Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
10
Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна
Бєлоусова Ірина Борисівна
УДК 576.316.352:576.15:595.77:575.22:577.171.7
Функціональна активність політенних хромосом і прояв кількісних ознак у Drosophila melanogaster Meig. у зв'язку з генотипом і дією ювенільного гормону
03.00.15 - генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків - 2005 р.
Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна
Бєлоусова Ірина Борисівна
УДК 576.316.352:576.15:595.77:575.22:577.171.7
Функціональна активність політенних хромосом і прояв кількісних ознак у Drosophila melanogaster Meig. у зв'язку з генотипом і дією ювенільного гормону
03.00.15 - генетика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Харків - 2005 р.
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Харківському національному університеті імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,
заслужений діяч науки і техники України,
Шахбазов Валерій Гайович ,
Харківський національний університет
імені В. Н. Каразіна
Міністерства освіти і науки України,
професор кафедри генетики та цитології
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Злотін Олександр Зиновійович, Харківський національний педагогічний університет імені Г. С. Сковороди Міністерства освіти і науки України, професор кафедри зоології;
кандидат біологічних наук, Суханов Святослав Всеволодович,
Інститут шовківництва УААН, завідувач лабораторії генетики, м. Мерефа
Провідна установа:
Київській національний університет імені Т. Г. Шевченка (кафедра загальної і молекулярної генетики), Міністерство освіти і науки України, м. Київ
Захист відбудеться “”_грудня_ 2005 року о 15.15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 64.051.21 Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, біологічний факультет, ауд. III-15.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий __23 листопада_ 2005 року.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради
К 64.051.21 О. М. Федота
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Вивчення механізмів гормональної регуляції генетичної програми онтогенезу комах актуально як у теоретичному, так і в практичному плані. Незважаючи на численність фактичного матеріалу за данною проблемою та існування ряду гіпотез, запропонованих для пояснення регуляторних механізмів транскрипційної активности генів [Эшбернер М.,1974; Richards G., Ashburner M., 1981; Richards G., 1997], багато питань залишається невирішенними. У даному аспекті роль ювенільного гормону (ЮГ) в процессах регуляції генної активності в онтогенезі комах є недостатньо вивченою. У зв’язку з цим, дослідження впливу цього гормону на активність пуфінгу хромосом є актуальним, оскількі, ЮГ відіграє істотну роль у циклічності постембріонального розвитку комах, а також є антогоністом екдизону. Зміни співвідношення цих гормонів у онтогенезі комах викликають закономірні зміни активності генів [Полуэктова Е. В. и др., 1980; Буров Н. В., 1983; Дубровский Э. Б. и др., 1985; Ashburner M., 1990; Жимулев И. Ф., 1994].
Особливо значним є дослідження впливу аналогу ЮГ –метопрену на ступінь політенії хромосом. Актуальність досліджень у даному напрямку пов’язана з цим, що роль ювенільного гормону у процесах ендоредуплікації вивчена недостатньо, а наявні дані неповні і суперечливі [Буров Н.В., 1983; Жимулев И.Ф., 1994]. Одним із показників активності ядерного геному та інтенсивності метаболізму у дрозофіли є рівень политенії гігантських хромосом. У зв’язку з цим, ураховуя, що ювенільний гормон приймає активну участь у різних метаболічних процесах онтогенезу комах, доцільним є сумісне вивчення даного показника і компонентів пристосованості при дії цього гормону.
У свою чергу, найбільш ефективне використання гормональних препаратів на практиці для контролю розвитку комах неможливо без знання основних закономірностей і характеру змін, що виникають у прояві кількісних ознак при дії гормонального фактору. У зв'язку із цим становить інтерес вивчення прояву низки адаптивно важливих кількісних ознак на різному генетичному фоні при дії аналога ЮГ –метопрена, а також характеру зв'язку між їх проявом і функціональною активністю хромосом.
