Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
|
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» |
Кафедра инфекционных болезней,
зоогигиены и ветсанэкспертизы
С2. Б.11 ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МИКОЛОГИЯ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №1.
ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ КОККИ:
СТАФИЛОКОККОЗЫ, СТРЕПТОКОККОЗЫ
Направление подготовки 111801 Ветеринария
Профиль подготовки
Специализация Ветеринарная фармация
Квалификация выпускника - специалист
Уфа 2013
Лабораторная работа.
ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ КОККИ:
СТАФИЛОКОККОЗЫ, СТРЕПТОКОККОЗЫ
1.1 Цель занятия. Ознакомить студентов с этапами лабораторной диагностики, основными свойствами возбудителей стафилококкозов, стрептококкозов и биопрепаратами.
1.2 Оборудование и материалы. Культуры Staphylococcus aureus и Staphylococcus saprophyticus на МПА, кровяном МПА, в МПБ, результаты тестов по определению патогенных свойств стафилококков: ферментация маннита, плазмокоагуляция, гемолитическая, лецитиназная, ДНК-азная, желатиназная активность, культуры Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae (или S. Pyogenes) на глюкозо-сывороточном МПА, МПБ, на средах Гисса с углеводами, пипетки Пастера; стерильные МПБ и кровяной МПА, красители для окраски по Граму и на капсулы, биопрепараты.
1.3 Теоретический материал
1.3.1 Стафилококкозы. Бактериальные инфекции, вызываемые патогенными стафилококками, характеризующиеся преимущественно гноеродными процессами различной локализации. Проявляются в виде абсцессов, флегмон, маститов, метритов, пневмоний, сепсиса. Стафилококки обладают способностью вызывать воспалительные процессы сопровождающиеся образованием гноя, поэтому их называют гноеродными (пиогенными) коками. Нередко являются причиной осложнений при соматических и хирургических заболеваниях, а также пищевых и кормовых отравлений, вызывают порчу сырья и пищевых продуктов
Стафилококк обнаружен Р. Кохом (1878), выделен из гноя - фурункула человека Л. Пастером (1880), обстоятельно изучен Ф. Розенбахом (1884). Не все виды стафилококков патогенны, согласно современной классификации стафилококки разделяются на 3 вида:
St aureus – патогенные;
St epidermidis - условно- патогенные, постоянные обитатели кожи и слизистых оболочек;
St. saprophyticus - непатогенные стафилококки. Лабораторная диагностика стафилококкозов основана на результатах бактериологического исследования.
Материал для исследования. Для прижизненной диагностики берут раневой экссудат, гной; при мастите – пробы молока. При открытых раневых поверхностях или обширных флегмонах раневой экссудат (отделение) берут стерильным ватным тампоном. Жидкий экссудат отсасывают стерильной пипеткой или иглой со шприцем и слить в стерильную пробирку. Если абсцесс не вскрыт, скопившийся в нем экссудат (гной) берут асептически: поверхность абсцесса дезинфецируют, затем делают прокол стерильной толстой острой иглой на стерилизованном шприце и содержимое выливают в стерильную пробирку, закрывают пробкой, помещают в железный или деревянный футляр (пенал) для отправки в лабораторию. Материал, поступивший в лабораторию, подвергают следующим исследованиям.
Микроскопия. Мазки готовят следующим образом: на предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и в нее вносят (растирают) бактериологической петлей каплю гноя. Мазки после высушивания на воздухе фиксируют, окрашивают по Граму и на капсулу, микроскопируют.
Стафилококки имеют шаровидную форму. Располагаются часто в виде неправильных бессистемных скоплений. В мазках из бульонных культур имеют вид микро- или диплококков, из агаровых культур - расположены в виде скоплений, напоминающих гроздь винограда (рисунок 1).
В МПБ растут интенсивно, вызывают равномерное помутнение среды, образуют значительный рыхлый осадок. Иногда при достаточной аэрации образуют поверхностную пленку.
На агаре стафилококки растут в виде выпуклых, правильной круглой формы с ровными краями, гладкой поверхностью колоний, диаметром 2-7 мм, непрозрачные. При комнатной температуре, широкой аэрации и рассеянном свете стафилококки вырабатывают золотистые, белые, лимонно-желтые и другие пигменты.
Лучшая среда для выделения стафилококка из патологического материла – кровяной агар. Вирулентные штаммы на кровяном МПА обычно растут, формируя широкую зону бета-гемолиза (прозрачная зона), (рисунок 2).
Рисунок 2 Гемолиз на кровяных средах (стафилококки)
На желточно-солевом агаре (ЖСА) вокруг колоний стафилококков, обладающих лецитиназной активностью, образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком.
Из культур, выросших на питательных средах, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Патогенные стафилококки в отличии от непатогенных образуют капсулу (S.aureus), выделяют гемолизин, фибринолизин (стафилокиназу), гиалуронидазу, плазмокоагулазу, желатиназу, ДНК-азу, лецитиназу, ферментируют маннит.
