реферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук.2
Работа добавлена на сайт samzan.net:
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Шевченко Тетяна Петрівна
УДК 578.85/865.1:578.1
біологічнІ та молекулярнІ особливостІ ізолятів
вірусу тютюнової мозаїки (Tobamovirus), виділених
з РІЗНИХ регіонів України
03.00.06-вірусологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ –
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті агроекології
та біотехнології УААН
Науковий керівник: доктор біологічних наук,
професор, академік УААН Бойко Анатолій Леонідович,
Київський Національний Університет
імені Тараса Шевченка, завідувач
кафедрою вірусології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, ст. наук.
Співробітник Щербатенко Іван Степанович,
Інститут мікробіології та вірусології
ім. Д.К.Заболотного НАН України,
завідувач відділу фітопатогенних вірусів
кандидат біологічних наук, доцент
Мельничук Максим Дмитрович,
Національний аграрний університет,
завідувач кафедрою
фізіології рослин, вірусології та біотехнології
Провідна установа: Інститут сільськогосподарської
мікробіології УААН, м. Чернігів
Захист дисертації відбудеться “11”_грудня_____2001 р. о 16годині
на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського
Національного Університету імені Тараса Шевченка за адресою:
, Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, ауд. 215
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського
Національного Університету імені Тараса Шевченка:
, Київ-33, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий “_7_”__листопада__2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Молчанець О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Нові штами представляють собою вихідний матеріал для еволюції вірусів. Оскільки РНК-вмісним вірусам бракує механізму виправлення помилок під час реплікації геному, то часто спостерігається утворення ними мутантів внаслідок однієї чи декількох нуклеотидних замін (Banerjee et al., 1995). Молекулярні механізми, за допомогою яких утворюються певні варіації у вірусній популяції, в своїй більшості ті ж самі, що й у клітинних організмів, за виключенням того випадку, коли у багатьох груп вірусів рослин матеріалом є не ДНК, а РНК (Elena, 2000). Одинична заміна основи, що призводить до заміни відповідної амінокислоти у білку є, ймовірно, однією з найбільш звичайних подій, які дають початок природній мінливості (Matthews, 1992). Первинна структура капсидних білків природніх штамів ВТМ підтверджує цей погляд. Щодо невеликих РНК-вмісних вірусів, до яких належить і ВТМ, капсидний білок є винятково важливим для опису вірусу та його штамів (Van Regenmortel, 1999). Крім загальних властивостей цього білку (розміру, амінокислотного складу, вторинної та третинної структури), багато інших його властивостей частково або майже повністю можуть визначати й функції вірусу (Lartey, 1996). Вони включають в себе серологічну специфічність, архітектуру віріону, електрофоретичну рухливість (Murphy, 1995). Тому вивчення штамового різноманіття шкодочинних вірусів, розробка надійних методів їх діагностики є актуальним сьогодні для вирішення ряду як теоретичних, так і прикладних завдань.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась відповідно проекту “Розробка комплексної еколого-економічної оцінки території України та системи оптимізації сільськогосподарського виробництва з урахуванням природно-ресурсного потенціалу та еколого-токсикологічної ситуації” (№ держ. реєстрації 0196U012978) у рамках проблеми “Моніторинг та прогнозування фітовірусної ситуації на сільськогосподарських культурах в різних агроценозах України з позиції підвищення їх урожайності”.
Мета та завдання досліджень. Виділити природні ізоляти ВТМ з рослин різних регіонів України та порівняти їх з типовими штамами за допомогою різних методів, як вірусологічних, так і імунохімічних. Удосконалити існуючі та розробити нові методики ідентифікації вірусів. Вивчити можливість застосування триптичних фрагментів капсидних білків вірусів для ідентифікації їх штамів.
Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі завдання:
Виділити природні ізоляти представників Tobamovirus та порівняти їх з типовими штамами за допомогою методів біологічних тестів на рослинах-індикаторах, електронної мікроскопії, електрофорезу білків та нуклеїнових кислот, імуноелектроблотингу та імуноферментного аналізу в різних модифікаціях.
Отримати діагностичні сироватки для ідентифікації вірусів імуноферментним методом у різних його варіаціях.
Застосувати метод фрагментації капсидних білків вірусних віріонів для порівняння штамів між собою.
Вивчити можливість застосування методу атомно-силової мікроскопії для виявлення локалізації антитіл на поверхні ВТМ як засобу експрес-діагностики.
Наукова новизна одержаних результатів. Отримано нові ізоляти ВТМ, відмінні за своїми молекулярно-біологічними властивостями. Вперше показана можливість візуалізації антигенних детермінант вірусних часток з використанням атомно-силової мікроскопії. Була показана можливість використання імунологічних властивостей пептидних фрагментів капсидного білку вірусу для вивчення штамового різноманіття вірусу тютюнової мозаїки.
Об’єкт дослідження –ізоляти вірусу тютюнової мозаїки.
Предмет дослідження –молекулярно-біологічні властивості ізолятів вірусу тютюнової мозаїки.
