Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Огромное значение для точности диагностических исследований имеет контраст МР-изображений, который определяется, прежде всего, интенсивностью сигнала. Вещества, способствующие изменению интенсивности сигнала, называются МР-контрастными агентами.
На контраст изображений в МРТ влияют в первую очередь такие параметры, как магнитная восприимчивость, протонная плотность, а также времена спин-спиновой и спин-решеточной релаксации. Учитывая большую сложность изменения содержания воды в тканях, основой для разработки веществ, способных улучшить контраст МР-изображений, являются их магнитные свойства и их влияние на магнитную восприимчивость и изменение времен релаксации.
Под влиянием внешнего магнитного поля различные вещества обладают способностью намагничиваться. Эта способность и называется магнитной восприимчивостью. В зависимости от значения магнитной восприимчивости все вещества можно разделить на диамагнетики, парамагнетики и ферромагнетики. Диамагнетики обладают отрицательной магнитной восприимчивостью, χ < 0. Парамагнетики − слабой положительной магнитной восприимчивостью, χ > 0. Для суперпарамагнетиков характерна магнитная восприимчивость на 2 – 3 порядка большая, чем у парамагнетиков. Ферромагнетики обладают сильной положительной магнитной восприимчивостью, χ >> 0.
Большинство разрабатываемых в настоящее время МР-контрастных веществ [9] либо парамагнетики, либо суперпарамагнетики.
Все контрастные вещества делятся на позитивные и негативные.
Позитивные контрастные вещества оказывают одинаковое влияние на времена спин-спиновой и спин-решеточной релаксации (T1 и T2). Вследствие того, что спин-решеточное время релаксации оказывается намного больше времени спин-спиновой релаксации тканей, при малых дозах позитивного контрастного агента преобладает эффект сокращения времени T1 релаксации. В результате этого на T1-взвешенных томограммах ткани, накопившие контрастное вещество, оказываются более яркими. Большинство парамагнитных контрастных веществ позитивны.
Из позитивных контрастных веществ наибольшее применение в клинической МРТ получили парамагнитные низкомолекулярные комплексы гадолиния (Gd) − неспецифичные внеклеточные контрастные вещества, которые не проникают через неповрежденный гематоэнцефалический барьер. Усиление контраста при исследовании здорового головного мозга наблюдают только в тех местах, где гематоэнцефалический барьер отсутствует. При этом увеличение интенсивности сигнала в норме встречают, например, в сосудистых сплетениях, в области гипофиза и воронки, твердой оболочки головного мозга, а также от кровеносных сосудов, особенно после первого прохождения болюса контрастирующего агента. Патологическое нарушение приводит к исчезновению гематоэнцефалического барьера и проникновению контрастного вещества в межклеточное пространство, в результате чего происходит локальное изменение времени спин-решеточной релаксации T1. Это имеет большое диагностическое значение для определения морфологической структуры областей, в которых отмечается высокая проницаемость гематоэнцефалического барьера или признаки его отсутствия, как правило, сопровождающиеся нарушениями перфузии или увеличением объема внеклеточной жидкости. Это зачастую наблюдается при первичных и вторичных опухолях, воспалительных и демиелинизирующих заболеваниях. Негативные контрастные вещества снижают интенсивность сигнала в области их накопления, сокращая или T2. К ним относятся суперпарамагнетики и ферромагнетики. Ферромагнитные вещества состоят из постоянно намагниченных мелких частиц. При уменьшении размера последних их постоянные магнитные свойства исчезают, и такие частицы называют суперпарамагнитными [58]. В зависимости от размера и покрытия они также могут стать веществами, воздействующими на T1.
Ферромагнетики и суперпарамагнетики создают локальные градиентные магнитные поля, которые нарушают однородность магнитного поля. Время спин-спиновой релаксации T2 уменьшается благодаря диффузии воды в этих градиентных полях. Однако основной эффект этого процесса − сокращение , поэтому влияние таких контрастных веществ наиболее заметно при использовании градиентных последовательностей, когда -эффекты наиболее выражены.
Влияние ферромагнетиков и суперпарамагнетиков на T2 и называют эффектом восприимчивости, который увеличивается пропорционально квадрату напряженности магнитного поля.
Негативные контрастные агенты применяются в тех случаях, когда необходимо снизить сигнал от нормальной ткани для выделения патологических очагов. Так, накапливаясь в ткани печени, негативный МР-контрастный агент снижает интенсивность сигнала от ткани печени, на фоне чего инородные образования остаются светлыми (рисунке 6) [9].
Рисунок 6 − T2-взвешенные томограммы без контрастирования (a) и после контрастного усиления (b)
Важнейшими требованиями, предъявляемыми к разработке контрастных агентов, являются их безопасность для пациента, а также распределение по тканям, переносимость и элиминация из организма.
Контрастные вещества разрабатывают не только для протонной МР-томографии. Можно воспользоваться магнитными свойствами ядер, отличных от 1H (например, 19F). Возможность применения перфторированных соединений in vivo была продемонстрирована при исследовании вентиляции и перфузии легких [59].
Новое направление в исследованиях контрастных веществ – молекулярная МРТ с использованием “умных агентов” – специфических молекул, позволяющих селективно метить патологические образования, определенные ткани, клетки, осуществлять направленный транспорт лекарственных веществ.
Особый интерес с целью обеспечения селективного накопления контрастных веществ в органах и повышения специфичности выявления заболеваний представляют оксиды железа и липосомы.
Частицы оксида железа посредством фагоцитоза захватываются клетками ретикулоэндотелиальной системы. Тем самым создается возможность селективного контрастирования печени, селезенки, лимфатических узлов и костного мозга. Кроме того, оксиды железа применимы для контрастирования рецепторов и антител, а также для исследования кровоснабжения сердца и головного мозга. В зависимости от размера, состава, концентрации, насыщения намагниченностью исследуемой области оксиды железа могут быть как позитивными, так и негативными контрастными агентами. Их распределение по тканям определяется размером, формой, зарядом, гидрофильностью или гидрофобностью, химическим составом и оболочкой.
Большинство веществ имеет полидисперсную (больше одной группы кристаллов оксида железа разного размера) или поликристаллическую (каждая частица содержит множество кристаллов) структуру. Оксиды железа, выпускаемые для активного накопления, имеют монодисперсную (группа кристаллов одного размера) и монокристаллическую (каждая частица содержит только один кристалл) структуру. В них желательно добавлять более мелкие суперпарамагнитные метки.
Еще один вид контрастных веществ, выпускаемых в виде частиц, − липосомы. Парамагнитный ион можно инкапсулировать в водную часть или присоединить к липидному бислою. Клинические испытания прошли липосомы как с хелатами гадолиния, так и марганца. В настоящее время предлагают использовать липосомы, имеющие более сложное строение, − к примеру, фосфолипидные спин-меченые и амфипатические хелатные комплексы.
Кроме сосудистых структур, можно добиться контрастирования гепатоцитов или клеток ретикулоэндотелиальной системы. Сосудистые структуры и сильно васкуляризированные образования как правило контрастируют при динамических исследованиях посредством стандартных низкомолекулярных контрастных веществ на основе комплексов Gd или Mn.
Частицы оксида железа и липосомы избирательно захватываются ретикулоэндотелиальной системой [60,61]. Частицы оксида железа могут влиять и на время T1-релаксации, и на отношение T2/. Частицы оксида железа, которые вводятся внутривенно, должны иметь размер менее 50 нм в диаметре, чтобы не захватываться при прохождении через легкие. Такие частицы получили название SPIO (суперпарамагнитрые частицы железа) и USPIO (ультрамелкие суперпарамагнитрые частицы железа).
Контрастные вещества, которые связываются со специфическими рецепторами, могут позволить дифференцировать злокачественные опухоли печени (такие, например, как печеночно-клеточный рак) от доброкачественных новообразований (таких, к примеру, как фокальная узловая гиперплазия или аденома).
При исследовании печени может быть использована еще одна группа контрастных веществ − липосомы, содержащие хелаты гадолиния [62, 63]. Эти вещества обеспечивают продолжительное усиление контраста сосудистых структур, печени и селезенки.
Накапливающиеся в печени вещества усиливают интенсивность сигнала и от селезенки. Частицы оксида железа улучшают выявление метастазов в селезенке, а также позволяют дифференцировать доброкачественную и злокачественную спленомегалию (например, при лимфоме или лейкозе).
В клинической практике пока еще не используются специфические контрастные агенты, накапливающиеся в лимфатических узлах. В такой области научных исследований, как МР-лимфография, также весьма перспективным являетсяся применение частиц оксида железа. Покрытые оболочкой из декстрана, такие частицы доставляются к лимфатическим узлам.
Одна из наиболее важных задач разработки контрастных веществ – усиление сигнала от опухолей. Развитие оборудования и программного обеспечения должно позволить проводить быстрые скрининговые исследования для выявления рака, включающие проведение быстрого МР-исследования всего тела с введением специфических контрастных веществ, избирательно накапливающихся в опухолях.
Металлопорфирины – соединения, специфически аккумулируемые различными опухолями [64]. В качестве контрастных веществ, специфичных для опухолей, могут быть использованы растворимые в воде порфирины, меченые марганцем.
Неспецифическое увеличение интенсивности сигнала от опухолей в раннюю фазу и резко выраженное усиление сигнала от очагов некроза в позднюю фазу контрастирования показало использование гадолиний-мезапорфирина и марганец-тетрафенилпорфирина. Это открытие может выявить новые области применения этих веществ, например, для определения очертаний области инфаркта миокарда или мониторинга противоопухолевой терапии [65].
Кроме того, синтезированы специфичные для опухоли моноклональные антитела, меченые гадолинием или наночастицами оксида железа. Исследования на животных показали, что такие контрастные вещества усиливают сигнал от специфичных опухолей и мест, содержащих антигены (например, при инфаркте миокарда или инфекционных заболеваниях) [66, 67].
Не прекращается разработка новых контрастных препаратов для МРТ. Создание низкоосмолярных МР-контрастных препаратов позволяет при необходимости увеличивать их дозировку, что может быть полезным для выявления новых зон поражения мозга при рассеянном склерозе и метастазах опухолей, а также для более четкого определения границ ряда внутримозговых опухолей. Помимо создания препаратов для введения в кровь, разрабатываются новые способы инфузионного контрастирования полых органов и дыхательной системы. Весьма перспективен в данном направлении метод визуализации легких, основанный на вдыхании изотопов инертных газов с гиперполяризованными ядрами (предложены к применению гелий 3He и ксенон 129Xe). Данная технология еще недоступна для клинического применения в связи со значительными техническими трудностями ее проведения, но она открывает перспективы использования МРТ для диагностики заболеваний легких, которые обычно считаются органом, недоступным для МРТ исследования.
Можно полагать, что в ближайшие годы будут разработаны и другие, возможно, принципиально новые подходы к повышению диагностической эффективности МР методов исследования.
В большинстве случаев МР томограф настроен на получение изображений от протонов водорода, находящихся в теле пациента. Контраст в МРТ является результатом различия в сигнале от смежных пикселей или вокселей, сигнал в наибольшей степени зависит от трех основных параметров: протонной плотности, времени спин-решеточной релаксации T1, и времени спин-спиновой релаксации T2. Плотность спинов, пропорциональная суммарной намагниченности спиновой системы M0, отражает общее количество спинов, доступных для получения МР-изображения в пределах данной ткани (или пикселя).
Времена релаксации T1 и T2 описывают законы, по которым изменяется спиновая система. T1 - закон, по которому система возвращается к равновесию после возбуждения энергией РЧ поля. Чем быстрее система возвращается к равновесию, тем больше доступных спинов для возбуждения следующим импульсом.
Спин-спиновая T2 -релаксация описывает процесс расфазировки МР-сигнала из-за локальной неоднородности магнитного поля, возникающей за счет взаимодействия спинов друг с другом, в результате чего происходит потеря интенсивности МР-сигнала. В общем случае расфазировка спиновых прецессий ядерных моментов вызывается не только спин-спиновыми взаимодействиями, но и и наличием неоднородных локальных внешних магнитных полей в объеме образца, обусловленных или неоднородностью постоянного магнитного поля B0, или градиентными магнитными полями, создаваемыми соседними магнитными моментами других ядер и неспаренных электронов. В этом случае говорят о времени поперечной релаксации T2*:
1/T2* = 1/T2 + γδB/π , (67)
где γ – гиромагнитное отношение, δB – неоднородность локального магнитного поля.
Времена T1 и T2 зависят от нескольких параметров [42]:- резонансной частоты (индукции магнитного поля);- температуры; - подвижности спинов (микровязкости); присутствия больших молекул; - присутствия парамагнитных молекул.
Контраст МР-изображений зависит в большей или меньшей степени от T1, T2 или T2* и протонной плотности. Таблица 3 [43] показывает времена релаксации различных тканей в магнитном поле 1.5 Tл и температуре 37°C. Хороший контраст мягких тканей на МР-томограммах (рис. 20) обусловлен в основном различными временами релаксации, как в случае МР-изображений тканей головного мозга, на которых можно легко различить серое и белое вещество.
