Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
23
ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА
ТАРНОВСЬКА АНТОНІНА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК: 577.352+577.181.5+504.504+597.551.2-131
ПЕРЕКИСНЕ ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ У ЗАРОДКАХ В’ЮНА ЗА ВПЛИВУ ФТОРХІНОЛОНІВ, ІОНІВ КАЛЬЦІЮ ТА МАГНІЮ
03.00.02 –біофізика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів –
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
Санагурський Дмитро Іванович,
Львівський національний університет імені Івана Франка,
завідувач кафедри біофізики та математичних методів у біології.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Рибальченко Володимир Корнійович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
завідувач лабораторії мембранології;
доктор біологічних наук, професор
Сологуб Леонід Ілліч,
Інститут біології тварин УААН.
завідувач лабораторії обміну речовин.
Провідна установа: Інститут фізіології імені академіка О.О. Богомольця НАН України, м. Київ
Захист відбудеться “7” липня 2005 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет, ауд. № 321.
З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.
Автореферат розісланий “6” червня 2005 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради К 35.051.14,
кандидат біологічних наук,
доцент Манько В.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. В сучасній біології залишається актуальним пошук тест-систем, які б дозволяли адекватно оцінити вплив фармакологічних засобів на організм людини і тварин. Застосування зародкових об‘єктів є перспективним при дослідженні токсичності низки речовин, зокрема, антибіотиків класу фторхінолонів. Останні мають широкий спектр дії та використовуються для лікування захворювань центральної нервової системи, запальних процесів, захворювань ендокринної системи, а також як протиракові і противірусні препарати. Проте ступінь токсичності та механізм їх впливу на клітину остаточно не з’ясовані.
Як показники, що швидко реагують на зовнішні впливи, можна використати процеси перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) та стан системи антиоксидантного захисту (АОЗ) (Владимиров Ю.А. и др., 1986). Відомо, що продукти ПОЛ впливають на активність мембранозв’язаних ферментів (Антонов В.Ф., 1997, Бурлакова Е.Б., 1975, Владимиров Ю.А., 2002), беруть участь у процесах клітинного поділу (Бурлакова Е.Б., 1975, Владимиров Ю.А., 2000) та старінні організму (Владимиров Ю.А., 2002). Ранній ембріогенез в цьому аспекті вивчений недостатньо. Зацікавленість до вивчення початкових стадій ембріогенезу зумовлене тим, що в цей час відбувається інтенсивний поділ клітин, а в його регуляції ПОЛ відіграє провідну роль (Барабой В.А. и др., 1997, Бурлакова Е.Б., 1975, Владимиров Ю.А. и др., 1986).
За дії різноманітних чинників, зокрема, антибіотиків рівновага в системі перекисне окиснення ліпідів ↔ антиоксидантна система зміщується в бік ПОЛ. Фторхінолони –велика група антимікробних препаратів з класу хінолонів. Це високоефективні синтетичні хіміотерапевтичні засоби широкого спектру дії, з переважаючою антибактеріальною активністю, загальнорезобтивною дією і фармакокінетикою, що забезпечує високу ступінь біодоступності, добре проникнення в органи, тканини, біологічні рідини. Відомо, що фторхінолони утворюють хелатні комплекси з катіонами кальцію та магнію.
З огляду на це, застосування зародків в’юна, як тест-систем для дослідження впливу фторхінолонів та катіонів кальцію і магнію на систему прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу набуває теоретичного та практичного інтересу.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у рамках держбюджетних тем: “Вплив іонів важких металів на електрогенез клітин в ранньому ембріогенезі”, № держреєстрації 0102U003573 (2000–рр.) та “Вплив катіонів важких металів на іонтранспортні системи в період раннього розвитку зародків в’юна”, № держреєстрації 0103U001873 (2003–рр.).
Мета і завдання роботи. Мета роботи полягала у з’ясуванні впливу антибіотиків фторхінолонового ряду та катіонів кальцію і магнію на інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів та систему антиоксидантного захисту зародкових клітин в’юна Misgurnus fossilis L. Для досягнення цієї мети у роботі вирішували наступні завдання:
. Дослідити інтенсивність процесів ПОЛ та стан ферментів АОЗ у зародках в’юна у контролі та за впливу катіонів кальцію і магнію на різних стадіях розвитку впродовж періоду дроблення бластомерів.
. Вивчити вплив бороцину та флюміквілу у концентраціях (0,00001%; 0,001%; 0,005%) на прооксидантно-антиоксидантний гомеостаз на різних стадіях раннього ембріогенезу в’юна.
. Дослідити сумарну дію катіонів кальцію, магнію та антибіотиків фторхінолонового ряду на стан вільнорадикальних процесів і активність ферментів АОЗ зародків в’юна в період розвитку в’юна.
. Визначити летальну концентрацію бороцину та флюміквілу для зародків в’юна Misgurnus fossilis L.
