Это связано прежде всего с необходимостью поддержания координированной экспрессии эукариотических генов
Работа добавлена на сайт samzan.net:
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА УРОВНЕ ТРАНСКРИПЦИИ У ЭУКАРИОТ
Несмотря на то что основные принципы регуляции транскрипции генов у прокариотических и эукариотических организмов остаются неизменными (через специфические взаимодействия белков и нуклеиновых кислот друг с другом, а также между собой) данный процесс у эукариот характеризуется рядом существенных особенностей. Это связано, прежде всего, с необходимостью поддержания координированной экспрессии эукариотических генов в более сложно организованной генетической системе. Достаточно вспомнить, что в организме человека гистологически различают, по крайней мере, 100 типов клеток, формирующих его органы и ткани. Для любого типа клеток характерен свой уникальный набор экспрессирующихся генов, которые начинают функционировать во время дифференцировки клеток-предшественников. Кроме того, сам процесс формирования органов и тканей сопровождается пролиферацией строго определенных групп клеток, а также упорядоченным во времени и пространстве перемещением клеток. Все эти особенности жизнедеятельности клеток высших организмов обеспечиваются функционированием их генов.
Гены высших организмов подразделяют по функциональному признаку на две большие группы:
- "гены домашнего хозяйства", к которым относятся гены, функционирующие повсеместно, на всех стадиях жизненного цикла организма. Они обеспечивают процесс гликолиза, биосинтез аминокислот и нуклеотидов, катаболизм белков и т.п.
- "гены роскоши", экспрессирующиеся лишь в специализированных клетках и являются маркерами дифференцированных состояний этих клеток.
Особенности экспрессии эукариотических генов
Сложность жизненного цикла многоклеточных организмов накладывает свои требования на особенности функционирования их генов.
1. Большое число генов и даже целые блоки их функционируют лишь на определенных стадиях эмбриогенеза и не транскрибируются в клетках взрослого организма.
Например, у человека к ним относятся гены α-фетопротеина. Экспрессия этих генов в клетках взрослого организма свидетельствует о развитии патологического процесса, в частности злокачественных новообразований в печени.
2. Тканеспецифический характер экспрессии "генов роскоши" обеспечивается различными механизмами. В этом случае ключевую роль играют специфические взаимодействия белковых факторов транскрипции с регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот. Транскрипцию генов высших организмов осуществляют, по крайней мере, три различные РНК-полимеразы. При этом для промоторов каждой из них характерны специфические регуляторные последовательности нуклеотидов, с которыми взаимодействуют свои факторы транскрипции, изменяющие уровень транскрипции соответствующих генов.
3. В свою очередь, сами эукариотические факторы транскрипции реализуют новый, известный (в таком масштабе) только у эукариот механизм регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции так называемого комбинаторного типа.
Молекулы факторов транскрипции обладают консервативными доменами, которые дают им возможность осуществлять высокоспецифические белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия. В результате, in vivo происходит объединение факторов транскрипции и других регуляторных белков, обладающих соответствующими доменами, в разных сочетаниях в большие регуляторные комплексы. Каждое новое сочетание факторов, число которых хотя и велико, но ограничено, придает комплексу уникальные регуляторные свойства, обеспечивая изменение специфичности его взаимодействия с регуляторными последовательностями ДНК и другими регуляторными белками аппарата транскрипции. В результате реализации такого механизма достигается беспрецедентная гибкость в модуляции уровней транскрипции эукариотических генов и соответственно в контроле экспрессии фенотипических признаков клетки и организма.
4. Не менее уникальна способность эукариот использовать для регуляции транскрипции своих генов изменения структуры хроматина. С помощью таких эффективных механизмов осуществляются репрессия и дерепрессия генов во время дифференцировки клеток, и соответствующее функциональное состояние отдельных генов, их больших массивов и даже целых хромосом может поддерживаться на протяжении всей жизни организма. Перестройки хроматина в окрестностях регуляторных участков генов происходят и в связи с более тонкой регуляцией их транскрипции.
5. Несмотря на то что изменение уровней транскрипции генов является одним из важнейших способов регуляции их экспрессии, такая стратегия - лишь одна из многих, используемых эукариотическими организмами для контроля биосинтеза, содержания и функционирования соответствующих продуктов генов: белков или нуклеиновых кислот. В процессе синтеза и после его завершения первичный транскрипт подвергается многочисленным посттранскрипционным модификациям и процессингу. Таким образом, генетической информации, заключенной в конкретном гене, недостаточно для полноценной экспрессии, и чтобы ген правильно функционировал, требуется координированная работа дополнительных генов.
6. Многие из модифицирующих генов активны не вблизи регулируемых генов, а в других тканях, удаленных от клеток-мишеней. Для осуществления такой передачи регуляторных сигналов на большие расстояния в организме присутствуют специальные системы, осуществляющие генерацию сигналов, перенос их к клеткам-мишеням, а также специфическое распознавание сигналов клетками, которым они адресованы.
МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ
При исследовании механизмов регуляции экспрессии генов у животных обнаружены регуляторные белки, которые взаимодействуют со специфическими последовательностями нуклеотидов генов, получившие название факторов транскрипции. Больше тысячи этих белков разных организмов уже идентифицированы, а общее их число, по некоторым оценкам, составляет не менее нескольких тысяч.
