Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Белки — универсальные биополимеры, из которых строится жизнь, — выполняют весь спектр биологических функций: от структурной до каталитической. Именно каталитическая активность ферментов определяет возможность лёгкого протекания огромного множества химических реакций идущих в каждом организме на планете и обеспечивающих его жизнедеятельность [1].
Белки - высокомолекулярные органические вещества, состоящие из соединённых в цепочку пептидными связями альфа-аминокислот. В живых организмах аминокислотный состав белков определяется генетическим кодом, при синтезе в большинстве случаев используется 20 стандартных аминокислот. Множество их комбинаций дают большое разнообразие свойств молекул белков.
Часто в живых организмах несколько молекул белков образуют сложные комплексы, например, фотосинтетический комплекс у зелёных растений.
Важность изучения белков не ограничивается только фундаментальной наукой: сегодня и медицина, и промышленность — потребители знаний о функциях и структуре белков.
Понимание механизмов функционирования живых систем, а значит, и возможность влиять на них, например, с помощью лекарственных средств [2], требует знания структуры белковых молекул и глубокого понимания их функций. Благодаря работам Кристиана Анфинсена [3] — нобелевского лауреата по химии 1972 года «за работы по рибонуклеазе, в частности, за установление связи между последовательностью аминокислот и конформацией биологически активной молекулы», — нам известно, что «необходимая [для сворачивания белка] информация заключена в линейной последовательности аминокислот пептидной цепочки, и что никакой дополнительной генетической информации, большей, чем та, которая заключена в ДНК, не требуется» [3]. Однако физико-химические аспекты этого сложнейшего процесса, называемого также фолдингом белка, остаются до сих пор понятыми лишь приблизительно.
Кроме учёных, структура белка интересует и специалистов более практического профиля. Фармацевты и врачи, например, заинтересованы в производстве и выпуске на рынок новых поколений лекарственных средств. Однако в наше время уже нельзя рассчитывать на случайный успех, и нужно хорошо разбираться в молекулярных механизмах действия проектируемого лекарства, — направленного, скорее всего, на взаимодействие с каким-нибудь белком (рецептором или ферментом) в человеческом организме. Проектирование нового лекарства с учётом атомарного строения молекул-«мишеней», на которые это лекарство будет действовать — наукоёмкий и сложный процесс, называемый драг-дизайном [2].
При образовании белка в результате взаимодействия α-аминогруппы (-NH2) одной аминокислоты с α-карбоксильной группой (-COOH) другой аминокислоты образуются пептидные связи. Концы белка называют C- и N-концом (в зависимости от того, какая из групп концевой аминокислоты свободна: -COOH или -NH2, соответственно). При синтезе белка на рибосоме новые аминокислоты присоединяются к C-концу, поэтому название пептида или белка даётся путём перечисления аминокислотных остатков начиная с N-конца [4].
Фолдинг — сворачивание белков (и других биомакромолекул) из развёрнутой конформации в «нативную» форму — физико-химический процесс, в результате которого белки в своей естественной «среде обитания» (растворе, цитоплазме или мембране) приобретают характерные только для них пространственную укладку и функции [5]. Фолдинг причисляют к списку крупнейших неразрешённых научных проблем современности — поскольку процесс этот далёк от окончательного понимания [6].
С термодинамической точки зрения самосворачивание белкá является переходом белковой молекулы в наиболее статистически вероятную конформацию (что практически можно приравнять к конформации с наименьшей потенциальной энергией). С кинетикой же фолдинга связывают так называемый парадокс Левинталя [7], согласно которому, если бы молекула белкá длиной хотя бы 100 аминокислотных остатков «перебирала» все возможные конформации, прежде чем свернуться в нативную форму, этот процесс потребовал бы времени, превышающего время существования Вселенной. Однако из практики известно, что максимальное время сворачивания ограничивается минутами, типичное время — порядка миллисекунд, а кратчайший требуемый срок, зарегистрированный для трёхлистового β-слоя — всего 140 нс [8].