Таблица 3. Типичные времена релаксаций различных тканей в магнитном поле 1.5 Tл и температуре 37°C. R1=1/T1, R2=1/T2 – скорости релаксации([43]).
|
Ткань |
Т1, мс |
R1, с-1 |
Т2, мс |
R2, с-1 |
|
серое вещество |
950 |
1,05 |
100 |
10 |
|
белое вещество |
600 |
1,67 |
80 |
12,5 |
|
мышечная ткань |
900 |
1,11 |
50 |
20 |
|
спинномозговая жидкость (СМЖ) |
4500 |
0,22 |
2200 |
0,45 |
|
жир |
250 |
4,00 |
60 |
16,67 |
|
кровь |
1200 |
0,83 |
100-200 |
5-10 |
Рис. 20. Примеры МР-изображений [43].
На изображениях взвешенных по протонной плотности более яркие пиксели соответствуют более высокой плотности спинов. Параметр T1 влияет на контраст в белом и сером веществе (см. времена T1 в таблице 3), на Т1-взвешенном изображении белое вещество с более коротким T1 кажется более ярким. Из-за длинного T2 спинномозговая жидкость выглядит яркой на Т2-взвешенном изображении.
Так как T1 и T2 являются основными параметрами контраста МР-изображений, именно эти параметры должны быть изменены любым потенциальным контрастным агентом. Самыми распространенными МР контрастными агентами являются парамагнитные комплексы ионы гадолиния и суперпарамагнитные частицы оксида железа (см. Таблицу 4). Гадолиниевые контрастные агенты используются прежде всего для сокращения времени спин-решеточной Т1 релаксации, хотя при высоких концентрациях они могут оказывать существенное влияние и на T2 релаксацию. Контрастные агенты на основе оксида железа, с другой стороны, оказывают меньшее влияние на T1 и используются, прежде всего, для сокращения T2*.
Таблица 4: Значения релаксационной эффективности основных контрастных агентов [44].
|
МР контрастный агент |
Главное использования |
Молекулярная масса или размер частицы |
Релаксивность, (мМ л)-1 |
Назначение (цель) |
|
Gd-DTPA |
Т1-агент |
0,6 кДа |
r1 = 3,7 |
Внеклеточный |
|
Dextran-Gd-DTPA |
Т1-агент |
75 кДа |
r1 = 11 |
Кровь (Blood-pool) |
|
Carboxydextran-coated SPIO SHU-555 |
Т2-агент |
62 нм |
r1 = 12 r2 = 188 (0,94T) |
Капиллярная проходимость |
|
Dextran-coated SPIO AMI-25 |
Т2-агент |
58 нм |
r1 = 24 r2 = 107 (0,47T) |
Органы MPS (печень) |
|
Dextran-coated USPIO MION-46L |
Т2-агент |
18-24 нм (CLIO 30 -40 нм) |
r1= 16 r2= 35 (0,47T) |
Органы MPS |
|
Dextran-coated USPIO AMI-227 |
Т2-агент |
17 -20 нм |
r1 = 23 r2 = 53 (0,47T) |
Узлы лимфы |
|
MION-encapsulated liposomes (MION-скрытые липосомы) |
Т2-агент |
170 - 300 нм |
r1 = 23 r2 = 130 (0,47T) |
Органы MPS (печень) |
|
PEGylated magnetoliposomes |
Т2-агент |
40 нм |
r1 = 3 r2 = 240 (1,5T) |
Костный мозг |
|
(Protein-coated) magnetoferritin |
Т2-агент |
12 нм |
r1 = 8 r2 = 218 (1,5T) |
Кровь (Blood-pool) |
Связь спинов протонов с большими магнитными моментами суперпарамагнитных веществ увеличивает релаксивность воды, делая их полезными в качестве контрастных агентов для МРТ. В присутствии суперпарамагнитных веществ, таких как наночастицы оксида железа, времена релаксации ядерных спинов протонов воды, T1, T2 и T2*, сокращаются [43]. Что касается T2 и T2*, магнитные наночастицы действуют как магнитные моменты, производящие крошечные градиенты локального магнитного поля, через которые протоны осуществляют диффузию. Так как каждый протон будет иметь отдельный путь через градиентное поле, то разности фаз между протонами будут накапливаться. В результате будет происходить индуцированная различной восприимчивостью расфазировка МР сигнала протона с последующим уменьшением Т2*. Это сокращение T2* может быть использовано в МРТ-эксперименте, когда наночастицы сильно намагничены.
При использовании суперпарамагнитных частиц оксида железа релаксация вызвана время- или частотно-модулированными взаимодействиями между протонами и магнитными моментами частиц [44]. Связь может быть дипольного и скалярного характера, а временная или частотная модуляция возникает из-за трансляционной диффузии протонов, вращательной диффузии магнитных частиц и обмена между связанными протонами биомакромолекул и протонами свободной воды.
В настоящее время, теория, объясняющая сокращение T2* протонов воды парамагнитными ионами магнитных наночастиц может быть разделена на две группы: модели внутренней сферы (IS) и внешней сферы (OS) [45]. Теория внутренней сферы рассматривает обмен между координированными молекулами воды и молекулами объемной воды. Теория внешней сферы описывает релаксацию индуцированную диффузией молекул воды в пределах градиентного магнитного поля вокруг парамагнитного гидратированного иона. IS вклад состоит из протонов, физически взаимодействующих с парамагнитным ионом. В этом случае расстояние между ионом и координированной молекулой воды в среднем меньше, чем между гидратированным ионом и диффундирующей молекулой воды в модели OS. Кроме того, координированные протоны находятся на местах связывания дольше, подвергаясь воздействию магнитных ионов в течение более длительного времени, чем в случае диффундирования протона в модели OS. Как результат, вклад IS, как правило, больше, чем вклад OS. Однако, для хелатных ионов и в отсутствие обмена протонов воды, механизм OS доминирует в релаксации.
Релаксацию, индуцируемую частицами магнетита (Fe3O4) в целом можно отнести к диффузии молекул воды вокруг суперпарамагнитного ядра железа. Она может быть в целом описываться теорией OS, адаптированной для учета анизотропии кристаллов магнетита [46]. Применение IS в сравнении с теорий OS может математически определяться критерием τDΔωr, где τD = r2 / D (г - радиус частиц, D является коэффициентом диффузии воды, и Δωr является среднеквадратическим сдвигом угловой частоты на поверхности частиц). Для τDΔωr <1 выполняется режим усреднения движения. Скорость релаксации тогда задается квантово-механической теорией внешней сферы:
(68)
где v является частью объема занимаемой наночастицами. Для τDΔωr> 1 работает режим статической расфазировки. Этот термин относится к расфазировке неподвижных магнитных моментов, но также остается справедливым и для медленного движения, где расфазировка проявляется в одиночном столкновении протона и сдвиг поля составляет больше, чем один радиан. В этом случае скорость релаксации для сферических частиц характеризуется уравнением:
, (69)
где Δωr определяется по формуле:
, (70)
где γ - протонное гиромагнитное отношение, Beq - экваториальное магнитное поле частицы, μ - магнитный момент, и М - ее намагниченность.
В случае синтезированных наночастиц оксида железа, вполне вероятно, что комбинирование процессов происходит в процессе расфазировки. В хорошо-дисперсном растворе, протоны будут диффундировать через магнитные градиенты, накапливая фазу Δω = γΔB, где ΔВ –градиентное магнитное поле частицы, воздействующее на протон. Однако, на границе между частицей и протонами воды, вполне вероятно, существуют несколько типов событий. Протоны могут физически обмениваться с протонами в молекулах, составляющих оболочку (покрытие) частиц. Такие взаимодействия, как правило, известны как химический обмен и были использованы для MTC- томографии (контрастирование с использованием переноса намагниченности) [47, 48] и в развитии класса соединений, известных как агенты переноса насыщения, зависящего от химического обмена (CEST) [49].
Не исключено, однако, что оболочка молекулы может влиять на протоны иными способами, чем прямой химический обмен. Диффузия протона может быть замедлена в областях вблизи частиц за счет молекулярных сил, а в некоторых случаях, таких, как фосфолипид-полиэтилен-гликолевая (PEG) оболочка частицы, не исключено, что протоны могут диффундировать в и из пространства между оболочками молекул [50] (рис. 21). В результате может происходить эффективное изменение в диффузии протонов вокруг частиц, которое приводит к изменению релаксационных характеристик наночастиц, основанных на специфических свойствах оболочки.
Рисунок 21 Различные схемы диффузии протонов и взаимодействия с наночастицами и их оболочкой. a) диффузия протонов мимо наночастицы представляет основной вклад в теорию внешней сферы (OS), b) диффундирующие протоны воды могут обмениваться с протонами на поверхности частиц; увеличение времени пребывания и сближение вплотную приводит к эффекту во внутренней сфере (IS), c) диффузия может быть ограничена оболочкой частиц, приводя к случаю где-то между OS и IS.
Существующие теории сосредотачивают внимание или на диффузии протонов мимо наночастиц или на химическом обмене в качестве механизмов для релаксации. Взаимодействие между протонами и оболочкой наночастицы хотя и не до конца понятно, но, однако, может иметь значительное влияние на индуцированную релаксацию. Такие взаимодействия не в полной мере учитываются в современных теориях, и дальнейшее более глубокое понимание такого влияния может помочь в разработке более эффективных контрастирующих агентов-зондов. Это особенно важно в томографии in vivo, когда важно обеспечить малый размер зонда и усилить релаксационные характеристики.
Есть много факторов, которые потенциально могут повлиять на способность магнитных наночастиц индуцировать уменьшение T2*. К ним относятся физические размеры частицы и ее оболочки, химические свойства оболочки и окружающей среды, движение частиц и протонов, и неоднородности в самих частицах. Регулируя размер ядра, толщину оболочки, химию поверхности, и нацеленные на мишень лиганды, зонды наночастиц могут быть ориентированы, чтобы достигать конкретные мишени в виде определенных органов, клеток, или даже молекулярных маркеров различных заболеваний in vivo[51]. Релаксация магнитных наночастиц, как правило, модулируется размером ядра, часто в диапазоне 4-20 нм в диаметре. Однако, меньше известно о влиянии свойств оболочки на индуцированную наночастицами релаксацию. Поскольку многие из этих факторов могут взаимодействовать сложным образом, влияя на релаксацию, то выяснение влияния свойств оболочки на уменьшение Т2* может обеспечить полезную основу для разработки более мощных зондов-наночастиц без необходимости увеличения размера зонда.
Для сферической частицы определенного размера ядра, можно представить себе силовые линии магнитного поля, распределенными в пространстве в соответствии с уравнением для диполя [50] (рис. 22а).
Рисунок 22 Оболочка частицы предотвращает приближение протонов к магнитному ядру. а) Протоны диффундируют через дипольное поле наночастицы (окрашенной в зеленый цвет). b) В связи с большой оболочкой (синий цвет), протоны не могут получить доступ к пространству вблизи частицы, где градиенты поля являются наибольшими.
Здесь мы касаемся только Z-компоненты магнитного поля. Магнитные наночастицы вызывают релаксацию Т2* протонов, проходящих через эти градиентные поля наночастиц. Протоны индивидуально накапливают изменения фазы в соответствии с Δφ = γ · Bz · Δt, где Δt – промежуток времени, в течение которого протон находится в градиентном поле. Поскольку протоны находятся первоначально в фазе, то спад сигнала, из-за расфазировки, происходит из-за градиентного поля частицы, а не от основного магнитного поля. На рисунке 22а, ядро частицы (зеленое) производит определенное магнитное поле, через которое частицы могут диффундировать. На рисунке 22b, то же самое ядро окружено оболочкой, которое физически исключает диффузию протонов из некоторой области вокруг ядра. Хотя ядро производит то же поле, протоны имеют меньший доступ к более высоким градиентам вблизи частицы. Как результат, предполагается, что протонная релаксация в ситуации частицы с оболочкой будет медленнее, что приводит к наблюдаемому уменьшению R2 с ростом размера оболочки.
Таким образом, результаты исследований могут привести к пониманию взаимосвязи между размерами оболочки и изменениями релаксации, и соответственно, к разработке оптимальных магнитных наночастиц – зондов для молекулярной МРТ.
Суперпарамагнитные наночастицы оксида железа все чаще используются в разработке зондов МРТ из-за их влияния на релаксивность [51]. Эти наночастицы уже сейчас играют растущую роль в отслеживании стволовых клеток [52], в сортировке клеток и ДНК [53] и в доставке лекарств [54].
Особый интерес представляют исследования возможностей использования суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в низкопольной МР-томографии.
Цель исследований: исследования концентрационных эффектов влияния суперпарамагнитных наночастиц оксида железа на форму линии ЯМР и времена релаксации Т1, Т2 протонов воды с учетом вкладов диффузионного обмена в неоднородное уширение линии ЯМР.
Объекты исследований: суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в водных суспензиях, суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в составе пористых микросфер целлюлозы.
Исследуемые параметры: ширина линии ЯМР протонов воды, химический сдвиг протонов воды и времена протонной релаксации Т1, Т2.
Методы определения: измерение спектров ЯМР методом ЯМР фурье-спектроскопии, измерение времени спин-решеточной релаксации Т1 методом инверсии намагниченности, измерение времени спин-спиновой релаксации методом спинового эха.
Приборные средства измерений: Фурье спектрометр ядерного магнитного резонанса СХР-300 (Брукер, Германия) с величиной магнитного поля 7,1 Т. Все измерения осуществлялись в стандартных стеклянных ампулах диаметром 5 мм без вращения. Для стабилизации поля использовали сигнал дейтериевого резонанса тяжелой воды, которая добавлялась в количестве 50 мкл к 500 мкл суспензий магнитных наночастиц.