Методи дослідження включали метод біологічного тестування з використанням рослин-індикаторів, вивчення структурних білків із застосуванням методів електрофорезу, імуноферментного аналізу, імуноелектроблотингу, високоефективної рідинної хроматографії, дослідження РНК ізолятів ВТМ методами електрофорезу та рестрикційного аналізу кДНК РНК їх капсидних білків.
Практичне значення роботи. Отримано діагностичні поліклональні сироватки до окремих ізолятів ВТМ, які можуть бути використаними на спецкурсах кафедри вірусології Київського Національного університету ім. Тараса Шевченка по вивченню антигенних властивостей вірусів рослин. Створено діагностичні системи на основі отриманих діагностичних сироваток з використанням лужної фосфатази, які можуть бути використані в діагностичних лабораторіях для детекції ВТМ в рослинному матеріалі та грунті. Оптимізовано етап нанесення вірусного антигену для постановки непрямого імуноферментного аналізу. Розроблена методика дослідження реакції антиген-антитіло з використанням атомно-силової мікроскопії на прикладі ВТМ.
Особистий внесок здобувача. Інформаційний пошук, опрацювання літературних даних, розробка схеми експерименту, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретацію автором дисертації здійснено особисто. Підготовка матеріалів до друку здійснена за участю Поліщука В.П. Результати дослідження з використанням атомно-силової мікроскопії здійснені спільно із науковим співробітником Інституту фізики напівпровідників НАНУ Бекетовим Г.В. ВЕРХ здійснена з участю наукових співробітників Інституту біоорганічної хімії НАНУ Ткаченко Т.Ю та Вітера С.С. Синтез праймерів та кДНК капсидних білків ізолятів був здійснений за участю Бубряка І.І., Оксфордський університет (Англія).
Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи були представлені на: Міжнародному регіональному семінарі “Захист навколишнього середовища: сучасні дослідження в екології та мікробіології”, Ужгород, Україна, 1997 рік; ІІ Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси”, Київ, Україна, 1998 рік; Конференції по генетиці та молекулярній біології для молодих вчених, Львів, 1999 рік; 5-му Конгресі Європейського товариства фітопатологів, Таорміна, Італія, 2000; 6-му Міжнародному Симпозіумі по “+” РНК геномним вірусам, Париж, 2001 рік.
Публікації. За метеріалами дисертації опубліковано 13 наукових праць, з яких 7 статей у наукових журналах та 6 –матеріали конференцій.
Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг роботи становить 136 сторінок машинописного тексту і складається зі вступу, п’яти розділів, висновків, списку літератури, який містить 212 посилань (з яких 152 іноземних авторів). Робота містить 2 таблиці та 35 рисунків.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури складається з розділів, в яких наведені дані останніх років стосовно штамового різноманіття представників роду Tobamovirus, висвітлені питання штамоутворення вірусів рослин, генетичної характеристики вірусних популяцій, впливу екологічних факторів на штамове різноманіття фітовірусів, а також обговорюються наслідки застосування результатів вивчення штамового різноманіття вірусів.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єктом дослідження були ізоляти ВТМ, виділені з Plantago major L. (подорожник великий) Зони відчуження ЧАЕС (ВТМч) та Шацького Національного парку (ВТМш). Накопичення вірусу здійснювали на рослинах Nicotiana tabacum сv. trapeson. Виділення вірусного матеріалу проводили за раніше описаною методикою (Dorokhov et al., 1983). Концентрацію вірусу визначали спектрофотометрично. Виділення капсидного білку ізолятів здійснювали ацетатним методом (Френкель-Конрат, 1972).
При встановленні відмінностей між амінокислотними послідовностями капсидних білків різних ізолятів використовували як хімічне розщеплення за допомогою бромциану, так і ферментативне розщеплення трипсином. Електрофоретичне дослідження продуктів реакції проводили по Лемлі з використанням 14% розділяючого та 5% концентруючого поліакриламідного гелю з подальшим фарбуванням кумассі блакитним R-250. Визначення молекулярних мас білків здійснювали за допомогою використання набіру маркерних білків LMW (кДа): 94, 67, 43, 20.1, 14.4. Електрофорез низькомолекулярних триптичних фрагментів капсидних білків виконували по Hoefer (1993) з подальшим переносом на полівінілідендифлуоридову мембрану у буфері Towbin та імунодетекцією антивірусними поліклональними кролячими сироватками до кожного ізоляту ВТМ в непрямому імуноферментному аналізі із застосуванням лужної фосфатази. Для визначення молекулярних мас використовували набір низькомолекулярних маркерних білків (кДа): 29, 21, 12.5, 6.5. РНК досліджуваних ізолятів вірусу тютюнової мозаїки була виділена методом фенольної екстракції.
Для імунологічних методів дослідження вірусів отримували вірусспецифічні кролячі поліклональні сироватки. Специфічність отриманих сироваток перевіряли за допомогою імуноелектроблотингу. Серологічні властивості отриманих ізолятів вивчали методом імуноферментного аналізу в різних модифікаціях. Серологічну спорідненість вивчали за допомогою конкурентного аналізу з використанням як гомологічних, так і гетерологічних сироваток до кожного ізоляту.
Якість та порівняння препаратів РНК оцінювали горизонтальним електрофорезом в 0.8 % агарозному гелі в 0.089 М тріс-боратному буфері, рН 8.0. Фарбування проводили бромистим етидієм.