Одним із показників, які відображають загальний функціональний стан ядерного геному, є біоелектричні властивості клітинних ядер. Дослідження прояву даного показника під впливом аналога ЮГ –метопрену є актуальним і новим аспектом у вивченні проблеми гормонального контролю індивідуального розвітку комах.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана в межах наукової тематики відділу генетики науково-дослідного інституту біології Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України і є складовою теми за номером держреєстрації 0103U004274 “Дослідження дії іонизуючого і неіонизуючого випромінювання на геном і механізмів стресового та антистресового впливу ”.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясувати зміни структури і функцій політенних хромосом, адаптивно важливих ознак і біоелектричних властивостей клітинних ядер слинних залоз дрозофіли у зв'язку з дією аналога ювенільного гормону розвитку комах –метопрену.
Виходячи із загальної мети роботи, були поставлені наступні задачі:
Об'єкт дослідження –гормональна регуляція функціональної активності політенних хромосом слинних залоз дрозофіли.
Предмет дослідження –активність пуфінгу політенних хромосом, ступінь політенії хромосом, теплостійкість імаго, вихід імаго, маса тіла імаго, тривалість предімагінальних стадій розвитку, біоелектричні властивості клітинних ядер.
Методи дослідження –метод давлених ацетоорсеїнових препаратів політенних хромосом; цитоморфометричний метод; термотест; метод внутрішньоклітинного мікроелектрофорезу клітинних ядер, а також методи математичного аналізу отриманих результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Результати дослідження впливу ювенільного гормону на ступінь політенії гігантських хромосом Drosophila melanogaster, на пуфову активність політенних хромосом, на прояв низки кількісних ознак і на біоелектричні властивості клітинних ядер слинних залоз є новим і важливим доповненням у вивченні механізмів регуляції окремих стадій онтогенезу комах.
Вперше на політенних хромосомах слинних залоз Drosophila melanogaster у дослідах in vitro виявлений ряд пуфів, що специфічно реагують на аналог ЮГ –метопрен, що збігається із впливом гормону in vivo.
Новими є результати дослідження впливу метопрену на ендоредуплікацію політенних хромосом і прояв кількісних ознак дрозофіли. Виявлений стимулюючий ефект даного гормону на показник ступеня політенії хромосом, маси тіла імаго і теплостійкість дрозофіли. Показана залежність виявлених ефектів від генотипу мух і концентрації гормону у поживному середовищі. Отримані дані свідчать, що на фоні регуляції диференційної активності генів, ЮГ також впливає на ступінь помноження геному, регулюючи функцію ендоредуплікації політенних хромосом.
У роботі вперше отримані дані про вплив метопрену на біоелектричні властивості клітинних ядер дрозофіли in vitro. Показано, що дія ЮГ на пуфінг і ендоредуплікацію політенних хромосом відбувається на фоні низьких значень електрокінетичного потенціалу клітинних ядер.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані про вплив гормонального препарату метопрену на пуфову активність політенних хромосом можуть слугувати основою для розробки методів визначення й оцінки активності ювенільного гормону і його аналогів у культуральному середовищі. Практичне значення подібних тестів пов'язане з використанням ЮГ і виробництвом нових синтетичних препаратів –аналогів ЮГ для регуляції розвитку бджіл, шовкопряда, а також для боротьби з комахами-шкідниками й паразитами тварин.
Особистий внесок здобувача. Огляд літератури й експериментальна частина дисертаційної роботи виконані здобувачем повністю самостійно. Аналіз отриманих результатів проводився разом з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені в дисертацію, були повідомлені на Конференції по генетиці й молекулярній біології для студентів і молодих вчених, присвяченої 100-річчю генетики (Львів, 2000), на 7-ій Пущинській школі-конференції молодих вчених “Биология - наука ХХІ столетия” (Пущино, 2003), на конференції молодих вчених, аспірантів і студентів по молекулярній біології й генетиці “50 years of the double helix of DNA” (Київ, 2003), на наукової конференції молодих вчених, присвяченої 200-річчю заснування університету “Актуальні проблеми біології в дослідженнях молодих учених Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна” (Харків, 2003), на установчному з'їзді “First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology” (Львів, 2004), на VI Міжнародному симпозіумі “Биологические механизмы старения” (Харків, 2004), на науковій конференції, присвяченої 70-річчю кафедри генетики й цитології ХНУ ім. В.Н. Каразіна “Генетика в современном обществе” (Харків, 2004).
