Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
24
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
УДК 577.32’.012:543.422.25
02.00.10 –біоорганічна хімія
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата хімічних наук
Одеса –00
Дисертацією є рукопис
|
Робота виконана в |
Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського Національної академії наук України |
|
Науковий керівник: |
академік НАН України, доктор хімічних наук, професор Андронаті Сергій Андрійович, Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, директор, завідувач відділу. |
|
Офіційні опоненти: |
доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Вовк Андрій Іванович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, в.о. заступника директора кандидат хімічних наук Басок Степан Степанович, Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, старший науковий співробітник |
|
Провідна установа: |
Київський національний університет ім. Тараса Шевченка МОіН Украіни, кафедра органічної хімії, м. Київ. |
Захист відбудеться “ 18”січня 2001 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.219.02 при Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України (65080, Одеса, Люстдорфська дорога, 86. Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Фізико-хімічного інституту
ім. О.В. Богатського НАН України (65080, Одеса, Люстдорфська дорога, 86. Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського).
Автореферат розісланий “ 15 ” грудня 2000 р.
|
Вчений секретарспеціалізованої вченої ради к. х. н. |
Л.О. Литвинова |
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи. Пошук нових антитромботичних і антиагрегаційних засобів, які мають високу ефективність і низьку токсичність, є однією з найважливіших задач біоорганічної та медичної хімії. З кожним роком з'являється все більше публікацій щодо створення лікарських засобів, які впливають на різні етапи тромбоутворення. Це зумовлено відсутністю досить ефективних і безпечних препаратів для лікування захворювань серцево-судинної системи. Тому найвідоміші фармацевтичні компанії світу проводять розробку нових сполук як потенційних лікарських засобів даного класу.
Відомо, що тромбоцити крові людини відіграють важливу роль не тільки в нормальному гемостазі, а й в артеріальних тромбозах, які ведуть до таких захворювань, як інфаркт міокарда, інсульт та ін. Успіхи у рішенні медико-біологічних проблем тромбоутворення і боротьби з ним, безсумнівно, дозволять підвищити ефективність профілактики і терапії багатьох найтяжчих і небезпечних недугів.
В наш час відомо багато антиагрегантів, які за механізмом їх дії підрозділяються на кілька груп. Одні пов’язані з впливом на метаболізм арахідонової кислоти, другі –з АДФ-залежним шляхом агрегації, треті –з інгібуванням фактора активації тромбоцитів. Проте, існує широкий ряд сполук різноманітної структури, механізм дії яких до теперішнього моменту не виявлений в достатній мірі. Великий інтерес викликають азотовмісні гетероцикли як потенційні антиагреганти. Високоактивні сполуки були знайдені серед представників бенздіазепінового ряду, похідних імідазохіноліну, піридину, ізоксазолону, піперидин-3-карбоксамідів, тощо.
Останнім часом окремо розглядається група сполук, котрі є антагоністами фібриногенових рецепторів. Відповідальною за зв’язування фібриногену з його рецепторами є трипептидна RGD (Arg-Gly-Asp) послідовність. Невеликі білки і пептиди, що містять RGD-послідовність, є антагоністами фібриногенових рецепторів, тому для запобігання агрегації тромбоцитів можливе використання природних RGD-пептидів. Проте, недоліками таких пептидів є низька селективність і схильність до біодеградації. Молекулярний дизайн потенційних антагоністів фібриногенових рецепторів з метою підвищення афінітету і селективності включає моделювання структур, що містять RGD-послідовність або імітують її фрагменти.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є частиною досліджень Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України за темою № 234 (№ державної реєстрації 0100V001145) та міжнародної програми РЕСО-94 (BIOMED, Проект № ERВCIPDCT 940247).
Мета і задачі дослідження. Мета дисертації –синтез, вивчення властивостей і молекулярного механізму дії антиагрегаційних засобів в рядах похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону і RGD-міметиків.
В зв’язку з метою роботи були поставлені такі задачі:
Наукова новизна одержаних результатів. Синтезований ряд похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону, антиагрегаціний ефект котрих перевищує ефект ацетилсаліцилової кислоти.
