Депарафиншация образца- 1

Работа добавлена на сайт samzan.net:

Протокол метода TUNEL (ApopTag Plus Peroxidase In situ Apoptosis Detection Kit)

для парафиновых срезов

1.   Депарафиншация образца:

1.1.3 смены ксилола по 5 минут;

1.2.2 смены абсолютного этанола по 5 минут;

1.  1 смена 95% этанола и 1 смена 79% этанола по 3 минуты;
2.  1 смена PBS по 5 минут

2. Предобработка образца:

1.  на срез нанести 15 мкл раствора протеиназы К (предварительно готовится stock
   solution: 5 мг/мл протеиназы К в PBS, который разливается по аликвотам (по 10 мкл) и
   замораживается; при использовании этот раствор разводится до концентрации 20
   мкг/мл в PBS (разведение 250 раз: 2 мкл stock solution + 498 мкл PBS);
2.  инкубировать срез 15 минут при комнатной температуре во влажной камере;
3.  промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.

3. Гашение активности эндогенной пероксидазы:

1.  поместить срез в 3% раствор перекиси водорода в PBS на 5 минут при комнатной
   температуре;
2.  отмыть срез PBS два раза по 5 минут

4. Добавление эквилибрационного буфера:

1.  осторожно удалить остатки PBS со среза;
2.  немедленно добавить 15 мкл Equilibration buffer на срез;
3.  инкубировать срез не менее 10 секунд при комнатной температуре.

5. Добавление рабочего раствора TdT:

1.  осторожно удалить остатки буфера со среза;
2.  немедленно нанести на срез 15 мкл рабочего раствора TdT (предварительно
   смешать в эппендорфе 35 мкл Reaction buffer и 15 мкл TdT , хорошо перемешать на
   вортексе, полученный раствор может храниться в холодильнике не более 6 часов,
   этого количества достаточно для 3-х срезов);
3.  инкубировать во влажной камере в термостате при +37°С 1 час.

б.Добавление останавливающего буфера:

1.  поместить срез в рабочий раствор Stop/Wash Buffer (предварительно смешать в
   пластиковой пробирке (на 50 мл) 1 мл Stop/Wash Buffer и 34 мл дистиллированной
   воды,    полученный    раствор    может    храниться    в    холодильнике    до    1    года
   (аликвотировать!);
2.  прополоскать срез в растворе 15 секунд;
3.  инкубировать срез в растворе 10 минут при комнатной температуре.

Достать из пробирки Anti-Digoxygenin conjugate (Anti-Digoxigenin Peroxidase) (45 мкл) и

оставить в эппендорфе согреваться до комнатной температуры.

7. Добавление Anti-Digoxygenin conjugate:

1.  промыть срез в 3-х сменах PBS по 1 минуте;
2.  осторожно удалить остатки PBS со среза;
3.  добавить 15 мкл рабочего раствора Anti-Digoxygenin conjugate;
4.  

7.4. инкубировать во влажной камере 30 минут при комнатной температуре.

8.Промывка срезов:

8.1. Промыть срезы в 4 сменах PBS по две минуты

Приготовить рабочий раствор субстрата пероксидазы: смешать в эппендорфе в темноте 145 мкл DAB Dilution Buffer и 5 мкл DAB Substrate. Этого количества будет достаточно для 10 срезов. После приготовления смесь нагреть до комнатной температуры и хранить в темноте до использования. Раствор может храниться 14 дней в холодильнике или 7 дней при комнатной температуре.

9. Окраска субстратом пероксидазы:

1.  осторожно удалить избыток жидкости со среза;
2.  нанести рабочий раствор субстрата пероксидазы на срез;

9.3. инкубировать   3-6  минут  при  комнатной  температуре   (влажная  камера  не
обязательна);

9.4. контролировать оптимальную окраску (коричневый цвет) можно периодически в
световой микроскоп.

10. Промывка срезов:

10.1. промыть срезы в 2 сменах дистиллированной воды не более чем по 1 минуте;

10.2. инкубировать   срез   в   дистиллированной   воде   5   минут   при   комнатной
температуре.

Приготовление раствора метиленового зеленого:

1.  Приготовить 0,1 М ацетатный буфер (растворить 1,36 г ацетата натрия в 80 мл
   дистиллированной воды, довести рН до 4 с помощью уксусной кислоты. Добавить
   дистиллированной воды до конечного объема 100 мл).
2.  Растворить 0,5 г метиленового зеленого в 100 мл ацетатного буфера.
3.  Фильтровать раствор через фильтр (0,22 мкм).

11. Докраска метиленовым зеленым:

1.  поместить образец в 0,5% раствор метиленового зеленого (раствор готовится в
   на 10 минут при комнатной температуре;
2.  промыть срез дистиллированной водой в двух сменах воды по 10 секунд, а затем
   30 секунд - в третьей смене воды;
3.  промыть срезы в трех сменах абсолютного бутанола (два раза по 10 секунд и 1
   раз 30 секунд)

12. Монтирование:

1.  дегидрировать срезы в ксилоле (три смены по 2 минуты);
2.  осторожно удалить остатки ксилола со срезов;
3.  нанести на срез монтирующую жидкость;
4.  закрыть срез пластиковым покровным стеклом

13. Микроскопия.

Окрашенные срезы могут храниться сколь угодно долго при комнатной температуре.

1. Разработка нормативов почтовой связи
2. Sch~tzen Sie die Erholungsktivit~ten ein
3. Саратовский государственный технический университет имени Гагарина Ю
4. Організація і проведення рятувальних робіт на об`єктах із сильнодіючими отруйними речовинами
5.  ПОНЯТИЕ НАСИЛЬСТВЕННЫХ ХИЩЕНИЙ И РАЗВИТИЕ УГОЛОВНОПРАВОВЫХ НОРМ УСТАНАВЛИВАЮЩИХ ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ЗА НИХ
6. Вольное экономическое общество
7. Расчет налога на добавленную стоимость
8. Социальной педагогике Понятие педагогическая поддержка.html
9. Выручка от реализации продукции, работ и услуг как основной источник денежных средств предприятий, особенности ее формирования и использования в рыночных условиях хозяйствования (на материалах ТКУП Столичный)
10. столыпинской аграрной реформы
11. Б УМК- Начальная школа 21 века Учитель - Солоха Татьяна Ивановна Методист- Новохатская Светлана Викт
12. Вера проявляется на различных уровнях душевного и духовного
13. Тема- КРАЇНИ БЛИЗЬКОГО ТА СЕРЕДНЬОГО СХОДУ
14. Лікарські рослини заплави річки Сіверський Донець
15. Тема урока Системы счислений
16. Гражданское и уголовное право по Русской Правде
17. РЕФЕРАТ ПО ДОКУМЕНТОВЕДЕНИЮ И АРХИВНОМУ ДЕЛУ ПОРЯДОК ФОРМИРОВАНИЯ ДЕЛ Работу выполнила- студентка 1 ку
18. ПОНЯТИЕ И СУЩНОСТЬ СВЯЗЕЙ С ОБЩЕСТВЕННОСТЬЮ ГЛАВА 2.html
19. Душа в принципе наблюдаема и неизмерима
20. Федерация спортивного и боевого самбо Вологодской области 160013 г

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе