недавно был добавлен четвертый тип - belfanti. Названия были предложены для обозначения степени тяжести болезни, которую эти типы вызывали: gravis вызывал наиболее тяжёлое заболевание, mitis – наименее тяжёлое, а intermedius находился посредине, однако в настоящее время эта связь непостоянна. Однако определенные биологические признаки этих типов имеют относительную ценность: типы gravis и intermedius в большинстве случаев вызывают развитие параличей и летальный исход, а инфекции mitis вызывают обструкционные поражения дыхательных путей. Штаммы mitis превалируют в эндемических районах, а типы gravis и intermedius являются эпидемическими. Тип mitis может выступать как комменсал в макроорганизме. В популяциях людей с природным или искусственно созданным иммунитетом типы gravis и, в меньшей степени, intermedius распространяются более быстро, чем mitis. В таблице 1 приведены данные о дифференциации типов дифтерийных бактерий.
Таблица 1
Дифференциация типов коринебактерий дифтерии
|
Признак |
gravis |
intermedius |
mitis |
|
Морфология |
Обычно короткие палочки, равномерно окрашены, содержат мало или совсем не содержат гранул. Умеренно плеоморфные |
Длинные палочки с булавовидными концами, содержат мало гранул, крайне плеоморфные |
Длинные выгнутые плеоморфные палочки с чёткими гранулами |
|
Колонии на теллуритовом кровяном агаре |
Через 18 часов колонии имеют диаметр 1-2 мм, центр серовато-чёрный, периферия светлее, края фестончатые. Через 2-3 дня колонии имеют диаметр 3-5 мм, они плоские с выпуклым тёмным центром, фестончатыми краями и радиальной исчерченностью (“цветок маргаритки”) |
Через 18 часов колонии мелкие (1 мм), непрозрачные. Через 48 часов не увеличиваются в размере, имеют плоский гранулярный центр с гладкой, более блестящей периферией и светлым кольцом около края (вид “жабьей икры”) |
Размер вариабельный, цвет – блестяще-черный. Через 2-3 дня колонии становятся плоскими с приподнятым центром (вид “взболтанного яйца”) |
|
Консистенция колоний |
Имеют вид “холодного маргарина”, крошатся, суховатые, цельные |
Промежуточные между gravis и mitis |
Мягкие, маслянистые, легко растворяются |
|
Гемолиз |
Вариабельный |
Нет |
Есть |
|
Рост в бульоне |
Фестончатая пленка на поверхности, грануляция, нет или небольшое помутнение |
Помутнение через 24 часа, просветление через 48 часов, небольшая грануляция |
Диффузное помутнение с образованием позднее мягкой фестончатой пленки на поверхности |
|
Ферментация гликогена и крахмала |
Происходит |
Нет |
Нет |
Отличия между типами не всегда чёткие, поэтому иногда невозможно отнести некоторые определенные штаммы к одному из типов. В лабораторных условиях возможна трансформация одного типа в другой, но в макроорганизме все три типа остаются стабильными.
Резистентность. Культуры могут оставаться жизнеспособными в течение двух и больше недель при 25-30ºC (их можно культивировать из сухих клочков псевдомембран через 4 недели). Нагревание до 58ºC разрушает их через 10 минут, кипячение - через 1 минуту. Коринебактерии дифтерии более стойкие к действию света, высушиванию и замораживанию, чем большинство неспорообразующих бактерий. Они сохраняют вирулентность в белье и бытовой пыли в течение 5 недель, но легко разрушаются антисептиками, чувствительны к пенициллину, эритромицину и антибиотикам широкого спектра действия.
Ферментативные свойства. Коринебактерии дифтерии ферментируют с образованием кислоты (но не газа) глюкозу, галактозу, мальтозу и декстрин (но не лактозу, маннитол или сахарозу). Некоторые вирулентные штаммы способны ферментировать сахарозу. Следует использовать сывороточную воду Гиса для исследования ферментации сахаров. Протеолитическая активность отсутствует; коринебактерии дифтерии не гидролизуют мочевину и не образуют фосфатазу. Характеристика подвидов C. diphtheriae приведена в таблице 2.