Для того чтобы фактор транскрипции оказал специфическое действие на синтез РНК определенным геном, он прежде всего должен распознать этот ген и связаться с определенной последовательностью ДНК. Затем фактор транскрипции должен взаимодействовать с другими факторами или непосредственно с самой РНК-полимеразой для стимуляции или подавления транскрипции на этом гене. Кроме того, необходимость включения и выключения транскрипции в строго определенных месте и времени (тканеспецифическии характер экспрессии генов на разных стадиях онтогенеза организма) предполагает наличие механизмов контроля биосинтеза или активации самих факторов транскрипции для упорядочивания их функционирования.
Позитивная регуляция синтеза РНК.
Изучение механизмов функционирования белковых факторов транскрипции - задача непростая. Прежде всего, это связано с их малой концентрацией в клетках и большими сложностями получения факторов в очищенном состоянии для дальнейших биохимических исследований. Развитие генно-инженерных методов позволило получать факторы транскрипции в неограниченных количествах, что не замедлило принести плоды в виде новой информации.
Все известные факторы транскрипции на основании гомологии первичных структур их полипептидных цепей разделяют на четыре больших суперкласса
1) факторы с доменами, обогащенными основными аминокислотами (типа "лейциновая застежка").
В этой структуре остатки лейцина (Leu), находящиеся в составе α-спирального участка полипептидных цепей факторов, расположены через каждые шесть аминокислотных остатков на равном расстоянии друг от друга и оказываются на одной стороне α-спирали через каждые два витка (рис. 8.3,б). Такие домены сами по себе не связываются с ДНК, однако обеспечивают димеризацию содержащих их факторов путем взаимопроникновения лейциновых α-спиралей двух молекул факторов. В результате в димере появляются две правильно расположенные друг относительно друга полипептидные цепи, составленные преимущественно из основных аминокислотных остатков, которые и образуют ДНК-связывающий центр фактора транскрипции.
2) факторы с ДНК-связывающими доменами, координирующими ионы Zn2+. ("цинковые пальцы")
Одним из первых факторов транскрипции, полученных в виде очищенного рекомбинантного белка, был фактор ТFIIIА, который играет ключевую роль в транскрипции генов 5S рРНК РНК-полимеразой Ш. ДНК-связывающий участок полипептидной цепи этого фактора содержит девять 30-звенных повторов: Tyr/Phe-Xaa-Cys-Xaa-Cys-Xaa2,4-Cys-Xaa3-Phe-Xaa5-Leu-Xaa2-His-Хаа3,4-His-Xaa5, где Хаа - остаток любой аминокислоты. Таким образом, каждый из повторов содержит две строго консервативные пары остатков цистедина (Cys) и гистедина (His), которые взаимодействуют с одним ионом цинка. Это приводит к образованию в свернутой полипептидной цепи пространственной структуры, выступающей над поверхностью белковой глобулы в виде "пальца" (рис. 8.2,а). Вершины пальцев непосредственно контактируют с большой бороздкой ДНК, причем соседние пальцеобразные структуры связываются противоположными сторонами спирали ДНК (рис. 8.2,б).
Домены типа "цинковые пальцы" обнаружены у многих факторов транскрипции, обеспечивающих функционирование РНК-полимеразы II. Интересно, что точковая мутация в гене Kruppel-белка, приводящая к замене лишь одного из остатков Cys на Ser, что, в свою очередь, предотвращает связывание иона Zn2+, фенотипически проявляется как делеция целого гена этого фактора. На данном основании был сделан вывод о том, что способность связывать ионы Zn2+ является критической для проявления ДНК-связывающей активности факторов такого типа.
3) факторы, содержащие домены типа "спираль-поворот-спираль"
Такой тип пептидных доменов, специфически распознающих регуляторные последовательности на ДНК, характерен для белковых продуктов гомеотических (гомеозисных) генов, впервые обнаруженных у дрозофилы. Гомеотические гены позвоночных и растений играют ключевую роль в их морфогенезе. Полипептидные цепи белков, кодируемых этими генами, содержат высококонсервативную последовательность длиной в 60 аминокислотных остатков, называемую гомеодоменом, которая определяет специфичность взаимодействия белков с регуляторными последовательностями ДНК. Анализ третичной структуры гомеодоменов показал, что они образуют структуру типа "спираль-поворот-спираль", в которой за α-спиральным участком следует β-структура с последующим еще одним α-спиральным участком (рис. 8.3,a).
Для бактериальных белков-репрессоров было показано, что при образовании специфических комплексов с ДНК первый α-спиральный участок расположен перпендикулярно большой бороздке ДНК, тогда как второй частично находится в ней и обеспечивает специфические контакты репрессора с операторным участком ДНК.
4) факторы, содержащие домены типа p-scaffold, образующие контакты с малой бороздкой ДНК.
Факторы, не попадающих по своим структурным особенностям ни в один из вышеперечисленных суперклассов, отнесены к суперклассу 0. Такое разнообразие регуляторных белков у эукариот обусловлено наличием у них большого количества генов и необходимостью тонкой регуляции их экспрессии на протяжении жизненного цикла.
Таковы особенности структуры некоторых наиболее хорошо изученных доменов факторов транскрипции, обеспечивающих специфичность взаимодействия последних с регуляторными последовательностями ДНК, что необходимо для их регуляторного воздействия на транскрипцию соответствующих генов. Количество известных доменов у факторов транскрипции быстро возрастает с развитием исследований в этой области. В белках существует несколько структур, обеспечивающих специфическое распознавание определенных последовательностей ДНК, что позволяет осуществлять передачу регуляторных сигналов к определенным генам-мишеням и служит основой для обеспечения их дифференциальной экспрессии на уровне транскрипции.