Тест на плазмокоагулазу. Коагулаза – фермент стафилококков, которые в сочетании с некоторыми компонентами сыворотки обладают способностью коагулировать плазму крови. Признак плазмокоагуляции является сравнительно стабильным и используется для дифференциации патогенных видов стафилококков от непатогенных. Плазмокоагулязную активность определяют в специальной реакции плазмокоагуляции (РПК):
В 0,5 мл плазмы крови кролика (человека) (не разведенной или разведенной стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:4), вносят петлю бактериальной массы исследуемой культуры, снятой с поверхности агаровой среды и инкубируют при 37 С. Результаты учитывают через 2 и 24 часа. При положительной реакции образуется сгусток.
Тест на гиалуронидазу. Гиалуронидаза – фермент, расщепляющий гиалуроновую кислоту. На поверхность агара в чашки Петри дробно засевают культуру S.egui. Затем в виде линии высевают на поверхность среды культуру микроорганизма, у которого выявляют способность к синтезу гиалуронидазы. Чашки с посевами инкубируют при 37 С 16-24 часа. Если исследуемый микроорганизм выделяет гиалуронидазу, то она диффундирует в толщу питательной среды и разрушает капсулу тест-микроба.
Тест на гемолизин. Бактериальные гемолизины – обширная группа веществ-мембранотоксинов, которые вызывают нарушение целостности мембраны эритроцитов и их лизис.
Исследуемую культуру уколом или дробно засевают в чашки Петри с 5%-м кровяным агаром, посевы инкубируют при 37С 24ч. Гемолизин, выделяемый растущей культурой бактерий, диффундирует в толщу агара и вызывает лизис эритроцитов, что проявляется в виде светлой (бета-гемолиз) или полупрозрачной (альфа-гемолиз) зоны вокруг колоний. Гемолитическую активность микроорганизма можно также определить его посевом в 1-5%-й кровяной бульон, который после культивирования выделяющего гемолизин микроба становится прозрачным за счет лизиса эритроцитов.
Тест на лецитиназу. Лецитиназа расщепляет гидролизом лецитин. Исследуемую культуру засевают дробно на желточный агар, культивируют при 37-38С 24-48ч. Положительный результат – появление зоны помутнения вокруг колоний. Желточный агар: пептон – 20 г, гидрофосфат натрия – 0,1 мл, глюкоза – 1 г, агар – 12,5 г, вода дистиллированная – 500 мл. Устанавливают рН 7,2-7,4, стерилизуют при 121С 15 мин, охлаждают до 55С, добавляют один стерильный желток на 500 мл среды, компоненты перемешивают и смесь разливают в чашки Петри.
Тест на ДНК-азу. Исследуемую культуру бактерий засевают «штрихом» на питательный агар с ДНК и культивируют при 37С 24 ч. Затем на поверхность среды с бактериальной культурой наливают 1 н. Раствор соляной кислоты. Положительный результат – при гидролизе ДНК вдоль «штриха» культуры видна светлая зона.
Питательная среда с ДНК: в расплавленный МПА добавляют 10%-й раствор ДНК до конечной 0,2%-й концентрации, перемешивают компоненты, автоклавируют при 120С 15 мин и разливают в чашки Петри.
Биохимические свойства Стафилококки ферментируют многие углеводы. Считают, что штаммы, сбраживающиеся маннит, являются патогенными (но эта способность не стабильна).
Биопроба. Заражают лабораторных животных для подтверждения токсигенных свойств выделенного стафилококка.
Летальный токсин выявляют внутривенным введением кролику фильтрата бульонной культуры 0,75 мл на 1 кг массы.
Некротоксин обнаруживают внутрикожной пробой. Готовят суспензию суточной культуры в физиологическом растворе с концентрацией клеток 4,2109/мл и 1109/мл. Каждое разведение культуры по 0,1 мл вводят внутрикожно кролику, предварительно удалив шерстный покров на месте инъекции. Результаты учитывают ежедневно на протяжении 4-5 сут. В положительных случаях развивается некроз кожи.
Энтеротоксин продуцируют токсигенные штаммы. Пробу на энтеротоксин ставят при отравлениях. Культуру стафилококка выращивают на специальной питательной среде (пептон, хлорид кальция, хлорид магния, дигидрофосфат калия, 0,8% агар-агара, рН 7,2), в атмосфере, содержащей 20% оксида углерода (IV), в течение трех суток. Затем культуру стерилизуют фильтрованием, 10-15 мл фильтрата смешивают с равным объемом молока и вскармливают 4-8 недельным котятам. При наличии энтеротоксина через 1-2 ч у животных возникают симптомы гастроэнтерита и рвота.
1.3.2 Стрептококкозы. Инфекционные болезни, вызываемые бактериями рода Streptococcus, к которому относят 29 видов. Наибольшее значение в патологии сельскохозяйственных животных имеют следующие виды:
S. pneumoniae – возбудитель стрептококковой (диплококковой) септицемии молодняка сельскохозяйственных животных;
S. equi – возбудитель мыта лошадей;
S. agalactiae и S. dysagalactiae – этиологические агенты маститов крупного рогатого скота;
S. pyogenes – возбудитель ряда заболеваний, преимущественно человека.
Лабораторная диагностика стрептококкозов основана на результатах бактериологического исследования.