Само собой, парадокс Левинталя — кажущийся. Решение его заключается в том, что молекула, конечно, никогда не принимает подавляющего большинства теоретически возможных конформаций. Кооперативные эффекты фолдинга — одновременное формирование «зародышей» вторичной структуры, являющихся энергетически стабильными и уже не изменяющимися в процессе дальнейшего сворачивания — приводят к тому, что молекула белка находит «кратчайший путь» на воображаемой гиперплоскости потенциальной энергии к точке, соответствующей нативной конформации белка. Нативная конформация при этом отделена заметным «энергетическим промежутком» (potential energy gap) от подавляющего числа несвёрнутых форм, а ближайшая её «окрестность» (очень «узкая», впрочем) определяет естественную конформационную подвижность молекулы.
Ограниченность понимания механизмов фолдинга связана ещё и с тем, что его сложно наблюдать экспериментально: это достаточно быстрый динамический процесс, «разглядывать» который нужно на уровне отдельных молекул! И хотя сейчас уже проводят изучение сворачивания (а точнее, разворачивания) на отдельных молекулах [9], это не пока не привело к принципиально новому уровню понимания механизма фолдинга — а ведь такое понимание могло бы дать эффективный алгоритм теоретического моделирования этого процесса.
Несмотря на то что в клетке имеется много факторов, вовлеченных в процесс фолдинга полипептидной цепи, можно считать установленным то обстоятельство, что код, согласно которому полипептидная цепь сворачивается в уникальную третичную структуру, заключен в аминокислотной последовательности самой полипептидной цепи [10]. Впервые это было продемонстрировано в работах Анфинсена (см., например: Anfinsen, 1973[3]), показавшего экспериментально, что рибонуклеаза А, денатурированная мочевиной, в присутствии агента, разрушающего S—S-связи, восстанавливает полностью нативную структуру и ферментативную активность после удаления денатуранта и агента, разрушающего S—S-связи. За эту работу Анфинсен был удостоен Нобелевской премии. В последующем способность к ренатурации была показана для ряда других однодоменных белков относительно небольшого размера. Тем самым было доказано, что пространственная структура нативного состояния макромолекулы белка запрограммирована в его первичной структуре. При этом важно подчеркнуть, что принципы кодировки нативной пространственной структуры белка принципиально отличаются от принципа кодировки его аминокислотной последовательности (рис. 1). При синтезе белка последовательно, шаг за шагом считывается информация, закодированная в нуклеотидах, и одна за другой собираются в полипептидную цепь соответствующие аминокислоты, т. е. одномерная информация, заключенная в нуклеотидной последовательности ДНК, трансформируется в одномерную же информацию о последовательности аминокислот первичной структуры белка. При фолдинге белка пошаговый механизм передачи информации явно не работает. В определении контактов, возникающих в третичной пространственной структуре макромолекулы белка, участвуют удаленные друг от друга по цепи аминокислотные остатки. При этом определяющую роль в фолдинге белка играют лишь некоторые (далеко не все) аминокислотные остатки. По этой причине гомологичные белки (иногда с достаточно низкой гомологией) имеют сходную структуру. С другой стороны, одна-единственная аминокислотная замена может существеннейшим образом сказаться на скорости сворачивания или даже полностью нарушить правильное сворачивание белка [10].
Мерой стабильности структуры белка является свободная энергия F=Н-TS, которая определяется его энтальпией Н, т. е. энергией взаимодействия атомов белка, и его энтропией S = R In N (R — молярная газовая постоянная, Т— абсолютная температура), являющейся мерой числа конформаций N, которыми данное состояние белка может быть реализовано. Способность белка самопроизвольно сворачиваться в нативное состояние означает, что этому состоянию белка отвечает минимум свободной энергии. Более строго нужно говорить о минимуме свободной энергии системы белок—растворитель. Дело в том, что одним из основных факторов, определяющих стабильность структуры белка, являются гидрофобные взаимодействия, т. е. стремление неполярных групп белка уйти из водного окружения, поскольку при этом происходит освобождение молекул воды, образующих вокруг неполярных групп белка льдоподобные упорядоченные структуры. Образование гидрофобного ядра макромолекулы белка приводит к существенному уменьшению свободной энергии системы белок—растворитель за счет возрастания энтропии растворителя.