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 12 друкованих праць: з них - 5 статей, з яких 3 статті у наукових фахових журналах і 7 тез.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках тексту, включає вступ, огляд літератури, розділ “Матеріали і методи дослідження”, 3 розділи результатів власних досліджень і їх обговорення, заключення, висновки, список цитованої літератури із 230 найменувань та додатки. Дисертація містить 19 рисунків, 8 мікрофотографій політенних хромосом.
ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Матеріалом дослідження служили неселектована лінія дикого типу Oregon-R (Or-R), інбредні лінії Oregon-R (інбридинг 80-105 поколінь) і Swedish (Sw) (інбридинг 98-103 покоління) Drosophila melanogaster Meig., а також інбредна мутантна лінія forked (f) (інбридинг 105-125 поколінь; локалізація мутації 1-56.7; делеція; рецесивна; гомозиготи життєздатні; фенотипово проявляється в укорочених або обпалених щетинках); реципрокні гібриди F між інбредними лініями дикого типу Or-R і Sw, а також між інбредною лінією Or-R і інбредною мутантною лінією forked. Культуру дрозофіли підтримували у стандартних умовах термостату при температурі 22-24 С.
Досліджували вплив аналога ювенільного гормону - метопрену (ювемону) на активність пуфів онтогенезу, ступінь політенії хромосом, біоелектричні властивості клітинних ядер слинних залоз дрозофіли й адаптивно важливі ознаки.
Метопрен є інсектицидом гормональної дії, що пригнічує перетворення личинок або німф комах у життєздатні дорослі особини, а також має овіцидну дію. За хімічною природою метопрен являє собою ізопропіловий ефір 11-метокси-3,7,11-триметіл-2-транс-4-транс-додекадієнової кислоти [Одиноков В. Н. и др., 1992].
При впливі метопрену на пуфінг і біоелектричні властивості клітинних ядер дрозофіли умови експерименту включали 4 варіанти: контроль 1 (слинні залози без інкубації, які після витягування на стадії 0-годинної передлялечки відразу ж піддавали фарбуванню); контроль 2 (інкубація слинних залоз в 1 % розчині диметилсульфоксиду (DMSO) з експозицією 30 хвилин при 24 °С); у досліді 1 і досліді 2 слинні залози інкубували в розчинах метопрену в концентраціях 0,1 і 1 мкг/мл, відповідно, в 1 % розчині DMSO протягом 30 хвилин при 24 °С.
Політенні хромосоми дрозофіли досліджували на давлених ацетоорсеїнових препаратах слинних залоз, приготовлених за стандартною методикою [Полуэктова Е. В. и др., 1974]. Локалізацію пуфів проводили згідно виправлених карт Бріджеса [Lindsley D.E. et.al., 1968]. Пуфову активність досліджували в 7 локусах: 43E, 58DE, 60B (хромосома 2R), 85D, 100DE (хромосома 3R), 63E (хромосома 3L), 82EF (хромосома 3R). Про активність пуфінгу в політенних хромосомах судили за відношенням поперечних розмірів пуфів до ширини хромосоми в районі прилеглого диска, не залученого у процес пуфування, (відношення пуф/диск): 43E/44A, 58DE/58A, 60B/60C, 85D/85B, 100DE/100C, 63E/64B, 82EF/84D. Виміри проводили за допомогою окуляр-мікрометру при збільшенні мікроскопа 600. За даними авторадіографічних досліджень, розміри пуфів позитивно корелюють із рівнем транскрипції генів [Pelling G., 1964].
