Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Національна Академія1 наук України
Інститут клітинної біології і генетичної інженерії
РУБЦОВА Мирослава Олександрівна
УДК 581.143.6:578.21
ОДЕРЖАННЯ МІЖВИДОВИХ ГІБРИДІВ І
ТРАНСГЕННИХ РОСЛИН ГРЕЧКИ ТА ЇХ АНАЛІЗ
03.00.15 - генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 1998
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики
НАН України
Науковий керівник - доктор біологічних наук,
Левенко Борис Олексійович,
Інститут фізіології рослин і генетики
НАН України, зав. відділом
Офіційні опоненти - доктор біологічних наук,
Галкін Анатолій Павлович,
Інститут біоорганічної хімії і
нафтохімії НАН України, зав.відділом
доктор біологічних наук,
Парій Федір Микитович,
Інститут цукрових буряків УААН,
провідний науковий співробітник
Провідна установа-Київський університет ім. Тараса Шевченка.
Захист відбудеться "21” січня 1999 р. о 14 год. на за-
сіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інсти-
туті клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за
адресою: 252143, Київ, вул. Заболотного, 148.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту
клітинної біології і генетичної інженерії НАН України , Київ,
вул. Заболотного, 148.
Автореферат розісланий " 20 " грудня 1998 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Л.В.Тарасенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми .Гречка є однією з найважливіших круп'яних культур. Народногосподарське значення її визначається високими поживними і дієтичними якостями гречаної продукції, яка містить добре засвоювані білки які складаються в основному із глобуліну і глютеніну. Біологічна цінність білків гречки - найвища, у порівнянні з іншими культурами. Крупа містить стійкі до окислення жири; дуже корисні для організму людини органічні кислоти (лимонна, яблучна, щавлева). Вона багата вітамінами (Савицький, 1970; Кротов, 1975).
Гречка - добрий медонос і сприяє розвитку бджільництва. Її часто застосовують, як страхову і лікарську рослину.
Проте площі її вирощування на Україні з кожним роком зменшуються, тому що гречка характеризується специфічними особливостями біології живлення, розвитку і цвітіння, що ставить її в ряд культур, примхливих до умов вирощування. Вона вимоглива до температур і вологи (Алексеева, Паушева,1988). Районовані сорти гречки, маючи високий генетичний потенціал, характеризуються нестабільністю врожайності.
Сучасні її сорти потребують поліпшення ряду таких ознак, як здатність до самозапилення, стійкість до стресових чинників середовища, стійкість проти хвороб і шкідників. Ці ознаки мають дикі види гречки, зокрема татарська. Тому залучення їх як донорів бажаних ознак для покращення природи рослин гречки є важливим питанням у селекції цієї культури.
Проведені роботи по схрещуванню культурних і диких видів гречки не дали очікуваних результатів, оскільки існують бар’єри міжвидової несумісності (Morris, 1952; Гришина,1976; Ruszkowski, 1980; Adachi et al., 1989; Samimy, 1991).
Вирішення проблеми несумісності у гречки потребує застосування нових підходів, поєднання нетрадиційних методів, таких як культура клітин і органів з традиційно застосованою в селекції віддаленою гібридизацією.
Застосування примусового запилення між несумісними формами та стимулювання фізіологічно активними речовинами проростання пилку і росту пилкових трубок у видів які не схрещуються, дозволяють подолати перший бар’єр міжвидової несумісності.
Після використання методу культури тканини повністю чи частково долаються ще два бар’єри, які існують при віддаленій гібридизації: нежиттєздатність гібридних зародків і стерильність гібридів першого покоління.
Для створення цінних форм гречки, які будуть носіями потрібних ознак, необхідно з одного боку, залучати природні донори генів (дикі види), а з другого - одержувати рослини альтернативними методами.
В сучасному сільськогосподарському виробництві гербіциди відіграють важливу роль. Вони контролюють чисельність бур'янів, чим сприяють збереженню врожаю. Нове покоління гербіцидів поєднує високу ефективність з відсутністю токсичності для людини та тварин і характеризується швидкою деградацією у грунті (De Block et al., 1987). Проте, ці гербіциди не є селективними і пригнічують ріст та розвиток всіх рослин. Одержання гербіцидостійких рослин дає можливість застосовувати їх на протязі всього вегетаційного періоду (Piruzian et al.,1988).
Гербіцид фосфінотрицин (БАСТА) відноситься до гербіцидів нового покоління. Відомості про отримання трансгенних рослин гречки, стійких до фосфінотрицину та інших гербіцидів, в літературі відсутні.