Виявлення відмінності між капсидними білками досліджуваних ізолятів було проведено за допомогою клонування ділянки РНК, що кодувала капсидний білок вірусу, методом RT-PCR. Для постановки RT-PCR застосовували праймери, підбір яких здійснювали з використанням програми “Primer detection”. Синтез кДНК здійснювався за допомогою RT-PCR з використанням системи “Ready-To-GoTM RT-PCR Beads” фірми “Amersham pharmacia biotech” (США) за загальноприйнятою методикою. Очистка продуктів здійснювалась за допомогою відповідного кіта очистки кДНК (DNAce Spin PCR Pure Kit Sample "Bioline", UK) при загальному кінцевому виході до 90%. Ефективність проведення RT-PCR перевірялась за допомогою електрофорезу в 10% поліакриламідному гелі.
Для встановлення відмінностей між ізолятами було здійснено рестрикційний аналіз кДНК з використанням ферментів Hpa II та Tag I за загальноприйнятою методикою. Результати рестрикційного аналізу перевіряли за допомогою електрофорезу в 10% ПААГ.
В атомно-силових дослідженнях використовувався мікроскоп Nanoscope D 3000 (Digital Instruments, USA). Для вивчення реакції антиген-антитіло (Аг-Ат) в якості Аг використовували суспензію ВТМ в концентрації 0.8 мг/мл, як Ат були взяті мишачі моноклональні Ат, специфічні до звичайного штаму ВТМ, з робочим титром, що в 10 раз перевищує робочий титр для імуноферментного аналізу. Термін контакту становив 24 год при кімнатній температурі.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Характеристика виділених ізолятів ВТМ.
Відібрані з природніх ценозів рослини мали системну реакцію, яка проявлялалася у вигляді мозаїчних симптомів у випадку Чорнобильської зони та симптомів фіолетового забарвлення подорожника на території Шацького Національного парку. Електронномікроскопічні дослідження виявили паличкоподібні віруси, розміри яких становлять 300±5 х 18±0.2, які є характерними для типового штаму ВТМ.
Для подальшої роботи вірус був накопичений на N. tabacum сорт Самсун із системною реакцією на ураження ВТМ. Симптоми на уражених рослинах з’явились на 11 день після інокуляції, віруси були виділені на 18 день після інокуляції. Спектрофотометричні характеристики ізолятів показали, що співвідношення Е/Едля ВТМч становило 1.21, для ВТМш –.23, а для ВТМд (штамU) –.2.
Результати дослідження біологічних властивостей виділених ізолятів за допомогою механічної інокуляцї спектру рослин-індикаторів подані в таблиці 1.
Таблиця 1
Симптоми, спричинені різними штамами ВТМ на спектрі рослин-господарів
Примітка.* - реакції рослин-індикаторів на томатний штам ВТМ приведені за даними Новікова В.К. та інших (2000).
Ізолят ВТМч за симптоматикою, а саме, некрози на Ch.amaranticolor та N.glutinosa, N.rustica та N.tabacum сорт Імунний і системна реакція на N. sylvestris та N. tabacum сорт Самсун, аналогічний штаму ВТМ U. У той же час ВТМш не дав некрози на N. glutinosa та системну реакцію на N. sylvestris, що свідчить про біологічну відмінність даного ізоляту.
У нашій роботі ми використали декілька сироваток до різних штамів ВТМ, які відрізняються між собою за біологічними характеристиками. Серед цих штамів були звичайний штам ВТМ U, який розповсюджений в своїй більшості на тютюні; томатний штам, виділений з томатів, що інфікує тільки рослин родини Solanaceae; та хрестоцвітний штам, який ефективно репродукується і забезпечує системне ураження як рослин родини хрестоцвітних (Brassica compestris L., Arabidopsis thaliana), так і тютюн (Nicotiana tabacum L.). Отже, для виявлення серологічної спорідненості були використані поліклональні кролячі сироватки до звичайного штаму U, томатного штаму ВТМ (ВТМто) та хрестоцвітного штаму (ВТМкр), який є найвіддаленішим штамом з групи тобамовірусів.
Встановлення серологічних властивостей отриманих ізолятів здійснювали методом ІФА в модифікації DAS-ELISA, контролем слугувала нормальна кроляча сироватка.
У результаті проведення аналізу найбільшу спорідненість отримані ізоляти мали з ВТМ U, так як вони активно реагують з сироваткою до цього штаму (рис.1), про що свідчить
Рис. 1. Результати імуноферментного аналізу: а –ВТМч; b –ВТМш;
1 –сироватка до хрестоцвітного штаму ВТМ; 2 –сироватка до звичайного штаму ВТМ; 3 –сироватка до томатного штаму ВТМ; 4 –нормальна сироватка.
показник оптичної густини Е492. Таким чином, з сироваткою до томатного штаму ВТМ ізоляти ВТМч та ВТМш реагують на 81.2% та 69.1%, відповідно, у порівнянні з сироваткою до типового штаму ВТМ. Стосовно сироватки, яка специфічна до хрестоцвітного штаму, то з нею ізоляти ВТМч та ВТМш реагували на 11 % та 9.8%, відповідно. Отже, отримані нами ізоляти є спорідними як до звичайного штаму ВТМ, так і до томатного, і неспоріднені з хрестоцвітним штамом ВТМ.