Несмотря на то что специфическое связывание с ДНК является обязательным этапом для регуляторного воздействия белковых факторов на транскрипцию, реализация активности факторов часто требует их специфического взаимодействия с другими регуляторными белками, а также с самой РНК-полимеразой II. Большинство таких воздействий приводит к активации транскрипции. Однако результатом некоторых из них может быть и репрессия синтеза мРНК.
Негативная регуляция синтеза РНК.
Позитивный контроль транскрипции у эукариот, в котором участвуют многочисленные активаторы транскрипции, играет ключевую роль в регуляции экспрессии их генов на уровне транскрипции. Однако негативная регуляция активности генов у эукариот является столь же жизненно важным регуляторным механизмом, как и у бактерий. Подавление транскрипции необходимо при установлении разделенных во времени и пространстве паттернов транскрипции в клетках различных тканей в онтогенезе, а также при изменении уровней синтеза РНК в ответ на регуляторные изменения в микроокружении клеток. Механизмы негативной регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот разнообразны.
Задержка транспорта факторов транскрипции из цитоплазмы в ядра. Подавление определенных генов может достигаться за счет задержки в цитоплазме соответствующих факторов транскрипции.
В хорошо изученном случае белки-активаторы семейства Rel задерживаются в цитоплазме и не переносятся в ядра вследствие их взаимодействия с белковыми факторами IxB. Все IxB-белки содержат один и тот же участок, гомологичный структурному белку анкирину и необходимый для их взаимодействия с Rel-белками. В результате такого контакта маскируется сигнальная последовательность Rel-белков, которая важна для их транспорта в ядра и активации транскрипции соответствующих генов. Диссоциация комплексов Rel-IxB, сопровождаемая транспортом Rel-факторов в ядра.
Активация факторов транскрипции из пула неактивных цитоплазматических комплексов обеспечивает быструю индукцию транскрипции в ответ на внешние регуляторные сигналы. Более того, эта регуляторная система предусматривает в случае необходимости и инактивацию Rel-факторов в ответ на соответствующие сигналы через изменение уровня фосфорилирования IxB-белков. Поскольку имеется целое семейство IxB-белков, обладающих разной специфичностью в отношении Rel-факторов, и различные белки семейства реагируют на разные внешние сигналы, такая система негативной регуляции является очень гибкой.
Предотвращение взаимодействия факторов транскрипции с регуляторными последовательностями на ДНК. Внутриядерное предотвращение связывания активаторов транскрипции с соответствующими регуляторными последовательностями на ДНК является еще одним широко распространенным механизмом негативной регуляции транскрипции у эукариот. В некоторых случаях негативно действующий фактор связывается с регуляторной последовательностью нуклеотидов, которая располагается по соседству с позитивным регуляторным элементом или перекрывается с ним. Это создает стерические препятствия для связывания последним активатора транскрипции, что предотвращает индукцию синтеза РНК. Функционирование такого в основном пассивного механизма зависит от взаимного расположения негативных и позитивных регуляторных последовательностей в промоторе. В данном случае для проявления активности негативного регулятора транскрипции необходимо его связывание с соответствующей последовательностью ДНК, и его действие не распространяется на другие регуляторные последовательности.
Образование гетеродимеров между субъединицами активаторов транскрипции. Многие факторы транскрипции взаимодействуют с ДНК в виде димеров. В димеризации участвуют специализированные домены этих белков, такие как "лейциновая застежка" или мотив "спираль-поворот-спираль". Имеется определенная неразборчивость в образовании гетеродимеров внутри родственных семейств факторов транскрипции.
Регуляторный белок Id у млекопитающих и его гомолог у дрозофилы являются антагонистами активаторов транскрипции, обладающих доменами типа "спираль-поворот-спираль". Эти белки взаимодействуют с факторами транскрипции, однако сами не имеют ДНК-связывающих доменов и, следовательно, подавляют активность своих партнеров по димеризации.
Подобные регуляторные воздействия играют важную роль в онтогенезе данных организмов. В случае других негативно действующих факторов образующийся димер взаимодействует с регуляторными последовательностями промоторов. Однако он утрачивает способность реагировать на внешние активирующие сигналы. В рассмотренном примере действие негативного белка-регулятора не ограничивается пассивной конкуренцией с активатором транскрипции за место посадки на ДНК, но способствует переводу белка-активатора в неактивную форму в виде гетеродимерного комплекса.
Многие негативно действующие факторы транскрипции являются продуктами генов, которые одновременно кодируют и активаторы транскрипции. Такие факторы-репрессоры синтезируются в результате альтернативного сплайсинга предшественника их мРНК или при альтернативном использовании инициирующих кодонов во время трансляции. Образование позитивно или негативно действующего фактора транскрипции во время экспрессии одного и того же гена регулируется в онтогенезе, в процессе дифференцировки тканей или в ответ на определенные внешние сигналы в конкретной группе клеток.
Генетический контроль активности факторов транскрипции
Первичная роль многих факторов транскрипции заключается в активации некоторых групп генов в определенных тканях в ответ на поступление специфических сигналов. Для достижения данной цели конкретные факторы транскрипции должны быть активны только в строго детерминированных тканях или в ответ на появление соответствующего сигнала. Включение фактора транскрипции в каскад этих реакций может быть достигнуто двумя путями:
- тканеспецифическим синтезом соответствующего белка или
- регулируемой активацией белка-предшественника в определенном месте и в заданное время (рис. 9.1).
Регуляция на уровне биосинтеза факторов транскрипции. Для многих регуляторных белков биосинтез ограничен клетками строго определенных типов.