Робота у цих напрямах викликає як практичний, так і теоретичний інтерес.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота виконувалась у відповідності з тематичним планом відділу генетичної інженерії ІФРГ НАН України на 1994 - 1997 рр. (тема "Вивчення експресії і взаємодії генів стійкості до гербіцидів і комах у трансгенних рослин",2.34.5.2) та проектом ДКНТ на 1992-1996 рр. (тема "Розробка методів одержання віддалених гібридів гречки", N3.01.15/138).
Мета і задачі дослідження . Метою роботи була розробка методу одержання міжвидових гібридів гречки між Fagopyrum esculentum M. i Fagopyrum tataricum L. з використанням способу дорощування гібридних зародків в умовах in vitro та регенерації рослин із калусних тканин, отриманих із гібридних зародків. Одержання трансгенних рослин гречки, стійких до гербіциду фосфінотрицину.
Основні задачі дослідження:
1.Подолати постгамну несумісність в дослідних міжвидових комбінаціях схрещувань гречки, застосовуючи водний розчин хлористого кадмію.
2.Підібрати склад поживного середовища для ефективного дорощування гібридних зародків до зрілих рослин.
3.Визначити оптимальний вік гібридних зародків, необхідний для максимального їх виживання в умовах in vitro.
4.Розробити методику ефективної регенерації рослин із калусних тканин гібридних зародків та отримати рослини - регенеранти.
5.Підтвердити гібридну природу одержаних рослин з допомогою методу ізоферментного аналізу та провести цитогенетичний аналіз гібридів.
6.Розробити методику отримання трансгенних рослин гречки, стійких до гербіциду фосфінотрицину, шляхом прямої регенерації із експлантів.
7.Підтвердити інтеграцію bar гена в геном одержаних рослин молекулярно -біологічним аналізом.
8.Визначити рівень фенотипічної експресії bar гена у трансгенних рослин.
Наукова новизна одержаних результатів . Вперше розроблений метод поетапного подолання бар’єрів міжвидової несумісності у гречки: прогамної несумісності, загибелі гібридних зародків і стерильності гібридів першого покоління.
Вперше отримано міжвидові гібриди між гречкою звичайною (Fagopyrum esculentum M.), та двома підвидами (F. tataricum L.v. rotundatum і F.tataricum L. v. tuberculatum ) татарської гречки.
Вперше проведено порівняння ефективності двох методів одержання гібридів: дорощування гібридних зародків в умовах in vitro та регенерації рослин із калусних тканин гібридних зародків. З'ясовано, що отримання гібридів через калусну культуру зародків в -2-3 рази ефективніше, ніж їх дорощування. Показано, що одержані методом регенерації із калусу гібридних зародків рослини, є в більшості амфідиплоїдними, тоді як гібриди, отримані при дорощуванні зародків - амфігаплоїдними.
Встановлено, що ферменти алкогольдегідрогеназа и 6-фосфоглюко-натдегідрогеназа можуть слугувати маркерними для відбору істинних гібридних рослин гречки.
Вперше шляхом прямої регенерації із експлантів розроблена методика трансформації звичайної та міжвидових гібридів гречки.
Вперше одержані трансгенні рослини гречки з господарсько - цінною ознакою стійкості до гербіциду фосфінотрицину.
Практичне значення одержаних результатів .
1.Розроблена схема поетапного подолання бар’єрів міжвидової несумісності у гречки рекомендована як ефективний засіб одержання міжвидових гібридів з цінними ознаками.
2.Отримані міжвидові гібриди можуть бути використані в селекційній практиці.
3.Запропонована методика одержання трансгенних рослин гречки дозволить отримувати цінні для селекції сорти, шляхом інтродукції генів, які кодують важливі ознаки.
4.Отримані трансгенні рослини гречки, стійкі до гербіциду фосфінотрицину, можуть бути застосовані в сільськогосподарському виробництві.
Особистий внесок здобувача. Дисертант опрацювала наукову літературу та оволоділа необхідними методами досліджень, брала участь в підготовці та проведенні експериментів, аналізі та інтерпретації одержаних результатів. Всі основні експериментальні дослідження та їх обробка виконані дисертантом.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень дисертаційної роботи доповідались на конференції молодих вчених " Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики" (Київ,1992); на VI з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. Вавілова (Полтава, 1992); на Міжнародному симпозіумі "Біотехнологія та генетична інженерія рослин" (Київ, 1994); VI конференції молодих вчених, присвяченій 50-й річниці з дня заснування ІФРГ НАН України (Київ,1996); на VII Міжнародній конференції " Біологія клітин рослин in vitro, біотехнологія і збереження генофонду (Москва, 1997); Міжнародній конференції "Агробіотехнологія рослин і тварин" (Київ,1997); на ІІ Міжнародному симпозіумі по біотехнології рослин (Київ, 1998).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 12 наукових робіт, в тому числі 3 статті у провідних виданнях та подана заявка на винахід № 98074048, Заявл. 23.07.1998; Опубл.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 132 сторінках машинописного тексту. Складається із списку умовних скорочень, вступу, огляду літератури, експериментальної частини з обговоренням одержаних результатів, висновків і списку використаних джерел з 250 найменувань, в тому числі 159 на іноземних мовах. Містить 12 таблиць і 20 малюнків.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Матеріалом досліджень були - гречка культурна - Fagopyrum esculentum M. (2n=16) , яка представлена сортом Айстра та самосумiсними формами: Зеленоквiткова, Гомостилiйна та Донор Бiлоруський - селекцiї Iнституту землеробства УААН, та дикий вид татарської гречки - Fagopyrum tataricum L. (2n=16) двох підвидів: rotundatum - (далі - К-17), і tuberculatum - (далі - К-21). Цей вид одержаний з колекцiї ВIРу.