Сворачивание белка заключается в поиске уникальной нативной структуры, отвечающей минимуму свободной энергии, среди большого числа конформаций, которые может принимать полипептидная цепь за счет поворотной изомеризации относительно связей N—Со (угол ф), Со—С (угол *Р) и С—N (угол со) (рис. 2). Однако жесткость пептидной связи не допускает вращения вокруг связи С—N. Атомы, входящие в пептидную связь, лежат в одной плоскости в трансконформации (рис. 2). Исключение составляет пептидная связь, предшествующая остатку пролина. В нативном белке часть пептидных связей в этом случае имеет цисконформацию. Энергетические барьеры между шестью конформация-ми полипептидной цепи, отвечающими минимуму свободной энергии по углам ф иТ, составляют около 1 ккал/моль, т. е. близки к энергии тепловых колебаний (0.6 ккал/моль). Поэтому поворотная изомеризация относительно связей N—Со и Со—С обеспечивает возможность существования огромного числа конформаций основной цепи белка в развернутом состоянии. Возможно практически свободное вращение относительно этих связей.
Простой расчет показывает, что даже для небольшого белка из ста аминокислотных остатков потребуется биллион лет, для того чтобы найти нативную структуру, если сворачивание будет осуществляться за счет произвольного перебора всех возможных конформаций[12]. Тот факт, что сворачивание белка в состояние, отвечающее минимуму свободной энергии, происходит за очень короткий промежуток времени (который обычно составляет доли секунды), известен как «парадокс Левинталя». Это сделало очевидным, что в аминокислотной последовательности запрограммирована не только структура нативного состояния макромолекулы белка, но и путь его достижения.
Особенности фолдинга белков в клетке
Фолдинг белков в живой клетке осложнен по крайней мере двумя факторами. Во-первых, фолдинг белка всегда сопряжен с его синтезом. Сходящая с рибосомы полипептидная цепь сразу начнет сворачиваться. Если это небольшой а-спиральный белок, то сворачивание полипептидной цепи происходит по мере ее роста (котран-сляционное сворачивание). Однако это не всегда так, и существует опасность возникновения неправильных внутримолекулярных контактов. Кроме того, сходя с рибосомы, полипептидная цепь сразу попадает в «густонаселенную» физиологическую среду клетки. При этом очень велика опасность образования нежелательных контактов с «соседями»[13]. Поэтому для правильного сворачивания белков в этих условиях им необходимы помощники. Такими помощниками являются шапероны [14] и ферменты, ответственные за цис-трансизомеризацию пролина [15] и образование «правильных» ди-сульфидных мостиков. Шапероны представляют собой обширный класс белков, различающихся по молекулярной массе, структуре и функции. Они способствуют котрансляционному сворачиванию полипептидных цепей, что особенно важно при синтезе больших мультидоменных белков, препятствуют агрегации денатурированных белков, ускоряют процесс перехода белка из промежуточного в нативное состояние, участвуют в транспорте белков к местам их назначения, в частности обеспечивают перенос белков через мембраны (Radford, 2000; Chen et al., 2001). Необходимо подчеркнуть, что наличие помощников при фолдинге белка в клетке отнюдь не противоречит фундаментальному заключению, сделанному на основании экспериментов, выполненных in vitro, о том, что структура нативного состояния белка и путь ее достижения закодированы в его первичной структуре.
Одностадийное кооперативное сворачивание небольших белков
Вопрос о том, как же белки сворачиваются в уникальное компактное, высокоорганизованное, функционально активное состояние, является в настоящее время одним из центральных вопросов структурной и клеточной биологии. Решение проблемы фолдинга лежит на стыке биологии, физики и химии, и нет другой области исследований, где бы эти науки так перекрывались (Fersht, 1998; Финкельштейн, Птицын, 2002). Основным подходом к решению этой проблемы является изучение процессов сворачивания—разворачивания белков in vitro с использованием различных физических методов, дающих информацию о структуре белка.
Методы малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, седиментации, вискозиметрии и проникающей гель-хроматографии дают информацию о размерах и форме макромолекулы, методы кругового дихроизма в дальней УФ-области и ИФ-спектроскопии — о вторичной структуре белка, круговой дихроизм в ближней УФ-области спектра и собственная флуоресценция — о третичной структуре белка (Goldbeck et al., 1997; Fersht, 1998; Pollack, 1999; Roder, Shastry, 1999; Eaton et al., 2000; Kuznetsova et al., 2002, 2004; Arai et al., 2003; Dobson, 2004; Zeeb, Balbach, 2004).