Параметры импульсных последовательностей
Для получения 1Н ЯМР спектров использовалась одноимпульсная последовательность (длительность 90° импульса 0,5 мкс; длительность паузы между 90° импульсами 3 с; количество повторений 4).
Для измерения времени Т1 использовалась импульсная последовательность «инверсия-восстановление»180°-t-90° (длительность 90° импульса 4,4 мкс; длительность 180° импульса 8,8 мкс; длительность пауз между 180° и 90° импульсами: 1 мкс, 10 мкс, 100 мкс, 1 мс, 10 мс, 100 мс, 1с, 10 с, всего 8 точек; длительность паузы между 180° импульсами 10 с).
.Для измерения времени спин-спиновой релаксации Т2 применяли последовательность импульсов Carr-Purcell-Meilboom-Gill (длительность 90° импульса 4,4 мкс; длительность 180° импульса 8,8 мкс; время эхо от 1 мкс до 7 мс для разных образцов; 32 сигнала эхо).
Постановка задачи.
Избирательное введение в ткани органов пара, ферри и ферромагнитных веществ является одним из путей повышения информативности метода МРТ. МР-контрастные вещества вызывают усиление или ослабление сигнала ядерного магнитного резонанса, тем самым увеличивая контраст изображений органов. Мировой фармацевтический рынок диагностических МР-контрастных препаратов представлен двумя главными группами МР-позитивных и МР-негативных контрастных препаратов. МР-позитивные контрастные препараты вызывают повышение яркости мест локализации, что способствует улучшению видимости контура органа или мест патогенеза. Для избирательного контрастирования и визуализации канцерогенеза более предпочтительны ферро- и ферри- контрастные препараты негативного принципа действия, которые в отличие от экстрацеллюлярных комплексов гадолиния (позитивный контрастер) способны включаться в клетки по механизму эндоцитоза. Особый интерес представляют ферримагнетики оксида железа, которые способны образовывать наноразмерные частицы с суперпарамагнитными свойствами. Входя в состав МР-негативных контрастирующих препаратов, такие суперпарамагнитные наночастицы придают ему высокие значения магнитной восприимчивости. Среди МР – негативных контрастеров нанодисперсные препараты оксида железа занимают особое доминирующее положение. Для придания биосоместимости и повышения стабильности коллоидных суспензий частицы оксида железа покрывают гидрофильным слоем полимера или ионов органических молекул. В таком виде наночастицы оксидов железа сохраняют магнетизм, имеют малую токсичность и могут применяться в высоких дозах при диагностических обследованиях печени, селезенки, лимфатической системы и желудочно-кишечного тракта.
При неспецифическом поглощении наночастиц клетками ретикуло-эндотелиальной системы они индуцируют в ближайшей окрестности клетки сильное магнитное поле, которое визуализируется как затемнение визуального поля в методе МРТ. Уменьшение яркости зоны наблюдения связано с так называемым эффектом сокращения времени спин-спиновой релаксации Т2 протонов молекул окружения, поэтому такие МР- препараты также называют Т2 – контрастерами. Эффективность контрастирующего действия суперпарамагнитных частиц зависит от степени экранирования магнитных центров при включении в макрофагальные клетки, моноциты, которое приводит с одной стороны к увеличению удельной намагниченности этих клеток за счет концентрирования магнитного материала, а с другой – к уменьшению содержания магнитных частиц во внеклеточной среде (плазме). Это приводит к сильному перераспределению магнитной плотности по тканям и как следствие к артефактным эффектам при исследованиях МРТ. Высокая интенсивность движения молекул воды возле магнитных наночастиц вызывает заметное ослабление измеряемого сигнала ЯМР в области вокселя анализируемой области, что в результате дает усиление контраста изображения. Необходимо ясно представлять роль экранирующего воздействия стенок клеток в трансмембранном транспорте воды на контрастирующие свойства препарата. Учет влияния диффузионного обмена имеет еще одно значение: нахождение магнитных наночастиц в ферментативно активной жидкой среде организма ведет к сокращению срока жизни магнитного состояния частицы. Включение магнитной частицы внутрь защитной оболочки увеличивает время жизни контрастера при парентеральном введении, но одновременно снижает фактор неоднородности магнитного поля за пределами зоны нахождения частицы в капсуле.
Для оценки фактора диффузионного обмена воды при включении магнитных наночастиц в клетки ретикуло-эндотелиальной системы рассмотрена модель микроносителя с внедренными магнитными наночастицами и регулирумой скоростью диффузионного обмена воды, которая отражает основные закономерности магнитной релаксации в биологических жидкостях. Исследование строилось путем сравнения скорости магнитной релаксации в суспензии суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в воде и суспензии микросферических носителей.
Содержание работы:
Экспериментальные результаты исследований.
Полученные спектры ЯМР протонов дистиллированной воды и плазмы крови до- и после введения МР-контрастирующих веществ на основе наночастиц оксида железа (концентрация наночастиц Fe3+ составляла 1,8 мМ/л) (рис. 41) показывают, что сигналы ЯМР протонов воды и плазмы крови по форме до- и после введения контрастного вещества практически идентичны, наблюдается значительное уширение сигналов ЯМР как протонов воды, так и плазмы крови после введения контрастного вещества. До введения контрастера ширина линии составляла примерно 0,05 м.д., а после введения линия уширилась до 1 м.д.
Результаты измерений скорости ядерной магнитной релаксации протонов воды в суспензиях магнитных наночастиц в воде и плазме крови представлены в Таблице 5.
Рис. 41. Спектры ЯМР протонов дистиллированной воды (сверху) и протонов плазмы крови (снизу) до- (слева) и после (справа) введения МР-контрастирующих веществ на основе наночастиц оксида железа.
Таблица 5. Скорости ядерной магнитной релаксации протонов воды в суспензиях магнитных наночастиц в воде и плазме крови
|
Скорости ядерной магнитной релаксации |
R2*, л/мМ с |
R2, л/мМ с |
R1, л/мМ с |
|
Контрастный агент в воде |
382±17 |
187±27 |
1,6±0,1 |
|
Контрастный агент в плазме крови |
112±5 |
164±25 |
1,5± 0,1 |
По результатам измерений были получены зависимости скоростей ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации контрастирующего вещества в суспензиях наночастиц оксида железа в воде и плазме крови (рис. 42-47).
Рис. 42. Зависимость скорости релаксации r2* протонов дистиллированной воды от концентрации наночастиц оксида железа.
Рис. 43. Зависимость скорости релаксации r2 протонов дистиллированной воды от концентрации наночастиц оксида железа.
Рис. 44. Зависимость скорости релаксации r1 протонов дистиллированной воды от концентрации наночастиц оксида железа.
Рис. 45. Зависимость скорости релаксации r2* протонов воды плазмы крови мышей от концентрации наночастиц оксида железа.
Рис. 46. Зависимость скорости релаксации r2 протонов воды плазмы крови мышей от концентрации наночастиц оксида железа.
Рис. 47. Зависимость скорости релаксации r1 протонов воды плазмы крови мышей от концентрации наночастиц оксида железа.
В результате исследования релаксационного поведения протонов воды в водных суспензиях магнитных наночастиц оксида железа и плазме крови установлено, что присутствие сывороточных белков в плазме уменьшает эффект неоднородного уширения линии ЯМР за счет экранирования ядра магнитных частиц адсорбционным слоем белков. Как видно из таблицы 5 этот эффект проявляется в трехкратном сокращении скорости ядерной магнитной релаксации R2* и практически не сказывается на скорости спин-решеточной релаксации. Образование адсорбционного слоя белков ведет к опсонизации частиц контрастера и усилению макрофагального захвата в процессе эндоцитоза, которое является вторым источником экранирования магнитных центров. Моделирование эффектов неоднородного уширения линии путем искусственного экранирования магнитных наночастиц оксида железа полупроницаемой матрицей целлюлозы подтвердило справедливость этих заключений.
Магнитные наночастицы оксида железа были введены в матрицу целлюлозы in situ. Получение микросферического пористого носителя суперпарамагнитных наночастиц осуществлялось следующим образом. В реактор ёмкостью 200 мл. помещали суспензию микросферической целлюлозыс с диаметром 80 -120 мкм.. При постоянном перемешивании и температуре насыщали поры микросфер смесью растворов солей железа в течение определённого времени. После пропитки капиллярных пор в реакционную массу добавляли раствор щелочи и выдерживали при постоянном перемешивании и температуре согласно условиям опыта. Наночастицы магнетита формировались внутри пор в соответствии с реакцией
2FeCl3×6H2O + FeSO4×7H2O + 8NH4OH→Fe3O4↓ + 6NH4Cl + (NH4)2SO4 + 23H2O
Fe2+ + Fe3+ + 8OH- ↔ Fe3O4↓ + 4H2O
Композит микросферической целлюлозы, содержащий магнитные частицы, промывали деконтацией дистиллированной водой до нейтрального значения рН. В полученных образцах была измерена концентрация ионов железа. Измерение спектров ЯМР суспензий магнитных наночастиц, включенных в микросферический носитель целлюлозы (рис.48 и 49) показало значительное уширение линии резонанса внутренней воды.
Существование сложной капиллярной системы узких пор в микросфере препятствовало свободному диффузионному обмену внешней воды с внутренней, что отразилось в ее меньшей ширине линии внешней межчастичной воды. Уширение линии ЯМР, вызванное частицами магнетита 100 ррм, заметно превышает величину уширения, вызываемого парамагнитными ионами трехвалентного железа 17 ррм. и магнитными частицами в водных суспензиях. Положение центра линии резонанса протонов воды в суспензии в целом совпадает с положением линии резонанса объемной фазы воды 4,8 ррм..
Рис.48. Спектр протонного резонанса воды в суспензии суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, осажденных в порах микросферической целлюлозы диаметром 80-120 мкм. Полуширина линии внутренней воды 100 ppm , внешней 0,67 ppm.
Рис.49. Спектр протонного резонанса 0,1М раствора FeCl3, сорбированного микросферической пористой целлюлозой. Полуширина линии воды 17 ppm.
Анализ формы линии ЯМР суспензии микросфер (рис.50) показал, что форма линии лучше описывается функцией Лоренца, чем гауссовой функцией распределения.
Рис.50. Сравнительный анализ формы линии резонанса протонов сорбированной воды в суспензии микросферической целлюлозы. Фракция частиц диаметром 125-80 мкм в CCl4.
Этот результат отличается от теоретических выводов по оценке неоднородного уширения линии в суспензии магнитных частиц в пренебрежении межчастичных магнитных взаимодействий [76, 77]. Искажение магнитного поля, индуцируемое полями магнитных наночастиц должно приводить к гауссовому типу распределения частоты резонанса. Диффузионный обмен воды в порах микросферического носителя сглаживает неоднородности поля за времена прецессии спинов (около нескольких мкс), что и приводит к изменению типа формы линии и моноэкспоненциальному спаду сигнала магнитной прецессии. Таким образом, включение суперпарамагнитных наночастиц в микросферический носитель сохраняет контрастирующие свойства магнитных наночастиц, одновременно защищая микрокристаллы магнетита от действия агрессивных факторов биологических жидкостей внутренней среды организма. Сокращение времени спин-спиновой релаксации суспензии магнитных носителей, оцененное по ширине линии, не уступает величине скорости релаксации суспензии суперпарамагнитных наночастиц непосредственно в водном растворе. Следовательно, контрастирующие свойства суспензии суперпарамагнитных наночастиц, включенных в состав микросфер целлюлозы, сохраняются на уровне первоначального источника - суспензии наночастиц оксида железа в воде. Моделирование макрофагальных клеток микросферами с ограниченным диффузионным транспортом воды через поверхность сфер показало, что контрастирующие свойства магнитных наночастиц не должны утрачиваться при макрофагальном эндоцитозе магнитных наночастиц.
Выводы:
Цель исследований: исследования влияния концентрационных эффектов суперпарамагнитных наночастиц оксида железа на скорости релаксации R2*, R2, R1 протонов дистиллированной воды, геля “агар-агар”, раствора альбумина.
Объекты исследований: суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в модельных водных растворах: в дистиллированной воде, в 2% геле «агар-агар» (смесь молекул воды и биомакромолекул полисахаридов агарозы и агаропекина), в водном растворе альбумина (50 г/л) (смеси воды и простых, растворимых в воде белков). В дальнейшем последние две смеси мы для упрощения иногда будем называть системой «биополимер-вода».
Приборные средства измерений:
1) Фурье спектрометр ядерного магнитного резонанса СХР-300 (Брукер, Германия) с величиной магнитного поля 7.1 Тл. Все измерения осуществлялись в стандартных стеклянных ампулах диаметром 5 мм без вращения. Резонансная частота на ядрах протонов - 300 МГц.
2) ЯМР релаксометр «Спин Трэк» с величиной магнитного поля 0.33 Тл. Резонансная частота на ядрах протонов - 14 МГц.
Подготовка к измерению: в стандартные стеклянные ампулы диаметром 5 мм для записи ЯМР спектров вносили по 500 мкл суспензий и добавляли по 50 мкл тяжелой воды («Изотоп») с тем, чтобы получить сигнал ЯМР дейтерия, необходимый для стабилизации магнитного поля. Концентрация железа в образце определялась переводом водной суспензии в раствор трехвалентного железа и последующего спектрофотометрического тестирования тиоцианатного комплекса железа на УФ-спектрофотометре.