. Провести дисперсійний аналіз впливу досліджуваних металів та антибіотиків фторхінолонового ряду на інтенсивність процесів ПОЛ та активність ферментів АОЗ зародкових клітин та визначити частки впливу досліджуваних чинників.
Об’єктом даного дослідження були процеси перекисного окиснення ліпідів та стан антиоксидантної системи зародків прісноводної риби в’юна Misgurnus fossilis L. на ранніх етапах розвитку.
Предмет досліджень: адекватність реагування показників життєздатності зародків в’юна (інтенсивність процесів ліпопероксидації та активність ферментів антиоксидантної системи) на вплив фторхінолонів та катіонів кальцію та магнію.
Методи досліджень –для визначення вмісту ТБК-позитивних продуктів та активності ферментів АОЗ використовували спектрофотометричні методи, для оцінки вірогідності отриманих результатів –методи математичної статистики (порівняльний, кореляційний та дисперсійний аналіз).
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було проведено дослідження впливу фторхінолонів на систему прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу зародкових клітин в’юна Misgurnus fossilis L.. Встановлено, що вплив фторхінолонів на зародки в’юна протягом ембріогенезу реалізується на мембранному рівні, а саме через активування інтенсивності вільнорадикальних реакцій та зміну ензиматичної активності антиоксидантної системи. Ступінь впливу антибіотиків залежить не тільки від концентрації препаратів у середовищі інкубації, а й від стадії розвитку зародків та від структури самого фторхінолону, що визначає його фізико-хімічні властивості. За допомогою методу електронної мікроскопії досліджено вплив бороцину та флюміквілу на морфологію зародків в’юна. Показано, що вплив бороцину в концентрації 0,001% і флюміквілу в концентрації 0,01% веде до затримки розвитку та появи різних аномалій у личинок в’юна. Вперше з’ясовано, що вплив досліджуваних фторхінолонів призводить до активації процесів пероксидації ліпідів. Показано, що іони кальцію активують процеси ПОЛ в зародках в’юна, а іони магнію, навпаки, знижують їх активність на початкових стадіях дроблення бластомерів. З’ясовано, що іони кальцію посилюють активуючий вплив бороцину та флюміквілу на процеси ПОЛ, а іони магнію –нівелюють його.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати розширюють уявлення про механізми впливу фторхінолонів бороцину та флюміквілу на зародкові об’єкти. Чутливість і швидкість реагування зародків в’юна до таких негативних факторів створюють можливість застосування їх як тест-системи для перевірки шкідливості речовин. Вони можуть бути використані для токсикологічної оцінки фармакологічних речовин. Результати роботи впроваджені у навчальний процес при викладанні загального курсу біофізики та спецкурсів з біофізики мембран та фізико-хімічних методів досліджень у Львівському національному університеті імені Івана Франка.
Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу експериментальної частини дисертації, статистичній обробці результатів, підборі та обробці даних літератури, формулюванні основних висновків роботи, підготовці до друку публікацій за матеріалами дисертації. Планування напрямків досліджень, аналіз та інтерпретація одержаних результатів проведені за участю наукового керівника д.б.н., професора Санагурського Д.І.
Апробація результатів дослідження. Основні наукові результати дисертаційної роботи щорічно доповідались на звітних наукових конференціях співробітників Львівського національного університету імені Івана Франка (2000-2005 рр.). Матеріали роботи були представлені на ІІІ з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002), міжнародній конференції "Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи", приуроченій до 80-ліття з дня народження проф. І.В. Шостаковської (Львів, 2004), 7-ій Пущинскій школі-конференції молодих вчених “Биологія–наука ХХІ століття”, (Пущино,2003) та міжкафедральному семінарі біологічного факультету у грудні 2004 року.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових виданнях, 3 тез доповідей в матеріалах міжнародних та українських наукових конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків, додатків, а також списку використаних джерел (222 найменування). Робота викладена на 144 сторінках, ілюстрована 49 рисунками і 7 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
В розділі “Огляд літератури” узагальнено сучасні уявлення про систему прооксидантно–антиоксидантного гомеостазу зародків тварин, проаналізовано критерії впливу антибіотиків фторхінолонового ряду та катіонів кальцію й магнію на інтенсивність вільнорадикальних реакцій різних об’єктів, розглянуто ембріотоксичну та тератогенну дію фторхінолонів.
Дослідження проведено на зародках в’юна Misgurnus fossilis L. у період від запліднення яйцеклітин до закінчення стадії дроблення бластомерів. В’юн широко використовується в ембріологічних, біохімічних, цитологічних дослідженнях з огляду на відносно коротку тривалість періоду ембріогенезу, легкість одержання статевих клітин і відсутність особливих труднощів в утриманні цих риб (Нейфах А.А., 1977).
Овуляцію стимулювали внутрішньом’язовим введенням самкам хоріогонічного гонадотропіну (500 од.). Ікру одержували через 36 год після стимуляції та запліднювали в чашках Петрі суспензією сперміїв за Нейфахом (Нейфах А.А., 1977). Сім’яники отримували після декапітації та розтину черевної порожнини самців. Через 5-10 хв після запліднення зиготи відмивали та інкубували у фізіологічному розчині Гольтфретера (t = 20-22С).