Например, октамерсвязывающий белок Oct-2, участвующий в активации экспрессии генов иммуноглобулинов в В-лимфоцитах, обнаруживают только в клетках, синтезирующих иммуноглобулины, но не в других клетках. Экспрессия рекомбинантного гена, кодирующего Oct-2, приводит к активации экспрессии генов иммуноглобулинов на уровне транскрипции. Таким образом, для осуществления тканеспецифической регуляции экспрессии генов в этом примере необходим тканеспецифический синтез белка-активатора транскрипции (рис. 9.1,а).
Во многих случаях регулируемая экспрессия генов факторов транскрипции достигается путем соответствующего управления транскрипцией генов этих факторов. Очевидно, что такой способ контроля транскрипции у эукариот не решает полностью проблему регуляции экспрессии генов, поскольку предполагает необходимость наличия регуляторных генов, влияющих на транскрипцию генов факторов транскрипции, регулируемая экспрессия которых, в свою очередь, требует новых факторов, и так далее до бесконечности. В этой связи не является неожиданным, что регуляция экспрессии генов многих факторов транскрипции происходит на посттранскрипционном уровне.
Например, возрастание уровня биосинтеза дрожжевого фактора GCN4, активирующего гены биосинтеза аминокислот, является следствием ускорения трансляции его мРНК рибосомами в ответ на недостаток внутриклеточного содержания аминокислот.
Регуляция экспрессии генов факторов транскрипции может происходить и на уровне сплайсинга соответствующих РНК. В частности, существуют две формы рецептора тиреоидных гормонов, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга У одной из них отсутствует домен, связывающий гормон, и она способна распознавать те же последовательности ДНК, что и гормонсвязывающии рецептор однако не может активировать транскрипцию в присутствии гормона. Таким образом эта форма действует как доминантный репрессор соответствующих генов.
Регуляция активности факторов транскрипции. Белковый продукты генов многих специфически действующих факторов транскрипции часто присутствуют но всех тканях, однако специфический характер их воздействия достигается путем их посттрансляционной активации в строго определенном месте или же и ответ на соответствующий сигнал.
Простым примером такого рода является активация дрожжевого фактора транскрипции АСЕ1, который стимулирует транскрипцию гена металлотионеина в присутствии ионов меди. В этом случае ионы Сu2+, взаимодействуя с фактором, вызывают конформационные изменения в его полипептидной цепи, после чего фактор приобретает способность связываться с регуляторным участком гена металлотионеина и активировать его транскрипцию (рис. 9.1,б).
Активация факторов транскрипции может происходить путем лигандзависимого разрушения ингибирующего белок-белкового взаимодействия. Такую зависимость от активирующего лиганда демонстрируют молекулы факторов транскрипции, принадлежащие к семейству рецепторов стероидных/тиреоидных гормонов. Молекулы таких рецепторов для осуществления активирующего действия на гены-мишени должны вначале специфически связать определенное количества соответствующего гормона-эффектора. Эти рецепторы обладают специальным С-концевым доменом, выполняющим данную функцию. В клетках рецепторы находятся в комплексе с белком, предотвращающим их связывание соответствующими регуляторными последовательностями ДНК и гормоны после взаимодействия с рецепторами в этих комплексах вызывают диссоциацию последних (рис. 9.1,в).
Активация факторов транскрипции может осуществляться не только путем изменения белок-белковых взаимодействий, но и под действием ковалентных модификаций самих факторов в ответ на появление специфических сигналов (рис. 9.1,г).
Примером может служить механизм активации фактора транскрипции CREB, который обеспечивает активацию некоторых клеточных генов в ответ на воздействие циклическим АМР. В этом случае сАМР стимулирует протеинкиназу А, которая, в свою очередь, фосфорилирует CREB, что сопровождается активацией домена, расположенного в полипептидной цепи фактора по соседству с сайтом фосфорилирования.
Регуляторные области ДНК
Энхансеры. Энхансерами называют определенный класс регуляторных последовательностей нуклеотидов, которые обладают рядом существенных особенностей, резко отличающих их от других регуляторных последовательностей эукариот, регулирующих транскрипцию. Энхансеры представляют собой протяженные последовательности нуклеотидов, которые содержат сайты связывания нескольких факторов транскрипции. Характерными свойствами энхансера являются
- способность осуществлять регуляторное действие на промотор на больших расстояниях от него, достигающих 60 т.п.о. и более,
- независимость его активности от ориентации по отношению к промоторам,
- а также от расположения относительно регулируемого гена.
На рис. 9.2 приведены схемы строения нескольких эукариотических генов, которые отражают взаимное расположение их структурных и регуляторных частей. Если у гена альбумина (рис. 9.2,а) энхансер находится перед промотором, а вся регуляторная часть предшествует его структурной части, то в случае генов иммуноглобулинов регуляторные элементы локализованы в интронах самого гена (рис. 9.2,б). Энхансер может быть расположен и ниже гена на значительном от него расстоянии, как это имеет место у β-глобинового гена (рис. 9.2,в).
Анализируя компоненты энхансеров непосредственно-ранних генов ВПГ (вируса простого герпеса), можно сделать вывод, что в их активации принимают участие не менее пяти белков (VP16, Oct-1, HCF, GABPa и GABPp), которые участвуют, как минимум, в пяти белок-белковых контактах и шести специфических контактах белок-ДНК (рис. 9.3). Прежде всего, обращает на себя внимание кооперативность взаимодействия компонентов, активирующих энхансеры. Ключевые белки этого комплекса - Oct-1, VP-16 и GABPa, сами по себе слабо взаимодействуют со специфическими последовательностями ДНК, но обладают способностью собираться в стабильный функционально активный комплекс, по крайней мере, двумя путями: во-первых, объединяясь с кофакторами, которые самостоятельно не способны взаимодействовать с ДНК (например, VP16 с HCF и GABPacGABPp); во-вторых, контактируя с последовательностью нуклеотидов энхансера, содержащей функциональные участки "tat" и "garal", а также повтор "cigar" и образующей матрицу для геометрически правильной сборки всего активирующего комплекса.