Вперше показана можливість застосування залишку 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти як Arg-міметика для одержання RGD-міметиків.
За двома альтернативними схемами синтезований ряд нових RGD-міметиків на основі залишку 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти, які мають в дослідах in vitro високу антиагрегаційну активність і є антагоністами фібриногенових рецепторів.
Синтезовані нові “проліки” - похідні RGD-міметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну. Показано, що в дослідах ex vivo метиловий ефір 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну має високу антиагрегаційну активність.
Практичне значення одержаних результатів. Експериментальні результати свідчать про перспективність пошуку антиагрегантів в рядах похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону, які є потенційними антиагрегантами. Залишок 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти може використовуватися як замінник залишку аргініну для створення нових RGD-міметиків, перспективних сполук з високою антиагрегаційною активністю, котрі можуть бути застосованими в медицині для профілактики і лікування різноманітних захворювань серцево-судинної системи.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно синтезовані нові похідні 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону і ряд нових RGD-міметиків, а також “проліки” на основі залишку 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти, інтерпретовані дані спектрів Н ЯМР, мас спектрів. У співавторстві виконані дослідження впливу одержаних RGD-міметиків на зв’язування FITC-фібриногену з рецепторами на тромбоцитах, аналіз одержаних результатів.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на міжнародному симпозіумі “23-rd European Peptide Symposium” (Брага, Португалія, 1994), IX конференції з органічної та біоорганічної хімії молодих вчених (Прага, Чехія, 1995), XVIII Українській конференції з органічної хімії (Дніпропетровськ, Україна, 1998), І конференції молодих вчених і студентів-хіміків південного регіону України (Одеса, Україна, 1998), V національному з'їзді фармацевтів України (Харків, Україна, 1999), міжнародній конференції “The Second Multidisciplinary Conference on Drug Research” (Єленя гура, Польща, 2000), науково-практичному семінарі “Природні біологічно активні речовини і їх синтетичні аналоги” (Гурзуф, Україна, 2000).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті у фахових журналах і тези 8 доповідей на українських і міжнародних конференціях.
Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 127 стор. машинописного тексту і складається із вступу, трьох розділів, висновків, містить 18 таблиць, 17 рисунків. Список використаних джерел включає 120 найменувань. Перший розділ являє собою огляд літератури, в якому описано сполуки непептидної природи –інгібітори агрегації тромбоцитів, викладено підходи до дизайну і синтезу RGD-міметиків, описано їх фармакологічні властивості і застосування в медицині, а також подано сучасні уявлення про молекулярний механізм антиагрегаційної дії RGD-міметиків.
У другому розділі описано синтез похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону, нового RGD-міметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну, модельного RGD-міметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну, наведено спектральні підтвердження будови одержаних речовин, особливості їх розпаду під електронним ударом, описані антиагрегаційні властивості і вплив RGD-міметиків на зв’язування FITC-фібриногену з рецептором на тромбоцитах.
Третій розділ містить методики синтезу одержаних сполук.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Пошук потенційних інгібіторів агрегації тромбоцитів в ряді похідних
-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону
Знайдено велику кількість інгібіторів агрегації тромбоцитів серед сполук, що належать до класу азотвмісних гетероціклів. Високоактивні антиагреганти виявлено в ряді похідних піридину, піперазину, хіназоліну, 1,4-бенздіазепину, триазолобенздіазепінів та інших класів сполук.
З метою пошуку ефективних антиагрегантів серед похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону нами синтезовані сполуки –.
Для отримання 1-незаміщеного-3-амінопіперидин-2,6-діону (сполука ) ми застосували реакцію циклізації п-нітрофенілового ефіру Boc-Gln (Boc-Gln-ONp) в присутності триетиламіну, представлену на схемі 1.
Схема 1
Синтез 1-(піридилзаміщених)-3-амінопіперидин-2,6-діонів і 3-амінопіролідин-2,5-діонів базується на утворенні циклічних ангідридів N-захищених дикарбонових амінокислот з наступною реакцією їх з 2-, 3- і 4-амінопіридинами (схема 2). Для отримання сполук і як вихідну сполуку застосовували Boc-Asp-OH. Схема синтезу при цьому лишається незмінною.