Флуоресценция гидрофобного красителя АНС (1-анилинонафталин-8-сульфо-ната) используется для тестирования гидрофобных кластеров на поверхности белка и возникновения аморфных агрегатов (Uversky et al., 1996). Другой флуоресцентный краситель — тиофлавин Т — используется для тестирования амилоидных фибрилл, богатых (3-складчаты-ми структурами. Свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый выход флуоресценции. При встраивании в амилоидные фибриллы квантовый выход флуоресценции тиофлавина Т возрастает на три порядка (Le Vine, 1999; Воропай и др., 2003; Melanie, 2004).
Проведение исследований процессов сворачивания—разворачивания белков с использованием этих методов показало, что по крайней мере для сравнительно небольших однодоменных белков переход между развернутым (U) и нативным (N) состояниями является обратимым и осуществляется по принципу «все или ничего». Регистрация равновесной зависимости любой экстенсивной физической характеристики белка от температуры или концентрации химического денатуранта позволяет определить константу равновесия в каждой точке денатурационной зависимости:
и тем самым разность свободных энергий макромолекулы белка в этих состояниях AFm- и (рис. 3):
Здесь АЯдг- и и ASn- и — изменение соответственно энтальпии и энтропии в результате реакции U -» N, R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, /(0) — экспериментально измеряемая величина, 0 — температура или концентрация денатуранта, 1мф) и /?у(0) — значения /(0) для белка в нативном и денатурированном состояниях. Обычно принимается, что /w(9) = ам+ Ьм-0 и 1цф) = аи + Ьи • 0, где аы, Ьы, аи, Ьи — постоянные. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что свободная энергия макромолекулы белка в состояниях N и U различается не очень сильно, так что путем изменения температуры или концентрации химического денатуранта (гуанидингидрохлорида, мочевины, ионов Н+ или ОН-и т. п.) можно подобрать условия, при которых свободные энергии нативного и полностью развернутого состояний становятся равными. При этом нативная структура стабильна благодаря сильным взаимодействиям в макромолекуле белка (в том числе гидрофобным взаимодействиям, возникновение которых существенно увеличивает энтропию системы белок—растворитель), развернутая — за счет высокого уровня конформационной энтропии основной цепи.
Разность свободных энергий белка в нативном и развернутом состояниях AFN-u является мерой стабильности белка. Стабильность белка изменяется линейно с изменением концентрации денатуранта (Nolting, 1999):
где [D] — концентрация денатуранта, разность свободных энергий макромолекулы белка в состояниях N и U в отсутствие денатуранта, т = =d(AFN_v ([-D])) /d([D]). Зависимость стабильности белка от температуры подчиняется соотношению Гибб-са—Ãåëüìãîëüöà (Privalov, Potekhin, 1986; Kuhlman, Raleigh, 1998; Nolting, 1999):
где Тт — температура середины перехода, АНт, АСР — изменение величин энтальпии и теплоемкости при переходе из состояния U в N при температуре Тт.
Сопоставление результатов определения основных термодинамических характеристик процесса разворачивания белка, полученных путем измерения равновесных зависимостей тех или иных физических характеристик (метод Ван-Гоффа) и методом дифференциальной сканирующей калориметрии, позволяет делать вывод о кооперативное™ процесса разворачивания белка (Финкель-штейн, Птицын, 2002).
Белки — это природные гетерополимеры, однако по свойствам они существенно отличаются от синтетических гетерополимеров. Большое разнообразие мономерных звеньев (20 различных аминокислот) само по себе уже существенно отличает белки от синтетических гетерополимеров. В отличие от синтетических полимеров число мономерных звеньев (аминокислот), образующих белок, и их последовательность в белковой цепи строго детерминированы. И наконец (и это очень существенно!), в отличие от синтетических полимеров белки могут образовывать кристаллы, т. е. все молекулы белка в на-тивном состоянии идентичны, если, конечно, не считать флуктуации структуры, обусловленных тепловым броуновским движением входящих в их состав атомов. А это возможно только в том случае, если между нативным и всеми другими состояниями белка (полностью развернутым состоянием или промежуточным частично свернутым состоянием) существует свободноэнергетический барьер. Таким образом, в отличие от синтетических полимеров первичная структура белка такова, что она обеспечивает существование энергетического барьера между нативным и развернутым (или промежуточным) состояниями. В результате этот переход является фазовым переходом первого рода и осуществляется по принципу «все или ничего». Это обстоятельство чрезвычайно существенно для правильного функционирования белков, так как только существование свобод-ноэнергетического барьера между нативным и денатурированными состояниями белка приводит к тому, что все молекулы белка в нативном состоянии идентичны. Уникальная первичная структура, обеспечивающая существование энергетического барьера между нативным и денатурированными состояниями, является результатом эволюционного отбора.