Материал для исследования. При подозрении на мыт прижизненно берут носовое истечения, содержимое абсцессов лимфатических узлов (путем пункции), для посмертной диагностики – кровь из сердца, части печени, селезенки, легких. При стрептококковых маститах исследуют молоко, при подозрении на септические стрептококкозы (диплококковая инфекция и др.) – кровь из сердца, селезенку, печень, костный мозг, носовые истечения.
Микроскопия. Мазки окрашивают по Граму и на капсулу, микроскопируют. Все стрептококки представляют собой сферические или овальные грамположительные клетки диаметром 0,5-1,25 мкм, без спор и жгутиков, с тенденцией к образованию цепочек различной длины (рисунок 3).
Рисунок 3 Стрептококки (цепочки различной длины)
S. agalactiae и S. pyogenes в препаратах из материала чаще обнаруживают в виде цепочек.
У S. pneumoniae клетки обычно парные, окруженные капсулой, концевые части клеток слегка удлинены, поэтому данный стрептококк ранее называли ланцетовидным диплококком. Также они могут располагаться одиночно и короткими цепочками.
S. equi в мазках из гноя обнаруживают в виде длинных цепочек, причём клетки в цепочке как бы сплющены в горизонтальной плоскости, образуют капсулу. В мазках из культуры они чаще располагаются короткими цепочками, одиночно, парами.
Культуральные свойства. Стрептококки – факультативные анаэробы, температурный оптимум 37 С (диапазон 25 – 45 С). На общепринятых питательных средах растут плохо, обычно используют обогащённые среды: МПБ с 1 % глюкозы и 10 % инактивированной сыворотки крови лошади, МПА с 1 % глюкозы и 5 % крови барана или кролика. Для выделения культуры возбудителя исследуемый материал высевают на указанные питательные среды и культивируют 18 – 24 часа. На глюкозо-кровяном МПА все виды патогенных стрептококков образуют мелкие колонии, чаще с зоной гемолиза (рисунок 4).
Рисунок 4 Рост стрептококков на кровяном МПА
У S.pneumoniae колонии круглые, полупрозрачные, плоские, с приподнятом центром и краями, с зоной гемолиза типа “альфа”; в МПБ растет с равномерным помутнением среды.
S.equi формирует мелкие, росинчатые, слизистые, правильной круглой формы колонии с узкой зоной бета-гемолиза, позднее они становятся серо-белыми, непрозрачными; в МПБ растет с помутнением среды, образованием пушистых хлопьев, через 3-5 сут. Культивирования бульон просветляется, на дне пробирки образуется осадок.
У S.agalactiae (S.dysagalactiae) мелкие, сероватые, просвечивающие колонии с бета- или двойной зоной бета-гемолиза, при росте в МПБ среда остается прозрачной,формирующиеся крупинки оседают на дно пробирки.
S.pyogenes на кровяном МПА образует мелкие, прозрачные, правильной круглой формы колонии с зоной бета-гемолиза, в бульоне растет с просветлением среды и выпадением зернистого осадка (рисунок 5).
Рисунок 5 Гемолитическая активность стрептококков
(зоны - и -гемолиза)
Чтобы исключить стафилококковую, энтерококковую (род Enterococcus) инфекции ставят тест на каталазу – стафилококки образуют каталазу, стрептококки нет. С целью дифференциации пиогенных гемолитических стрептококков от энтерококков культуры высевают в МПБ, содержащий 40% желчи крупного рогатого скота, МПБ с 6,5% хлорида натрия. Энтерококки в отличие от гноеродных стрептококков растут на этих средах. Также проверяют чувствительность клеток культуры к желчи: в пробирку с МПБ, содержащим 10% желчи крупного рогатого скота, вносят 0,5 мл исследуемой суточной бульонной культуры и выдерживают при 37С 1ч. При лизисе содержимое пробирки просветляются, энтерококки не лизируются.
Биопроба. Для заражения используют только свежевыделенные штаммы в виде 18…20-часовых бульонных культур, которые по 0,5 мл вводят внутрибрюшинно трем мышам. Культуру признают патогенной при гибели не менее двух мышей.
Для выделения S. pneumaniae тканевую суспензию разведенную стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:2, вводят внутрибрюшинно белым мышам по 0,5 мл. в положительных случаях мыши погибают через 1…2 сут.
Биопрепараты. Вакцина против диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят.
Ассоциированная (поливалентная) вакцина против паратифа, пастереллеза и диплококковой септицемии поросят.
Сыворотка против диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят.
Инактивированная вакцина из стрептококков серологической группы С.
Биохимические свойства стрептококков представлены в таблице 1.
Таблица 1 Ферментативная активность патогенных стрептококков
|
Признак |
S. pneu- moniae |
S. aga- lactiae |
S. dysaga- lactiae |
S. pyo- genes |
S. equi |
|
Гидролиз: гиппурата эскулина аргинина |
d + |
+ + |
+ |
+ |
+ |
|
Образование кислоты из: лактозы раффинозы салицина сорбита трегалозы |
+ + + |
d* d + |
+ d d + |
+ + + |
+ |
*d - варьирующие реакции.