Штучне запилення квітів культурної гречки проводили пилком татарської. Фертильнiсть пилкових зерен визначали йодним методом, а їх життєздатність за методикою Алексєєвої, Паушевої (1988).
Для подолання постгамної несумісності застосовували 0,05; 0,1; 0,15% -ні водні розчини солей хлористого кадмiю за рекомендацією Мельничука Ю.П. (1990). Дослiджували їх часову дiю на приймочки маточок культурної гречки, на які струшували в одних випадках сухий пилок дикого виду, у других - замочений на 3-5 хв. у розчині CdCl2 в концентрації, аналогічній тій, що попередньо наносили на приймочку. У контрольних комбінаціях схрещувань СdCl2 не застосовували.
За проростанням пилкових трубок у стовпчики маточок спостерігали за методикою Алексєєвої, Паушевої (1988).
Для введення гібридних зародків в культуру in vitro, 6-20-ти денні плоди стерилізували у 96%-ному спиртi 1 хв. та в 5%-ному розчині хлорамiну - 15 хв. Зародки виділяли і дорощували на cередовищі МС (Murashige & Skoog, 1962), яке доповнювали фітогормонами (БАП, ІМК, ІОК, НОК) в різних концентраціях і співвідношеннях.
Для індукції калусоутворення і наступної регенерації рослин із калусу гібридних зародків гречки застосовували середодовище МС доповнене БАП, ІМК, НОК. Ризогенез у одержаних пагонів стимулювали на середовищі МС в присутності НОК та ІМК.
Гібридні рослини вирощували на середовищі МС з домішками НОК та БАП, при 26± 20С та 16-годинному фотоперіоді.
Iстиннiсть гiбридiв, одержаних після схрещування культурного з диким видом татарської гречки, пiдтверджували, застосовуючи метод iзоферментного аналiзу (Глазко, Созинов, 1993).
Цитогенетичний аналіз отриманих гібридів проводили в клітинах кореневої меристеми рослин, культивованих in vitro, за стандартною методикою давлених препаратів (Паушева, 1980). У кожній рослині аналізували не менше 20-30 метафаз. Дослідження препаратів здійснювали на мікроскопі "Amplival" при збільшенні 100х. Мікрофотографування виконували на плівці "Мікрат" 300.
Як вихідний матеріал для одержання стійких до гербіциду фосфінотрицину рослини гречки використовували форми з різною регенераційною здатністю: Гомостилійну та гібриди Айстра х К-17, Зеленоквіткова х К-17 і Гомостилійна х К -17. Експланти (листки, черешки, міжвузля) цих рослин обробляли штамом Agrobacterium tumefaciens pGV3850::pBin19/pBА 3 з bar і npt II генами (Заяц и др, 1994).
Для індукції прямої регенерації рослин експланти культивували на поживному середовищі МС з домішками гормонів (БАП, ІМК, НОК) в різних концентраціях і співвідношеннях.
Як селективні фактори для відбору трансгенних рослин застосовували середовища МС з канаміцином (100мг/л) та фосфінотрици-ном (30мкл/л). Молекулярно - бiологiчний аналіз препаратів ДНК транс-генних рослин здійснювали методом блот-гібридизації (Southern, 1975).
Фенотипічну експресію гену bar у трансгенних рослин гречки першого покоління визначали після обробки листя комерційною концентрацією (3 - 5 мл/л) гербіциду.
Статистичну обробку експериментальних даних проводили за стандартною методикою (Доспехов, 1985).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Подолання першого бар’єру міжвидової несумісності у схрещуваних видів гречки . Оскільки у комбінаціях схрещувань Fagopyrum esculentum x F. tataricum виявлена повна прогамна несумісність (Румянцева и др., 1987), то необхідною умовою одержання міжвидових гібридів було проведення штучного запилення у поєднанні із використанням фізіологічно активної сполуки - хлористого кадмію (Мельничук, 1990).