2.Оптимізація непрямого імуноферментного аналізу для детекції ВТМ.
З метою оптимізації постановки непрямого ІФА для нанесення вірусного антигену на полістироловий планшет використовувався підібраний спектр покривних буферів (табл. 2).
За отриманими даними непрямого ІФА робочі титри сироваток до ВТМ U та ВТМч складали 1:32000, та титр сироватки до ВТМш – 1:8000. При порівнянні покривних буферів для нанесення антигену з різною іонною силою у непрямому ІФА встановлено, що лише лужні покривні буфери, а саме тріс-боратний, рН 8.5, та карбонатний, рН 9.6, відображали титр досліджуваних сироваток належним чином. Це пов’язане з кращою адсорбцією білків капсиду віріонів на полістиролі при лужних значеннях рН.
Таблиця 2
Покривні буфери, які використовувалися для нанесення антигену в непрямому ІФА
Специфічність отриманих сироваток перевіряли за допомогою імуноелектроблотингу за Тоубіном з кожним вірусним ізолятом та соком здорової рослини. Отримані результати свідчать, що сироватки реагують тільки з вірусними антигенами та не вступають у реакцію із жодним компонентом рослинного сроку. Таким чином, ми отримали якісний інструмент для порівняння серологічної спорідненності ізолятів між собою, яка залежить від Аг детермінант капсидних білків.
3.Структурні компоненти досліджуваних ізолятів.
При вивченні біологічних властивостей досліджуваних ізолятів та порівнянні їх з типовим штамом ВТМ були виявлені відмінності в реакціях на рослинах-індикаторах, а саме відсутність симптомів на N.glutinosa та N.sylvestris при ураження їх ізолятом ВТМш.
У результаті проведення електрофорезу в треках кожного із ізолятів спостерігався лише один білковий компонент, обрахунок молекулярної маси якого становив 18.0±0.5 кДа. Це значення Mr за літературними даними знаходиться в межах діапазону молекулярних мас для капсидного білку ВТМ U, який становить 17-18 кДа (Bushen-Osmond, 1998). Отже, капсидні білки виділених ізолятів та типового штаму ВТМ не відрізняються за молекулярними масами.
Наступним етапом роботи було встановлення серологічної спорідненості виділених ацетатним методом капсидних білків вірусів за допомогою ІФА з використанням поліклональних сироваток, отриманих як до типового штаму ВТМ, так і до досліджуваних ізолятів.
Середній рівень інгібування становив більше 50%, що свідчить про серологічну спорідненість капсидних білків досліджуваних вірусів.
Проведення електрофорезу пептидів, отриманих у результаті розщеплення бромцианом, показало відсутніть метіоніну в пептидному ланцюгу капсидного білку всіх ізолятів. У подальшому проводили трипсинізацію виділених ацетатним методом капсидних білків ізолятів ВТМ та як контроль –капсидного білку ВТМ U.
У результаті трипсинізації капсидних білків ізолятів ВТМ утворилось 13 триптичних фрагментів, довжина яких варіює від 3-х до 41-ї амінокислоти.
Трипсинізований капсидний білок досліджувався в електрофорезі низькомолекулярних білків і пептидів з наступним імуноелектроблотингом. Контролем слугували нативні структурні білки відповідних ізолятів та штаму U. Результати переносу білків на мембрану PVDF та їх імунологічної детекції показали наявність ідентичних нефрагментованих капсидних білків контролю (двох ізолятів та штам U) з молекулярною масою близько 18.0±0.5 кДа. У випадку треків із трипсинізованими зразками ВТМч та U, кролячі антисироватки імунологічно не виявили будь-яких білків. Щодо ізоляту ВТМш, то антисироватка до цього вірусу показала присутність білку масою близько 12 кДа. Така різниця свідчить про певну відмінність антигенних детермінант триптичних фрагментів капсидних білків ВТМч та штаму U від антигенних детермінант нативних білків цих вірусів (при трипсинізації змінюються їх антигенні детермінанти), а також про збереження відповідних детермінант при деградації трипсином у випадку ізоляту ВТМш.
У результаті проведення ВЕРХ в градієнті ацетонітрилу було отримано 14 пептидних фракцій, профіль яких був подібний між ізолятами та звичайним штамом ВТМ (рис.2). З представлених піків пік К відповідає трипсину, який брав участь в трипсинізації. Піки H, I та N містять триптофан у своєму ланцюгу. Таким чином, ми показали, що ферментативне розщеплення трипсином приводить до утворення пептидних фракцій, які загалом подібні між собою по кількості піків.
Профіль отриманих триптичних фракцій однаковий у всіх ізолятів ВТМ, однакова кількість цих фракцій та однакові величини відповідних фракцій. Найбільшими за площами піків є фракції F, H, L, N. За даними АК-аналізу СР ВТМ, найдовші фрагменти, які утворюються після трипсинізації, розташовані на N та C-кінцях.
Рис.2. Розділення триптичних фрагментів капсидних білків в градієнті ацетонітрила методом ВЕРХ: 1 –ВТМ U, 2 –ВТМш, 3 –ВТМч.