При исследовании механизмов действия многочисленных факторов транскрипции удивляет то, что специфичность взаимодействия с ДНК многих белков этих подсемейств, по крайней мере, определенная in vitro, невысока. В очищенном состоянии факторы часто узнают одни и те же последовательности нуклеотидов. Каким же образом данные белки осуществляют специфические регуляторные воздействия на регулируемые гены? Как уже было видно при обсуждении функционирования энхансеров непосредственно-ранних генов ВПГ, такую специфичность обеспечивают другие, вспомогательные белки, взаимодействующие с основными регуляторными белками. В частности, несмотря на сходство и специфичности распознавания последовательностей нуклеотидов, истинные регулиторные белки обладают большим сродством к последовательностям-мишеням, еще более усиливающимся под влиянием белок-белковых взаимодействий.
Рассмотренный нами пример регуляции экспрессии непосредственно-ранних генов ВПГ хорошо иллюстрирует те многочисленные белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия, которые требуются для функционирования сложной системы дифференциально экспрессирующихся генов высших организмов. Несмотря на то, что с развитием молекулярной генетики число известных регуляторных механизмов будет увеличиваться, именно этот принцип, основанный на возможности специфических взаимодействий макромолекул друг с другом, по-видимому, останется доминирующим в регуляторных механизмах эукариот.
Сайленсеры. Ингибирование транскрипции с использованием особых регуляторных элементов, называемых сайленсерами, является активным процессом. В этом случае происходит прямое подавление инициации транскрипции путем разрушения транскрипционного комплекса на промоторе или посредством его инактивации иным способом.
Первый из описанных в 1986 г. сайленсеров обладал классическими энхансероподобными свойствами, действуя на промоторы, расположенные в цис-положении (на той же молекуле ДНК) на большом расстоянии. При этом активность сайленсера, подобно знхансеру, не зависела от его ориентации по отношению к регулируемому промотору. Активность других сайленсеров в разной степени зависит от положения их по отношению к регулируемому промотору и ориентации относительно него, а также прямо пропорциональна числу их копий. Кроме того, регуляторные белки, связывающиеся с сайленсерами, по аналогии с белками энхансеров, помимо ДНК-связывающих доменов содержат аминокислотные последовательности, обеспечивающие белок-белковые взаимодействия, которые необходимы для осуществления негативной регуляции транскрипции. Исследование структуры этих доменов выявило их большое разнообразие, что позволяет думать о высокой функциональной значимости негативной регуляции транскрипции, обеспечиваемой сайленсерами.
СТРУКТУРА ХРОМАТИНА КАК СПЕЦИФИЧЕСКИЙ РЕГУЛЯТОР ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
Регуляция тканеспецифической экспрессии генов с использованием энхансеров и сайленсеров, а также некоторых других негативных регуляторных процессов часто происходит через изменение структуры хроматина. Изменение структуры хроматина может иметь характер от локального до уровня целых хромосом.
Локальные модификации ДНК. Интронный энхансер гена тяжелой цепи иммуноглобулина содержит много сайтов связывания для различных тканеспецифических, а также других широко распространенных факторов транскрипции. Максимальная активность энхансера наблюдается в зрелых В-лимфоцитах, где ген претерпевает ряд соматических перестроек. Активность этого энхансера обнаруживается и в некоторых нелимфоидных тканях. Однако в печени или фетальных фибробластах, а также в нескольких других тканях его активность полностью подавлена. Такой энхансер фланкирован негативными регуляторными последовательностями нуклеотидов, которые ингибируют его активность в незрелых В-клетках или клетках других типов, но не обладают аналогичными свойствами в зрелых В-лимфоцитах (рис. 9.4,а). Оба этих регуляторных элемента требуются для проявления ингибирующей активности, для которой важно также их положение относительно энхансера. В регуляторных элементах обнаружены сайты связывания транскрипционного фактора NF-μNR, содержание которого особенно велико в клетках, где активность энхансера подавлена. Поскольку фактор NF-μNR способен образовывать тетрамеры, предполагается, что прямое взаимодействие между этими молекулами, ассоциированными с сайтами связывания, фланкирующими энхансер, может приводить к структурной перестройке сегмента ДНК, заключенного между такими сайтами и содержащего энхансер (рис. 9.4,б,в). Кроме того, регуляторные последовательности, связывающие NF-μNR, содержат MAR-сайты, взаимодействующие с ядерным матриксом, и последовательности, с которыми контактирует ДНК-топоизомераза II, что еще раз указывает на необходимость структурных перестроек ДНК в процессе изменения ее регуляторных функций.
В рассматриваемом случае механизм негативной регуляции активности энхансера можно представить в следующем виде. В клетках, где отсутствует фактор транскрипции NF-μNR (зрелые В-лимфоциты), последовательности MAR, которые фланкируют энхансер, ассоциированы с ядерным матриксом, что сопровождается формированием пространственной структуры энхансера, открытой для взаимодействия с активаторами транскрипции (рис. 9.4,б). Это приводит к эффективной транскрипции всего гена иммуноглобулина. В клетках же, где фактор NF-μNR присутствует в больших количествах, фрагмент ДНК с энхансером не ассоциирован с ядерным матриксом, так как MAR-сайты блокированы фактором (рис. 9.4,в). Энхансер приобретает закрытую для позитивных регуляторных факторов конформацию, что сопровождается подавлением транскрипции регулируемого им гена.