Схема 2
Синтез сполук і здійснювався за методом активованих ефірів шляхом конденсації 1-(піридин-2-іл)-3-амінопіперидин-2,6-діону з Вос-похідними п’ятичленних циклічних амінокислот в присутності триетиламіну (схема 3).
Схема 3
Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методу ТШХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії і спектроскопії Н-ЯМР.
Була досліджена антиагрегаційна активність тринадцяти сполук –похідних піперидину ( - , - , , ) і піролідину (, ), в тому числі сполук, що містять Вос-групу ( - ) і залишки циклічних амінокислот. Як свідчать дані, наведені у табл. 1, всі одержані сполуки різною мірою, залежно від структури, інгібували агрегацію тромбоцитів, викликану АДФ у багатій на тромбоцити плазмі крові щурів. Величини ІС варіюють в межах від 3.6.10-4 М до 26.5.10-4 М. Слід відмітити, що майже всі вивчені сполуки цієї серії за антиагрегаційною активністю перевищували ацетилсаліцилову кислоту.
Таблиця 1.
Похідні 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону і показники їх антиагрегаційної активності.
|
№№ |
Структура |
R |
R |
n |
m |
IC(10-4 M) |
|
1 |
H |
H |
1 |
.5 0.65 |
||
|
2 |
Boc |
піридил-2 |
0 |
.6 0.51 |
||
|
3 |
Boc |
піридил-3 |
0 |
.2 0.49 |
||
|
4 |
Boc |
піридил-4 |
0 |
- |
||
|
5 |
Boc |
піридил-2 |
0 |
- |
||
|
6 |
Boc |
піридил-3 |
0 |
.9 0.70 |
||
|
7 |
H |
піридил-2 |
2 |
.6 0.25 |
||
|
8 |
H |
піридил-3 |
2 |
.0 0.47 |
||
|
9 |
H |
піридил-4 |
2 |
.5 0.61 |
||
|
10 |
H |
піридил-2 |
2 |
.0 0.72 |
||
|
11 |
H |
піридил-3 |
2 |
.0 0.68 |
||
|
12 |
Pro |
піридил-2 |
2 |
.0 0.93 |
||
|
13 |
Thz |
піридил-2 |
2 |
.6 1.70 |
Аналізуючи вплив структури на антиагрегаційну активність одержаних сполук, ми встановили, що ефект 3-амінопіперидин-2,6-діону () знаходиться на рівні ефекту ацетилсаліцилової кислоти. Введення ж замісників у положення 1 й ацилювання аміногруп як похідних піперидину - , - , і , так і похідних піролідину , , підвищує їх антиагрегаційну активність. Очевидно, що найбільшій внесок у підвищення активності робить залишок піридину в першому положенні, тому що наявність в третьому положенні захисної Вос-групи або залишків циклічних амінокислот не впливала суттєво на активність даних сполук, так само як і повна відсутність замісників у положенні 3.
Одержані результати вказують на перспективність пошуку сполук з антиагрегаційними властивостями серед похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону.
Синтез RGDF-пептидоміметика -
-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирил-гліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну
Даний розділ роботи присвячено синтезу нової сполуки - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну (), яка є модельним пептидоміметиком, що імітує RGDF-послідовність фібриногену. В цьому пептидоміметику перший амінокислотний залишок (R) було замінено на його міметик 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутаноїл (PS) (Рис. 1). Решту амінокислотних залишків не заміняли.
Рис. 1. RGDF-пептид і його міметик - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланін ().
Жорсткість 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутаноїлу як можливого Arg-подібного фрагменту більша, ніж у залишку 4-(піперидин-1-іл)бутанової кислоти, і менша, ніж у амінобензамідину. Останні успішно використовуються для дизайну RGD-міметиків (рис 2).
Рис. 2. Структури залишків аргініну і його міметіків.