Исследуемые параметры: скорости релаксации R2*, R2, R1.
Параметры импульсных последовательностей
Для измерения времени Т1 и, соответственно, скорости релаксации R1=1/T1 использовалась импульсная последовательность «инверсия-восстановление» 180°-t-90° (длительность 90° импульса 4.6 мкс; длительность 180° импульса 8.9 мкс; длительности пауз между 180° и 90° импульсами находились в пределах от 10 мкс до 10 с, всего 16 точек; длительность паузы между 180° импульсами 10 с).
Для измерения времени спин-спиновой релаксации Т2 и, соответственно, скорости релаксации R2=1/T2 применяли последовательность импульсов Carr-Purcell-Meilboom-Gill (длительность 90° импульса 4.6 мкс; длительность 180° импульса 8.9 мкс; время эхо от 1 мкс до 7 мс для разных образцов; 512 сигналов эхо).
Скорость R2* вычислялась по ширине линии спектра (R2*=πΔυ1/2), где Δυ1/2 – ширина спектральной линии на половине высоты. Измерения проводились только на частоте 300 МГц, использовалась одноимпульсная последователь (длительность 90° импульса 0.5 мкс, пауза между импульсами 3 с, количество накоплений от 4 до 32 в зависимости от уровня шумов).
Полученные экспериментальные значения скоростей релаксации R2*, R2, R1 протонов в различных средах при разных концентрациях суперпарамагнитных наночастиц оксида железа представлены в таблице 4 (для частоты ЯМР 300 Мгц) и таблице 5 (для частоты ЯМР 14 МГц).
Таблица 4. Скорости релаксаций, измеренные на частоте ЯМР 300 МГц в различных средах с разным содержанием наночастиц оксида железа.
|
2% гель “агар-агар” с наночастицами оксида железа |
Вода дистиллированная с наночастицами оксида железа |
Водный раствор альбумина 50 г/л с наночастицами оксида железа |
|||||||
|
C(Fe3+), мМ/л |
R2*, 1/c |
R2, 1/c |
R1, 1/c |
R2*, 1/c |
R2, 1/c |
R1, 1/c |
R2*, 1/c |
R2, 1/c |
R1, 1/c |
|
0.5 |
345±10 |
208±6 |
0.95±0.02 |
345±10 |
49±1 |
0.72±0.02 |
345±10 |
92±3 |
0.87±0.03 |
|
1 |
729±22 |
474±14 |
1.56±0.05 |
537±16 |
78±2 |
1.02±0.03 |
653±20 |
172±5 |
1,10±0.03 |
|
2 |
1341±40 |
870±26 |
2.5±0.1 |
691±21 |
126±4 |
1.69±0.05 |
1000±30 |
287±9 |
1,64±0.05 |
|
3 |
2148±64 |
1466±44 |
4.0±0.1 |
729±22 |
220±7 |
2.61±0.08 |
1303±40 |
459±14 |
2,47±0.07 |
|
5 |
3988±120 |
2564±77 |
6.9±0.2 |
1162±35 |
435±13 |
4.9±0.2 |
1815±54 |
788±24 |
4,2±0.1 |
|
8 |
5872±176 |
3636±109 |
9.7±0.3 |
1570±47 |
690±21 |
7,7±0.2 |
2490±75 |
1299±39 |
7,1±0.2 |
|
10 |
8356±250 |
5236±157 |
13.8±0.4 |
1840±55 |
841±25 |
10,8±0.3 |
3140±94 |
1613±48 |
8,9±0.3 |
Таблица 5. Скорости релаксаций, измеренные на частоте ЯМР 14 МГц в различных средах с разным содержанием наночастиц оксида железа.
По результатам измерений были построены графики зависимости скоростей продольной R1 и поперечной R2 ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде (рис. 36 и 37), в геле “агар-агар” (рис. 38 и 39), в растворе альбумина (рис.40 и 41) для двух частот ЯМР: 300 и 14 МГЦ.
Рисунок 36. Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 37. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 38. Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 39. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 40. Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 41. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Обработка результатов измерений:
1. Времена релаксации Т1, Т2 определяли по спаду сигнала ядерной индукции протонов воды с помощью программ Excel по методу наименьших квадратов.
2. На основании данных для образцов с различной концентрацией суперпарамагнитных наночастиц оксида железа строили зависимость скорости релаксации R1 = 1/Т1 и R2 = 1/Т2 от концентрации суперпарамагнитных наночастиц в исследуемых растворах.
3. Зависимость скорости релаксации R1 и R2 от концентрации наночастиц аппроксимировали линейной зависимостью по методу наименьших квадратов с использованием программы Excel.
В качестве критерия контрастирующей эффективности суперпарамагнитных наночастиц оксида железа использовали коэффициент релаксационной эффективности, который рассчитывали как коэффициент пропорциональности ri эмпирической зависимости скоростей магнитной продольной R1 и поперечной R2 релаксации протонов молекул воды от концентрации магнитных наночастиц в исследуемых растворах
Ri = ri∙C + A ,
где С - концентрация магнитных наночастиц, выраженная в мМ, А - константа, определяемая скоростью релаксации протонов воды в отсутствие суперпарамагнитных наночастиц.
Анализ концентрационных зависимостей скоростей продольной и поперечной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» в присутствии суперпарамагнитных наночастиц оксида железа показывает, что:
- скорость продольной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» возрастает линейно с увеличением концентрации суперпарамагнитных молекул;
- с уменьшением индукции магнитного поля (в пределах исследованного диапазона) скорость продольной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» растет, что свидетельствует о наличии частотной дисперсии времен спин-решеточной ЯМР релаксации. И чем выше концентрация суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в водном растворе, тем больше рост скорости продольной релаксации в более низком магнитном поле;
- скорость поперечной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» возрастает линейно с увеличением концентрации суперпарамагнитных молекул;
- с уменьшением индукции магнитного поля (в пределах исследованного диапазона) рост скорости поперечной релаксации для протонов дистиллированной воды практически одинаков, а для протонов систем «биополимер – вода» ее рост незначителен.
По результатам измерений были также построены графики зависимостей скорости эффективной спин-спиновой (поперечной) R2* ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде (рис. 42), в геле “агар-агар” (рис. 43) и в растворе альбумина (рис.44) для частоты ЯМР 300 МГЦ.
Анализ этих зависимостей показывает, что скорость эффективной поперечной релаксации протонов дистиллированной воды и систем «биополимер – вода» возрастает линейно с увеличением концентрации суперпарамагнитных молекул. Наиболее значительный рост скорости эффективной поперечной релаксации протонов наблюдается для геля “агар-агар”.
Рисунок 42. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 43. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа.
Рисунок 44. Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа.
В результате проведенных исследований были определены релаксационные эффективности (релаксивности) ri = (1/C· Тi) (мМ·с/л)-1 суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде, геле «агар-агар» и водном растворе альбумина (Таблица 6).
Таблица 6. Релаксационные эффективности наночастиц оксида железа в разных средах, измеренные на частотах 300 МГц и 14 МГц.
|
Релаксационные эффективности наночастиц оксида железа |
В 2% геле агар-агар |
В дистиллированной воде |
В водном растворе альбумина 50 г/л с |
Частота, МГц |
|
r2*, л/мМ*с |
817±25 |
153±5 |
277±8 |
300 |
|
r2, л/мМ*с |
508±15 |
87±3 |
162±5 |
|
|
r1, л/мМ*с |
1.30±0.04 |
1.05±0.03 |
0.86±0.03 |
|
|
r2, л/мМ*с |
395±12 |
54±2 |
159±5 |
14 |
|
r1, л/мМ*с |
45±1 |
9.6±0.3 |
21.4±0.6 |
Анализ данных таблицы 6 показывает, что:
- релаксационные эффективности r1 для суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде и системах «биополимер – вода» повышаются в более низком магнитном поле, достигая наибольших абсолютных значений r1 в геле «агар-агар». Увеличение релаксивностей r1 для более низкого магнитного поля В0 в системах «биополимер – вода» позволяет сделать вывод о том, что суперпарамагнитные наночастицы оксида железа могут быть использованы в низких магнитных полях как контрастирующие T1 агенты;
- релаксационная эффективность r2 для суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде и системах «биополимер – вода» наоборот уменьшается в более низком магнитном поле, хотя и незначительно;
- наибольшее абсолютное значение релаксационной эффективности зафиксировано для r2* в геле «агар-агар» в более высоких магнитных полях, что свидетельствует о наличии у суперпарамагнитных наночастиц оксида железа свойств Т2* контрастирующих агентов, которые усиливаются при повышении индукции магнитного поля В0.
- сокращение T2* протонов воды суперпарамагнитными наночастицами оксида железа объясняется релаксацией, индуцированной диффузией молекул воды в пределах градиентного магнитного поля вокруг парамагнитного гидратированного иона.
Контрастирующие свойства нанодисперсных частиц оксида железа находятся в прямой зависимости от релаксационной эффективности частиц, то есть их способности влиять на времена ядерной магнитной релаксации протонов растворителя в непосредственном окружении этих частиц. Установлено, что величина интенсивности томографических изображений в методе МРТ определяется не только протонной плотностью выбранного участка наблюдения (воксель), но и скоростью магнитной релаксации ядер в постоянном магнитном поле, причем в большинстве случаев существует также прямая взаимосвязь между скоростью релаксации протонов растворителя и концентрацией магнитных центров. Поэтому в качестве критерия контрастирующей эффективности нанодисперсий оксида железа можно использовать релаксационную эффективность частиц в суспензии, измеренную по временам магнитной релаксации ЯМР. В основу подхода были положены измерения зависимости времен ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации магнитных наночастиц в суспензии.
Исследована релаксационная эффективность магнитных наночастиц оксида железа, стабилизированных глицином, декстраном и хитозаном. Суспензии оксида железа получали методом соосаждения по схеме Массарата с последующей стабилизацией заряженным ионом глицина, нейтрального низкомолекулярного декстрана и хитозана. В зависимости от глубины реакции получали суспензии частиц разной устойчивости. Предварительными наблюдениями установлено, что степень агрегации и, следовательно, размер частиц в суспензии влияет на время седиментации супензии. Осаждение ускоряется при внесении образцов в поле магнита. Наночастичные образцы с размером ниже 100 нм сохраняли устойчивость в течении суток, а образцы с размером частиц выше 300 нм были неустойчивы и быстро расслаивались. Измерения спектров ЯМР и времен магнитной релаксации проводили в сравнении с растворами хлорного железа. Все спектры протонного резонанса имели вид одиночной линии ЯМР воды. Изменения вида спектров при варьировании дисперсий касались только формы линии, которая полностью характеризовалась единственным параметром ширины на половине высоты. Результаты измерений ширины линии представлены в графической форме и суммарной таблице значений релаксационной эффективности r (Таблица 7).
На рис. 45 приведена зависимость ширины линии протонов воды в суспензии от концентрации наночастиц, покрытых декстраном и глицином с размером частиц менее 100 нм. Наночастицы магнетита, покрытые глицином и декстраном, близким образом уширяют линии резонанса протонов воды.
Рисунок 45. Зависимость ширины линии ЯМР 1Н воды от концентрации наночастиц магнетита, покрытых декстраном и глицином.
На рис 46 приведена зависимость скорости релаксации 1/Т 2 протонов воды от концентрации наночастиц магнетита в различной оболочке, измеренных методом спинового эха. Концентрационные зависимости соответствуют линейной зависимости общего вида Ri = ri∙C + A (обозначения см. выше), что позволяет вычислить коэффициент релаксационной эффективности ri по соотношению: ri = (1/C· Тi) (мМ·с/л)-1.
Рисунок 46. Зависимость скорости релаксации ЯМР Н1 от концентрации ионов железа в суспензии наночастиц и раствора хлорного железа.
Результаты измерений релаксационной эффективности синтезированных препаратов магнитных наночастиц обобщены в таблице 7.
Таблица 7. Результаты измерений релаксационной эффективности магнитных наночастиц оксида железа.
|
N |
Стабилизатор |
Релаксационная эффективность, r2, л×ммоль-1×с-1 |
Примечание |
|
1 |
глицин |
130 ±5 |
Дисперсия неустойчивая |
|
2 |
декстран |
130 ±7 |
Супернатант, низкая концентрация Fe |
|
3 |
декстран |
6,7 |
Устойчивая дисперсия, высокая концентрация Fe |
|
4 |
декстран |
4,6 |
Устойчивая дисперсия, высокая концентрация Fe |
|
5 |
хитозан |
5,0 |
Устойчивая дисперсия, высокая концентрация Fe |
Релаксационная эффективность наночастиц магнетита, стабилизированного декстраном и глицином составила 130× с-1 ммоль-1 л в диапазоне концентрации ионов железа 0.05-0.20 ммоль/л, что на порядок превышало релаксационную эффективность парамагнитных ионов Fe. Было проверено влияние суперпарамагнитных частиц оксида железа на спин-решеточную релаксацию протонов воды. Оказалось, что при добавлении первой порции суспензии наночастиц время спин-решеточной релаксации Т1 уменьшилось в 1.25 раза, в то время как при той же концентрации наночастиц, время спин-спиновой релаксации уменьшилось в 14 раз. Наночастицы оксида железа в наибольшей степени влияют на время спин-спиновой релаксации протонов воды Т2. На этом основании можно отнести препараты оксида железа, стабилизированные декстраном и глицином, к контрастирующим веществам негативного действия.