Величину свободноэнергетического барьера AF#_№ разделяющего состояния N и U (рис. 4), можно определить, измерив константу скорости процесса сворачивания белка ки-ы-
Здесь # — переходное состояние, кв — постоянная Боль-цмана, h — постоянная Планка; остальные величины были определены выше. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что если процесс сворачивания белка не осложнен процессами изомеризации пролино-вых остатков, реорганизацией S—S-связей и т. п., то при физиологических условиях процесс сворачивания белка осуществляется быстро, за доли секунды. Это свидетельствует о том, что свободноэнергетический барьер на пути сворачивания белка невысок. Сворачивание белка, т. е. переход из развернутого состояния, которое может быть реализовано огромным числом конформаций боковой цепи, в нативное состояние, в котором конформация основной цепи строго детерминирована, связано с огромным увеличением свободной энергии за счет уменьшения конформационной энтропии основной цепи. Это означает, что процесс U -» N может осуществляться быстро только в том случае, если потеря конформационной энтропии основной цепи компенсируется уменьшением свободной энергии за счет возникновения внутримолекулярных контактов.
Как уже было сказано выше, макромолекуле белка, в каком бы структурном состоянии она ни находилась (в том числе и нативном), присущ определенный уровень структурной (равновесной) динамики, обусловленный тепловым броуновским движением входящих в состав белка атомов (Kay, 2005; Lange et al., 2005; Smith et al., 2005). Существует представление о том, что внутримолекулярная подвижность играет важную роль при выполнении белком его функции. Предполагается, что за счет теплового броуновского движения часть макромолекул принимает конформацию, при которой выполнение биологической функции (например, взаимодействие фермента с субстратом, взаимодействие антиген—антитело и т. д.) термодинамически более выгодно по сравнению с конформацией основного состояния макромолекулы.
Для объяснения одностадийного сворачивания белков было предложено несколько разных моделей, различающихся в деталях, но близких по своей сути. Предполагается, что в результате флуктуации основной цепи белковая цепь достигает такого состояния, в котором присутствует определенный набор нативных контактов между остатками — как соседними, так и достаточно удаленными друг от друга по цепи. После формирования ядра сворачивания процесс фолдинга быстро приходит к завершению. Ядром сворачивания может стать, например, участок а-спирали, образующийся на начальном этапе сворачивания белка, или образование нативных контактов между неполярными группами боковых цепей, приводящее в конечном итоге к образованию гидрофобного ядра молекулы. Как уже было сказано выше, образование контактов между неполярными группами белка сопровождается возрастанием энтропии растворителя, которая компенсирует уменьшение энтропии, связанное с уменьшением числа возможных конформаций основной цепи белка при его сворачивании в глобулу. Гидрофобные взаимодействия являются определяющими в формировании нативной глобулярной структуры макромолекулы белков.
Сворачивание белков через образование промежуточных состояний
Не все белки сворачиваются в нативное состояние по одностадийному механизму. В начале 1980-х годов было установлено, что переход из нативного состояния в полностью развернутое для ряда белков осуществляется не по принципу «все или ничего», а через образование термодинамически стабильных промежуточных состояний (Dolgikh et al., 1981; Гильманшин и др., 1982). Было также показано, что ренатурация многих глобулярных белков из полностью развернутого состояния происходит через стадию накопления кинетического интермедиата (Ptitsyn, 1995), свойства которого совпадают со свойствами термодинамически стабильного состояния белковой молекулы, промежуточного между нативным и полностью развернутым состояниями. В этом состоянии макромолекула белка сохраняет компактность и выраженную вторичную структуру, присущую нативному состоянию, однако отличается от нативной молекулы отсутствием жесткой упаковки боковых цепей. О. Б. Пти-цыным была выдвинута идея (см.: Ohgushi, Wada, 1983) о том, что это состояние белка, названное по совокупности перечисленных выше признаков «расплавленной глобулой», может играть универсальную роль в процессе самоорганизации белковой молекулы.