При дослідженні антигенних властивостей окремих фракцій, отриманих після трипсинізації методом непрямого ІФА, були використані сироватки, специфічні до кожного з ізолятів ВТМ. Позитивним контролем були СP відповідних ізолятів ВТМ у концентрації 1 мкг/мл, а негативним –сік здорової рослини.
За даними імуноферментного аналізу фракції можна розділити на 3 групи:
значення оптичної густини реакції Аг-Ат знаходиться на рівні негативного контролю;
значення оптичної густини реакції Аг-Ат становить 20% від значення оптичної густини реакції Аг-Ат для позитивного контролю;
значення оптичної густини реакції Аг-Ат становить 35-50% від значення оптичної густини реакції Аг-Ат для позитивного контролю.
До групи 1 належать фракції A, B, C, D, E, L, до групи 2 –фракції F, H, I, J, до групи 3 –фракції G та N (рис. 3).
Рис.3. Антигенні властивості трипсинізованих фракцій СP ізолятів ВТМ.
Отже, у результаті перевірки антигенних властивостей фракцій найбільш активними виявились фракції G і N, які були в подальшому використані для встановлення їх розміщення на вірусній частці. У непрямому ІФА, заснованому на інгібуванні антигеном (трипсинізована фракція) було встановлено, що фракція NU1 інгібує зв’язування Ат із ВТМ U, що свідчить про поверхневе розміщення антигенних детермінант, які знаходяться на пептидному ланцюгу, що міститься в цій фракції. Стосовно фракцій Nш та Gш, то перша з них не впливає на реакцію зв’язування Ат з вірусними частками, а друга навіть підвищує сигнал зв’язування Аг та Ат, що свідчить про відмінність її від поверхневих Аг детермінант вірусної частки. Фракція Nч також знижує реакцію взаємодії Ат-Аг (рис.4), що свідчить про наявність пептиду у цій фракції, який містить поверхневу антигенну детермінанту.
Рис. 4. Інгібування фракціями триптичних фрагментів реакції зв’язування Ат з ізолятами ВТМ.
Аналіз виділених фенольним методом РНК досліджуваних ізолятів за допомогою електрофорезу нуклеїнових кислот не виявив відмінностей у їх молекулярних масах. За допомогою специфічних праймерів та методу RT-PCR були отримані кДНК до РНК, що кодує СР типового штаму ВТМ (рис.5).
g ctactgtcgc cgaatcggat tcgttttaaa tatgtcttac agtatcacta ctccatctca gttcgtgttc ttgtcatcag cgtgggccga cccaatagag ttaattaatt tatgtactaa tgccttagga aatcagtttc aaacacaaca agctcgaact gtcgttcaaa gacaattcag tgaggtgtgg aaaccttcac cacaagtaac tgttaggttc cctgacagtg actttaaggt gtacaggtac aatgcggtat tagacccgct agtcacagca ctgttaggtg cattcgacac tagaaataga ataatagaag ttgaaaatca ggcgaacccc acgactgccg aaacgttaga tgctactcgt agagtagacg acgcaacggt ggccataagg agcgcgataa ataatttaat agtagaattg atcagaggaa ccggatctta taatcggagc tctttcgaga gctcttctgg tttggtttgg acctctggtc ctgcaacttg aggtagtcaa gatgcataat aaataacgga ttgtgtccgt aatcacacgt ggtgcgtacg ataacgcata gtgtttttcc ctccacttaa atcgaagggt tgtgtcttgg atcgcgcggg tcaaatgtat atggttcata tacatccgca ggcacgtaat aaagcgaggg gttcgaatcc ccccgttacc cc
Рис. 5. Послідовність кДНК, що відповідає за синтез капсидного білку у ВТМ (виділені місця посадки праймерів).
Електрофорез результатів проведення RТ-PCR свідчить про гомогенність в зразках отриманих кДНК та подібність їх молекулярних мас, яка становить близько 700 пн, що не суперечить літературним даним (Banerjee et al.,1993).
Для порівняльного аналізу РНК ізолятів було проведено рестрикційний аналіз з подальшим електрофорезом продуктів рестрикції.
Для рестрикційного аналізу використовували такі рестриктази, які б розрізали кДНК у місцях, що кодують антигенні детермінанти ВТМ або сайти, пов’язані з проявом їх біологічних властивостей. При рестрикційному аналізі з використанням рестриктази Hpa II відмінностей в рестрикційних фрагментах не відмічено, всі ізоляти так само як типовий штам мали два фрагменти з розміром 251 пн та 442 пн (рис.6а), а рестрикціний аналіз з використанням рестриктази Tag I, яка розрізає послідовність кДНК по сайту Т/СGA, показав відмінність між кДНК ВТМш та іншими кДНК. Електрофорез продуктів рестрикції виявив такі фрагменти у ВТМ U та ВТМч: 100 пн, 137 пн, 155 пн та 311 пн, тоді як у ВТМш тільки 100 пн, 137 пн та 155 пн (рис. 6б). Таким чином, відсутність фрагменту 311пн свідчить про зміни в цьому сайті у ізоляту ВТМш.