Релаксационная эффективность препаратов железа сильно зависит от химического состава ядра. При полном окислении магнетита в окись железа путем продувания кислорода суспензии частиц эффект сокращения времен релаксации пропадает, линия ЯМР воды сужается до значений нескольких десятков герц. При неполном окислении (краткая продувка воздухом) также намечается удлинение времен релаксации и сужение линии ЯМР. Проведенные полуколичественные измерения времен релаксации в образцах с заменой низкомолекулярного декстрана на декстран с ММ 40 т свидетельствуют о существовании эффекта экранирования ядра нанокристалла магнетита звеньями полисахарида. При возрастании молекулярной массы происходит увеличение толщины оболочки наночастиц и возрастание стабильности суспензии. Лимитация подхода молекул воды к поверхности магнетита сказывается на уменьшении релаксационной эффективности оксида железа. Способность к гидратации гликозидных звеньев декстрана оставляет возможность диффузионного сближения молекул воды с магнетитом. Можно предполагать, что уменьшение релаксационной эффективности при возрастании толщины оболочки описывается диффузионными уравнениями с привлечением понятия микровязкости среды оболочечного слоя. Зарядовое состояние оболочки наночастицы не оказывает прямого воздействия на механизм релаксации магнитных частиц оксида железа, но вторичное воздействие за счет повышения агрегационной устойчивости может быть достаточно велико. Наночастицы , стабилизированные хитозаном , несут положительный заряд аминогрупп, который электростатически препятствует ассоциации частиц. Показано, что образование крупных ассоциатов ферримагнитных частиц оксида железа ведет к резкому возрастанию эффективного магнитного момента. Крупные ассоциаты допустимо аппроксимировать магнитными диполями, которые искажают постоянное магнитное поле. Появление градиента магнитного поля в масштабе 100 нм и выше вызывает сильное расхождение в значениях времен магнитной релаксации Т2 и Т2*, что и наблюдалось на опыте. В случае суспензий наночастиц оксида железа, стабилизирован-ных хитозаном, размерное распределение частиц смещено в сторону мелкодисперсной фазы, что приводит к ожидаемому сужению линии воды в спектрах ЯМР.
Выводы
Цель исследований: исследования спектров ЭПР суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в водных растворах в зависимости от их размера и концентрации
Объекты исследований: суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в дистиллированной воде и водных физиологических растворах.
Исследуемые параметры: ширина и форма линий ЭПР наночастиц оксида железа.
Методы определения: измерение спектров ЭПР методом стационарной ЭПР-спектроскопии 3-см диапазона.
Приборные средства измерений: Малогабаритный спектрометр электронного парамагнитного резонанса модели ESR-MINI 3-см диапазона. Все измерения осуществлялись в стандартных стеклянных ампулах (капиллярах) диаметром 1,5 мм без вращения. В качестве реперного образца использовался образец дифенил-пикрил-гидразила (ДФПГ) с g-фактором 2,0036.
Параметры регистрации спектров ЭПР: частота ВЧ модуляции 100 кГц, амплитуда модуляции - 5 Гс, мощность СВЧ - 2 – 8 мВт, коэффициент усиления - варьировался, количество сканирований – 1.
Содержание работы:
Экспериментальные результаты исследований.
На рис.47-49 представлены спектры ЭПР магнитных частиц Fe3O4 в тонкой гекстрановой оболочке в дистиллированной воде. Условия регистрации спектров ЭПР: частота СВЧ f0 = 9,52 ГГц, мощность СВЧ облучения – 2 мВт (для образцов 1 и 2) и 8 мВт (для образца 3); коэффициент усиления – 400 (для образца 1) и 800 (для образцов 2 и 3).
Для этих спектров характерно наличие двух раздельных сигналов с g- факторами
g1 = 2,32 и g2 = 4,19 , что обусловлено существованием двух конфигураций комплексов железа Fe3+ (3 d5) и Fe 2+ (3 d6), соответственно. Проведенные нами исследования ЭПР показывают, что форма спектров ЭПР сильно зависит от технологии приготовления образцов, от концентрации и размера наночастиц железа в растворе.
Рисунок 47. Спектры ЭПР оксидов железа в дистиллированной воде (СFe = 10,6 мM/л).
Рисунок 48. Спектры ЭПР оксидов железа в дистиллированной воде (СFe = 2,6 мM/л).
Рисунок 49. Спектры ЭПР оксидов железа в дистиллированной воде (СFe = 1,3 мM/л).
Результаты исследований ЭПР наночастиц оксида железа в дистиллированной воде и водных физиологических растворах (использовался фосфатный буфер с pH = 7,0) в зависимости от концентрации и размера наночастиц, представлены на рисунках 50 - 52.
Рисунок 50. Спектры ЭПР суспензии наночастиц оксида железа в дистиллированной воде. Концентрация Fe3+: 1) – 10,5 ммоль/л, 3) – 19,0 ммоль/л, 4) – 31,25 ммоль/л, 5) – 75,9 ммоль/л.
Рисунок 51. Спектры ЭПР суспензии наночастиц оксида железа в физиологическом растворе. Размер наночастиц - менее 200 нм.
Рисунок 52. Спектры ЭПР суспензии наночастиц оксида железа в физиологическом растворе. Размер наночастиц – более 200 нм.
Сравнительный анализ спектров ЭПР суспензий наночастиц оксида железа как в дистиллированной воде, так и в водных физиологических растворах показывает следующие закономерности:
- с ростом концентрации наночастиц оксида железа происходит увеличение интенсивности и «эффективной» ширины сигналов ЭПР;
- форма линий ЭПР содержит две компоненты – узкий и широкий сигналы, накладывающиеся друг на друга.
Похожая форма линий ЭПР наблюдалась также в исследованиях ЭПР жидких (вода и толуол) и твердых (полимер) суспензий суперпарамагнитных частиц γ-Fe2O3, выполненных группой Ногиновой Н. [61], которые соотнесли данный спектр агрегатам частиц, образуемым в суспензиях.
Нами был проведен сравнительный анализ экспериментальных спектров ЭПР наночастиц оксида железа с моделированными спектрами ЭПР агрегатов металлических наночастиц в коллоидных растворах, полученными Долотовым C..В. и Ролдугиным В.И.[62-64].
В работах [62-64] использован подход, позволяющий моделировать агрегаты с наперед заданной фрактальной размерностью.
В рассматриваемом подходе структура агрегата задается величинами фрактальной размерности и префактора. Построение агрегата осуществлялось путём присоединения одиночных частиц. С использованием этих моделей были построены двух- и трёхмерные агрегаты моно- и полидисперсных наночастиц, содержащие различное число частиц и обладающие различной фрактальной размерностью (рис. 53).
Рисунок 53. Схема построения фрактального агрегата.
При расчёте спектров ЭПР учитывали только наиболее существенное диполь-дипольное взаимодействие спинов электронов, принадлежащих разным частицам. В этом случае магнитные дипольные моменты μi, наведенные на различных частицах, подчиняются системе уравнений
(4)
где индексы i и j нумеруют частицы, α , β - указывают компоненты
векторов в прямоугольной системе координат, α ,β = {x, y, z}, χ0 – восприимчивость изолированной частицы, rij = ri − rj , nij = rij / rij , i ri – радиус вектор центра i -ой частицы, Hi(0) – внешнее поле в точке ее расположения.
Система уравнений (4) разрешается, и, с учётом выражения для восприимчивости отдельной частицы, получается выражение для расчёта спектров ЭПР агрегатов металлических наночастиц
, (5)
гдеω0 – резонансная частота, g – электронный g -фактор, β – магнетон Бора, ћ - постоянная Планка, τi - время релаксации i -й частицы, Uiαn и wn - собственные векторы и собственные значения 3N -мерной матрицы W с элементами
, (6)
, .
С помощью соотношений (4-6) были рассчитаны спектры ЭПР построенных агрегатов, в том числе и спектры ЭПР анизотропных агрегатов при различной ориентации внешнего магнитного поля.
В случае полидисперсных наночастиц расчёты были проведены для фрактальных агрегатов, состоящих из 100 частиц, размер которых распределён по нормальному закону при среднем диаметре частиц, равном 10 нм. Приведём спектры для наиболее типичного случая агрегатов с df = 2.2.
При малых значениях среднего квадратичного отклонения σ в спектре наблюдается две накладывающиеся друг на друга линии ЭПР. Когда σ = 0.3 нм, в спектре остаётся только одна линия ЭПР (рис. 54).
Рисунок 54 - Спектры ЭПР фрактальных агрегатов (df = 2.2), состоящих из полидисперсных частиц, при различных значениях σ : 1 – 0, 2 – 0.1, 3 – 0.2, 4 – 0.3 нм.
Аналогичная картина наблюдается и для агрегатов с другой фрактальной размерностью, при которой спектр исходно расщеплялся. Это объясняется следующим образом. Расщепление спектров агрегатов на линии происходит из-за наличия в них статистически доминирующих расстояний между частицами, на которых взаимодействие достаточно сильно, чтобы проявить себя в спектре. С ростом σ появляется всё большее число частиц разных размеров, что приводит к случайному изменению расстояний между ними и, как следствие, к изменению положения новых резонансных линий. В результате множество линий ЭПР сливаются в одну широкую линию.
Сказанное выше справедливо для агрегатов, в которых частицы разного размера расположены случайным образом друг относительно друга. Проведённое моделирование спектров и анализ упаковки частиц показали, что спектр ЭПР полидисперсных систем зависит от порядка расположения крупных и мелких частиц в агрегате, от того, какие (крупные или мелкие) частицы находятся в центральной части агрегата или на периферии. Так, из рис. 55 видно, что даже при достаточно большом значении σ , равном 0.9 нм, в спектре всё ещё присутствуют две линии ЭПР, когда самые маленькие частицы располагаются в центре агрегата, затем идут частицы большего размера, а самые большие находятся на периферии. (Заметим, что такой порядок распределения частиц, по-видимому, должен соответствовать строению реальных агрегатов, поскольку мелкие частицы обладают большей подвижностью и потому больше склонны к агрегации.)
Рисунок 55 - Спектры ЭПР фрактальных агрегатов (df = 2.2), состоящих из полидисперсных чачтиц (σ = 0.9), при случайном (1) и регулярном (2, 3) расположении частиц в агрегате. 2 – самые маленькие частицы расположены в центре, а самые большие – на периферии, 3 – самые большие частицы расположены в центре, а самые маленькие – на периферии.
При обратном порядке расположения частиц спектр состоит только из одной линии. Таким образом, случайный порядок расположения частиц является неким промежуточным вариантом, и расщепление спектра на две линии может наблюдаться даже для агрегатов, состоящих из полидисперсных частиц с довольно большим σ.
Было также прослежено изменение спектра ЭПР агрегата, растущего из полидисперсных частиц (рис. 56). Видно, что на начальной стадии агрегации поведение спектра такое же, как и в случае агрегата, состоящего из монодисперсных частиц. Но для агрегатов, состоящих из 25−100 полидисперсных частиц, наблюдаются заметные различия в характере изменения спектров агрегатов монодисперсных и полидисперсных частиц. Рис. 56 демонстрирует сильное влияние полидисперсности частиц на эволюцию спектра ЭПР.
Рисунок 56 - Спектры ЭПР фрактальных агрегатов, состоящих из 5 (1), 10 (2), 25 (3), 50 (4) 100 полидисперсных частиц (5). σ = 0.9 нм, df = 2.2.
Сравнение полученных нами экспериментальных спектров ЭПР суспензий наночастиц оксида железа с моделированными спектрами ЭПР агрегатов металлических наночастиц [62 - 64] показывает, что наиболее вероятно, экспериментальные спектры ЭПР обусловлены агрегатами полидисперсных наночастиц оксида железа, когда самые маленькие частицы располагаются в центре агрегата, затем идут частицы большего размера, а самые большие находятся на периферии.
Таким образом в результате проведенных нами экспериментальных исследований ЭПР суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в водных суспензиях можно сделать следующие выводы:
Молекулярная МРТ основывается на том, что специальные молекулы – маркеры служат источником контраста на изображениях. Контраст в МРТ является результатом различия в сигнале от смежных пикселей или вокселей, сигнал в наибольшей степени зависит от трех основных параметров: протонной плотности, времени спин-решеточной релаксации T1, и времени спин-спиновой релаксации T2. Плотность спинов, пропорциональная суммарной намагниченности спиновой системы M0, отражает общее количество спинов, доступных для получения МР-изображения в пределах данной ткани (или пикселя).
Времена релаксации T1 и T2 описывают законы, по которым изменяется спиновая система. T1 - закон, по которому система возвращается к равновесию после возбуждения энергией РЧ поля. Чем быстрее система возвращается к равновесию, тем больше доступных спинов для возбуждения следующим импульсом.