Різницю за ступенем політенії хромосом (СПХ) на цитологічних препаратах визначали цитоморфометричним методом [Страшнюк В. Ю. И др., 1995]: хромосоми з різним ступенем політенії розрізняються за шириною та інтенсивністю забарвлення ацетоорсеїном. Відомо, що до кінця третьої личинкової стадії хромосоми в клітинах слинних залоз Drosophila melanogaster проходять від шести до дев'яти циклів ендоредуплікації й досягають ступеня політенії 265С, 512С, 1024С, 2048С [82]. На цитологічних препаратах ці класи ядер характеризуються різною шириною й інтенсивністю забарвлення політенних хромосом ацетоорсеїном. У районі диска А22 хромосоми 2L, що приблизно відповідає середній ширині хромосом, поперечні розміри становлять відповідно: 1,6; 2,3; 3,2; 4,6 мкм. Визначали відсоткове співвідношення різних класів ядер з різним СПХ на тотальних препаратах слинних залоз. За результатами отриманих даних підраховували середнє значення політенії в кожному варіанті експерименту.
Теплостійкість імаго дрозофіли досліджували методом термотесту [Шахбазов В. Г., 1975]. Імаго дрозофіли прогрівали у водному термостаті при температурі 41 ºС і експозиції 20 хв. Умови експерименту в усіх варіантах були стандартними. Показником теплостійкості слугував відсоток імаго, що вижили після прогріву.
Плідність оцінювали, підраховуючи число дорослих мух у потомстві однієї пари особин. Швидкість предімагінального розвитку визначали за часом між початком відкладки батьківським поколінням яєць і виходом імаго. Використовували синхронізовані культури, отримані за 3 години яйцекладки при температурі 22-24 °С. Для визначення відмінності за масою тіла імаго використовували показник маси 100 особин. Даний показник вимірювали за допомогою торсіонних ваг.
Біоелектричні властивості клітинних ядер у слинних залозах дрозофіли досліджували за допомогою оригінального методу внутрішньоклітинного мікроелектрофорезу, розробленого на кафедрі генетики і цитології ХНУ імені В.Н. Каразіна [Шахбазов В. Г. и др., 1971]. Основним показником слугував відсоток електронегативних ядер - ЕНЯ,%. Напруженість поля в камері становила 7-8 В/см, сила струму - 0,7 мА.
Результати експериментів оброблені методами варіаційної статистики. Визначали середнє значення ознаки й помилку середнього. Вірогідність різниці між ознаками визначали за t-критерієм Ст’юдента. Проведено дисперсійний аналіз двохфакторних комплексів за методом Плохінського для визначення ролі генотипового і гормонального факторів у проявах досліджених кількісних ознак. Кореляцію між досліджуваними кількісними ознаками визначали за допомогою коефіцієнта рангової кореляції Спірмена.
Результати досліджень та їх обговорення
Вплив аналога ювенільного гормону метопрену на активність пуфінгу політенних хромосом дрозофіли в умовах in vitro. Об'єктом для даного дослідження слугувала неселектована лінія дикого типу Or-R. З огляду на стадієспецифічність картини пуфінгу, дослідження проводили на стадії 0-годинної передлялечки. У цей період титр ендогенного ювенільного гормону мінімальний, а рівень гормону екдизону підвищений і, відповідно, міжлиняльні пуфи інактивовані.
Досліджували вплив аналога ЮГ - метопрену на активність пуфів, що проявляють активність на різних стадіях онтогенезу. Для аналізу були взяті 5 міжлиняльних пуфів (43E, 58DE, 60B, 85D, 100DE) і 2 пізніх екдизонових пуфа (63Е, 82EF).
У контролі 1, на стадії 0-годинної передлялечки, пуфінг у міжлиняльних локусах не виявлений (рис. 2, А). Встановлена значна активність екдизонових пуфів 63Е і 82EF (рис. 1, Б).
EMBED Excel.Sheet.8