Аналіз результатів, отриманих у ході польових досліджень, показав, що активне проростання пилку дикого виду і ріст пилкових трубок у стовпчиках маточок культурної гречки відбувалися пiсля 30-хвилинної дії на приймочки 0,1%-ного розчину хлористого кадмiю, що привело до підвищення відсотка утворення зав'язей у всіх комбінаціях схрещувань в порiвняннi з контролем та іншими концентраціями CdCl2 (табл.1).
З'ясували, що після застосування замоченого на 3-5 хв. в 0,1% водному розчині хлористого кадмію пилку відсоток утворення зав'язей був вищим, ніж після струшування його сухим у всіх досліджуваних комбінаціях схрещувань культурної гречки з підвидом татарської - К-17. У комбінації Айстра х К-21 (інший підвид) різниця в утворенні зав'язей, як при сухому, так і при замоченому пилку була незначна.
Таким чином, завдяки використанню 0,1%-ного розчину солей хлористого кадмію нам вдалось підвищити відсоток утворення зав’язей у дослідних комбінаціях схрещувань, в середньому до 55,7%. У порівнянні з результатами отриманими Румянцевою (1987), Тараненко (1988) і Семімі (1991) після застосовування фізіологічно активних речовин: диметилсульфоксиду, хлороміцетину, кінетину чи без них для аналогічних комбінацій схрещувань відсоток зв'язування не перевищував 32,1%.
Таблиця 1. Утворення зав'язей у міжвидових комбінацій схрещувань гречки після застосування водного розчину хлористого кадмію
|
Комбiнацiї мiжвидових схрещувань |
Застосування розчину хлористого кадмію |
Ефективність утворення зав'язей , % ;
концентрації CdCl2 : |
||
|
0,05% |
0,1% |
0,15% |
||
|
Айст.х К-17 |
контроль |
4,9±0,6 |
4,8±0,3 |
3,5±0,3 |
|
Айст.х К-17 |
сух.пилок |
22,3±4,0** |
35,2±3,3** |
|
|
Айст.х К-17 |
замоч.пилок |
41,4±3,9** |
62,4±3,9** |
38,5±5,1** |
|
Айст.х К-21 |
контроль |
5,4±0,8 |
4,4±0,1 |
2,2±0,4 |
|
Айст.х К-21 |
сух.пилок |
26,8±2,6* |
52,0±2,6* |
|
|
Айст.х К-21 |
замоч.пилок |
28,2±4,3** |
57,3±3,1* |
25,3±4,0** |
|
Г.ст.х К-17 |
контроль |
3,9±0,7 |
4,1±0,7 |
2,8±0,1 |
|
Г.ст.х К-17 |
сух.пилок |
10,4±3,4** |
38,0±3,2* |
|
|
Г.ст.х К-17 |
замоч.пилок |
40,6±3,0** |
65,5±3,9** |
34,8±3,1* |
|
Дон.Б.х К-17 |
контроль |
5,2±0,1 |
6,2±0,9 |
3,4±0,2 |
|
Дон.Б.х К-17 |
сух.пилок |
10,9±2,6* |
11,7±2,6* |
|
|
Дон.Б.х К-17 |
замоч.пилок |
38,1±3,9** |
52,8±4,1** |
22,4±3,0* |
|
Зел.х К-17 |
контроль |
5,1±0,3 |
4,8±0,2 |
2,9±0,6 |
|
Зел.х К-17 |
сух.пилок |
11,1±3,5** |
15,9±3,5** |
|
|
Зел.х К-17 |
замоч.пилок |
38,8±2,9* |
57,6±7,3** |
39,9±4,9** |
Примітка:* -різниця достовірна при Р=0,01; ** -при Р=0,001 (по відношенню до контролю); контроль - запилення без застосування CdCl2 ; сух.пилок - нанесення сухого пилку на зволожені водним розчином хлористого кадмію приймочки; замоч.пилок - нанесення замоченого в розчині CdCl2 пилку на зволожені, аналогічним розчином, приймочки маточок.
Айст.- сорт Айстра, Г.ст.- Гомостилійна, Дон.Б. - Донор Білоруський, Зел. - Зеленоквіткова форми, підвиди татарської гречки- К-17 - rotundatum, К-21 - tuberculatum.
Підвищення ефективності віддаленої гібридизації після застосування методу культури тканин. Наступною проблемою при віддаленій гібридизації рослин гречки є невисокий відсоток виживання гібридних зародків. Вони гинуть на середніх і пізніх стадіях ембріогенезу. Часто це є результатом відсутності ендосперму, чи аномального його розвитку, або деградації алейронового шару клітин, що перешкоджає проникненню поживних речовин від ендосперму до зародка (Ohnishi, 1988).
