Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Занятие 1
Лабораторная работа «Методы выделения и анализа веществ из биологических объектов»
Цели и задачи: изучить методы выделения и анализа веществ из биологических объектов, строение и свойства аминокислот и белков, освоить хроматографический метод исследования, объяснить возможности использования этого метода в медицинской практике.
Студент должен:
- знать: правила техники безопасности работы в лаборатории биологической химии; основные методы выделения и анализа веществ; классификацию, строение, свойства аминокислот;
- уметь: осуществлять хроматографический анализ смеси аминокислот, проводить расчеты коэффициентов распределения;
- владеть: техникой лабораторных работ в лаборатории биологической химии; методикой проведения тонкослойной хроматографии.
1. Качественный анализ аминокислотных смесей методом тонкослойной хроматографии.
Реактивы и оборудование: растворы аминокислот 0,04 М, смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7), раствор нингидрина в ацетоне 0,5%, бумага хроматографическая, капиллярные пипетки, сосуд хроматографический с крышкой, палочки стеклянные, термостолик, спрей-камера, пульверизатор.
Проводят карандашом линию на расстоянии 2 см от нижнего края листа хроматографической бумаги. Делят ее на отрезки по 2 см и деления обозначают цифрами 1, 2, 3 и 4. В первую пипетку набирают раствор первой аминокислоты. Прикасаясь кончиком пипетки к бумаге в точке 1, выпускают раствор. То же проделывают для точек 2, 3, 4 с оставшимися растворами аминокислот и их смеси. Для проявления хроматограмму помещают в хроматографический сосуд, на дно которого налита смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (15:3:7) так, чтобы ее край был погружен в проявитель на 1 см. Сосуд плотно закрывают крышкой и оставляют в нем хроматограмму на время, за которое проявитель пройдет по ней путь снизу вверх, равный примерно 10 см. Хроматограмму вынимают из сосуда, отмечают границу фронта проявителя и высушивают на термостолике. На высушенную хроматограмму наносят в спрей-камере при помощи пульверизатора 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне так, чтобы она была равномерно (без подтеков) смочена раствором. Как только ацетон испарится, хроматограмму помещают на термостолик при температуре 70°С на 15 мин. Позиции аминокислот на хроматограмме выявляются в виде сине-фиолетовых пятен.
Идентификацию аминокислот можно осуществить по значению Rf (коэффициент распределения). Для этого измеряют расстояние, пройденное проявителем от линии старта до границы фронта проявителя, а так же расстояние от точки нанесения каждой аминокислоты до центра цветного пятна, образовавшегося в результате нингидриновой реакции. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента распределения (Rf) каждой аминокислоты-свидетеля. Такие же расчеты проводят с аминокислотами исследуемой смеси. Сопоставляя величины Rf аминокислот-свидетелей и аминокислот исследуемой смеси, делают заключение о природе аминокислот в составе изучаемой смеси. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне, идентичны.
Контрольные вопросы
1. Напишите формулу тетрапептида, состоящего из глицина, аргинина, гистидина и треонина. Напишите уравнение его гидролиза. Какие связи разрушаются при гидролизе белка?
2. Как можно разделить смесь аминокислот в гидролизате белка?
3. Дайте определение ИЭТ и ИИТ для аминокислот и белков.
4. Установите соответствие
А. Сер-Мет-Глн-Арг 1. Пептид, содержащий все циклические аминокислоты
Б. Асн-Сер-Тре-Глн 2. Пептид, имеющий серусодержащую аминокислоту
В. Ала-Иле-Вал-Лей 3. Пептид, содержащий все гидрофобные аминокислоты
Г. Фен-Три-Про-Тир
В какой области будут находиться изоэлектрические точки этих пептидов?
5. Рассчитайте значения изоэлектрических точек глицина, аспарагиновой кислоты и лизина. Значения pKa для указанных аминокислот следующие:
|
Соединение |
pKa1 |
pKa2 |
pKa3 |
|
Глицин |
2,4 |
9,7 |
- |
|
Аспарагиновая кислота |
1,9 |
3,7 |
9,6 |
|
Лизин |
2,2 |
8,9 |
10,5 |
6. Дана смесь белков:
|
Название белка |
Молекулярная масса |
Рi белка |
|
Церулоплазмин |
151 000 |
4,4 |
|
- Глобулин |
150 000 |
6,3 |
|
- Лактоглобулин |
37 100 |
5,2 |
Предложите методы разделения белков и укажите последовательность их выделения из смеси.