Інтенсивність процесів ПОЛ оцінювали за накопиченням продуктів, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-позитивних продуктів) (Тимирбулатов и соавт., 1988). Активність ферментів системи АОЗ визначали наступними методами: супероксиддисмутаза (СОД) (супероксид: супероксид-оксидоредуктаза (КФ 1.15.1.1)) (Костюк и соавт., 1990), каталаза (КАТ) (гідроген-пероксидаза: гідроген-пероксид оксидоредуктаза (КФ 1.11.1.6)) (Королюк, 1988), глутатіонредуктаза (ГР) (глутатіонредуктаза (КФ 1.6.4.2)) (Путилина, 1982), глутатіонпероксидаза (ГПО) (глутатіонпероксидаза (КФ 1.11.1.9)) (Моин, 1988). Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951)
Статистичне опрацювання експериментальних даних здійснювали з використанням програмного пакета Microsoft Excel. Вірогідність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента. Однофакторний та двофакторний дисперсійний аналіз проводили за допомогою програм статистичної обробки Microsoft Excel, який використовували також для проведення кореляційного аналізу. Критичні рівні вірогідності при перевірці статистичних гіпотез у дослідженнях брали рівними 0,95 та 0,99.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
1. Вплив антибіотиків фторхінолонового ряду на розвиток та виживання зародків в’юна Misgurnus fossilis L. Дослідження впливу бороцину та флюміквілу у концентраціях 0,005; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 та 1% на виживання зародків в’юна дають змогу зробити висновок, що флюміквіл інтенсивніше інгібує їх життєздатність, ніж бороцин. Найбільш виражений інгібуючий вплив даних антибіотиків встановлено на 1–шу годину розвитку. Флюміквіл повністю інгібує розвиток зародків у концентраціях 0,1–%, а бороцин –,5–1%. Отримані результати вказують на більшу токсичність флюміквілу. Найбільший відсоток виживання показано за умов присутності в середовищі інкубації досліджуваних фторхінолонів у концентрації 0,005%.
2. Інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів у зародках в’юна за впливу фторхінолонів та катіонів кальцію і магнію. Для оцінки впливу антибіотиків фторхінолонового ряду на еукаріотичні клітини було проведено дослідження їхньої дії на інтенсивність процесів ліпопероксидації у зародках в’юна на різних стадіях раннього ембріогенезу. Визначення вмісту ТБК–позитивних продуктів на 1–шу, 3–тю та 5–ту години розвитку за відсутністю у середовищі інкубації катіонів кальцію та магнію свідчить про найвищу інтенсивність процесів ПОЛ у зародках в’юна на 1–шу годину (144,4±8,7 ммоль/мг білка).
Додавання до інкубаційного середовища (без Ca+ та Mg+) бороцину та флюміквілу у концентраціях 0,0001%, 0,001% та 0,005% призводить до підвищення вмісту ТБК–позитивних продуктів порівняно з контролем (рис. 1, А). Максимальний їх вміст встановлено на 1–шу годину розвитку зародків, що сягає 145,5±9,6 ммоль/мг білка (0,005% бороцин) та 160,9±10,3 ммоль/мг білка (0,0001% флюміквіл). Отже, можна зробити висновок про найвищу чутливість зародків до дії фторхінолонів у досліджуваних концентраціях на ранньому етапі розвитку (1–ша година).
Сумарний вплив іонів кальцію та вищезгаданих антибіотиків спричинює зниження вмісту ТБК–позитивних продуктів (1–години) (рис. 1, Б). За дії іонів магнію вміст продуктів ПОЛ знижується при використанні бороцину (0,0001%) впродовж 1-5 год розвитку та флюміквілу (0,0001%) на 3–тю та 5–ту години. Аналіз дії досліджуваних фторхінолонів на інтенсивність процесів ПОЛ зародків в’юна, які розвивались в кальцій- та магнійвмістному (рис. 1, В) середовищі дає змогу зробити висновок про вищу ефективність їх використання у комплексі з іонами кальцію.
Рис. 1. Вміст ТБК-позитивних продуктів зародків в’юна за дії антибіотиків фторхінолонового ряду (К –контроль, б1, б2, б3, ф1, ф2, ф3 –бороцин та флюміквіл у концентраціях 0,0001%, 0,001% та 0,005% відповідно), інкубованих у різних середовищах (А –за відсутністю катіонів кальцію та магнію, Б –з наявністю катіонів кальцію, В–з наявністю катіонів магнію, Г –з наявністю катіонів кальцію та магнію) (* –р≥0,95; **–р≥0,99).