Як вихідну сполуку використовували 1-Вос-піперазин, який ацилювали ангідридом янтарної кислоти. В результаті була одержана 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутанова кислота (), котра стала основою для будування Arg-імітуючої частини. Su-Ефір 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутанової кислоти () одержували двома способами. Перший базувався на використанні DCCI і SuOH, другий –на використані реагенту Сакакібари (TfaOSu). Цей реагент одержували реакцією між трифтороцтовим ангідридом і SuOH.
Далі для отримання блоку, що імітує аргінілгліцил (Схема 4), проводили реакцію між натрієвою сіллю гліцину і ефіром . В результаті був синтезований 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутирилгліцин (). Сполука , реагуючи з DCCI і SuOH, давала сукцинімідний ефір 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутирилгліцину ().
Будування другого блоку починалося з конденсації BocAsp(OBzl)OH з TsOH.HPheOBzl за DCCI-методом з добавкою BtOH. Видалення бензилових захисних груп проводили гідрогенолізом, що приводило до BocAspPheOH () з виходом 77 %. Як каталізатор застосовували 3 % паладій на активованому вугіллі. Останнім етапом при одержанні другого блоку, НСl.НAspPheOH () було ацидолітичне розщеплення Вос-захисту.
Схема 4
Реакція між сполуками і приводила до утворення 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну (). Заключна стадія синтезу цільового пептидоміметика –гідрохлориду 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланіну () –ацидолітичне розщеплення Вос-групи 4 н розчином HCl в діоксані ([]D = -17.52 (c = 1, HО)).
Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методів ТШХ і ВЕРХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії і спектроскопії Н-ЯМР.
Синтез і антиагрегаційна активність нового RGD-міметика
Метою дослідження, викладеного в даному розділі, був синтез нової сполуки, яка б імітувала RGD-послідовність фібриногену. Як Arg-міметик був застосований залишок 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти. Аспарагінову частину імітували залишком D,L--феніл--аланіну, якій має в своєму складі гідрофобний фенільний радикал, що необхідно для забезпечення здатності сполуки інгібувати агрегацію тромбоцитів, а також зв’язування фібриногену з GP IIb/IIIa рецептором.
Виходячи з вищенаведених уявлень, ми синтезували високоактивний RGD-міметик - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланін () на основі залишку 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти і D,L--феніл--аланіну. Синтез пептидоміметика подано на схемі 5.
Як вихідну використовували сполуку , яку дією DCCI і PfpOH переводили у відповідний Pfp-ефір (), що був першим блоком для створення заданого пептидоміметика.
Будування другого блоку починалося з синтезу D,L--феніл--аланіну, котрий був отриманий за стандартним методом Родіонова. Далі дією хлористого тіонілу на суспензію -амінокислоти в метанолі був одержаний гідрохлорид метилового ефіру (), конденсація якого з Вос-GlyOH за стандартним DCCI-методом з добавкою BtOH приводила до утворення дипептиду –Вос-гліцил-D,L--феніл--аланіну (). Видалення Вос-групи (без виділення проміжного гідрохлориду) і реакція з привели до утворення метилового ефіру 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну (), омилення складноефірної групи якого давало відповідну кислоту . Останню стадію отримання пептидоміметика проводили за стандартною методикою видалення Вос-групи 4 Н розчином HCl в діоксані.
Схема 5
Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методів ТШХ і ВЕРХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії і спектроскопії Н-ЯМР.
Оптимізація схеми синтезу і одержання нових RGD-міметиків
Схема 5, запропонована для синтезу пептидоміметика , складається з 6 стадій і описує досить складний і трудомісткий процес. В зв’язку з цим, ми поставили собі мету оптимізувати існуючу схему синтезу. Нову оптимізовану схему ми застосували для одержання нових аналогів пептидоміметика для дослідження впливу замісників на здатність сполук інгібувати агрегацію тромбоцитів, а також зв’язування фібриногену з GP IIb/IIIa рецепторами.
Синтез вихідних сполук. Необхідні вихідні D,L-β-арил-β-аланіни – були синтезовані за реакцією Родіонова з відповідних п-заміщених бензальдегідів (схема 6).