Идея о существовании универсального термодинамически стабильного интермедиата типа расплавленной глобулы оказалась исключительно плодотворной и на длительное время определила направление научных исследований многих ведущих лабораторий мира. Интерес исследователей к изучению белков в состоянии расплавленной глобулы еще более возрос в связи с появлением данных о том, что это состояние, возможно, является одной из основных форм существования макромолекул белков в клетке и обеспечивает ряд существенных внутриклеточных процессов, таких как узнавание белков ша-перонами, проникновение белков через мембраны, диссоциация лигандов и т. д. (см., например: Bychkova, Ptitsyn, 1993).
В последующем выяснилось, что наряду с состоянием типа расплавленной глобулы возможны и другие денатурированные частично свернутые состояния белка, например предшественник расплавленной глобулы (Uversky, 1993; Uversky, Ptitsyn, 1996) или высокоструктурированная расплавленная глобула (Dobson, 1992). Во многих случаях было обнаружено, что переход в промежуточное состояние сопровождается агрегацией или специфической ассоциацией (Fink, 1998), что совершенно исключалось в модели «расплавленной глобулы».
Модель энергетической воронки
Согласно современным представлениям, переход от полностью развернутого состояния в уникальное нативное состояние может осуществляться различными путями, которые определяются энергетической поверхностью, т. е. зависимостью свободной энергии макромолекулы белка от всех координат, определяющих состояние системы (модель «энергетических поверхностей»; Dinner et al., 2000). В рамках этой модели развернутому состоянию полипептидной цепи отвечает широкое «холмистое плато» свободной энергии, отражающее реализацию этого состояния огромным числом конформаций основной цепи. Возвышенности на плато отражают существование запрещенных конформаций (рис. 4). Переход от полностью развернутого состояния в уникальное нативное состояние может осуществляться различными путями. Число возможных конформационных состояний полипептидной цепи уменьшается по мере приближения к нативному состоянию, поэтому такую энергетическую поверхность часто называют также «энергетической воронкой». Совпадение денатурационных кривых, полученных путем измерения различных физических характеристик белка, является экспериментальным свидетельством того, что переход между этими состояниями осуществляется по принципу «все или ничего». Это означает, что плато отделено от входа в воронку свобод-ноэнергетическим барьером, отвечающим переходному состоянию #.
Переходное состояние и ядро сворачивания
Изучение переходного состояния — ключевой момент в изучении процесса фолдинга. Величина барьера между нативным и денатурированным состояниями может быть определена из экспериментов по изучению кинетики сворачивания.
Для того чтобы определить структуру переходного состояния, т. е. выявить те аминокислотные остатки, взаимодействие между которыми происходит на ранних стадиях сворачивания белка, А. Фершт предложил использовать изучение кинетики сворачивания различных му-тантных форм белка (см., например: Matouschek et al., 1989, 1990; Fersht, 1998). Точечная мутация в белке может приводить к изменению стабильности нативного белка и скорости сворачивания. Различие стабильности нативного состояния белка дикого типа и мутанта AAFN_u может быть определено на основании измерения денатурационных кривых этих двух белков. Путем измерения констант скоростей образования нативного состояния белка дикого типа и мутанта может быть определена разность свободных энергий этих белков в переходном состоянии AAF#_u (рис. 3). Величина отношения Ф# = = AAF#_u/AAFN_u является мерой участия этого остатка в формировании структуры переходного состояния. Величина Ф# равна единице в том случае, если контакты этой аминокислоты, определяющие изменение стабильности белка в нативном состоянии, возникли уже в переходном состоянии. Это говорит о том, что данная аминокислота входит в ядро сворачивания. Другой крайний случай — величина Ф# равна нулю. Это свидетельствует о том, что контакты данной аминокислоты, влияющие на стабильность нативного белка, возникают на последнем этапе сворачивания после преодоления молекулой свободноэнергетического барьера, отвечающего переходному состоянию.
Развернутое состояние белка
Структура белков в развернутом состоянии вряд ли даже отдаленно напоминает структуру статистического клубка, характерного для линейных полимеров в «хорошем» растворителе. Белок приобретает структуру, близкую к структуре статистического клубка, лишь в растворах с высоким содержанием денатурантов, таких как мочевина или гуанидингидрохлорид. Имеются, однако, данные о том, что даже при высоких концентрациях мочевины (8М) макромолекулы некоторых белков сохраняют элементы структуры, присущие нативному состоянию (Shortle, Ackerman, 2001). Таким образом, состояние U достаточно компактно, и число конформаций основной цепи, с помощью которых оно может быть реализовано, значительно меньше числа всех возможных конформаций основной цепи.