Оцінка впливу флюміквілу на вільнорадикальні процеси зародків в’юна, що розвивались на середовищі з іонами кальцію та магнію (рис. 1, Г) вказує на зниження рівня кінцевих продуктів ПОЛ на 3–тю годину розвитку. На 1-шу та 3-тю години встановлено підвищення їх рівня за дії бороцину у досліджуваних концентраціях
3. Активність ферментів антиоксидантного захисту зародків в’юна за впливу фторхінолонів та катіонів кальцію і магнію. Як показали отримані нами результати, найвища СОД та каталазна активність на 1–години розвитку в’юна зафіксована при інкубуванні їх на середовищі без іонів кальцію та магнію (рис. 2, А та 3, А, відповідно). За впливу бороцину та флюміквілу встановлено зростання каталазної активності (1–години) та СОД –при використанні 0,001% фторхінолонів (1–години).
Рис. 2. Активність супероксиддисмутази зародків в’юна за впливу антибіотиків фторхінолонового ряду (К –контроль, б1, б2, б3, ф1, ф2, ф3 –бороцин та флюміквіл у концентраціях 0,0001%, 0,001% та 0,005% відповідно), інкубованих у різних середовищах (А –за відсутністю катіонів кальцію та магнію, Б –з наявністю катіонів кальцію, В–з наявністю катіонів магнію, Г –з наявністю катіонів кальцію та магнію) (* –р≥0,95; ** –р≥0,99).
СОД активність максимально підвищується насамперед з катіонами магнію (рис. 2, В) при дії 0,0001% флюміквілу та 0,0001% бороцину (1–ша година розвитку), а на кальцій- та магнійвмістному середовищі –на 1-шу та 3–тю години (рис. 2, Г). Вплив 0,0001% бороцину значно підвищує каталазну активність зародків в’юна, що інкубовані у середовищі з катіонами кальцію (1–години) (рис. 3, Б), магнію –(3–години) (рис. 3, В) та катіонами кальцію та магнію (1–години розвитку) (рис. 3, Г). Додавання до середовища іонів магнію спричинює зниження СОД та підвищення каталазної активності (3–години) (рис. 2, В та 3, В, відповідно).
Рис. 3. Активність каталази зародків в’юна за впливу антибіотиків фторхінолонового ряду (де К –контроль, б1, б2, б3, ф1, ф2, ф3 –бороцин та флюміквіл у концентраціях 0,0001%, 0,001% та 0,005% відповідно), інкубованих на різних середовищах (А –за відсутністю катіонів кальцію та магнію, Б –з наявністю катіонів кальцію, В–з наявністю катіонів магнію, Г –з наявністю катіонів кальцію та магнію) (* –р≥0,99; ** –р≥0,99).
Встановлено зростання активності СОД на 1-шу годину розвитку зародків за умов інкубації в магнійвмісному та безкальційвмісному середовищі інкубації. Це супроводжується зниженням каталазної активності. Однак, більш вираженими є зміни у разі використання флюміквілу.
Зниження СОД активності за впливу антибіотиків на пізніших стадіях розвитку (3–години) на фоні активації каталази, вказує на розбалансованість дії ферментів АОЗ. Сукупний вплив іонів кальцію та магнію зумовлює активацію СОД (1–години) та каталази (1–години розвитку зародків).
Дослідження ферментів глутатіонової системи показали, що ГПО та ГР активність зародків в’юна, інкубованих у досліджуваних середовищах найбільше зростає на 3–тю годину розвитку (рис. 4). Треба зазначити, що ГПО активність є найвищою на даному етапі розвитку на середовищі інкубації з катіонами кальцію, а ГР –на середовищі, що не містять ні катіонів кальцію ні магнію.
Рис. 4. Активність глутатіонпероксидази зародків в’юна за впливу антибіотиків фторхінолонового ряду (де К –контроль, б1, б2, б3, ф1, ф2, ф3 –бороцин та флюміквіл у концентраціях 0,0001%, 0,001% та 0,005% відповідно), інкубованих на різних середовищах (А –за відсутністю катіонів кальцію та магнію, Б –з наявністю катіонів кальцію, В–з наявністю катіонів магнію, Г –з наявністю катіонів кальцію та магнію) (* –р≥0,99; ** –р≥0,99).
|
Рис. 5. Результати двофакторного дисперсійного аналізу впливу катіонів кальцію та магнію на загальну мінливість інтенсивності ПОЛ зародків в’юна у ранньому ембріогенезі. ( А - 1 год, Б - 3 год, В - 5 год розвитку). |
Внесення бороцину та флю-міквілу в інкубаційне середо-вище, що не містить катіонів кальцію та магнію зумовлює активацію ГПО та ГР, причому найбільшою мірою за дії фторхінолонів у концентрації 0,0001%. Аналогічні зміни активності зафіксовано при додаванні у середовище катіо-нів кальцію, магнію та кальцію і магнію.
Зростання активності ферментів АОЗ на фоні інтенсифікації процесів ПОЛ вказує на підвищення адап-тивних можливостей фермен-тативної ланки АОС за дії антибіотиків фторхінолонового ряду.