Схема 6
Спроба розділення енантіомерів D,L-β-арил-β-амінокислот за допомогою дробної кристалізації виявилася невдалою. З цієї причини L-3-аміно-3-фенілпропіонова кислота (L-) () нами була синтезована з L-2-аміно-2-фенілоцтової кислоти (L-фенілгліцін) за реакцією Арндта-Естерта (Схема 7).
Схема 7
Аміногрупу вихідного L-фенілгліцину блокували Вос-захисною групою, для введення якої застосовували ВосО, в результаті чого отримували сполуку . Далі Вос-похідне дією ізо-бутилхлорформіату перетворювали на змішаний ангідрид . Наступним етапом синтезу була конденсація ангідриду з діазометаном, в результаті чого одержували діазокетон . Діазокетон розкладали до Вос-L-β-феніл-β-аланіну () у водно-органічному середовищі, оксид срібла використовували як каталізатор. Ацидолітичне деблокування захисної групи давало гідрохлорид L-β-феніл-β-аланіну () з кількісним виходом ([]D = - 2.7 (c = 1, HO)).
Застосування альтернативної схеми синтезу для одержання 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну і його аналогів. В результаті ацилювання янтарним або глутаровим ангідридами 1-Вос-піперазину отримані, відповідно, 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутанова (15), вже описана вище, і 5-оксо-5-(4-Вос-піперазин-1-іл)пентанова (40) кислоти. Далі кислоти 15 і 40 перетворювали на активовані ефіри: Pfp- (24) і Su- (16) і (41) (Схема 8).
Схема 8
Таблиця 2
RGD-пептидоміметики.
|
№№ |
Структура |
R |
n |
m |
|
23 |
Ph |
|||
|
57 |
п-F-CH |
1 |
||
|
58 |
п-Cl-CH |
|||
|
59 |
п-MeO-CH |
|||
|
60 |
м, п-(MeO)-CH |
|||
|
61 |
||||
|
62 |
(L) Ph |
|||
|
63 |
(L) Me |
|||
|
65 |
H |
|||
|
66 |
(L) Ph |
|||
|
67 |
(D) Ph |
|||
|
68 |
Ph |
|||
|
69 |
п-MeO-CH |
|||
|
70 |
(L) Ph |
|||
|
71 |
(D) Ph |
Реакція між активованими ефірами або , або , і натрієвою сіллю гліцину давала 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутаноїл- (), і 5-оксо-5-(4-Вос-піперазин-1-іл)пентаноїл- () похідні гліцину. Проте, похідні і можна одержувати без виділення активованих ефірів , і , що значно простіше в препаративному плані, а також приводить до скорочення числа стадій. Проведення реакцій між активованими ефірами 4-оксо-4-(4-Вос-піперазин-1-іл)бутаноїл- або 5-оксо-5-(4-Вос-піперазин-1-іл)пентаноїлгліцину, без виділення з реакційної суміші, з β-аланіном, β-аріл-β-аланінами і енантіомерами фенілгліцину приводило до отримання Вос-похідних , -.
На останній стадії процесу ацидолітичним деблокуванням сполук 28, 43-56 були одержані цільові пептидоміметики 23, 57-71 (таблиця 2).
Сумарний вихід цільового міметика , синтезованого за схемою 5, складає 45 %. При застосуванні схеми 8 сумарний вихід складає в середньому 56 %. Крім того, схема 8 простіша в препаративному плані.
Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методів ТШХ і ВЕРХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії і спектроскопії Н-ЯМР.
Синтез “проліків” - похідних RGD-пептидоміметиків
Для лікування хронічних захворювань серцево-судинної системи необхідні сполуки з високою антиагрегаційною активністю і відносно тривалим часом напівжиття при їх пероральному введенні. Хоча на активність при пероральному введенні впливає багато факторів, проте основним є обмежене проникнення RGD-міметиків крізь мембрану через наявність заряджених груп і високої полярності. Другим фактором є метаболічна лабільність деяких RGD-міметиків в присутності протеаз і пептитаз. В зв'язку з цим виникає необхідність створення “проліків” найбільш активних RGD-пептидоміметиків для їх перорального застосування.