Спин-спиновая T2 -релаксация описывает процесс расфазировки МР-сигнала из-за локальной неоднородности магнитного поля, возникающей за счет взаимодействия спинов друг с другом, в результате чего происходит потеря интенсивности МР-сигнала. В общем случае расфазировка спиновых прецессий ядерных моментов вызывается не только спин-спиновыми взаимодействиями, но и наличием неоднородных локальных внешних магнитных полей в объеме образца, обусловленных или неоднородностью постоянного магнитного поля B0, или градиентными магнитными полями, создаваемыми соседними магнитными моментами других ядер и неспаренных электронов. В этом случае говорят о времени эффективной поперечной релаксации :
,
где γ – гиромагнитное отношение, δB – неоднородность локального магнитного поля.
Времена T1 и T2 зависят от нескольких параметров [53]: - резонансной частоты (индукции магнитного поля); - температуры; - подвижности спинов (микровязкости); присутствия больших молекул; - присутствия парамагнитных молекул.
Контраст МР-изображений зависит в большей или меньшей степени от T1, T2 или и протонной плотности.
Так как T1 и T2 являются основными параметрами контраста МР-изображений, именно эти параметры должны быть изменены любым потенциальным контрастным агентом.
Связь спинов протонов с большими магнитными моментами суперпарамагнитных веществ увеличивает скорость релаксации воды, делая их полезными в качестве контрастных агентов для МРТ. В присутствии суперпарамагнитных веществ, таких как наночастицы оксида железа, времена релаксации ядерных спинов протонов воды, T1, T2 и , сокращаются [54]. Что касается T2 и , магнитные наночастицы действуют как магнитные моменты, производящие крошечные градиенты локального магнитного поля, через которые протоны осуществляют диффузию. Так как каждый протон будет иметь отдельный путь через градиентное поле, то разности фаз между протонами будут накапливаться. В результате будет происходить индуцированная различной восприимчивостью расфазировка МР сигнала протона с последующим уменьшением . Это сокращение может быть использовано в МРТ-эксперименте, когда наночастицы сильно намагничены.
При использовании суперпарамагнитных частиц оксида железа релаксация вызвана время- или частотно-модулированными взаимодействиями между протонами и магнитными моментами частиц [55]. Связь может быть дипольного и скалярного характера, а временная или частотная модуляция возникает из-за трансляционной диффузии протонов, вращательной диффузии магнитных частиц и обмена между связанными протонами биомакромолекул и протонами свободной воды.
Есть много факторов, которые потенциально могут повлиять на способность магнитных наночастиц индуцировать уменьшение . К ним относятся физические размеры частицы и ее оболочки, химические свойства оболочки и окружающей среды, движение частиц и протонов, и неоднородности в самих частицах. Регулируя размер ядра, толщину оболочки, химию поверхности, и нацеленные на мишень лиганды, зонды наночастиц могут быть ориентированы, чтобы достигать конкретные мишени в виде определенных органов, клеток, или даже молекулярных маркеров различных заболеваний in vivo [56]. Релаксация магнитных наночастиц, как правило, модулируется размером ядра, часто в диапазоне 4-20 нм в диаметре. Однако, меньше известно о влиянии свойств оболочки на индуцированную наночастицами релаксацию. Поскольку многие из этих факторов могут взаимодействовать сложным образом, влияя на релаксацию, то выяснение влияния свойств оболочки на уменьшение может обеспечить полезную основу для разработки более мощных зондов-наночастиц без необходимости увеличения размера зонда.
Для сферической частицы определенного размера ядра, можно представить себе силовые линии магнитного поля, распределенными в пространстве в соответствии с уравнением для диполя [57]. Здесь мы касаемся только Z-компоненты магнитного поля Bz. Магнитные наночастицы вызывают релаксацию протонов, проходящих через эти градиентные поля наночастиц. Протоны индивидуально накапливают изменения фазы в соответствии с , где Δt – промежуток времени, в течение которого протон находится в градиентном поле. Поскольку протоны находятся первоначально в фазе, то спад сигнала, из-за расфазировки, происходит из-за градиентного поля частицы, а не от основного магнитного поля. Ядро частицы производит определенное магнитное поле, через которое частицы могут диффундировать. Оболочка частицы, физически исключает диффузию протонов из некоторой области вокруг ядра. Хотя ядро производит то же поле, протоны имеют меньший доступ к более высоким градиентам вблизи частицы. Как результат, предполагается, что протонная релаксация в ситуации частицы с оболочкой будет медленнее, что приводит к наблюдаемому уменьшению скорости релаксации R2 с ростом размера оболочки.
Целью данного этапа проекта является определение оптимальных параметров и условий улучшения магнитно-резонансных изображений при использовании наночастиц оксида железа.
Объекты исследований: суперпарамагнитные наночастицы оксида железа в модельных водных растворах: в дистиллированной воде, в 2% геле «агар-агар» (смесь молекул воды и биомакромолекул полисахаридов агарозы и агаропекина), в водном растворе альбумина (50 г/л) (смеси воды и простых, растворимых в воде белков). В дальнейшем последние две смеси мы для упрощения иногда будем называть системой «биополимер-вода».
Магнитно-резонансные изображения изучались in vivo при введении наночастиц оксида железа в ткани мышей.
Приборные средства измерений: Фурье спектрометр ядерного магнитного резонанса СХР-300 (Брукер, Германия) с величиной магнитного поля 7,1 Тл. Все измерения осуществлялись в стандартных стеклянных ампулах диаметром 5 мм без вращения. Для стабилизации поля использовали сигнал дейтериевого резонанса тяжелой воды.
ЯМР релаксометр «Спин Трэк» с величиной магнитного поля 0.33 Тл. Резонансная частота на ядрах протонов - 14 МГц.
Микро ЯМР томограф AVANCE II - 500 (Брукер, Германия). Область исследования 30х30 мм, матрица 256х256 пикселей, толщина среза 1мм, расстояние между срезами 1,5 мм.
Параметры импульсных последовательностей для исследований in vitro
Для получения 1Н ЯМР спектров использовалась одноимпульсная последовательность (длительность 90° импульса 0,5 мкс; длительность паузы между 90° импульсами 3 с; количество повторений 8).
Для измерения времени Т1 использовалась импульсная последовательность «инверсия-восстановление» 180°-t-90° (длительность 90° импульса 4,6 мкс; длительность 180° импульса 9,2 мкс; длительность пауз между 180° и 90° импульсами: от 1 мкс до 10с. 16 экспериментальных точек; длительность паузы между 180° импульсами 10 с).
Для измерения времени спин-спиновой релаксации Т2 применяли модифицированную импульсную последовательность Карра-Парселла (длительность 90° импульса 4,6 мкс; длительность 180° импульса 9,2 мкс; время эхо от 1 мкс до 7 мс для разных образцов; 512 сигналов эхо).
Скорость релаксации R2* вычислялась по ширине линии спектра (R2*=πΔυ1/2), где Δυ1/2 – ширина спектральной линии на половине высоты. Измерения проводились только на частоте 300 МГц, использовалась одноимпульсная последователь (длительность 90° импульса 0.5 мкс, пауза между импульсами 3 с, количество накоплений от 4 до 32 в зависимости от уровня шумов).
Экспериментальные результаты
Измерения спектров ЯМР и времен магнитной релаксации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в модельных водных растворах проводили в сравнении с водными растворами хлорного железа. Все спектры протонного резонанса имели вид одиночной линии ЯМР воды. Изменения вида спектров при варьировании дисперсий касались только формы линии, которая полностью характеризовалась единственным параметром ширины линии на половине высоты. Результаты измерений ширины линии представлены в графической форме в виде зависимости ширины линии протонов воды в суспензии от концентрации наночастиц. На рис. 20 показана типичная зависимость ширины линии ЯМР 1Н воды от концентрации наночастиц магнетита, покрытых декстраном и глицином, с размером частиц менее 100 нм. Наночастицы магнетита, покрытые глицином и декстраном, близким образом уширяют линии резонанса протонов воды.
Рисунок 20 – Зависимость ширины линии ЯМР 1Н воды от концентрации наночастиц магнетита, покрытых декстраном и глицином
Поскольку ширина линии ЯМР протонов воды пропорциональна скорости релаксации, то оптимальным для определения параметров контрастирующих свойств МР изображений является изучение экспериментальных зависимостей скоростей релаксации протонов воды в зависимости от концентрации наночастиц в водном растворе.
Полученные экспериментальные значения скоростей релаксации R2*, R2, R1 протонов в различных средах при разных концентрациях суперпарамагнитных наночастиц оксида железа представлены в таблице 4 (для частоты ЯМР 300 Мгц) и таблице 5 (для частоты ЯМР 14 МГц).
Таблица 4 – Скорости релаксации, измеренные на частоте ЯМР 300 МГц в различных средах с разным содержанием наночастиц оксида железа
|
2% гель “агар-агар” с наночастицами оксида железа |
Вода дистиллированная с наночастицами оксида железа |
Водный раствор альбумина 50 г/л с наночастицами оксида железа |
|||||||
|
C(Fe3+), мМ/л |
R2*, 1/c |
R2, 1/c |
R1, 1/c |
R2*, 1/c |
R2, 1/c |
R1, 1/c |
R2*, 1/c |
R2, 1/c |
R1, 1/c |
|
0.5 |
345±10 |
208±6 |
0.95±0.02 |
345±10 |
49±1 |
0.72±0.02 |
345±10 |
92±3 |
0.87±0.03 |
|
1 |
729±22 |
474±14 |
1.56±0.05 |
537±16 |
78±2 |
1.02±0.03 |
653±20 |
172±5 |
1,10±0.03 |
|
2 |
1341±40 |
870±26 |
2.5±0.1 |
691±21 |
126±4 |
1.69±0.05 |
1000±30 |
287±9 |
1,64±0.05 |
|
3 |
2148±64 |
1466±44 |
4.0±0.1 |
729±22 |
220±7 |
2.61±0.08 |
1303±40 |
459±14 |
2,47±0.07 |
|
5 |
3988±120 |
2564±77 |
6.9±0.2 |
1162±35 |
435±13 |
4.9±0.2 |
1815±54 |
788±24 |
4,2±0.1 |
|
8 |
5872±176 |
3636±109 |
9.7±0.3 |
1570±47 |
690±21 |
7,7±0.2 |
2490±75 |
1299±39 |
7,1±0.2 |
|
10 |
8356±250 |
5236±157 |
13.8±0.4 |
1840±55 |
841±25 |
10,8±0.3 |
3140±94 |
1613±48 |
8,9±0.3 |
Таблица 5 – Скорости релаксации, измеренные на частоте ЯМР 14 МГц в различных средах с разным содержанием наночастиц оксида железа
По результатам измерений были построены графики зависимости скоростей продольной R1 и поперечной R2 ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде (рис. 21 и 22), в геле “агар-агар” (рис. 23 и 24), в растворе альбумина (рис. 25 и 26) для двух частот ЯМР: 300 и 14 МГц.
Рисунок 21 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 Мгц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа
Рисунок 22 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14 МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа
Рисунок 23 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа
Рисунок 24 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14 МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа
Рисунок 25 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R1, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14 МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа
Рисунок 26 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2, полученная на частотах ЯМР 300 МГц (поле B0 = 7.1 Тл) и 14 МГц (поле B0 = 0.33 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа
По результатам измерений были также построены графики зависимостей скорости эффективной спин-спиновой (поперечной) R2* ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде (рис. 27), в геле “агар-агар” (рис. 28) и в растворе альбумина (рис. 29) для частоты ЯМР 300 МГц.
Как видно из рисунков 21–29 концентрационные зависимости соответствуют линейной зависимости общего вида Ri = ri∙C + A , где С - концентрация магнитных наночастиц, выраженная в мМ, А - константа, определяемая скоростью релаксации протонов воды в отсутствие суперпарамагнитных наночастиц, коэффициент релаксационной эффективности ri. Анализ концентрационных зависимостей позволяет определить коэффициент релаксационной эффективности ri как тангенс угла наклона экспериментальной зависимости Ri = f (C) и вычислить этот коэффициент по соотношению: ri = (1/C· Тi) (мМ·с/л)-1.
В результате проведенных исследований были определены релаксационные эффективности (релаксивности) ri = (1/C· Тi) (мМ·с/л)-1 суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в дистиллированной воде, геле «агар-агар» и водном растворе альбумина (Таблица 6).
Рисунок 27 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 МГц (поле B0 = 7.1 Тл) для образцов дистиллированной воды с различным содержанием наночастиц оксида железа
Рисунок 28 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 МГц (поле B0 = 7.1 Тл) для образцов геля “агар-агар” с различным содержанием наночастиц оксида железа
Рисунок 29 – Концентрационная зависимость скорости релаксации R2*, полученная на частоте ЯМР 300 МГц (поле B0 = 7.1 Тл) для образцов водного раствора альбумина с различным содержанием наночастиц оксида железа
Таблица 6 – Релаксационные эффективности наночастиц оксида железа в разных средах, измеренные на частотах 300 МГц и 14 МГц
|
Релаксационные эффективности наночастиц оксида железа |
В 2% геле агар-агар |
В дистиллированной воде |
В водном растворе альбумина 50 г/л с |
Частота, МГц |
|
r2*, л/мМ*с |
817±25 |
153±5 |
277±8 |
300 |
|
r2, л/мМ*с |
508±15 |
87±3 |
162±5 |
|
|
r1, л/мМ*с |
1.30±0.04 |
1.05±0.03 |
0.86±0.03 |
|
|
r2, л/мМ*с |
395±12 |
54±2 |
159±5 |
14 |
|
r1, л/мМ*с |
45±1 |
9.6±0.3 |
21.4±0.6 |
Анализ графиков на рис. 21–29 и данных таблицы 6 доказывает целесообразность использования коэффициента релаксационной эффективности ri для оценки контрастирующей эффективности суперпарамагнитных нанодисперсных частиц оксида железа в водных растворах и системах «биополимер – вода». Эксперименты показали, что чем больше значение коэффициента релаксационной эффективности ri, тем сильнее и лучше контрастирующая способность исследуемых контрастирующих агентов.