Таблица 2
Дифференциация подвидов коринебактерий дифтерии
|
Признак |
gravis |
intermedius |
mitis |
belfanti |
|
Нитраты |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Мочевина |
- |
- |
- |
- |
|
Глюкоза |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Рибоза |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Мальтоза |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Сахароза |
- |
- |
- |
- |
|
Гликоген |
+ |
- |
- |
- |
Патогенность для животных. В природе дифтерией болеют только люди, но иногда у коров выявляют дифтериеподобное заболевание вымени. В этом случае инфекция передается через дояра или через молоко инфицированных животных. Инфекцию можно воспроизвести экспериментально, чувствительность к ней разная у разных животных. Подкожное введение морским свинкам культуры вирулентных дифтерийных бактерий вызывает их гибель в течение 1-4 дней. При вскрытии наблюдают следующее: (1) желатинообразный геморрагический отёк и часто некроз вокруг места инокуляции; (2) отёк лимфатических узлов; (3) образование прозрачного, мутного или кровянистого экссудата (в том числе в брюшной полости); (4) гиперемию внутренних органов; (5) кровоизлияние и увеличение надпочечников, что является характерной особенностью.
Патогенез и заболевание человека. Ранее дифтерия была тяжёлым заболеванием детей во всем мире, но в связи с массовой иммунизацией и профилактическими мероприятиями она практически ликвидирована в развитых странах; в других государствах она продолжает оставаться серьёзной проблемой. В эндемических регионах она является основной детской болезнью. У детей до 1 года она встречается редко в связи с наличием у них пассивного иммунитета от матерей, у детей 2-5 лет заболеваемость резко повышается, медленно снижается у детей 5-10 лет и значительно - 10-15 лет; после чего практически не встречается вследствие формирования активного иммунитета после перенесенных субклинических инфекций. Наиболее существенным источником инфекции в эндемических районах являются бессимптомные носители коринебактерий дифтерии в носу и глотке в странах с умеренным климатом) и на коже (в тропических странах). На коже бактерии могут персистировать около 3 лет, способствуя развитию природного иммунитета, но чаще они вызывают заболевание у лиц, которые контактируют с носителями. Контактно-бытовой путь передачи не играет важной роли, но описаны случаи передачи дифтерии через игрушки, карандаши и ручки.
Инкубационный период при дифтерии составляет 3-4 дня, но может уменьшиться и до 1 дня, у носителей он может быть очень продолжительным. Зачастую возникает дифтерия зева, редко - носа, уха, глаз, кожи, половых органов. На месте входных ворот инфекции возникает воспаление с образованием серовато-жёлтой пленки, прочно спаянной с прилежащей тканью. Иногда процесс из глотки переходит на гортань, трахею, возникает отёк, развивается асфиксия. Заболевание сопровождается общей интоксикацией организма. По степени тяжести течения дифтерию разделяют на: (1) злокачественную или гипертоксическую, при которой развивается сильная токсемия с аденитом (“бычья шея”), возможно развитие параличей, смерть наступает вследствие нарушения кровообращения; (2) септическую, при которой возникают язвы, целюллит и даже гангрена вокруг псевдомембран; (3) геморрагическую, которая характеризуется кровотечением из мембран, конъюнктивальными кровоизлияниями, пурпурой и снижением свертывания крови. Основными осложнениями являются: (1) асфиксия вследствие механической обструкции дыхательных путей фибринозными пленками (часто нужно проводить трахеостомию); (2) острая недостаточность кровообращения, которая может быть периферического или сердечного происхождения; (3) параличи, возникающие на 3-4 неделю заболевания (часто они спонтанно исчезают); (4) септические осложнения (пневмония или отит). В 1 % случаев может произойти рецидив заболевания.
Дифтерия является токсемией. Бактерии остаются во входных воротах инфекции, где они размножаются и продуцируют токсин. Токсин вызывает локальные некротические поражения, в результате чего образуется фибринозний экссудат, который с разрушенными эпителиоцитами, лейкоцитами, эритроцитами и бактериями формирует пленки, характерные для дифтерийной инфекции. “Механические” осложнения дифтерии возникают вследствие появления пленок, системные эффекты - вследствие действия токсина. Нетоксигенные штаммы коринебактерий дифтерии могут вызывать инфекцию даже у иммунизированных лиц, поскольку антитоксический иммунитет не обеспечивает антибактериального иммунитета. Заболевание протекает в лёгкой форме, но пленки иногда также образуются.
Иммунитет. Перенесенное заболевание не всегда означает отсутствие повторных случаев в будущем. Реконваленсцентов следует вакцинировать анатоксином.
Лабораторная диагностика. Лабораторное подтверждение дифтерии необходимо для эпидемиологического контроля и разработки профилактических мероприятий, а не для лечения больных. Специфическое лечение следует назначать немедленно при подозрении на дифтерию, не дожидаясь результатов лабораторных тестов, любая задержка может стать роковой.