Нативное состояние — отвечает ли оно глобальному минимуму свободной энергии?
В том случае, если на склонах воронки нет глубоких минимумов, молекула после преодоления свободноэнер-гетического барьера быстро достигает нативного состояния. Скорее всего, минимум свободной энергии, отвечающей нативному состоянию, в которое белок сворачивается наиболее быстро, является одновременно и абсолютным минимумом свободной энергии. Модель энергетической воронки позволяет, однако, предположить, что нативное состояние не обязательно отвечает абсолютному минимуму свободной энергии, а является состоянием, отвечающим минимуму свободной энергии, который достигается скорейшим образом. Возможно, существует еще один более глубокий или близкий по величине свободной энергии минимум, отделенный от нативного состояния свободноэнергетическим барьером. В этом случае молекула быстро сворачивается в нативное состояние, а потом медленно переходит в неправильно свернутое состояние, отвечающее этому более глубокому, или глобальному, минимуму. Скорость перехода в это неправильно свернутое состояние зависит от свобод-ноэнергетического барьера, отделяющего его от нативного состояния. Примерами белков, для которых такая ситуация реализуется, являются ингибиторы сериновых протеаз — серпины.
Энергетические поверхности сворачивания прионов, по-видимому, также имеют два близких по величине минимума свободной энергии. В нативном состоянии прионы являются белками с выраженной α-спиральной вторичной структурой. Второму минимуму свободной энергии отвечает состояние с β-складчатой вторичной структурой. Белок в этом состоянии склонен к агрегации с образованием амилоидных фибрилл. В обычных условиях такие неправильно свернутые молекулы белка ликвидируются защитными системами клетки. Привнесение этого белка извне инициирует процесс превращения α-формы белка в β-форму (рис. 5), что становится причиной развития инфекционной губчатой энцефалопатии — болезни «коровьего бешенства» (Zahn, 1999). Существует ряд других тяжких заболеваний (которые иногда называют конформационными болезнями), таких как болезни Альцгеймера, Паркинсона и т. д., также связанных с нарушением правильного фолдинга белков и возникновением амилоидных фибрилл (Harper, Lansbury, 1997; Carrell, Gooptu, 1998; Fink, 1998; Uversky et al., 1999). Болезни эти наиболее часто встречаются у людей преклонного возраста, когда защитные системы клеток и организма в целом не справляются с функцией ликвидации неправильно свернутых белков.
Роль промежуточных состояний в образовании агрегированных форм белков
При наличии на склонах воронки глубоких локальных минимумов могут образовываться промежуточные состояния. Соотношение доли молекул, находящихся в нативном и промежуточном состояниях в условиях равновесия, определяется разностью их свободных энергий, скорость достижения равновесия — величиной свобод-ноэнергетического барьера, отделяющего эти состояния.
В противоположность представлению о том, что промежуточное состояние, являясь вехой на пути сворачивания, может содержать только нативоподобные структуры, модель энергетической поверхности позволяет предположить, что могут существовать промежуточные состояния, имеющие элементы структуры, не присутствующие в нативном белке. Возникновение таких промежуточных состояний может инициировать ассоциацию или агрегацию макромолекул. В некоторых случаях эти агрегаты могут иметь аморфный характер, в других — возникают обогащенные (3-структурой амилоидные фибриллы. Исследования структуры и путей образования денатурированных частично свернутых агрегированных (ассоциированных) форм белков важны не только для решения фундаментальной проблемы фол-динга белка, но имеют также существенное практическое значение для медицины (выяснение причин заболеваний, связанных с нарушением фолдинга белков: Harper, Lansbury, 1997; Carrell, Gooptu, 1998; Fink, 1998; Uversky et al., 1999; Selkoe, 2003) и биотехнологии (анализ причин возникновения неправильно свернутых агрегированных форм рекомбинантных белков и их аккумуляции в телах включения: Wetzel, 1994; Speed et al., 1996; Fink, 1998).