Нами разработана методика оптимального определения коэффициента релаксационной эффективности (r) при использовании суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в молекулярной МРТ.
В основу этой методики были положены измерения зависимости времен ядерной магнитной релаксации протонов воды от концентрации магнитных наночастиц в суспензии. Релаксационная эффективность магнитных наночастиц определяется как коэффициент r1,2 в эмпирической зависимости скоростей магнитной продольной (R1 = 1/Т1) и поперечной (R2 = 1/Т2) релаксации протонов молекул воды от концентрации магнитных наночастиц в исследуемых растворах
,
где С – концентрация магнитных наночастиц, выраженная в мМ/л, T1, T2 – времена продольной и поперечной релаксации (с), соответственно, А – константа, определяемая скоростью релаксации протонов воды в отсутствие наночастиц.
Измерение времен продольной Т1 и поперечной релаксации Т2 заключается в определении скорости возвращения спиновой системы протонов к равновесию в постоянном магнитном поле В0 после воздействия на нее последовательности радиочастотных (РЧ) импульсов на частоте резонанса протонов воды.
Для измерения времени поперечной релаксации Т2 используется методика, основанная на последовательности импульсов Carr-Purcell-Meilboom-Gill. Для измерения времени Т1 используется двухимпульсная последовательность инверсии намагниченности 180°-t-90°.
Подготовка к измерению: в стандартные стеклянные ампулы диаметром 5 мм для записи ЯМР спектров вносятся по 500 мкл суспензий и добавляются по 50 мкл тяжелой воды («Изотоп») с тем, чтобы получить сигнал ЯМР дейтерия, необходимый для стабилизации магнитного поля. Концентрация железа в образце определяется переводом суспензии в раствор трехвалентного железа и последующим спектрофотометрическим тестированием тиоцианатного комплекса железа на УФ-спектрофотометре.
Процесс оценки контрастирующих свойств:
1. Образец помещается в датчик ЯМР спектрометра и включается ядерная стабилизация магнитного поля в соответствии с Руководством по работе на приборе.
2. Измерения проводятся при комнатной температуре без вращения образца с числом накоплений сигнала свободной индукции для достижения необходимого отношения сигнал/шум.
3. Времена релаксации измеряются, используя импульсные программы в программном обеспечении ЯМР-спектрометра.
4. Времена релаксации Т1, Т2 определяются соответственно по нарастанию и спаду сигнала ядерной индукции протонов воды с помощью программы Origin по методу наименьших квадратов.
5. На основании экспериментальных данных для образцов с различной концентрацией магнитных наночастиц строят зависимость скорости релаксации R1 = 1/Т1 и R2 = 1/Т2 от концентрации магнитных наночастиц в исследуемых растворах.
3. Зависимость скорости релаксации R1 = 1/Т1 и R2 = 1/Т2 от концентрации наночастиц аппроксимируется линейной зависимостью по методу наименьших квадратов с использованием программ Excel и Origin. Коэффициент релаксационной эффективности рассчитывается как тангенс угла наклона экспериментальной зависимости Ri = f (C) по соотношению: ri = (1/C· Тi) (мМ·с/л)-1.
Аналогичная методика используется и для определения релаксационной эффективности r2* = (1/C· Т2*). Единственное отличие заключается в том, что скорость релаксации R2* = 1/Т2* вычисляется по ширине линии спектра ЯМР протонов исследуемых растворов (R2*=πΔυ1/2), где Δυ1/2 – ширина спектральной линии на половине высоты.
Для определения условий улучшения контрастных свойств магнитно-резонансных изображений (МРИ) при использовании суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в молекулярной МРТ нами были проведены исследования по оптимизации импульсных РЧ последовательностей, используемых для снятия магнитно-резонансных томограмм.
Наночастицы оксида железа оказывают сильное влияние только на времена релаксаций T2 и , на Т1 их влияние незначительное. Поэтому для оптимизации условий снятия МРИ в присутствии наночастиц оксида железа предлагается использование «быстрых» импульсных последовательностей [53], типа быстрое спин-эхо (RSE, RARE, FSE, TSE) и градиентное эхо (GRE, FLASH). Использование «быстрых» импульсных последовательностей сокращает время исследований, что позволяет избежать появления артефактов от движений пациентов без потери качества изображений.
Последовательности « быстрое спин-эхо»
Интенсивность сигнала в стандартной последовательности «спин-эхо»:
,
где K – константа, зависящая от кровотока, диффузии, перфузии и других параметров, ρ – протонная плотность, TE – время эхо, TR – время повторения. Диаграмма импульсной последовательности «спин-эхо» представлена на рисунке 30.
Рисунок 30 – Диаграмма импульсной последовательности «спин-эхо»
При нескольких сигналах эхо эта последовательность называется «мульти-эхо» последовательностью. Контраст МР-изображений здесь зависит в большей степени от T2, особенно, при длительных TR и TE.
На рисунке 31 представлены МР-изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности «мульти-эхо» с параметрами TE=10 мс, TR=2000 мс, 16 эхо.
Рисунок 31 – МР-изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности «мульти-эхо»: а) – контроль, б) – контраст на основе наночастиц оксида железа 0,1 мг/мл, в) - 1,0 мг/мл, г) - 10,0 мг/мл
В последовательности RARE – модифицированной «мульти-эхо» последовательности (рисунок 32) каждый сигнал эхо регистрируется при воздействии определенного фазово-кодирующего градиента. Каждый сигнал эхо используется для заполнения соответствующей строки матрицы k-пространства одного или двух изображений. Обычно используется от 8 до 16 сигналов эхо [53].
Рисунок 32 – Диаграмма модифицированной «мульти-эхо» последовательности
На рисунке 33 представлены МР Т2-взвешенные изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности RARE, с параметрами TE=12 мс, TR=4200 мс, 16 эхо.
Рисунок 33 – МР Т2-взвешенные изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности RARE: а) – контроль, б) – контраст на основе наночастиц оксида железа 0,1 мг/мл, в) - 1,0 мг/мл, г) - 10,0 мг/мл
На рисунке 34 представлены МР Т1-взвешенные изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности RARE с параметрами TE=7.5 мс, TR=1500 мс, 16 эхо.
Рисунок 34 – МР Т1-взвешенные изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности RARE: а) – контроль, б) – контраст на основе наночастиц оксида железа 0,1 мг/мл, в) - 1,0 мг/мл, г) - 10,0 мг/мл
Градиентные последовательности
Интенсивность сигнала в последовательности градиентное эхо (GRE) определяется соотношением:
,
где α – угол отклонения вектора намагниченности, TE – время эхо, TR – время повторения.
Контраст МР-изображений при использовании такой импульсной последовательности сильно зависит от времени . Диаграмма импульсной последовательности градиентное эхо представлена на рисунке 35.
Рисунок 35 – Диаграмма импульсной последовательности градиентное эхо
Среди быстрых градиентных последовательностей чаще применяют последовательности GRE. Градиентные последовательности позволяют использовать короткие TR. Интенсивность сигнала после серии 90ºимпульсов уменьшается и полностью исчезает, когда система достигает состояния равновесия (насыщения). В таких условиях более эффективны импульсы с углом отклонения менее 90º.
Градиентные последовательности, имеющие короткие TR, называют FLASH.
Интенсивность сигнала для быстрых импульсных FLASH последовательностей, если TR меньше T1, но больше T2*, или при использовании специальных очищающих градиентных полей для устранения поперечных когерентностей, можно определить из следующего соотношения:
,
где - угол отклонения; TR – время повторения; TE – время эхо; T1 – время спин-решеточной релаксации, T2 – время спин-спиновой релаксации.
К основным параметрам (TR, TE и TI) последовательность FLASH добавляет угол отклонения α. Градиентные последовательности, как и спин-эхо последовательности позволяют получать взвешенные изображения в зависимости от времени повторения эхо, угла отклонения, вида последовательности.
В последовательности FLASH интенсивность сигнала достигает максимального значения при угле отклонения 30-60º.
В последовательности «очищенная FLASH» полностью устраняется влияние поперечных когерентностей с помощью градиентных полей, восстанавливая естественный контраст последовательности «частичное насыщение».
В градиентной последовательности с усиленным контрастом (CE-FLASH) T2-взвешенность зависит от значений TR и TE. При больших TE T2-взвешивание лучше, но отношение сигнал/шум ухудшается.
На рисунке 36 представлены МР-изображения мыши, полученные с использованием импульсной последовательности градиентное эхо с параметрами TE = 5 мс, TR = 500 мс.
а) b)
Рисунок 36 – МР-изображения мыши, полученные с использованием импульсной последовательности градиентное эхо: а) – контроль, б) – контраст на основе наночастиц оксида железа 1,0 мг/мл
Таким образом, в ходе исследований была разработана общая методология получения суперпарамагнитных наночастиц, пригодных для неинвазивной инструментальной диагностики методом молекулярной МРТ. В соответствии с основными принципами разработанной методологии были синтезированы лабораторные образцы суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, обеспечивающих повышение контраста МРТ изображений при сканировании животной модели мышей. На наличие контрастирующих свойств препаратов указывали значения удельной намагниченности, коэффициентов релаксационной эффективности и прямые наблюдения гипоинтенсивных МР-изображений органов при внутривенном введении магнитных наночастиц в организм мыши (рисунки 31, 33, 34, 36).
Внерезонансное насыщение (ВРН) – новый перспективный метод МРТ, который значительно увеличивает контрастность изображений, особенно при детектировании специфичных биомаркеров раковых заболеваний – суперпарамагнитных наночастиц оксида железа in vivo.
Недавние разработки новых МР-контрастных агентов и новых методов МРТ с улучшенными чувствительностью и контрастностью изображения быстро нашли распространение в применениях молекулярно-клеточной МРТ [49–52]. По сравнению с парамагнитными металло-хелатами с низким молекулярным весом, такими как Gd-DTPA, суперпарамагнитные наночастицы (Fe3O4 [53–55], MnFe2O4 [56], нанокристаллы FeCo [57]) продемонстрировали существенно более высокие молярные релаксивности и улучшенную чувствительность для in vivo МРТ. Поверхностная функциональность суперпарамагнитного оксида железа (SPIO) обеспечила многочисленные примеры контрастных агентов-мишеней, которые специфично распознают маркеры раковых заболеваний, такие как рецепторы трансферрина [58], фолата [59], и Her-2/neu [60, 61]. После присоединения к мишени-маркеру или после вхождения в клетку наночастицы SPIO могут создавать существенные возмущения в локальных магнитных полях, приводя к быстрой расфазировке спинов протонов и потере интенсивности сигнала магнитного резонанса. T2 или T2*-взвешенные методы МРТ – наиболее общие, применяемые для контрастирования изображений в случае использования наночастиц SPIO. T2*-взвешенные изображения, получаемые с помощью импульсных последовательностей градиентного эхо (GRE) часто имеют низкие отношения сигнал/шум. T2*-взвешенная МРТ высокочувствительна к магнитной восприимчивости, продуцируемой присутствием агентов на основе SPIO, вызывая значительное уменьшение сигнала МР, зависящее от эффективных размеров аккумулированных SPIO агентов. Конечно, исчезновение изображения от влияния SPIO агентов может быть труднее дифференцировать относительно других исчезновений сигнала, вызываемых, например, некоторой магнитной анизотропией вследствие наличия границы раздела тканей. В отличие от этих ограничений, в некоторых недавних исследованиях приводятся сообщения о новых МРТ-методиках, позволяющих потенциально улучшить контрастность МР изображений с помощью агентов на основе SPIO [62–69]. Так Сеппенвульде и др. сообщили о методике, называемой «Белый маркер», разработанной для того, чтобы проследить за парамагнитными маркерами, установленными в катетере, вставляемом в свиную абдоминальную аорту [62]. Положительный контраст был достигнут расфазировкой спиновых прецессий протонов основного сигнала, в то время как на сигнал рядом с маркерами дипольное поле, генерируемое ими, не действовало.
Каннинхам и др. сообщили об использовании похожего метода, чтобы получить позитивный контраст от клеток, меченых суперпарамагнитными наночастицами [63]. В другой работе меченые SPIO стволовые клетки в крысином сердце были визуализированы с помощью методики «a sweep imaging with Fourier transformation (SWIFT) technique», в которой ядра возбуждались свипируемым радиочастотным полем вместе с одновременной обработкой сигнала [64].
Недавно, Зуркия и др. [67] и научная группа Джинминг Гао [68, 69] сообщили о применении метода внерезонансного насыщения для продуцирования позитивного контраста от SPIO наночастиц. Эта методика включала применение насыщающего РЧ-импульса на внерезонансной частоте, и позитивный контраст был получен взятием отношения или вычитания изображений с насыщением и без насыщения. Результаты предварительных исследований [69] продемонстрировали эффективность метода ВРН для детектирования in vivo раковых мишеней – суперпарамагнитных полимерных мицелл (СППМ) в мышах, больных раком. Разработка и применение ультрачувствительных СППМ вместе с методом ВРН обеспечили значительное усиление чувствительности детектирования МРТ вплоть до пикомолярного диапазона концентраций наночастиц. Метод ВРН также позволил улучшить контрастность изображения по сравнению с обычным методом T2-взвешенного изображения. Способность обеспечить увеличенные чувствительность и контрастность МР изображений при продуцировании позитивного контраста сделали ВРН многообещающим методом для молекулярной МРТ.