Регулирование на уровне генного окружения. Давно известно, что перенос гена или группы генов в гетерохроматиновые (неактивные в отношении транскрипции) участки хромосом часто сопровождается ослаблением или прекращением его экспрессии (так называемый эффект положения), и, наоборот, некоторые гены после переноса сохраняют свою активность и в гетерохроматиновом окружении. Подавление экспрессии таких транслоцированных генов может быть полным при стабильном эффекте положения и варьировать в зависимости от типа соматических клеток, в которых находится хромосома с транслокациями.
Исследование этого явления привело к открытию так называемых пограничных последовательностей нуклеотидов, фланкирующих функционально активные домены хроматина. Оказалось, что существуют определенные последовательности нуклеотидов длиной в несколько сотен пар оснований, которые обладают способностью подавлять позитивное и негативное влияние эухроматина и гетерохроматина на экспрессию трансгенов, интегрированных в этот хроматин и фланкированных указанными последовательностями в новом сайте интеграции. Фактически такие участки ДНК как бы изолируют ген, находящийся между ними, способствуя сохранению его обычной пространственной структуры, которая может отличаться от структуры окружающего хроматина. Эти последовательности известны кроме того под названием инсуляторов, а также как регуляторные области локусов.
К таким пограничным последовательностям относятся, например А-элементы, фланкирующие ген лизоцима цыплят, scs-элементы, окружающие ген hsp70 Drosophila melanogaster, а также последовательности нуклеотидов, разделяющие регуляторные элементы lab комплекса Bithorax того же объекта. Введение одного из таких элементов между энхансером и промотором регулируемого гена приводит к функциональной изоляции энхансера и подавлению экспрессии гена, а фланкирование гена пограничными последовательностями предохраняет его от инактивирующего действия окружающего конденсированного гетерохроматина, т.е. снимает эффект положения. При подавлении активности энхансеров инсуляторами ярко проявляется еще одно их свойство - полярность действия. Инсуляторы однонаправленно выключают энхансеры, расположенные дистально (на значительном расстоянии) по отношению к регулируемому промотору, но не рядом с ним. В дополнение к этим функциональным свойствам инсуляторов показано, что они могут разделять два участка хроматина, резко различающихся по пространственной структуре. В этом случае по одной стороне от пограничной последовательности располагается сильно компактизованный хроматин, ДНК которого недоступна действию нуклеаз, а по другой - хроматин в открытой конформации, характерной для компетентных в отношении транскрипции генов.
Результаты исследований белков указывают на то, что инсуляторы и пограничные последовательности формируют мультибелковые комплексы, регулирующие экспрессию генов через изменение структуры соседнего с ними хроматина. Такие изменения конформации хроматина могут оказывать влияние на взаимодействия между энхансерами и промоторами генов, не изменяя функциональной активности энхансеров как таковых. При этом изменения структуры хроматина, вызываемые инсуляторами, не препятствуют элонгации РНК РНК-полимеразами.
Уровень хромосом. Использование переходов конденсации-деконденсации хроматина для регуляции экспрессии как отдельных генов, так и их громадных массивов, по-видимому, является прерогативой эукариот. Ярким примером такого рода служит инактивация одной из Х-хромосом самок млекопитающих в раннем эмбриогенезе.
Поскольку соматические клетки самок млекопитающих содержат две половые Х-хромосомы, а самцов - только одну, у самок возникает необходимость в компенсации двойной дозы генов, сцепленных с этими хромосомами. Такая проблей решается путём инактивации одной из Х-хромосом, являющейся следствием перевода ее хроматина в высококонденсированное состояние с подавленной транскрипцией. Хотя в большинстве случаев в разных клетках одного и того же животного случайным образом инактивируется или материнская, или отцовская Х-хромосома, имеются специальные случаи, когда во всех клетках только отцовская хромосома становится транскрипционно неактивной. Последний случай, получивший название "импринтный тип инактивации Х-хромосомы", характерен для сумчатых животных и обнаружен в некоторых клетках эмбрионов мышей.
В ранних эмбрионах мышей и человека обе Х-хромосомы активны. У мышей инактивация Х-хромосомы впервые обнаруживается в ранних эмбрионах на стадии бластоцисты, когда для всех внеэмбриональных клеток характерен импринтный тип инактивации только отцовских X-хромосом. Позднее, через 6 дней эмбрионального развития во всех клетках зародыша материнские и отцовские Х-хромосомы инактивируются случайным образом. Неактивное состояние хромосом высоко стабильно, и их реактивация (повторная активация) имеет место лишь у самок в клетках зародышевой линии. В клетках зародышевой линии самцов единственная Х-хромосома инактивируется в раннем сперматогенезе.
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ
Единственной известной генетически запрограммированной ковалентной модификацией ДНК у высших эукариот является метилирование остатков цитозина в положении 5 с образованием 5-метилцитозина (5-тС). Эта реакция катализируется ферментом (цитозин-5)-ДНК-метилтрансферазой (Мтазой), который обнаружен у прокариот и эукариот.