Рис.6. Електрофорез рестрикційних фрагментів кДНК у результаті дії: а –Hpa II рестриктази, де 1 –маркери (110, 147, 157, 190, 242, 328, 404, 469, 710 пн), 2 –кДНК СР ВТМ U, 3 –кДНК СР ВТМш, 4 –кДНК СР ВТМч; б –Tag I рестриктази, де 1 –маркери (110, 147, 157, 190, 242, 328, 404, 469, 710 пн), 2 –кДНК СР ВТМ U, 3 –кДНК СР ВТМш, 4 –кДНК СР ВТМч.
4. Атомно-силова мікроскопія як новий підхід у вивченні вірусів.
При дослідженні взаємодії Аг-Ат в атомно-силовій мікроскопії умови контакту були підібрані по аналогії з умовами імуноферментного аналізу –год при кімнатній температурі. Зображення фазового зсуву взаємодії ВТМ з IgG дали можливість візуалізувати розподіл Ат по поверхні вірусних часток (рис.7). Після взаємодії з Ат вірусні частки не прилягають одна до одної боковими поверхнями, лежачи окремо або агрегуючи кінець-в-кінець.
Рис.7. Зображення взаємодії ВТМ з антитілами, отримані з допомогою атомно-силового мікроскопу.
Такі дослідження в майбутньому можуть використовуватись як методологічна основа для нового покоління діагностикумів. Крім того, AСM може застосовуватись для вивчення збірки вірусів в умовах in vitro, орієнтації віріонів під дією фізико-хімічних факторів, дослідження процесу кристалізації вірусів та іншого. Метод є унікальним з точки зору вірусології, так як виключає фіксацію препарату, необхідну для досліджень в трансмісійному мікроскопі.
ВИСНОВКИ
Проведено скринінг рослин на вірусоносійство та виділено нові ізоляти ВТМ (Tobamovirus) в зоні Чернобильської АЕС та регіоні Шацького Національного парку з рослин подорожника Plantago major.
За спектром рослин-індикаторів показана відмінність ідентифікованих ізолятів, зокрема ізоляту ВТМш, виділеного з Шацького Національного Парку, у порівнянні зі штамом ВТМ U та ізолятом ВТМч.
У двох досліджуваних ізолятів ВТМ показана відсутність метионіну всередині пептидного ланцюгу їх капсидних білків. Таким чином дані ізоляти не відносяться до штамів ВТМ Cg, OB та Dahlemense, які містять метионін.
Встановлена серологічна подібність антигенних детермінант триптичних фрагментів ВТМч та типового штаму ВТМ, а також відмінність ВТМш у антигенних детермінантах від ВТМч та ВТМ U.
Рестрикційий аналіз кДНК капсидних білків ізолятів показав відміність ізоляту ВТМш в сайті рестрикції рестриктази Tag1. Отже, отримані дані свідчать про подібність ізоляту ВТМч до типового штаму ВТМ та про відмінність ізоляту ВТМш від них, що корелює з даними біологічного тестування на рослина-індикаторах.
Отримано поліклональні діагностичні сироватки до всіх ізолятів ВТМ для створення діагностикумів на основі непрямого ІФА з використанням лужної фосфатази, що дозволить діагностувати ВТМ як в рослинному матеріалі, так і в грунті. Встановлено, що буфери лужного рН, а саме тріс-боратний, рН 8.5, та карбонатний, рН 9.6, можуть бути застосовані в діагностичних системах з метою ідентифікації цих та інших вірусів подібної морфології.
Вперше доведена можливість застосування атомно-силової мікроскопії для виявлення локалізації антитіл на поверхні ВТМ, що дає змогу отримувати нову інформацію про антигенну будову вірусів.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Polischuk V., Boyko A., Spaar D., Budzanivska I., Boubriak O. and Tyvonchuk T. Monitoring of some phytoviral infections in Ukraine // Arh. Phytopath. Pflanz. -1998. -V.31. -pp.459-464.
Тивончук Т.П., Поліщук В.П., Будзанівська І.Г., Бойко А.Л. Вивчення бур’янів як резервантів вірусних інфекцій в агроценозах // Вісник аграрної науки. -1998. -№2. -С.20-22.
Будзанівська І.Г., Поліщук В.П., Тивончук Т.П., Бойко А.Л. Зв’язок між наявністю антигенів фітовірусів в грунті, структурою грунтів та екологічним станом зовнішнього середовища //Вісник аграрної науки. -1998. -№9. -С. 61-63.
Тивончук Т.П., Поліщук В.П., Бойко А.Л. Вивчення штамового різноманіття вірусу тютюнової мозаїки на території України //Агроекологія та біотехнологія: Зб. наук. пр. -К: Вип. 2, 1998. -с.209-213.
Поліщук В.П., Ренгевич О.В., Бекетов Г.В., Тивончук Т.П., Бойко А.Л. Вивчення вірусу тютюнової мозаїки за допомогою атомно-силового мікроскопу //Биополимеры и клетка. -1999. -№ 5. -С.456-460.
Полищук В.П., Тывончук Т.П., Ренгевич Е.В., Бекетов Г.В., Будзанивская И.Г., Бойко А.Л. Использование метода атомно-силовой микроскопии для исследования морфологии и структурной организации вирусов //Микробиол. ж-л. -2000. -Т.62, №6. -С.40-43.