Цей розділ присвячений синтезу нових “проліків” - похідних RGD-пептидоміметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну ().
Синтез метилового ефіру 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну () здійснювали за схемою 9:
Схема 9
“Проліку” - Етиловий ефір 4-оксо-4-(4-етоксикарбоніл-піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну (), сполуку з двома ефірними групами на обох кінцях молекули, одержували за схемою 10. Спроба синтезу сполуки за схемою, аналогічною схемі 5, виявилася невдалою через гідроліз етоксикарбонільної групи Su-ефіру 4-оксо-4-(4-етоксикарбоніл-піперазин-1-іл)бутанової кислоти () на стадії його конденсації з гліцином у водно-органічному середовищі.
Як вихідну сполуку брали 1-етоксикарбонілпіперазин (), який ацилювали ангідридом янтарної кислоти. В результаті одержували 4-оксо-4-(4-етоксикарбоніл-піперазин-1-іл)бутанову кислоту (). Дією DCCI і SuOH на кислоту її переводили у відповідний Su-ефір (), який був першим блоком для створення заданої сполуки з властивостями “проліків” (схема 10).
Схема 10
Побудова другого блоку починалося з синтезу гідрохлоріду етилового ефіру D,L--феніл--аланіну. Конденсацію етилового ефіру D,L--феніл--аланіну з Boc-GlyOH за стандартним DCCI-методом з додаванням BtOH був одержаний дипептид –етиловий ефір Вос-гліцил-D,L--феніл--аланіну (). Видалення Вос-групи (без виділення проміжного гідрохлоріду) і реакція з Su-ефіром привели до утворення цільової сполуки з властивостями “проліків”.
Індивідуальність сполук контролювали за допомогою методів ТШХ і ВЕРХ, а їх структура підтверджена даними мас-спектрометрії та спектроскопії Н-ЯМР.
Антиагрегаційна активність RGD-міметиків на основі -
-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти
Антиагрегаційна активність синтезованої сполуки вивчалася на багатій на тромбоцити плазмі крові щурів за методом Борна. Пептидоміметик інгібував АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів з ІС = 8.7.10-9 М. Також було встановлено, що сполука має високу антиагрегаційну активність і у відношенні до тромбоцитів крові людини. Константа напівінгібування агрегації тромбоцитів у багатій на тромбоцити плазмі крові людини дорівнює 3.3.10-8 М.
Щоб з’ясувати молекулярний механізм антиагрегаційної дії пептидоміметика , проведено дослідження його впливу на специфічне зв’язування міченого флуоресцеїном фібриногену (FITC-фібриногену) з його рецепторами на суспензії відмитих тромбоцитів людини. Було встановлено, що дана сполука інгібує зв’язування FITC-фібриногену з рецептором GP IIb/IIIa на суспензії відмитих тромбоцитів людини з ІС = 2.2.10-8 М. Крива залежності відсотка зв’язування FITC-фібриногену з тромбоцитами людини від логарифму концентрації пептидоміметика наведена на рис. 3.
Рис. 3. Залежність відсотка специфічного зв’язування (SB, %) FITC-фібриногену з GP IIb/IIIa від логарифму концентрації 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну ().
Вивчення антиагрегаційної активності пептидоміметиків і на багатій на тромбоцити плазмі крові людини показало, що введення фтору в пара-положення фенілу залишку β-амінокислоти призвело до зниження активності (сполука , ІС = 9.9.10-7 М), а використання залишку D,L--(3,4-диметоксифеніл)--аланіну як міметика Asp-Phe-частини призвело до значного збільшення антиагрегаційної активності (сполука , ІС = 1.5.10-9 М).
Визначення констант напівінгібування специфічного зв’язування FITC-фібриногену з рецептором GP IIb/IIIa для сполук , і показало, що RGD-міметики і інгібують зв’язування в наномолярних концентраціях з ІС, що дорівнювало 0.9.10-9 М і 0.7.10-9 М, відповідно (рис. 4).