4. Дисперсійний аналіз впливу катіонів кальцію та магнію на зміни показників ПОЛ та АОЗ зародків в’юна на різних етапах розвитку. З метою кількісної оцінки впливу катіонів кальцію та магнію (N = 5) у загальну мінливість інтенсивності вільнорадикаль-них реакцій на різних стадіях розвитку зародків в’юна проведено 15 серій двофак-торного дисперсійного аналізу.
На стадії 2-х бластомерів частка впливу магнію у контролі становить 84,09% від загального внеску. За умови впливу досліджуваних фторі-нолонів (бороцину та флюмік-вілу) показано, що загальний внесок магнію у мінливість процесів ПОЛ вірогідно зни-жується (рис. 5). Частка впливу сумарної дії кальцію та магнію є високою. При найвищих концентраціях антибіотиків фторхінолонового ряду (0,005%) частки впливу кальцію, магнію та сумарного дії кальцію та магнію є рівноцінними. Через дві години розвитку у контролі від загального внеску досліджуваних металів на мінливість ПОЛ переважає частка впливу магнію, а за впливу бороцину у концентрації 0,001% переважає частка впливу кальцію. За дії фторхінолонів (0,0001% та 0,005%) частка впливу магнію є вищою. На стадії 256-ти бластомерів у контролі залишається високою частка впливу магнію, але за дії 0,001% бороцину внесок магнію у загальну мінливість є незначним. За умов впливу бороцину у концентрації 0,005% частки впливу кальцію, магнію та їх сумарного впливу є рівноцінними. На першу годину розвитку (стадія 2-х бластомерів) частки впливу магнію, кальцію і сумарної дії катіонів цих металів на активність СОД є рівноцінними, що не змінюється протягом наступних стадій розвитку. За дії бороцину у найвищій концентрації частка впливу магнію у загальній мінливості активності СОД значно переважає і становить 88,18%, що спостерігається і за дії флюміквілу в 0,0001% та 0,005% концентраціях. На стадії 32-х бластомерів за дії фторхінолонів частки впливу катіонів металів змінюються. За умов впливу фторхінолонів у найнижчих концентраціях частка впливу сумісної дії магнію та кальцію значно зростає. На стадії розвитку 256-ти бластомерів за дії бороцину та флюміквілу в концентрації 0,001% частка впливу магнію залишається високою. При дослідженні внеску кальцію, магнію та їх сумарної дії на ензиматичну активність каталази на початкових стадіях розвитку (2-х та 32-х бластомерів) у контролі є вищою частка впливу кальцію. За дії досліджуваних антибіотиків на стадії 2-х бластомерів внесок кальцію, магнію та їх сумарної дії є рівноцінним але через дві години розвитку змінюється зростанням частки впливу магнію. Проте на цій ж стадії зростає частка впливу кальцію. При дослідженні внеску кальцію, магнію та їх сумарної дії на зміну активності глутатіонпероксидази показано, що у контролі протягом періоду дроблення бластомерів залишається найвищою частка впливу магнію. На стадії 2-х бластомерів частка впливу магнію за дії досліджуваних фторхінолонів є найвищою. Проте через 2 години розвитку за дії флюміквілу переважає загальний внесок кальцію. На стадії 256-ти бластомерів внесок магнію у загальну зміну активності ГПО за дії фторхінолонів зростає. При дослідженні змін глутатіонредуктазної активності, як у контролі так і за дії фторхінолонів високою залишається частка впливу магнію, яка зберігається протягом всього періоду дроблення.
ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ досліджень
З огляду на високу чутливість до дії факторів зовнішнього середовища та особливості складу мембранних ліпідів риби характеризуються високим рівнем ПОЛ. В той же час порівняно активно функціонує антиоксидантна система, яка в цілому забезпечує знешкодження токсичних пероксидних продуктів і підтримує процеси ПОЛ на певному стаціонарному рівні.
Аналіз отриманих результатів дає змогу зробити висновок про те, що через 2 години після запліднення зародків в’юна значно активуються процеси перекисного окиснення ліпідів. Так, при інкубації зародків в середовищі Гольтфретера максимальний рівень ПОЛ відмічено на 3 годину розвитку, що узгоджується з даними літератури (Мукалов И.О. и др., 1980, Мукалов И.О., 1986). Відомо, що саме через 2 години починається інтенсивний поділ бластомерів зародків, тому зростання вільнорадикального ПОЛ може бути пов’язане з ефективним мембраногенезом (Мукалов И.О., 1984). Ініціація та активація ПОЛ відіграє важливу роль в заплідненні яйцеклітин та стимуляції бластодерм до поділу. Враховуючи здатність іонів кальцію підвищувати інтенсивність ПОЛ, можна припустити, що одним з цих факторів є саме цей катіон. Після запліднення в цитоплазмі клітин значно зростає концентрація вільного кальцію (Медина И.Р. и др., 1987), також перед кожним наступним поділом бластомерів (в період їх синхронних поділів) відмічено викиди вільного кальцію (Гойда О.А., Медина И.Р., 1985). Без іонів кальцію неможливе нормальне запліднення яйцеклітин і ранній розвиток зародків (Гойда О.А., 1993). Показано, що при транслокації іонів кальцію через клітинні мембрани навіть в нормальних умовах відбувається його зв’язування з мембранними ліпідами (Владимиров Ю.А., 2000). Таким чином, зв’язування іонів кальцію з фосфоліпідами дає можливість регулювати ПОЛ не тільки дуже швидко, але, що особливо важливо для селективних властивостей біомембран, швидкість процесу може бути різною на досить близьких ділянках мембран (Антонов В.Ф., 1997). Це має значення для процесів перебудов мембран, що особливо інтенсивно протікають під час ембріонального розвитку.