Використання методу культури тканин дозволяє в значній мірі подолати цю ваду, після виділення гібридних зародків та дорощування їх на поживному середовищі з необхідними елементами живлення.
Ми застосували і порівняли два методи для одержання міжвидових гібридів: 1) спосіб дорощування гібридних зародків до зрілих рослин в асептичних умовах; 2) спосіб регенерації рослин із калусних клітин, отриманих із виділених гібридних зародків.
Для багатьох культур відомо, що найбільш суттєвий вплив на процес розвитку рослин із гібридних зародків мають фітогормони : цитокініни (Ammirato, 1983) або ауксини у поєднанні з цитокінінами (Bhansal et al., 1991; Хохлова, Фісенко, 1994).
У зв'язку з відсутністю літературних даних відносно дії фітогормонів на процес формування із гібридних зародків гречки інтактних рослин ми вивчили дію ауксинів та цитокінінів як окремо так і разом і в різних концентраціях.
Після дослідження 84 варіантів поживних середовищ встановили, що формування рослин із гібридних зародків відбувалося на середовищі МС доповненому фітогормонами БАП та ІМК. На інших варіантах зародки не проростали або їх ріст і розвиток був дуже повільним.
Найактивніше проростання зародків на протязі двох тижнів відзначали на поживному середовищі МС з домішками 0,5 мг/л БАП та 0,1 мг/л ІМК для всіх досліджуваних комбінацій схрещувань.
Визначили, що на процес формування рослин із гібридних зародків гречки впливають певні співвідношення в поживному середовищі концентрацій ауксину ( ІМК) та цитокініну (БАП). Подібні результати були одержані після дорощування негібридних зародків гречки (Румянцева и др., 1988).
Встановили, що частота утворення інтактних рослин залежить від віку зародків (табл.2).
Таблиця 2. Залежність частоти утворення рослин від віку зародків
|
№ |
Вік зародків |
Кількість, шт |
Частота утворення |
|
|
п/п |
(дні) |
висаджених зародків |
сформованих рослин |
рослин, % |
|
1 |
6 - 8 |
570 |
14 |
2,5 ±0,6 |
|
2 |
8 - 10 |
567 |
26 |
4,6 ± 0,9 |
|
3 |
10 - 12 |
564 |
94 |
16,7 ± 1,8 |
|
4 |
12 - 14 |
572 |
386 |
67,4 ± 1,4 |
|
5 |
14 - 16 |
571 |
232 |
40,6 ± 1,7 |
|
6 |
16 - 18 |
570 |
124 |
21,8 ± 0,8 |
|
7 |
18 - 20 |
555 |
19 |
3,4 ± 0,5 |
Основна кількість 6 - 10 - денних зародків, які не проросли буріла та засихала чи покривалась калусною тканиною. Найбiльш життєздатними в асептичних умовах виявились гібридні зародки, видiленi на 12 - 14-тий та 14-16-тий день пiсля запилення для всіх досліджуваних комбінацій схрещувань. Частота утворення рослин становила 67,4 % та 40,6% відповідно. 16-20-денні зародки проростали, утворюючи сильно редукований потовщений гіпокотиль і великі сім'ядольні листки, на яких утворювався калус.
Отже, визначили оптимальний склад поживного середовища та вік зародків необхідні для ефективного їх дорощування в умовах in vitro.
За допомогою даного методу було одержано 618 рослин, що становить 50,4% від кількості висаджених зародків.
Нами вперше розроблена методика ефективної регенерації рослин гречки з калусу, отриманого із гібридних зародків. Встановлено, що оптимальним для одержання тотипотентного калусу є середовище МС з домішками фітогормонів БАП, ІМК, НОК. Воно виявилось ефективним для всіх досліджуваних комбінацій схрещувань.
У гібридних зародків на даному середовищі відзначали формування морфогенного калусу. Регенерація рослин (4-6 пасаж) із цього калусу проходила шляхом органогенезу з утворенням бруньок, а потім пагонів, які зберігали зв'язок з судинними тканинами калусу. Визначили, що для подальшого дорощування одержаних пагонів необхідною умовою є їх перенесення на середовище МС з домішками НОК і ІМК, для індукції ризогенезу.
Вивчали регенераційну здатність морфогенного калусу, одержаного із гібридних зародків (табл.3).