Для сполуки значення ІС дорівнювало 3.1.10-8 М, що, очевидно, обумовлено зменшенням ліпофільності сполуки порівняно із сполукою .
Одержані експериментальні дані за антиагрегаційною активностю та інгібуванню специфічного зв’язування FITC-фібриногену з його рецепторами на тромбоцитах дають змогу розглядати ряд RGD-міметиків на основі 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти як високоактивні інгібітори агрегації тромбоцитів і антагоністи фібриногенових рецепторів.
Рис. 4. Залежність відсотка специфічного зв’язування (SB, %) FITC-фібриногену з GP IIb/IIIa рецепторами від логарифму концентрації сполук і .
Антиагрегаційна активність сполуки при її пероральному введенні була досліджена за гібридним методом на мишах і щурах. Значення ID складало 10 мг/кг.
Таким чином, проведені дослідження дозволяють розглядати сполуку як потенційний засіб для перорального застосування, що потребує по дальшого поглибленого дослідження.
ВИСНОВКИ
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗДОБУВАЧА
ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
АНОТАЦІЇ
Крисько А.А. Синтез і властивості інгібіторів агрегації тромбоцитів. –Рукопис.
Дисертація на здобуття ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10. –біоорганічна хімія. Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України, Одеса, 2001.
Дисертація присвячена синтезу і дослідженню властивостей похідних 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону, і RGD-міметиків на основі 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти.
Синтезовані нові похідні 3-амінопіперидин-2,6-діону і 3-амінопіролідин-2,5-діону з антиагрегаційними властивостями.
Запропоновано новий Arg-міметик –залишок 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти для отримання RGD-міметиків. З використанням даного Arg-міметика синтезовано новий модельний RGDF-міметик - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-L-аспартил-L-фенілаланін.
За двома альтернативним схемам синтезу одержано ряд RGD-міметиків на основі 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанової кислоти як Arg-міметика і β-арил-β-аланінів як Asp-Phe-міметиків.
Синтезовані нові похідні RGD-міметика - 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну, як “проліки” для перорального застосування.
Нові синтезовані RGD-міметики виявили високу антиагрегаційну активність в дослідах in vitro з ІС в межах 10-7 –-9 М, а також інгібували специфічне зв'язування FITC-фібриногену з його рецептором GP IIb/IIIa на тромбоцитах людини з показниками ІС порядку 10-8 –-10 М.
Метиловий ефір 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутирилгліцил-D,L--феніл--аланіну виявив антиагрегаційну активність при пероральному введенні в дослідах ex vivo з ІD = 10 мг/кг.
Ключові слова: піперидин-2,6-діон, піролідин-2,5-діон, RGD-міметики, 4-оксо-4-(піперазин-1-іл)бутанова кислота, активованих ефірів метод, β-арил-β-аланіни, “проліки”, фібриноген, GP IIb/IIIa, антиагрегаційна активність.
Крысько А.А. Синтез и свойства ингибиторов агрегации тромбоцитов.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10. –биоорганическая химия. Физико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса, 2001.
Диссертация посвящена синтезу и изучению свойств производных 3-аминопиперидин-2,6-диона и 3-аминопирролидин-2,5-диона, а также RGD-миметиков –производных 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты.
Синтезированы новые производные 3-аминопиперидин-2,6-диона и 3-аминопирролидин-2,5-диона, обладающие свойствами ингибиторов агрегации тромбоцитов. Антиагрегационный эффект синтезированных соединений превосходит эффект ацетилсалициловой кислоты. Показано, что введение остатка пиридина в первое положение пиперидинового либо пирролидинового кольца приводит к увеличению антиагрегационной активности полученных производных. Ацилирование аминогруппы в третьем положении также положительно влияло на антиагрегационный эффект.