Інтенсифікація процесів перекисного окиснення ліпідів у зародках в’юна Misgurnus fossilis L за впливу бороцину та флюміквілу супроводжується активацією основних ензимів антиоксидантного захисту (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатіонпероксидаза та глутатіонредуктаза). Це свідчить про підвищення адаптивних можливостей зародкових клітин за дії досліджуваних антибіотиків.
Виходячи з результатів дослідження ми можемо стверджувати, що максимальний ефект впливу досліджуваних фторхінолонів (бороцину та флюміквілу) на процеси ліпопероксидації спостерігається на початкових стадіях розвитку. На пізніших етапах ембріогенезу (через 45 год після запліднення) зміни є менш виражені. З’ясовано, що проникність фторхінолонів знижується при одночасному застосуванні препаратів, які містять іони магнію, заліза, кальцію, магнію, цинку та алюмінію, з якими фторхінолони утворюють хелатні комплекси (Падейская Е.Н. и др., 1995, Падейская Е.Н., 2000, Падейская Е.Н., 2001).
Результати проведеного дисперсійного аналізу свідчать про те, що вплив бороцину та флюміквілу на загальну мінливість інтенсивності ПОЛ є рівноцінним.
Отже, досліджувані фторхінолони можна розглядати як комплексоутворювачі, що здатні зв’язуватись з катіонами кальцію та магнію, змінювати їх активність, а, отже, здатність їх впливати на процеси ПОЛ. Проведені дослідження підтверджують думку, що зародки в’юна Misgurnus fossilis L. є адекватним об’єктом для вивчення токсичного впливу різних фармакологічних та хімічних чинників на живі організми.
ВИСНОВКИ
У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження впливу фторхінолонів та катіонів кальцію і магнію на інтенсивність процесів ПОЛ та стан АОЗ зародків в’юна Misgurnus fossilis L., а також з’ясовано механізми їх впливу на систему прооксидантно–антиоксидантного гомеостазу зародків.
1. Фторхінолони бороцин та флюміквіл у діапазоні досліджуваних концентрацій (0,0001%, 0,001% та 0,005%) дозозалежно змінюють інтенсивність вільнорадикальних реакцій зародкових клітин в порівнянні з контролем. Ступінь їхнього впливу залежить від стадії розвитку зародка та структури самого фторхінолону, що визначає його фізико–хімічні властивості.
2. Показано, що за дії бороцину та флюміквілу в досліджуваних концентраціях відбувається посилення активності перекисного окиснення, при чому бороцин більшою мірою інтенсифікує ПОЛ, ніж флюміквіл.
3. Показано, що оптимальним для розвитку зародків є середовище з наявністю катіонів кальцію та магнію. Досліджено, що при інкубації зародків у середовищі з наявністю магнію вірогідно знижується інтенсивність вільнорадикальних реакцій, а при інкубації зародків у середовищі з наявністю кальцію, навпаки, посилюється інтенсивність процесів ПОЛ.
. Показано, що за дії бороцину та флюміквілу в досліджуваних концентраціях відбувається зміна активності ензимів антиоксидантної системи зародків в’юна. За сумісної дії фторхінолонів та катіонів кальцію та магнію відмічено зростання інтенсивності вільнорадикальних реакцій на фоні зниження активності СОД.
. Двофакторний дисперсійний аналіз впливу катіонів кальцію та магнію на зміну кінцевих продуктів ПОЛ та ферментів АОЗ зародків в’юна на різних стадіях розвитку показав що за дії досліджуваних фторхінолонів на початкових етапах розвитку їхній внесок є рівноцінним і близьким за значенням. У подальшому розвитку зростає частка впливу магнію на досліджувані показники.
. Встановлено, що летальною концентрацією, при якій інгібується розвиток зародків в’юна, є концентрація для бороцину –,5% і для флюміквілу –,1%.
. Отримані результати дають підставу вважати, що зародки в’юна Misgurnus fossilis L. на стадіях синхронних поділів бластомерів є зручною та адекватною тест–системою для дослідження впливу фармакологічних та хімічних чинників на живі організми.