Большинство прокариотических Мтаз способны метилировать ДНК de novo, распознавая неметилированные палиндромные гексануклеотидные последовательности. Они также метилируют последовательности, в которых одна цепь ДНК уже содержит метильные группы. В отличие от этого эукариотические Мтазы относятся к "поддерживающим" ферментам, которые узнают и метилируют только наполовину метилированные последовательности, формирующиеся во время репликации ДНК, когда вновь синтезированная цепь неметилирована. У млекопитающих остатки С метилируются преимущественно в составе динуклеотидов CpG. В геноме позвоночных животных метилировано ~70% динуклеотидов CpG и ~6-7% всех остатков цитозина.
"Поддерживающие" Мтазы животных обладают небольшой способностью осуществлять метилирование ДНК и de novo в полностью неметилированных участках, а также искусственных субстратов (олигонуклеотидов), содержащих ошибочно спаренные основания. Остается непонятным, является ли указанное свойство Мтаз достаточным для осуществления метилирования de novo обширных участков генома в эмбриогенезе или же этот процесс происходит с участием других ферментов. Известно, что гомозиготные делеции в гене Мтазы у мышей вызывают гибель зародышей в раннем эмбриогенезе, что указывает на важную роль метилирования ДНК в онтогенезе млекопитающих. Однако даже у таких мутантных эмбрионов небольшая часть последовательностей ДНК метилирована.
Метилирование остатков цитозина оказывает влияние на структурные характеристики ДНК. Это проявляется в облегчении перехода метилированных участков ДНК из В-формы в Z-форму, увеличении шага спирали ДНК и изменении кинетики образования крестообразных структур. Метильная группа 5-mС выступает на поверхности большой бороздки ДНК, находящейся в В-форме, и увеличивает ее гидрофобность, что в ряде случаев является решающим фактором при взаимодействии белков с соответствующими участками ДНК.
Регуляция экспрессии генов с помощью метилирования ДНК.
Метилирование остатков С может оказывать влияние на транскрипцию как непосредственно через изменение эффективности связывания позитивных и негативных факторов транскрипции со своими регуляторными участками на ДНК, так и опосредованно через формирование неактивных в транскрипционном отношении участков хроматина.
Поскольку 5-mС структурно подобен тимину, метилирование остатков С может сопровождаться возникновением новых консенсусных последовательностей для некоторых факторов транскрипции.
В частности, метилирование превращает низкоаффинный сайт связывания фактора транскрипции АР-1 (CGAGTCA) в высокоаффинный сайт (mCGAGTCA), который соответствует консенсусному сайту для этого фактора (TGAGTCA).
Известные промоторы, за небольшим исключением, неактивны в метилированном состоянии. Единственная метильная группа, введенная в промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или в С-промоторы вируса Эпштейна-Барр, может оказывать большое негативное влияние на транскрипцию. Уровень подавления активности других промоторов, в частности промоторов α- и γ-глобиновых генов человека или промотора мышиного гена MyoDI, находится в прямой зависимости от числа введенных в них метильных групп, но не от их положения в промоторах. Ингибирование транскрипции, вызванное частичным метилированием промоторов, может преодолеваться с помощью энхансеров, однако полностью метилированные промоторы не реактивируются энхансерами и сохраняют свое репрессированное состояние, несмотря на присутствие последних. На основании такого рода данных высказывается предположение, что метилирование ДНК регулирует транскрипцию по принципу "все или ничего" и не обеспечивает тонкой регуляции экспрессии генов.
Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина
Характер метилирования ДНК может оказывать решающее влияние на структуру хроматина и фазирование нуклеосом. Термином "фазирование" обозначают неслучайное расположение нуклеосом относительно конкретной последовательности нуклеотидов ДНК в определенных участках генома. Большинство нуклеосом генома животных располагаются на ДНК случайно. В редких случаях фазирования последовательности нуклеотидов упаковываются в нуклеосомы одним и тем же способом во всех клетках организма, что может оказывать влияние на эффективность транскрипции и репликации ДНК в соответствующих локусах. В настоящее время у млекопитающих описано несколько белков, которые взаимодействуют преимущественно с метилированной ДНК.
Ярким примером подавления экспрессии генов путем формирования хроматина, структурированного специфическим образом, является инактивация одной из Х-хромосом самок млекопитающих. Большинство генов неактивной Х-хромосомы прекращает свою экспрессию в раннем эмбриогенезе независимо от наличия в ней CpG-последовательностей. При этом метилирование ДНК и ацетилирование гистона Н4 усиливают и стабилизируют репрессированное состояние неактивной Х-хромосомы.
Активация генов, входящих в состав неактивного хроматина, требует изменения структуры хроматина и деметилирования ДНК. Обнаружены белковые комплексы, способные реактивировать неактивный хроматин. Деметилирование может происходить пассивно через подавление функционирования поддерживающих Мтаз. В этом случае дочерние цепи ДНК, образующиеся в процессе репликации, остаются неметилированными, что приводит к полному деметилированию ДНК после двух раундов репликации. Активное деметилирование ДНК происходит с участием специфических ферментов - деметилаз.
Гены, входящие в состав неактивного хроматина, в большинстве своем недоступны действию факторов транскрипции. Формирование неактивного хроматина через метилирование специфических последовательностей приводит к уменьшению линейных размеров генома и числа регуляторных последовательностей, доступных факторам транскрипции. Следствием этого является снижение неспецифических взаимодействий регуляторных белков с соответствующими последовательностями генов, что, в свою очередь, уменьшает уровень информационного шума в генетической системе, который может появляться в результате неконтролируемой транскрипции. В этой связи высказывается предположение о важной роли не только генетических, но и видоспецифических эпигенетических изменений в эволюции высших эукариот. Действительно, наследуемый характер паттернов метилирования геномной ДНК способствует стабилизации и распространению в популяциях специфических структур хроматина, а изменение паттернов через эпигенетические мутации может быть одним из путей повышения пластичности генетической информации и ее разнообразия, что может служить материалом для естественного отбора.