Таблиця 3. Регенерація рослин із морфогенного калусу,
отриманого з гібридних зародків гречки
|
Комбінації схрещувань |
Кількість зародків |
Частота регенерації, % |
Кількість регенерантів |
Коефіцієнт регенерації |
|
|
висад-жених |
з морф.* калусом |
** |
|||
|
Айст.х К-17 |
50 |
21 |
42,0 ± 0,8 |
98 |
2,0 |
|
Айст.х К-21 |
50 |
12 |
24,0 ± 1,4 |
46 |
0,9 |
|
Г.ст. х К-17 |
50 |
44 |
88,0 ± 1,9 |
114 |
2,3 |
|
Дон.Б.хК-17 |
50 |
9 |
18,0 ± 0,4 |
51 |
1,0 |
|
Зел. х К-17 |
50 |
16 |
32,0 ± 0,7 |
97 |
1,9 |
Примітка: * - морфогенним, ** - відношення кількості отриманих рослин-регенерантів до числа висаджених зародків.
Відмічено залежність частоти та коефіцієнта регенерації від генотипу. Так у комбінаціях Гомостилійна х К-17, Айстра х К-17 і Зеленоквіткова х К-17, як частота регенерації (88%; 42%; 32%) так і коефіцієнт були високими (2,3; 2,0; 1,9; відповідно), у порівнянні з комбінаціями схрещувань - Айстра х К-21, Донор Білоруський х К-17 (табл.3).
За допомогою даного методу було одержано 406 рослин - регенерантів. Порівнюючи ці дані з результатами, які ми мали при дорощуванні гібридних зародків, можна прийти до висновку, що вони достовірно відрізняються. У перерахунку на кожен висаджений зародок при калусогенезі зародка і регенерації рослин із двох зародків одержали - 2- 3 рослини, а при дорощуванні - із двох - одну.
Отже, кількість рослин-регенерантів через калусну культуру в два рази перевищує кількість рослин, одержаних при дорощуванні гібридних зародків.
Аналіз гібридних рослин гречки. Підтвердження істинності міжвидових гібридів гречки проводили за допомогою методу ізоферментного аналізу. Досліджували активність 13 ферментiв: НАД-залежної малатдегiдрогенази, НАДФ - залежної малатдегiдрогенази, НАД*Н дегiдрогенази, глутаматдегiдрогенази, алкогольдегiдрогенази, сукцинатдегiдрогенази, 6-фосфоглюконатдегiдрогенази, цитратдегiдро-генази, кислої фосфатази, лужної фосфатази, дiафорази, фумарази, естерази в листках і черешках батьківських форм та гібридних рослин гречки, що вирощувались in vitro. Встановили, що активними в момент дослідження були - НАД - залежна малатдегідрогеназа, 6-фосфоглюко-натдегідрогеназа, алкогольдегідрогеназа.
Відзначили, що ізоферментні спектри алкогольдегідрогенази та 6-фосфоглюконатдегідрогенази в тканинах батьківських форм містять ізоформи цих ферментів які відрізняються за електрофоретичною рухо-містю. У татарської гречки F - форма ферменту більш рухома, культур-ної - S - менш рухома. Гібридні рослини об'єднують в собі ці батьківські видоспецифічні форми (FS), що підтверджує їх гібридну природу (мал. 1).
Мал. 1. Електрофоретичні спектри алкогольдегідрогенази у тканинах батьківських видів (культурна гречка-сорт Айстра, татарська - К-17), та їх міжвидових гібридів (1,2,3).
Отже, ці ферменти можуть слугувати маркерними для відбору справжніх гібридних рослин гречки.
Всi одержані 1014 рослин разом з батькiвськими формами були проаналiзованi по даним iзоферментам та виявлені із них 167 істинних.
Проведено цитогенетичний аналіз 167 справжніх гібридних рослин гречки. Із 57 рослин, отриманих методом дорощування зародків, 43 мали диплоїдний набір хромосом (2n=16), а у 14 було виявлено анеуплоїдний набір (у більшості випадків 16±1 ізохромосома).
Із калусних тканин зародків одержано 110 гібридних рослин -регенерантів, серед яких 12 були диплоїдними, 62 - тетраплоїдними, 23 - анеуплоїдними і 13 міксоплоїдними по числу хромосом.
Частота хромосомних аберацій в клітинах меристеми кореня диплоїдних рослин не перевищувала 1,5%, а в клітинах тетраплоїдних рослин-регенерантів знаходилась на рівні 2%. Аномалії мітозу були представлені у вигляді відсталих хромосом, мостів та фрагментів. Виявлені асиметричні і трьохполюсні мітози.
Одержання амфідиплоїдних гібридних рослин гречки із тетраплоїдним набором хромосом є подоланням ще одного бар'єру між-видової несумісності - стерильності гібридів першого покоління. Поліплоїдизація клітин можливо була результатом дії умов культивування та гормонального складу поживного середовища на калусні культури, отримані із гібридних зародків. Оскільки рослинні клітини здатні до тотипотентності, то одержані із них рослини-регенеранти мали тетраплоїдний набір хромосом.