Тивончук Т.П., Шевченко О.В., Бойко А.Л., Поліщук В.П. Порівняльне вивчення молекулярних та серологічних властивостей двох ізолятів вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) та його типового штаму U //Бюлетень Ін-ту с/г мікробіології. -2000. -№7. -С. 34-36.
Polishcuk V., Demyanenko F., Budzanivskaya I., Smalius E., Tyvonchuk T. Identification of plant viruses in different agrocenoses of Ukraine and creation of computer database // International regional seminar “Environment protection: modern studies in ecology and microbiology”. Uzhgorod. Ukraine. -1997. -pp.204-208.
Budzanivskaya Irene, Polischuk Valery, Smalius Elena, Tyvonchuk Tatyana, Boyko Anatoly. Relationship between phytovirus availability in soil of Ukraine and ecological condition of agrocenosis // 16th World congress of soil science. Montpellier. France. 20-26 August 1998. -V.1. -p.204.
Tyvonchuk T.P., Budzanivskaya I.G., Ryzkova A.E A rod-shaped virus isolated from Elytrigia repens growing in the Chernobyl region // Abst. II International conference “Bioresourses and viruses”. Ukraine. 7-10 September 1998. -Kyiv. -1998. -p.219.
T.P.Tyvonchuk, V.P.Polischuk, I.G.Budzanivskaya, E.V.Rengevych. Atomic force microscopy as a modern method in studying of molecular and biological properties of viruses // Abst. Conference on genetics and molecular biology for young scientists. Ukraine. 20-22 April 2000. Lviv. -p.50.
T.P.Tyvonchuk, V.P. polischuk, A.L. Boyko, A.V. Shevchenko. A comparative study of molecular and biological properties of two isolates of tobacco mosaic virus (TMV) and its common strain U// 5th Congress of the European Foundation for plant pathology, Italy. 18-22 September 2000. Taormina-Giardini Naxos. -p.54.
Shevchenko T.P., Shevchenko O.V., Polischuk V.P., Viter S.S., Boyko A.L. Coat protein analysis of two isolates of tobacco mosaic virus tha differed in their host range // 6th International Symposium on Positive Strand RNA Viruses. France, Paris, 28 th May –d June, -p.1-04.
АНОТАЦІЇ
Шевченко Т.П. Біологічні та молекулярні особливості ізолятів вірусу тютюнової мозаїки (Tobamovirus), виділених з різних регіонів України.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 –вірусологія.- Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2001.
Дисертація присвячена дослідженню біологічних та молекулярних властивостей ізолятів ВТМ. Представлені результати порівняльного вивчення двох ізолятів ВТМ, які виділені з Plantago major Чернобильської зони –ВТМч та Шацького Національного парку –ВТМш і порівняння їх з типовим штамом ВТМ U. Тестування на рослинах-індикаторах виявило відмінність ізоляту ВТМш від ВТМч та ВТМ U внаслідок відсутності симптомів на Nicotiana glutinosa та Nicotiana sylvestris.
При хімічному розщепленні капсидних білків ізолятів бромцианом показана відсутість метіоніну всередині пептидного ланцюгу, що свідчить про те, що дані ізоляти не відносяться до штамів ВТМ Cg, OB та Dahlemense.
Отримані специфічні сироватки до ізолятів, а також встановлена серологічна подібність антигенних детермінант триптичних фрагметів капсидних білків ВТМч та ВТМ U, та відмінність у антигенних детермінантах між ВТМш та ВТМ U. Рестрикційний аналіз кДНК капсидних білків ізолятів показав відміність в сайті рестрикції рестриктази Tag1 у ізоляту ВТМш. Отже, отримані дані свідчать про подібність ізоляту ВТМч до типового штаму ВТМ та відмінність ізоляту ВТМш від них.
У роботі представлені методичні підходи використання атомно-силової мікроскопії для дослідження антигенних властивостей вірусів. Вперше доведена можливість застосування атомно-силової мікроскопії для виявлення локалізації атитіл на поверхні вірусної частки ВТМ, що дає змогу отримувати нову інформацію про антигенну будову вірусів.
Ключові слова: вірус тютюнової мозаїки, ізоляти, капсидний білок, триптичні фрагменти, атомно-силова мікроскопія.
Шевченко Т.П. Биологические и молекулярные особенности изолятов вируса табачной мозаики (Tobamovirus), выделенных с различных регионов Украины.- Рукопись.
Диссертация на получение ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 –вирусология.- Киевский Национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2001.
Диссертация посвящена изучению биологических и молекулярных свойств изолятов ВТМ.
Представлены результаты сравнительного изучения двух изолятов ВТМ, выделенных из Plantago major Чернобыльской зоны –ВТМч, и Шацкого Национального парка –ВТМш, а также их сравнение с типичным штаммом ВТМ U. Тестирование на растениях-индикаторах определило отличие изолята ВТМш от ВТМч и ВТМ U вследствие отсутствия симптомов на N. glutinosa и N. sylvestris.
При химическом расщеплении капсидных белков изолятов бромцианом показано отсутствие метионина внутри полипептидной цепи, что свидетельствует о том, что данные изоляты не относятся к штаммам ВТМ Cg, OB и Dahlemense.