Отцовский импринтинг и аллельное исключение
При отцовском импринтинге экспрессия некоторых генов в дочерних соматических клетках зависит от того, локализованы ли они на отцовских или материнских хромосомах. При этом часто наблюдают различный характер метилирования отцовских и материнских хромосом. У мышей известны ~15 областей хромосом, подвергнутых импринтингу. У многих генов с таким эпигенетическим наследованием обнаружены прямые повторы, которые, как полагают, могут быть задействованы в установлении и поддержании импринтинга. Локализация нескольких генов, в регуляции экспрессии которых задействован импринтинг, в одном и том же участке хромосомы 16 указывает на то, что в установление импринтинга могут быть вовлечены целые домены хромосом.
При аллельном исключении происходит инактивация одного из аллелей, приводящая к функциональной гемизиготности соответствующего гена независимо от его происхождения со стороны родителей. Под гемизиготностью диплоидных организмов или отдельных соматических клеток понимают представленность одного или нескольких генов только одним аллелем.
Гемизиготное состояние характерно, в частности для генов Х-хромосом самок млекопитающих отдельных соматических клеток, где одна из Х-хромосом инактивирована случайным образом.
Обычно аллельное исключение тонко регулируется в онтогенезе. Однако теоретически аналогичный механизм может реализовываться в результате постепенно накапливаемых случайных ошибок метилирования на протяжении жизни организма. Накопление ошибок метилирования сверх определенного уровня должно сопровождаться выключением соответствующего аллеля на фоне нормального функционирования другого аллеля в конкретной соматической клетке. Происхождение часто обнаруживаемых частично метилированных CpG-сайтов в ДНК различных тканей объясняют такими ошибками метилирования, получившими название эпимутаций. На фоне эпимутаций может легко произойти инактивация единственного оставшегося аллеля дикого типа под действием обычных мутаций или в результате гиперметилирования, что приведет к полному подавлению экспрессии соответствующего гена.
Метилирование как механизм инактивацни чужеродной и повторяющейся ДНК у эукариот
T. Бестором (1990 г.) было высказано предположение о том, что метилирование ДНК у эукариот может выполнять защитную функцию, предохраняя организм от чужеродной ДНК и избытка эндогенных повторяющихся последовательностей. Поскольку у эукариот не описано ферментов рестрикции, специфичных в отношении GpC-последовательностей, предполагается, что такие защитные механизмы осуществляют инактивацию чужеродной ДНК, а не ее деградацию, как это имеет место у бактерий. Экспериментально установлено, что ДНК из внешних источников, например вирусная ДНК или ДНК, введенная в клетки с помощью трансфекции, а также эндогенная ДНК ретротранспозонов и повторяющихся последовательностей (в частности LINE и SINE) могут быть объектом метилирования de novo, приводящего к их генетической инактивации.
Например, интеграция ДНК аденовирусов в эукариотический геном сопровождается ее постепенным метилированием. Другим примером функционирования этого механизма является гиперметилирование трансгенов, интегрированных в геном организма реципиента в большом числе копий.
Механизмы, которые позволяют высшим эукариотическим организмам избирательно распознавать и инактивировать чужеродную и повторяющуюся ДНК, не совсем понятны. Полагают, что Мтазы преимущественно распознают молекулы ДНК, формирующие необычные пространственные структуры, например петли или ошибочно спаренные нуклеотиды. В случае повторяющихся последовательностей мишенями Мтаз при метилировании de novo могут быть интермедиаты, образующиеся во время их рекомбинации друг с другом. У грибов остатки цитозина в повторах либо метилируются ферментными системами, либо превращаются в мутантные остатки тимина.
Вообще, остатки С, которые являются мишенями для Мтаз, мутируют в геноме эукариот по механизму дезаминирования и превращения в остатки тимина гораздо чаще, чем другие остатки цитозина. Это позволяет рассматривать метилирование как постоянно функционирующий механизм эукариот, инактивирующий чужеродные и повторяющиеся последовательности ДНК с помощью таких мутаций.
Литература
Патрушев Л.И. Экспрессия генов. - М.: Наука, 2000. - 527 с.
2. . Понятие и признаки нормы права6 1
3. Задание Передвижение занимающихся по диагонали- змейкой зигзагом открытой и закрытой петлей называется
4. Реферат- Теория регулярных соответствий
5. В ассортименте оборудование ridgid позиционирует ручные гидравлические и электрические трубогибы
6. Постоянная Планка
7. Хурриты
8. Изучение зрительных иллюзий
9. ЭКОНОМИКА 1991 Содержание [1] ПРЕДИСЛОВИЕ [2] ВВЕДЕНИЕ [2
10. Дидактические игры в развитии речи детей-сирот 2 года жизни
11. Статья- Получение Pt-Re катализатора с использованием возвратных Pt и Re
12. Государство и Аристотеля Политика
13. экология в 1866 г
14. Обнаружение радиоактивных выбросов
15. Ответы к билетам по физкультуре 11 класс
16. тема фонетических лексических грамматических средств являющихся орудием выражения мысли чувств волеизъя
17. Вектор 2.1 Организационно ' экономическая характеристика ООО Вектор 2
18. вариантность Динамика языковой нормы
19. Реферат на тему- Обучающие игры на уроке ИЯ Выполнила- Мутьянова Я
20. Дневники вампира- Возвращение