Таким чином, підсумовуючи, слід зазначити, що нами запропонована схема поетапного подолання бар'єрів міжвидової несумісності у гречки яка є ефективним засобом одержання міжвидових гібридів.
СХЕМА ОДЕРЖАННЯ МІЖВИДОВИХ ГІБРИДІВ ГРЕЧКИ
|
Штучне запилення з використанням розчину CdCl2 для подолання прогамної несумісності (Перший бар’єр) |
Виділення і культивування зародків in vitro
(Другий бар'єр - аномальний розвиток зародків)
Пряме дорощування
зародків (амфігаплоїди)
|
Калусогенез і регенерація амфідиплоїдних рослин (Третій бар' єр - стерильність - гібридів F1 ) |
Інтактна рослина
|
Відбір гібридних рослин методом ізоферментного аналізу алкогольдегідрогенази і 6-фосфоглюконатдегідрогенази |
|
Гібридні рослини |
Одержання трансгенних рослин гречки та їх аналіз .
Розроблений метод одержання стійких до гербіциду фосфінотрицину рослин гречки. Стимуляція прямої регенерації рослин із експлантів залежала від часу їх обробки (оптимальний 2 години) штамом Agrobacterium tumefaciens pGV3850::pBin19/pBА3 з bar і npt II генами, складу середовища та умов культивування.
Найвищу (14%) частоту пагоноутворення відзначали на середовищі МС з домішками 3 мг/л БАП і 0,1 мг/л ІМК. Оптимальними умовами, після кокультивації експлантів із штамом агробактерії, було вирощування їх в темновому термостаті при температурі 27 0С, а з появою регенерантів - на світлі при 25±2 0С.
Відбір трансгенних рослин проводили на середовищі з домішками 100 мг/л канаміцину. Стійкі до канаміцину пагони, які були зеленими переносили на середовище з домішками фосфінотрицину в концентрації 30 мкл/л. Відмітили, що контрольні рослини гинули уже при концентрації гербіциду 3 мкл/л, а трансгенні - при 30 мкл/л укорінювались і росли.
Проведений молекулярно - бiологiчний аналіз регенерантів, показав, що трансгенні рослини дали позитивну авторадіографічну відповідь при блот-гібридизації з міченим зондом, який несе bar ген, що свідчить про інтеграцію даного гену в геном дослідних рослин (мал2.).
Мал.2 а) Рестрикційна карта плазміди pBA 3; б) авторадіограф блот-гібридизації за Саузерном ДНК рослин гречки; 1 - позитивний контроль (Hind III - фрагмент плазміди pBA 3 з геном bar); 2 - 6 - ДНК рослин, гідролізованих рестриктазою Hind III, які дали позитивну авторадіографічну відповідь; 7 - негативний контроль (ДНК нетрансгенної рослини гречки)
Фенотипічну експресію гену визначили у трансгенних рослин гречки першого покоління після обробки їх листя комерційною концентрацією (3-5 мл/л) гербіциду. Відзначили, що в контрольних рослин листя скручувалось і опадало, а у трансгенних залишалось зеленим.
Отже, розроблений нами метод трансформації дозволив одержати трансгенні рослини гречки стійкі до гербіциду фосфінотрицину.
ВИСНОВКИ
1.Вперше розроблений метод поетапного подолання бар'єрів міжвидової несумісності у гречки, який дозволяє отримувати гібридні рослини.
2. Одержано високий відсоток (52-65%) утворення зав'язей у досліджуваних комбінаціях схрещувань шляхом добору оптимальної концентрації (0,1%) хлористого кадмію.
3.Підібрані умови культивування, оптимальний склад поживного середовища та вік виділення зародків для ефективного їх дорощування в умовах in vitro.
4.Визначені стадії розвитку гібридного зародка та склад поживного середовища для одержання морфогенного калусу і оптимальної регенерації із нього рослин.
5. Встановлено, що ферменти алкогольдегідрогеназа і 6-фосфоглюконат-дегідрогеназа можуть слугувати маркерними для відбору істинних гі- бридних рослин гречки.
6.Хромосомний аналіз гібридних рослин показав, що 74% рослин, отриманих при дорощуванні зародків були амфігаплоїдними, тоді як гібриди, одержані через калусну культуру, були в більшості (57%) амфідиплоїдними.
7.Розроблена методика трансформації рослин гречки, шляхом прямої регенерації із експлантів, яка дозволяє отримувати трансгенні рослини.
8.Наявність bar гену в геномі трансгенних рослин підтверджена методом блот - гібридизації.