Целью лабораторной диагностики является изоляция дифтерийных бактерий и демонстрация их токсичности. Берут 1-2 образца с пораженных участков с помощью шпателя. Бактерии не всегда выявляют в мазках с пораженного участка, а также их не всегда можно отличить от комменсалов, которые составляют нормальную микрофлору глотки. Таким образом, только бактериоскопического исследования недостаточно для постановки диагноза “дифтерия”, но оно является важным в диагностике ангины Винсента. Для этого мазок красят по Граму или Лейшману и изучают спирохеты Винсента и фузиформные бактерии. Токсигенные коринебактерии дифтерии можно выявить в мазках методом иммунофлюоресценции. Для культивирования материал переносят на свернутую сыворотку Леффлера, теллуритовый кровяной агар и чашку с обычным кровяным агаром (для дифференцирования от стафилококкового или стрептококкового фарингита, которые могут симулировать дифтерию). Если материал невозможно сразу перенести в питательную среду, его нужно сохранять смоченным стерильной сывороткой для сохранения жизнеспособности бактерий. На свернутой сыворотке рост можно наблюдать уже через 4-8 часов, но при его отсутствии следует инкубировать культуру еще 24 часа. В мазках, окрашенных метиленовым синим или одним из специальных методов (по Нейссеру или Альберту) выявляют бактерии с метахроматическими гранулами и типичным расположением. Культуры на теллуритовом агаре следует инкубировать минимум 2 дня, поскольку в некоторых случаях рост может быть замедленным. Теллуритовая среда играет значительную роль в изоляции коринебактерий дифтерии от носителей, лиц, которые переболели дифтерией или контактировали с больными, поскольку у этого контингента рост коринебактерий может быть угнетен другими бактериями.
Тесты на определение вирулентности. Каждый изолят коринебактерий дифтерии следует исследовать на вирулентность и токсигенность для полной бактериологической диагностики. Тесты на определение вирулентности можно проводить методами in vivo (подкожное и внутрикожное введение животным) и in vitro (реакция преципитации и тест в культурах тканей).
Подкожное введение. Культуру коринебактерий, которая выросла после 12-часовой инкубации на свернутой сыворотке Леффлера, растворяют в 2-4 мл бульона и вводят подкожно 0,8 мл эмульсии двум морским свинкам, одной из которых за 18-24 часа до этого ввели 500 единиц дифтерийного антитоксина. Если штамм является вирулентным, то неиммунизированное животное гибнет через 4 часа; при его вскрытии выявляют все симптомы, перечисленные в подразделе “Патогенность для животных” этого параграфа. Этот тест уже не используют в связи с изменениями правил работы с лабораторными животными.
Внутрикожное введение. Бульонную эмульсию культуры вводят внутрикожно двум морским свинкам (или кроликам) по 0,1 мл в два различных места каждой. Одно животное служит контролем, ему за день до эксперимента вводят 500 единиц антитоксина. Другому животному вводят внутрибрюшинно 50 единиц антитоксина через 4 часа после внутрикожного введения. Токсигенность оценивают по воспалительной реакции, которая прогрессирует до некроза через 48-72 часа у опытного животного, у контрольного животного изменений не происходит. Преимуществом этого теста является то, что животные не умирают. На одном кролике можно протестировать 10 штаммов.
Реакция преципитации Элека. Прямоугольную полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином (1000 единиц в 1 мл) помещают на поверхность чашки Петри с агаром, который содержит 20 % сыворотки крови лошадей; когда агар ещё жидкий. Вместо лошадиной сыворотки можно использовать сыворотку овец или кроликов. После эту поверхность подсушивают и делают узкие посевы штаммов под прямыми углами к полоскам фильтровальной бумаги. Чашку инкубируют при 37ºС в течение 24-48 часов. Токсины, которые продуцируются бактериями во время их роста, растворяются в агаре и при контакте с антитоксином в оптимальной концентрации проявляется линия преципитации. Наличие таких линий преципитации (в виде головок стрелок) является доказательством токсигенности штамма, отсутствие - наоборот. Этот тест очень удобен и экономен, но следует помнить, что некоторые пептоны и сыворотки непригодны для использования.
Тест в культурах тканей. Токсигенность дифтерийных коринебактерий можно продемонстрировать путём нанесения штаммов в агаре на монослой клеточных культур. Токсин, который продуцируют бактерии, диффундирует в клетки и разрушает их.
Описано около 15 типов бактериофагов. Типы I и III - это mitis, IV и VI - intermedius, VИИ - невирулентный gravis, а другие - вирулентные gravis. Фаготипы являются относительно стабильными. В лабораторной диагностике используют бактериоцины (дифтерицины), молекулярно-генетический метод.
