Депарафиншация образца- 1
Работа добавлена на сайт samzan.net: 2016-03-30
Поможем написать учебную работу
Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
от 25%
Подписываем
договор
Протокол метода TUNEL (ApopTag Plus Peroxidase In situ Apoptosis Detection Kit)
для парафиновых срезов
1. Депарафиншация образца:
1.1.3 смены ксилола по 5 минут;
1.2.2 смены абсолютного этанола по 5 минут;
- 1 смена 95% этанола и 1 смена 79% этанола по 3 минуты;
- 1 смена PBS по 5 минут
2. Предобработка образца:
- на срез нанести 15 мкл раствора протеиназы К (предварительно готовится stock
solution: 5 мг/мл протеиназы К в PBS, который разливается по аликвотам (по 10 мкл) и
замораживается; при использовании этот раствор разводится до концентрации 20
мкг/мл в PBS (разведение 250 раз: 2 мкл stock solution + 498 мкл PBS);
- инкубировать срез 15 минут при комнатной температуре во влажной камере;
- промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
3. Гашение активности эндогенной пероксидазы:
- поместить срез в 3% раствор перекиси водорода в PBS на 5 минут при комнатной
температуре;
- отмыть срез PBS два раза по 5 минут
4. Добавление эквилибрационного буфера:
- осторожно удалить остатки PBS со среза;
- немедленно добавить 15 мкл Equilibration buffer на срез;
- инкубировать срез не менее 10 секунд при комнатной температуре.
5. Добавление рабочего раствора TdT:
- осторожно удалить остатки буфера со среза;
- немедленно нанести на срез 15 мкл рабочего раствора TdT (предварительно
смешать в эппендорфе 35 мкл Reaction buffer и 15 мкл TdT , хорошо перемешать на
вортексе, полученный раствор может храниться в холодильнике не более 6 часов,
этого количества достаточно для 3-х срезов);
- инкубировать во влажной камере в термостате при +37°С 1 час.
б.Добавление останавливающего буфера:
- поместить срез в рабочий раствор Stop/Wash Buffer (предварительно смешать в
пластиковой пробирке (на 50 мл) 1 мл Stop/Wash Buffer и 34 мл дистиллированной
воды, полученный раствор может храниться в холодильнике до 1 года
(аликвотировать!);
- прополоскать срез в растворе 15 секунд;
- инкубировать срез в растворе 10 минут при комнатной температуре.
Достать из пробирки Anti-Digoxygenin conjugate (Anti-Digoxigenin Peroxidase) (45 мкл) и
оставить в эппендорфе согреваться до комнатной температуры.
7. Добавление Anti-Digoxygenin conjugate:
- промыть срез в 3-х сменах PBS по 1 минуте;
- осторожно удалить остатки PBS со среза;
- добавить 15 мкл рабочего раствора Anti-Digoxygenin conjugate;
-
7.4. инкубировать во влажной камере 30 минут при комнатной температуре.
8.Промывка срезов:
8.1. Промыть срезы в 4 сменах PBS по две минуты
Приготовить рабочий раствор субстрата пероксидазы: смешать в эппендорфе в темноте 145 мкл DAB Dilution Buffer и 5 мкл DAB Substrate. Этого количества будет достаточно для 10 срезов. После приготовления смесь нагреть до комнатной температуры и хранить в темноте до использования. Раствор может храниться 14 дней в холодильнике или 7 дней при комнатной температуре.
9. Окраска субстратом пероксидазы:
- осторожно удалить избыток жидкости со среза;
- нанести рабочий раствор субстрата пероксидазы на срез;
9.3. инкубировать 3-6 минут при комнатной температуре (влажная камера не
обязательна);
9.4. контролировать оптимальную окраску (коричневый цвет) можно периодически в
световой микроскоп.
10. Промывка срезов:
10.1. промыть срезы в 2 сменах дистиллированной воды не более чем по 1 минуте;
10.2. инкубировать срез в дистиллированной воде 5 минут при комнатной
температуре.
Приготовление раствора метиленового зеленого:
- Приготовить 0,1 М ацетатный буфер (растворить 1,36 г ацетата натрия в 80 мл
дистиллированной воды, довести рН до 4 с помощью уксусной кислоты. Добавить
дистиллированной воды до конечного объема 100 мл).
- Растворить 0,5 г метиленового зеленого в 100 мл ацетатного буфера.
- Фильтровать раствор через фильтр (0,22 мкм).
11. Докраска метиленовым зеленым:
- поместить образец в 0,5% раствор метиленового зеленого (раствор готовится в
на 10 минут при комнатной температуре;
- промыть срез дистиллированной водой в двух сменах воды по 10 секунд, а затем
30 секунд - в третьей смене воды;
- промыть срезы в трех сменах абсолютного бутанола (два раза по 10 секунд и 1
раз 30 секунд)
12. Монтирование:
- дегидрировать срезы в ксилоле (три смены по 2 минуты);
- осторожно удалить остатки ксилола со срезов;
- нанести на срез монтирующую жидкость;
- закрыть срез пластиковым покровным стеклом
13. Микроскопия.
Окрашенные срезы могут храниться сколь угодно долго при комнатной температуре.