9.Рівень фенотипічної експресії bar гену у рослин дозволив їм витримати обробку комерційною концентрацією гербіциду. Аналогічна обробка контрольних рослин приводила до їх дефоліації.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ОСНОВНИХ ПРАЦЬ
1. Рубцова М.А., Левенко Б.А., Тараненко Л.К., Шаповал А.И. Получение межвидовых гибридов между гречихой обыкновенной и гречихой татарской с помощью эмбриокультуры. // Физиология и биохимия культурных растений. - 1994. - T 26, N6. - С. 563-566.
2. Rubtsova M.A., Levenko B.A., Тaranenko L.K., StekhinI.N., Zayats A. Introduction of herbicide bialaphos resistance into buckwheat рlants. //Биополимеры и клетка.- 1997.- Т.13, N5.- С.416-418.
3. Тараненко Л.К.,Рубцова М.А.,Шаповал А.И,Яцишин О.Л. Получение межвидовых гибридов между Fagopyrum esculentum и Fagopyrum tataricum с помощью ембриокультуры. / / Селекция и технология возделывания полевых культур. - Черновцы: Прут.- 1994.- С. 113-118.
4. Левенко Б.А., Марьюшкин В.Ф., Рубцова М.А., Стехин И.Н. Трансгенные растения устойчивые к гербицидам. - Материалы Междунар. конф. "Молекулярная генетика и биотехнология". - Минск: Беларусь. - 1998. - С. 217-219.
5. Пат.98074048, Україна кл.МКИ6 А 01 Р 1/06. Спосіб одержання амфідиплоїдних фертильних міжвидових гібридів гречки/ Рубцова М.О., Левенко Б.О., Тараненко Л.К. (Україна); Заявл.3.07.98; Опубл.
6. Рубцова М.А., Левенко Б.А., Тараненко Л.К., Шаповал А.И. Преодоление межвидовой несовместимости у гречихи. // Тез. докл. ІІ Междунар. конф."Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда". -Москва (Россия).- 1997. - С.157.
7. Rubtsova M.A., Levenko B.A., Taranenko L.K. Fertile interspecific amphidiploid hybrids of buckwheat. // Abstr. of the II Int. Symp. on Plant Biotechnology . - Kyiv (Ukraine). - 1998. - P.109.
Рубцова М.О. Одержання міжвидових гібридів і трансгенних рослин гречки та їх аналіз. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15-генетика. - Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, Київ, 1998.
Дисертацію присвячено розробці методів отримання міжвидових гібридів і трансгенних рослини гречки. Оптимізовані умови дорощування гібридних зародків і регенерації рослин із калусної тканини. Визначені маркерні ферменти для відбору істинних гібридних рослин гречки. Показано, що одержані методом регенерації із калусу гібридних зародків рослини, є в більшості випадків амфідиплоїдами. Розроблена методика трансформації гречки шляхом прямої регенерації із експлантів. Одержані міжвидові гібриди і трансгенні рослини гречки з господарсько - цінними ознаками.
Ключові слова : гречка, міжвидові гібриди, калусні культури, амфідиплоїди , трансгенні рослини.
Рубцова М.А. Получение межвидовых гибридов и трансгенных растений гречихи и их анализ. - Рукопись.
Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15- 0 генетика. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1998.
Диссертация посвящена разработке методов получения межвидовых гибридов и трансгенных растений гречихи. Оптимизированы условия доращиванния гибридных зародышей и регенерации растений из каллусной ткани. Определены маркерные ферменты для отбора истинных гибридных растений гречихи. Показано, что полученные методом регенерации из каллуса гибридных зародышей растения, являются в большинстве случаев амфидиплоидами. Разработана методика трансформации гречихи путем прямой регенерации из эксплантов. Получены межвидовые гибриды и трансгенные растения гречихи с хозяйственно - ценными признаками.
Ключевые слова : гречиха, межвидовые гибриды, каллусные культуры, амфидиплоиды, трансгенные растения.
Rubtsova M.A. Obtaining the interspecific hybrids and transgenic buckwheat plants and their analysis. - Manuscript.
Thesis for Ph.D. degree (Biology) by speciality 03.00.15. - genetics. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.
The thesis is devoted to the development of the methods of obtaining interspecific hybrids and transgenic buckwheat plants. The conditions of hybrid embryos growth and plant regeneration from their callus tissue have been optimized. The marker enzymes for the selection of true hybrids of buckwheat have been determined. Plants regenerated from callus tissues developed from hybrid embryos were mainly amphidiploids. The method of genetic transformation of buckwheat plants by direct regeneration from primary explants was worked out. The interspecific hybrids and transgenic buckwheat plants with agriculturally valuable characters have been obtained.
Key words : buckwheat, interspecific hybrids , callus tissues, amphidiploid, transgenic plants.