Лечение. Специфическое лечение дифтерии включает антитоксическую терапию и назначение антибиотиков. Антитоксин назначают немедленно при подозрении на дифтерию, промедление приводит к увеличению смертности. В тяжёлых случаях следует вводить 20-100 тысяч единиц, половину этой дозы - внутривенно. Лечение антитоксином не назначают при дифтерии кожи, поскольку эти штаммы обычно не токсигенны. C. diphtheriae чувствительны к пенициллину и их можно элиминировать из зева за несколько дней при лечении пенициллином. Пациентам назначают пенициллин только дополнительно, это не заменяет антитоксического лечения. Для ликвидации носительства назначают эритромицин.
Профилактика. Дифтерию можно контролировать путем иммунизации (активной, пассивной и комбинированной), но только активная иммунизация способна обеспечить стойкий иммунитет и привести к ликвидации заболевания. Пассивная или комбинированная иммунизация может только обеспечить срочную защиту восприимчивым лицам, которые имели контакт с больными дифтерией. Целью иммунизации является увеличение защитных уровней антител в популяции. В начале развития профилактики дифтерии, когда препараты для иммунизации были опасными и их было недостаточно, проводили тест на чувствительность до начала активной иммунизации. Этот тест называли тестом Шика (предложен в 1913 г.), он заключался во введении внутрикожно дозы 0,02 МLD дифтерийного токсина в зоне предплечья и такой же инъекции инактивированного токсина или анатоксина в качестве контроля в другую руку. Учет результатов проводили через 1-2 дня и через 5-7 дней. Были возможны следующие реакции: (1) нет реакции на обоих руках, токсин нейтрализован циркулирующим антитоксином (эта отрицательная реакция отображает наличие иммунитета); (2) нет реакции на контрольной руке, но через 24-36 часов возникает ограниченное покраснение в месте введения токсина, которое сохраняется в течение недели и более (эта положительная реакция свидетельствует о чувствительности); (3) псевдореакция в виде появления диффузного покраснения на обоих предплечьях через 24 часа, которое уменьшается в течение 4 дней (это свидетельствует о наличии иммунитета, а также о гиперчувствительности к компонентам коринебактерий дифтерии; (4) комбинированная реакция, при которой сначала на обоих предплечьях возникает псевдореакция, которая потом сменяется на положительную реакцию на опытной руке (это свидетельствовало о чувствительности и гиперчувствительности).
В настоящее время тест Шика не используют. Доступность безопасных и эффективных анатоксинов сделало тесты на чувствительность ненужными. Если, в некоторых случаях, следует определить уровень циркулирующего антитоксина, это осуществляют с помощью серологических тестов (реакция пассивной гемагглютинации или нейтрализации в клеточной культуре). Индексом иммунитета считают уровень антитоксина 0,01 единицы в 1 мл и более в сыворотке крови.
Активная иммунизация. Иммунизация детей против дифтерии была впервые осуществлена в 1913 г. Э. фон Берингом путем использования смеси токсина и антитоксина, которая содержала количество антитоксина, достаточное для минимальной нейтрализации токсина. Эта смесь была опасной, поскольку финальная ее токсичность определялась не только относительными пропорциями токсина и антитоксина, но и другими особенностями (включая способ их смешивания). Если к определенному количеству антитоксина добавляли вместе эквивалентное количество токсина, смесь оставалась нетоксичной. Если токсин добавляли к антитоксину дважды или более раз с интервалами 15 минут и больше, смесь оставалась токсичной. Этот феномен получил название феномена Даниша и объяснялся способностью токсинов и антитоксинов взаимодействовать в различных пропорциях. Когда токсин добавляли не единовременно, то токсин, которые влили в первый раз, связывался с большим, чем эквивалентное, количеством антитоксина, вследствие чего этот антитоксин становился неспособным нейтрализовать дополнительно влитый токсин.
Для активной иммунизации использовали также несколько других препаратов, из которых в настоящее время используют только 2 - формалиновый анатоксин (жидкий анатоксин) и адсорбированный анатоксин. Формалиновый анатоксин получают путем инкубации токсина с формалином при рН 7,4-7,6 в течение 3-4 недель при 37ºС до потери ним токсигенности при сохраненной иммуногенности. Адсорбированный анатоксин - это очищенный анатоксин, который адсорбирован на нерастворимых субстанциях, содержащих алюминий - обычно алюминии фосфате, реже - гидроксиде. Адсорбированный анатоксин значительно больше иммуногенен, чем жидкий. В связи с риском возникновения провокационного полиомиелита жидкий анатоксин был на некоторое время заменен на адсорбированный, но в настоящее время адсорбированный анатоксин используют в качестве универсального препарату для внутримышечного введения.