Список опублікованих автором праць за темою дисертації
1. Тарновська А.В., Санагурський Д.І. Вплив іонів кальцію, магнію та високомолекулярних сполук на виживання зародків риб // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2002. - Вип. 31. - С. 3 - 15. (Здобувач самостійно виконала експериментальну частину та статистичне опрацювання отриманих результатів, проаналізувала та узагальнила літературні джерела, брала участь в аналізі експериментальних даних, оформленні та написанні статті).
2. Тарновська А.В., Смалюх Г.І., Санагурський Д.І. Інтенсивність процесів ліпопероксидації у зародках в’юна під впливом катіонів кальцію, магнію та антибіотиків класу фторхінолони // Вісн. Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2003. - Вип. 34. - С. 19 - 25. (Здобувач провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, проаналізувала та узагальнила літературні джерела, взяла участь в аналізі експериментальних даних та в їх обговоренні, підготувала до друку статтю).
3. Тарновська А.В., Дика М.В., Санагурський Д.І. Вплив бороцину та флюміквілу на інтенсивність пероксидної оксидації ліпідів у зародках в’юна (Misgurnus fossilis L.) // Львів. мед. часопис. - 2004. № 1 - С. 55-61. (Здобувач провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, проаналізувала та узагальнила літературні джерела, взяла участь в аналізі експериментальних даних та в їх обговоренні, підготувала до друку статтю).
4. Тарновська А.В., Дика М.В., Санагурський Д.І. Перекисне окиснення ліпідів та антиоксидантний статус у зародків в’юна за умов впливу фторхінолонів // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького. 2004. Том 6 (№1), частина 2. С.260-265. (Здобувач провела дослідження та статистичне опрацювання результатів, проаналізувала та узагальнила літературні джерела, взяла участь в аналізі експериментальних даних та в їх обговоренні, підготувала до друку статтю).
5. Тарновська А.В., Смалюх Г.И., Санагурский Д.И. Влияние фторхинолонов на изменение показателей перекисного окисления липидов у зародышей вьюна // Сборник тезисов 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология–наука ХХІ века”. –Пущино. –. –С. 77-78. (Здобувач провела дослідження, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді, представляла стендову доповідь на конференції).
6. Тарновська А.В., Дика М.В., Санагурський Д.І. Активність ферментів антиоксидантної системи зародків в’юна за умов впливу фторхінолонів // матеріали міжнародної конференції "Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи", приуроченої до 80-ліття з дня народження проф. І.В. Шостаковської. –Львів ––с. 70. (Здобувач провела дослідження, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді, представляла стендову доповідь на конференції).
7. Тарновська А.В., Санагурський Д.І. Особливості зміни фракційного складу ліпідів мембран зародків в’юна під впливом іонів кальцію та магнію // Тези доповідей ІІІ з’їзду Українського біофізичного товариства 8-11 жовтня 2002 року, Львів, 2002. с. 119. (Здобувач провела дослідження, взяла участь в аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез доповіді, представляла стендову доповідь на конференції).
АНОТАЦІЯ
Тарновська А.В. Перекисне окиснення ліпідів у зародках в’юна за впливу фторхінолонів, іонів кальцію та магнію. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02–біофізика. –Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2005.
Дисертація присвячена дослідженню процесів перекисного окиснення ліпідів зародків в’юна Misgurnus fossilis L. за умов дії фторхінолонів та катіонів кальцію та магнію. Вперше проведено дослідження впливу фторхінолонів на систему прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу зародкових клітин. Встановлено, що вплив фторхінолонів на зародки в’юна протягом ембріогенезу реалізується на мембранному рівні, а саме через активування інтенсивності вільнорадикальних реакцій та зміну ензиматичної активності антиоксидантної системи. Ступінь впливу антибіотиків залежить не тільки від концентрації препаратів у середовищі інкубації, а й від стадії розвитку зародків та від структури самого фторхінолону, що визначає його фізико-хімічні властивості. Одержані результати розширюють уявлення про механізми впливу фторхінолонів бороцину та флюміквілу на зародкові об’єкти.
За допомогою методу електронної мікроскопії досліджено вплив антибіотиків бороцину та флюміквілу на морфологію зародків в’юна. Показано, що вплив бороцину в концентрації 0,001% і флюміквілу в концентрації 0,01% веде до затримки розвитку та появи різних аномалій у личинок в’юна.
Вперше з’ясовано, що вплив досліджуваних фторхінолонів веде до активації системи ПОЛ. Показано, що іони кальцію активують проходження процесів ПОЛ в зародках в’юна, а вплив іонів магнію веде до зниження активності ПОЛ на початкових стадіях дроблення бластомерів. З’ясовано, що іони кальцію посилюють активуючий вплив бороцину та флюміквілу на процеси ПОЛ, а іони магнію –нівелюють його.
Ключові слова: перекисне окиснення ліпідів, ферменти антиоксидантного захисту, зародки в’юна, поділ бластомерів, фторхінолони, катіони кальцію та магнію.