Впервые предложен для молекулярного дизайна RGD-миметиков остаток 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты в качестве фрагмента, имитирующего остаток аргинина. С использованием данного аргинил-имитирующего фрагмента синтезирован новый модельный RGDF-миметик - 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутирилглицил-L-аспартил-L-фенилаланин, в котором имитировался только остаток аргинина, а остальные аминокислотные остатки не заменялись. Получен также новый RGD-миметик, который содержит два имитирующие фрагменты. При этом остаток аргинина заменён, как и в первом случае, на остаток 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты, а Asp-Phe-участок - на остаток D,L-β-фенил-β-аланина.
Предложены две схемы синтеза RGD-миметиков на основе 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты и β-арил-β-аланинов. Суммарный выход целевого RGD-миметика - 4-оксо-4-(пиперазин-1-иіл)бутирилглицил-D,L--фенил--аланина, синтезированного по первой схеме составляет 45 %, в то время как использование второй схемы синтеза приводит к увеличению суммарного выхода на 3 % и упрощению выделения промежуточных продуктов.
С целью получения производных RGD-миметика, обладающих повышенной биодоступностью и длительным временем полужизни при их пероральном введении, синтезированы “пролекарства” –производные - 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутирилглицил-D,L--фенил--аланина.
Синтезированные RGD-миметики –производные 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановой кислоты, в опытах in vitro на богатой тромбоцитами плазме крови животных и человека ингибировали АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов с IC в пределах 10-7 –-9 М.
Установлено, что молекулярной мишенью новых RGD-миметиков является гликопротеиновый комплекс GP IIb/IIIa, расположенный на поверхности активированных тромбоцитов человека. Полученные RGD-миметики ингибировали специфическое связывание флуоресцеин-меченного фибриногена с его рецептором GP IIb/IIIa. Значения IC в находятся пределах 10-8 –-10 М.
В опытах ex vivo на животных новое “пролекарство” –метиловый эфир 4-оксо-4-(пиперазин-1-иіл)бутирилглицил-D,L--фенил--аланина, проявило антиагрегационную активность при пероральном введении с показателем ID = 10 мг/кг.
Ключевые слова: пиперидин-2,6-дион, пироллидин-2,5-дион, RGD-миметики, 4-оксо-4-(пиперазин-1-ил)бутановая кислота, активированных эфиров метод, β-арил-β-аланины, “пролекарства”, фибриноген, GP IIb/IIIa, антиагрегационная активность.
Krysko A.A. Synthesis and properties of platelet aggregation inhibitors. –The manuscript.
Thesis for a candidate's degree in Chemical Sciences on speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. A.V. Bogatsky Physico-Chemical Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Odessa, 2001.
The dissertation concerns the synthesis and investigation of properties of
-aminopiperidine-2,6-dione and 3-aminopyrrolidine-2,5-dione derivatives and RGD-mimetics based on 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyric acid.
The novel 3-aminopiperidine-2,6-dione and 3-aminopyrrolidine-2,5-dione derivatives with antiaggregative properties were synthesized. The novel Arg-mimetic –the residue of 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyric acid, was proposed for receiving of RGD-mimetics. The novel model RGDF-mimetic - 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyrylglycyl-L-aspartyl-L-phenylalanine, was synthesized using above mentioned Arg-mimetic. The series of RGD-mimetics on the basis of 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyric acid as Arg-mimetic and -aryl--alanines as Asp-Phe-mimetics was synthesized by two alternative schemes. The novel derivatives of RGD-mimetic - 4-oxo-(piperazine-1-yl)butyrylglycyl-D,L--phenyl--alanine were synthesized as oral active prodrugs. The synthesized RGD-mimetics showed a high antiaggregatory activity in vitro with IC values within 10-7 –-9 M. They also inhibited the FITC-fibrinogen specific binding to its receptor GP IIb/IIIa on human platelets with IC values of 10-8 –-10 M. 4-Oxo-(piperazine-1-yl)butyrylglycyl-D,L--phenyl--alanine methyl ester showed an oral antiaggregatory activity ex vivo with ID of 10 mg/kg.
Key words: piperidine-2,6-dione, pirrolidine-2,5-dione, RGD-mimetics,
-oxo-(piperazine-1-yl)butyric acid, activated esters method, -aryl--alanines, prodrugs, fibrinogen, GP IIb/IIIa, antiaggregatory activity.