Дифтерийный анатоксин обычно вводят детям в составе трехвалентного препарата, содержащего столбнячный анатоксин и коклюшную вакцину. Существует также четырехвалентная вакцина, в состав которой дополнительно входит инактивированная полиовакцина.
Для детей младшего возраста дифтерийный анатоксин назначают в дозе 10-25 флоккуляционных единиц. Меньшие концентрации (1-2 флоккуляционных единицы) используют для иммунизации детей старше 7 лет и взрослых для предупреждения осложнений. В препаратах анатоксинов небольшую дозу помечают маленькой буквой “d”, а полную дозу - прописной буквой “D”. Схема первичной иммунизации грудных детей и детей состоит из трёхкратного введения трёхвалентной вакцины с интервалами в 4-6 недель, через год после этого вводят четвёртую дозу. Иммунизацию повторяют в 7 лет.
Пассивная иммунизация - это экстренная мера при контакте индивидуумов с больными или если больной дифтерей ребенок находился на лечении в неинфекционном детском отделении. Её проводят путем введения подкожно антитоксина в дозе 500-1000 единиц (противодифтерийная сыворотка). Поскольку это лошадиная сыворотка, следует предварительно сделать тест на гиперчувствительность.
Комбинированная иммунизация состоит из введения первой дозы адсорбированного анатоксина в одну руку, тогда как противодифтерийную сыворотку вводят в другую руку, после чего проводят полный курс активной иммунизации. В идеале все лица, которые профилактически получают противодифтерийную сыворотку, должны быть подвергнуты комбинированной иммунизации.
Стандартизация токсинов и антитоксинов. Токсическая активность фильтратов культур отличается в каждой партии, поэтому нужно проводить стандартизацию или измерение их биологической активности. Эрлих предложил считать минимальной летальной дозой (MLD) дифтерийного токсина наименьшее количество токсина, способное убить морскую свинку массой 250 г в течение 96 часов после подкожного введения. Одной единицей антитоксина считают наименьшее количество антитоксина, способное нейтрализовать 100 MLD токсина. Поскольку токсин является лабильным веществом, трудно сохранять его в стандартном виде. Токсин может спонтанно превратиться в анатоксин, что будет препятствовать стандартизации антитоксина. Антитоксин, с другой стороны, стабилен постоянно в замороженном высушенном состоянии, поэтому его приняли за стандарт. Интернациональным стандартом считают оригинальный антитоксин Эрлиха. Одна единица антитоксина (ОА) - это количество антитоксина, имеющее такую же активность совокупно токсина и анатоксина, как одна единица оригинального антитоксина Эрлиха.
Поскольку токсин всегда содержит небольшое количество анатоксина, используют 2 другие единицы для измерения силы токсина - дозы L0 и L+. Доза L0 - это наибольшая доза дифтерийного токсина, которая при смешивании с 1 единицей антитоксина и введении морской свинке массой 250 г не вызывает развития любой реакции (поскольку “нет реакции” - это неточный термин, в лабораторной практике за точку счета берут возникновение минимального локального отёка). Доза L+ - это минимальное количество токсина, которое при смешивании с 1 единицей антитоксина и введении морской свинке массой 250 г вызывает гибель животного в течение 96 часов. Считают, что если токсин смешать с антитоксином в постоянной пропорции, то разность между L+ и L0 должна равняться 1 MLD, но реально она может варьировать от 10 до 100 MLD и более. Это происходит вследствие наличия в препаратах токсина варьирующих количеств анатоксина и способности токсина и антитоксина смешиваться в различных пропорциях. Это явление называют феноменом Эрлиха.
Рамон предложил метод титрования токсина и антитоксина в пробирках, который основан на флоккуляции. Флоккуляционная единица дифтерийного токсина - это количество токсина, которое флоккулирует наиболее быстро с 1 единицей антитоксина. Флоккуляционная единица имеет несколько преимуществ: ее определение недорогое, быстрое и не нуждается в использования животных. Этот также единственный метод, пригодный для титрования анатоксинов, количество анатоксинов для профилактических мероприятий выражают в флоккуляционных единицах.
Для выявления антигенов существует большое количество других тестов in vitro: реакция нейтрализации в клеточной культуре (клетки почек кролика), реакция пассивной гемагглютинации с покрытыми токсином бараньими эритроцитами и радиоиммунные исследования.
PAGE 277