АННОТАЦИЯ
Тарновская А.В. Перекисное окисление липидов зародышей вьюна при действии фторхинолонов, ионов кальция и магния. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 –биофизика. –Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2005.
Диссертация посвящена исследованию процессов перекисного окисления липидов зародышей вьюна Misgurnus fossilis L. при действии антибиотиков фторхинолонового ряда (бороцина и флюмиквила в концентраціях 0,0001%, 0,001% и 0,005%) и катионов кальция и магния. Впервые исследовано влияние фторхинолонов на систему прооксидантно-антиоксидантного гомеостаза зародышевых клеток. Установлено, что деиствие фторхинолонов на зародыши вьюна на протяжении эмбриогенеза (1, 3 и 5 час развития) реализируется на мембранном уровне, а именно через активирование интенсивности свободнорадикальных реакций и изменение энзиматической активности антиоксидантной системы. Степень влияния антибиотиков зависит не только от концентрации препаратов в среде инкубации, но и от стадии развития зародышей и от структуры фторхинолона, что определяет его физико-химические свойства. Полученные результаты расширяют представление о механизмах влияния бороцина и флюмиквила на зародышевые объекты.
Исследование влияния бороцина и флюмиквила в концентраціях 0,005; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 та 1% на выживание зародышей в’юна Misgurnus fossilis L. позволяют сделать вивод о том, что флюмиквил более интенсивно ингибирует жизнеспособность, чем бороцин. Наиболее выражено ингибирующее влияние исследуемых антибиотиков установлено на 1 час развития. Флюмиквил полностью ингибирует развитие зародышей в концентраціях 0,1–%, а бороцин –,5–1%. Полученые результаты подтверждают более выраженую токсичность флюмиквила. Наибольший процент выживания показано в присутствии в среде инкубации исследуемых фторхинолонов в концентрации 0,005%.
С помощью метода электронной микроскопии исследовано влияние антибиотиков бороцина и флюмиквила на морфологию зародышей вьюна. Показано, что влияние бороцина в концентрации 0,001% и флюмиквила в концентрации 0,01% ведет к задержке развития и появления различных аномалий у личинок вьюна.
Впервые выяснено, что влияние исследуемых фторхинолонов ведет к активации системы перекисного окисления липидов. Показано, что ионы кальция активируют прохождение процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в зародышах вьюна, а влияние ионов магния ведет к снижению интенсивности ПОЛ на начальных стадиях дробления бластомеров. Выяснено, что ионы кальция усиливают активирующее влияние бороцина и флюмиквила на процессы ПОЛ, а ионы магния –нивелируют его.
Ключевые слова: перекисное окисление липидов, антиоксидантная система, супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, зародыши вьюна, деление бластомеров, фторхинолоны, катионы кальция и магния.
SUMMARY
Tarnovska A.V. The peroxide lipid oxidation in loach embryos under the action of fluoroquinolones, calcium and magnesium ions. –Manuscript.
Thesis for Ph.D. degree on speciality 03.00.02 –biophysics. Ivan Franko National University of Lviv, Lviv, 2005.
The dissertation is devoted to research of peroxide lipid oxidation processes in loach Misgurnus fossilis of L. under the action of fluoroquinolones and calcium and magnesium cations. For the first time the investigation of influence of fluoroquinolones was conducted on the system of prooxidant-antioxydant homoeostasis of embryos cells. It was established, that the effect of fluoroquinolones on embryos of loach during embryogenesis was realized on membrane level, namely through activation of intensity of free-radical reactions and alteration of antioxydation system enzyme activity. The degree of action of antibiotics did not depends only on the concentration of preparations in the incubation medium, but also on the stage of development of embryos and on the structure of fluoroquinolone that determined its physical and chemical properties. The results obtained extend our notion about the mechanisms of influence of fluoroquinolones –borocin and flumiquil on embryonic objects.
By the method of electronic microscopy the influence of antibiotics of borocin and flumiquil on the morphology of loach embryos was investigated. It was shown, that the action of borocin in the concentration of 0,001% and flumiquil in the concentration of 0,01% led to the delay of development and appearance of different anomalied in the loach larvae.
For the first it was found out, that the influence of these fluoroquinolones led to activation of peroxide oxidation of lipids (POL) system. It was shown, that the calcium ions activated the POL processes in loach embryos, while the magnesium ions decreased the POL activity in them on the initial stages of blastomeres dividing. It was found out, that calcium ions intensified the activating action of borocin and flumiquil on the POL processes, while the magnesium ions eliminated that effect.
Key words: peroxide lipid oxidation, antioxidant system, superoxide dismutase, catalase, glutationperoxidase, glutationreductase, embryos of loach, division of blastomeres, fluoroquinolone, cations of calcium and magnesium.
Підписано до друку 02.06.05 р.
Формат паперу 6090/16. Гарнітура Times. Папір офсетний.
Наклад 100 прим. Умовних друк. арк. 0,9. Замовл. № 34
Друк ПП “Арал”
м. Львів, вул. Нижанківського, 4.