В связи с практической значимостью для медицины выяснение факторов, способствующих образованию амилоидных фибрилл, а также изучение структуры белков в этом состоянии являются в настоящее время предметом интенсивных исследований. Установлено, что амилоидные фибриллы разного происхождения имеют сходную морфологию. Они представляют собой длинные неразветвленные структуры диаметром несколько нанометров, образованные перевитыми между собой протофибриллами, в которых (3-слои ориентированы перпендикулярно оси фибриллы (Dobson, 2003; Dumou-lin, Dobson, 2004). Для все большего числа белков удается подобрать условия, при которых такие структуры возникают (Goers et al., 2002). Обычно амилоидные фибриллы образуются при инкубации белков, находящихся в промежуточных состояниях, при повышенной температуре и интенсивном перемешивании. Это обусловлено, по-видимому, тем, что для этих белков наряду с минимумом свободной энергии, отвечающим промежуточному состоянию, имеется еще один, достаточно глубокий минимум свободной энергии, отвечающий (3-форме белка. В этом состоянии белки склонны к агрегации с образованием амилоидных фибрилл. Переход из промежуточного состояния в (3-форму при низкой температуре происходит очень медленно, поскольку он требует преодоления значительного активационного барьера, разделяющего эти состояния белка. Скорость этого процесса существенно возрастает при инкубации белка при повышенной температуре. Ввиду того что процесс агрегации (3-формы белка сопровождается значительным снижением свободной энергии и является необратимым, этот процесс может осуществляться даже в том случае, если мономер белка в (3-форме имеет более высокий уровень свободной энергии, чем тот же белок в промежуточном состоянии, из которого эта форма возникает.
Таким образом, экспериментальные результаты, полученные in vitro, свидетельствуют о том, что первичная структура несет информацию о пространственной структуре макромолекулы и путях ее достижения. Кроме того, она обеспечивает существование свободноэнергетиче-ского барьера между развернутым и нативным состояниями белка, в результате чего переход U—N осуществляется как фазовый переход первого рода. Несмотря на огромное число экспериментальных и теоретических работ по изучению процессов сворачивания—разворачивания белков, вопрос о том, каким образом в последовательности аминокислотных остатков закодирована информация о пространственной структуре белка, остается нерешенным.
В настоящее время ключевым вопросом является выяснение структуры ядра сворачивания, что требует выполнения чрезвычайно трудоемких экспериментов с привлечением методов генной инженерии для получения мутантных форм белка и физико-химического исследования кинетики процессов их сворачивания—разворачивания. Большинство работ выполнено на небольших од-нодоменных белках. Значительно менее исследованы процессы фолдинга мультидоменных глобулярных и во-донерастворимых мембранных белков.
4. Болезни связанные с нарушением фолдинга белка
Существует ряд заболеваний этиология и патогенез которых связан с нарушениями фолдинга белка. Их можно (с теми или иными допущениями) разделить на те, где нарушения процесса свёртывания происходит самопроизвольно и те, где нарушение свёртывание индуцируется инородным белком—прионом.
К первой группе можно отнести такие заболевания как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, по некоторым гипотезам — диабет типа II и рассеяный склероз.
Вторая группа — прионные болезни - болезнь Крейцфельда-Якоби (коровье бешенство), Фатальная семейная бессонница, болезнь Куру и другие.
4.1. Болезнь Альцгеймера
4.1.1.Общая характеристика болезни Альцгеймера
Болезнь Альцгеймера (также сенильная деменция альцгеймеровского типа) — наиболее распространённая форма деменции, неизлечимое дегенеративное заболевание, впервые описанное в 1906 году немецким психиатром Алоисом Альцгеймером. Как правило, она обнаруживается у людей старше 65 лет, но существует и ранняя болезнь Альцгеймера — редкая форма заболевания. Общемировая заболеваемость на 2006 год оценивалась в 26.6 млн человек, а к 2050 году число больных может вырасти вчетверо.
4.2. Болезнь Крейтцфельдта — Якоба
Болезнь Кройцфе́льдта — Я́коба, (более распространена транскрипция Крейтцфельдта — Якоба, названо по именам немецких врачей Hans Gerhard Creutzfeldt, Alfons Maria Jakob; синонимы: псевдосклероз спастический, синдром кортико-стриоспинальной дегенерации, трансмиссивная спонгиоформная энцефалопатия, коровье бешенство) — прогрессирующее дистрофическое заболевание коры большого мозга, базальных ганглиев и спинного мозга. Считается основным проявлением губчатой энцефалопатии (прионная болезнь).
Список литературы