Были получены специфичные сыворотки к изолятам и установлено серологическое подобие антигенных детерминант триптических фрагментов капсидных белков ВТМч и ВТМ U, а также отличие антигенных детерминант ВТМш и ВТМ U. Рестрикционный анализ кДНК капсидных белков изолятов показал отличие в сайте рестрикции рестриктазы Tag1 в случае изолята ВТМш. Итак, полученные данные свидетельствуют про подобие изолята ВТМч и типичного штамма ВТМ U, и про отличие изолята ВТМш от них.
В работе представлены методические подходы использования атомно-силового микроскопа (Atomic Force Microscope –AFM) для изучения антигенных свойств вирусов. Впервые доказана возможность использования атомно-силовой микроскопии для локализации антител на поверхности вирусной частички ВТМ, что дает возможность получать новую информацию про антигенную структуру вирусов.
Ключевые слова: вирус табачной мозаики, изоляты, капсидный белок, триптические фрагменты, атомно-силовая микроскопия.
Shevchenko T.P. Biological and molecular properties of tobacco mosaic virus isolates (Tobamovirus) extracted from different regions of Ukraine.-Manuscript.
The thesis for obtaining PhD degree in speciality 03.00.06 –virology. Taras Shevchenko’Kyiv National University, Kyiv, 2001.
The thesis is dedicated to studying of biological and molecular properties of tobacco mosaic virus isolates. Partial isolates’ characteristics included biological test using indicator plants, electronic microscopy, electrophoresis of coat proteins and nucleic acids, HPLC, ELISA, atomic force microscopy (AFM), etc.
Here are represented results of comparative study of two TMV isolates taken from Plantago major plants from Chornobyl region –TMVch, and from Shatsky National park –TMVsh, and also their matching with the typical TMV strain U. The biological test using indicator plants (Chenopodium amaranticolor, Nicotiana glutinosa, N. debneyi, N. tabacum cv. trapeson, N. tabacum cv. Samsun, N. sylvestris and others) showed the distinction of TMVsh from the other viruses by absence of symptoms on N. glutinosa і N. sylvestris.
A single amino acid change in the coat protein may be the only difference detected between strains causing different disease. Chemical digestion of isolates’coat proteins with BrCn demonstrated absence of methionine during the polypeptide chains confirming thus, that these isolates do not belong to following TMV strains: Cg, OB and Dahlemense.
Specific polyclonal antiserums to isolates have been received in order to create diagnosticums based on indirect ELISA with alkaline phosphatase for TMV diagnostics in plant material and soil as well. It was definitely shown, that only alkaline coating buffers (tris-borate, pH 8.5, and carbonate, pH 9.6) may be adequately used in indirect ELISA for identification of TMV and other viruses similar in morphology. Serological similarity of antigenic determinants of coat proteins’tryptic fragments of TMVch and TMV U have been stated as well as their distinction in case of TMVsh and TMV U. Serological difference of TMVsh from the other isolate and typical strain U has been also shown in homo- and heterological systems in cross-reactive ELISA, and ELISA based on antigen inhibition. Results of immunoelectroblotting of CPs’tryptic fragments using polyclonal antiserums demonstrated the difference of TMVsh from TMVch and U strain. Restriction analysis of cDNAs corresponded to genes of isolates’ coat proteins showed a difference in Tag1 restrictase restriction site for TMVsh isolate. Thus, obtained data support similarity of TMVch isolate and typical TMV strain U, and distinction of TMVsh from them both, respectively. Thus, difference in symptom development on host plants is confirmed by difference in structure and antigenic properties of coat proteins of these isolates.
Methodic approaches for using atomic force microscopy (AFM) in studying viruses’antigenic properties are decribed in the work. Opportunity of AFM using for antibodies’ localization on the surface of TMV particle is shown for the first time, that gives a new powerful tool to obtain information on virus antigenic structure.
Key words: tobacco mosaic virus, isolates, coat protein, tryptic fragments, atomic force microscope.
2. Тема контрольной определяется по последней цифре номера зачётной книжки
3. Тема- Управление человеком и управление группойК профессиональным качествам руководителя ориентированного
4. Основные течения в русской психологии в начале XX века (естественнонаучное, духовнорелигиозное, эмпирическое)
5. Лекция 11. Топографические съемки 11
6. 20 г. Гражданин ка именуемый в дальнейшем Наймодатель
7. Взаимодействие детского сада и школы в условиях семейной социализации детей младшего школьного возраста
8. DVD
9. тематичний факультет ІІІ курс Лектор ~ Кметь І1
10. Эмбриональное развитие кости
11. Тематика науководослідницьких робіт має відповідати напрямам секцій наукових відділень МАН
12. Сидерский А. Мищенко Ю
13. Семья в зеркале науки.html
14. Ночевала тучка золотая.html
15. МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ до оформлення курсових проектів (робіт) у
16. политическая деятельность социальные притязания и их удовлетворение
17. 122013 ПН ВТ СР
18. комплекса неполноценности; риск развития осложнений.
19. го октября 2012 - Из печатной версии С 1999 когда американский суд дал Джеку Кеворкиэну длинный тюремный срок
20. Межкультурные коммуникации Никитина М