Теоретическая модель эффекта ВРН
Когда наночастица SPIO намагничивается внешним магнитным полем, времена релаксации соседних протонов воды сильно укорачиваются. При этом предполагается, что все молекулы воды внешней сферы имеют быструю диффузию в шкале ЯМР-времени, и что сигнал от основной массы воды может характеризоваться одиночным набором времен поперечной (T2) и продольной (T1) релаксации. После приложения слабого гладкого длительного РЧ волнового импульса с уровнем мощности ὠ1 (ὠ1 = 2πB1, B1 в Гц) и расстройкой частоты Ω в течение времени t, динамику намагниченности ослабленного сигнала воды можно описать уравнением Блоха:
, (29)
где , , ,
Mz0 – Z-компонента равновесной намагниченности в статическом внешнем магнитном поле. Решение уравнения Блоха (29) может быть выражено как
, (30)
где M0 – вектор намагниченности в начальном состоянии до насыщения, и M∞- намагниченность в устойчивом состоянии,
(31)
. (32)
Отметим, что второй член в уравнении (30) представляет собой разность намагниченностей в первоначальном и устойчивом состояниях, модулированную зависящей от времени функцией e- At (e- At конвергируется в 0 при t → ∞).
Уравнение (32) – основное для нахождения Z-намагниченности в устойчивом состоянии (Mz∞ далее обозначается как Mz) и понимания ее взаимосвязи с параметрами МРТ. Зависимость Z-намагниченности от мощности РЧ насыщения (ὠ1), расстройки частоты насыщения (Ω) и времен релаксации T1 и T2 может быть предсказана и оценена с помощью этого уравнения. На отношение Z-намагниченностей (Mz/Mz0) [70] водного раствора при данных временах релаксации T1 и T2 сильно влияет расстройка частоты насыщения (Ω). При частоте насыщения, расположенной далеко от пика связанной воды, |Ω|→∞, отношение Mz/Mz0 приблизительно равно 1, поскольку член Ω2T22 становится доминирующим фактором в уравнении. Другими словами, интенсивность ВРН пренебрежимо мала из-за того, что намагниченности в начальном и устойчивом состояниях эквивалентны. Наоборот, уменьшение отношения Mz/ Mz0 или более ярко выраженный контраст ВРН ожидается, когда установка частоты насыщения приближается к резонансной частоте воды, или |Ω|→0 м.д. Член Ω2T22 становится менее доминирующим и времена релаксации играют большую роль во влиянии на интенсивность ВРН, приводя к меньшему отношению Mz/ Mz0.
В работе [69] было рассмотрено ВРН растворов СППМ и его зависимость от частоты насыщения и концентрации СППМ. Для томографии ВРН in vivo использовались заранее определенные параметры визуализации, такие как мощность насыщения ὠ1 и расстройка частоты Ω.
С этими известными параметрами можно предсказать и оценить интенсивность ВРН (Mz/ Mz0). Чтобы проверить это, уравнение (32) можно преобразовать так, чтобы получить упрощенную модель для оценки интенсивности ВРН растворов СППМ.
Уравнение (32) может быть преобразовано к виду
(33)
где , которое далее приводится к .
В условиях ВРН с относительно большим значением Ω (например, Ω ≥ 900 Гц или 3 м.д.), где 1/ Ω2<< T22, уравнение (33) станет равным:
(34)
Уравнение (34) показывает линейное соотношение между интенсивностью ВРН и временем продольной релаксации (T1) и обратно пропорционально времени поперечной релаксации (T2) растворов СППМ при данной мощности насыщения и частоте.
Для образцов тканей уравнение (34) может быть далее преобразовано таким образом, чтобы показать корреляцию между интенсивностью ВРН и концентрацией СППМ [69]:
(35)
где , и T2endo – время эндогенной T2 релаксации.
Так как T2endo длиннее чем 200 мс и пробы СППМ имеют высокие r2 значения, то 1/T2endo << r2 [СППМ]. Уравнение (35) тогда станет:
(36)
Линейное соотношение между интенсивностью ВРН и концентрацией СППМ предсказывается уравнением (36). Эти уравнения показывают, что интенсивность ВРН сильно зависит от T2-релаксивности и концентрации СППМ проб в дополнение к ее зависимости от мощности насыщения и расстройки частоты. Важно отметить, однако, что похожее замещение (1/T1endo + r1 [СППМ]) для 1/T1 не будет упрощать рассматриваемое уравнение из-за того, что оба члена будут наиболее вероятно одного и того же порядка величины. Это из-за того, что СППМ не являются эффективными T1 релаксационными агентами с низкими значениями r1.
Данная теоретическая аппроксимированная модель контрастирования МР изображений методом ВРН была экспериментально подтверждена в исследованиях с суперпарамагнитными полимерными мицеллами (СППМ) с прецизионно контролируемыми структурными свойствами [69]. Отобранные по размеру, монодисперсные наночастицы Fe3O4 (6.1 ± 0.2 нм) были использованы для образования ряда СППМ нанопроб со специфично контролируемой толщиной короны (венца) с помощью 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxypoly(ethylene glycol) (DSPE-PEG) с различными PEG молекулярными весами (Рис. 27).
Для количественной оценки эффекта ВРН используют коэффициент ВРН или отношение ВРН, определяемое как
K ВРН = 1-(Msat/M0),
где Мsat – интенсивность изображения при ВРН, М0 –интенсивность изображения без насыщения. Это отношение аналогично по смыслу коэффициенту переноса ядерной намагниченности (MTR). Усиление эффекта ВРН характеризуется более высокими значениями отношения ВРН.
Рисунок 27 – (А) Иллюстрация механизма СППМ индуцированного ВРН контраста и (В) схематическое представление СППМ различной длиной PEG короны, но одного и того же Fe3O4 ядра. В ВРН контрасте импульс внерезонасного РЧ насыщения воздействует только на СППМ-содержащие протоны воды. Вследствие быстрой диффузии воды и большой длительности РЧ импульса устойчивое состояние достигается с меньшей интенсивностью сигнала.
Сравнение методов ВРН и МТ
Метод внерезонансного насыщения, применяемый для SPIO наночастиц, по своей технической реализации в случае слабых магнитных полей идентичен методу внерезонансного насыщения, применяемого для наблюдения эффекта переноса ядерной намагниченности (magnetization transfer - MT) [71]. В случае использования SPIO наночастиц in vivo эти два эффекта часто накладываются друг на друга. Поэтому, чтобы дифференцировать эти два эффекта необходимо знать особенности метода внерезонансного насыщения в случае эффекта переноса ядерной намагниченности. В методе переноса ядерной намагниченности в системе биополимер – вода [72] производится насыщение протонов макромолекул не на частоте резонанса протонов воды, но, конечно, в пределах резонансной линии протонов биополимера, поэтому термин «внерезонансное» следует понимать условно. Происходит процесс переноса ядерной намагниченности от мало подвижных протонов в биополимере на протоны свободной воды, и эффективность этого переноса можно наблюдать по уменьшению сигнала ЯМР от протонов воды по сравнению с сигналом, принятым от них в отсутствии насыщения протонов макромолекул. Однако намагниченность не может быть передана от протонов в биополимере непосредственно протонам подвижной воды, так как время их взаимодействия слишком мало. Поэтому такой перенос возможен лишь при наличии молекул воды, присоединенных к биополимеру и живущих достаточно долго в этом положении. Существование такого взаимодействия (гидратации) не подвергается сомнению [73], хотя его природа достаточно сложна и понятна не до конца. Механизмы передачи ядерной спиновой намагниченности в молекулярно-клеточных структурах рассмотрены нами подробно в п. 1.1.
Схематически основные этапы переноса намагниченности представлены на рис. 28.
Рисунок 28 – Схематическое представление процесса переноса намагниченности в системе «макромолекула – свободная вода».
Насыщающие РЧИ действуют («выжигают») только в узком частотном диапазоне (рис. 29), но из-за того, что линию биополимера в слабом магнитном поле можно считать однородно уширенной [90], эффект насыщения распространяется по всей ширине линии («спиновая диффузия»), на рис. 29 – широкая линия малой интенсивности. Так как спиновые подсистемы контактируют между собой, то протоны биополимера выводят из равновесия протонную систему воды, уменьшая продольную компоненту ее намагничености (узкая линия малой интенсивности).
Рисунок 29 – Наглядное представление изменений спектральных линий в процессе переноса насыщения:
– исходный спектр биополимера;
– исходный спектр воды;
– локально насыщенная («выжженная») линия биополимера;
(широкая) – линия биополимера, ослабленная спиновой диффузией;
(узкая) – линия воды, передавшая намагниченность подсистеме спинов биополимеров.
Таким образом, эффект ВРН в присутствии SPIO отличается от эффекта переноса ядерной намагниченности (МТ) тем , что он основывается на том, что диффузия молекул воды проходит вдоль определенных разделительных областей, которые определяются границами изоповерхностей магнитного поля, а не обязательно каким-то физическим разделением. В эффекте переноса ядерной намагниченности происходит химический или какой-то другой физический обмен протонами [71]. Для того, чтобы определить, что ВРН в присутствии SPIO происходит не вследствие переноса ядерной намагниченности, этот эффект был изучен в растворах с различным pH. Госсуин и др. [74, 75] предварительно использовали этот подход, чтобы различить эффекты внешней и внутренней сфер. Группы OH, локализованные на поверхности частиц, показывают амфотерный характер (см. рис. 30).
Рисунок 30 – Группы OH, локализованные на поверхности частиц, имеют различное число обмениваемых протонов в зависимости от pH.
При низких значениях pH, поверхность более протонирована, увеличивая число потенциально обменноспособных протонов, что приводит к более выраженной релаксации.
Протонный обмен от этих групп может управляться изменением pH. Так как изменения в pH воздействуют на скорость обмена, то изменения в pH будут действовать на процесс переноса ядерной намагниченности, в то время как эффект ВРН в присутствии SPIO, в основном зависящий от диффузии, должен оставаться постоянным при изменениях в pH, для которых наночастицы остаются стабильными. Рисунок 31 показывает, что независимость отношения ВРН от pH для наночастиц Feridex предполагает, что происходит процесс вследствие диффузии, а не от обмена, как в случае переноса намагниченности [67].
Рисунок 31 – Зависимость коэффициента ВРН (отношения ВРН) от pH для разных значений расстройки частоты.
В применениях in vivo, где используются наночастицы SPIO, чаще всего эффекты MT и ВРН аддитивны. Если желательно разделить эти эффекты, то необходимо сначала оценить эффект МТ перед использованием SPIO, тогда изображение с МТ будет служить как базовым, и его можно будет вычесть из аддитивного изображения.
Экспериментальные исследования моделей молекулярно-клеточных структур, содержащих нанодисперсные частицы железа, методом ВРН.
Эффект внерезонансного насыщения (ВРН) был проверен экспериментально на модельных образцах в присутствии магнитных наночастиц железа в работах Зуркия [67]. Было продемонстрировано, что он отличается от эффекта переноса ядерной намагниченности (MT), обусловленной процессами диффузионного обмена и может наблюдаться даже при наличии эффекта MT. Были исследованы зависимости эффекта ВРН от параметров внерезонансного насыщения, концентрации наночастиц, pH, и скорости диффузии. На основе экспериментальных данных была построена простая модель эффекта ВРН. Эффект ВРН усиливается с увеличением концентрации наночастиц железа. Он усиливается пропорционально размеру оболочки, но также сильно зависит от диффузии. Зависимость от диффузии можно выразить через время δt, в течение которого протон находится на оболочке частицы. Тогда приближенное выражение для отношения ВРН может быть записано, как:
(37)
где k – коэффициент пропорциональности (константа), Vshell – объем части воды, захваченной оболочкой, который зависит от характеристик намагниченности частиц, их концентрации, расстройки частоты внерезонансного насыщения. T представляет длительность внерезонансного облучения, величиной порядка миллисекунд, в то время как δt – порядка десятков наносекунд или микросекунд в зависимости от размера оболочки. Поэтому выражает диффузионно-опосредованный насыщением объем, который больше, чем объем, определяемый только внерезонансной частотой. Простая оценка δt может быть сделана используя объем оболочки и коэффициент диффузии из уравнения Δzrms = (2Dδt)1/2, где Δzrms – усредненная толщина данной оболочки. Уравнение (37) приводит к кривым, представленным на рис. 32, которые показывают усиление эффекта ВРН для малых констант диффузии и для малых расстроек внерезонансной частоты, что находится в полном соответствии с экспериментальными данными.
Рисунок 32 – Графики, моделирующие зависимость эффекта ВРН от скорости диффузии. Каждый график соответствует одной и той же расстройке резонансной частоты.
Выводы:
1. Метод ВРН, использующий наночастицы оксида железа, позволяет осуществить генерацию изображения, в которой существует положительная корреляция между интенсивностью изображения и концентрацией суперпарамагнитных наночастиц.
2. Эффект ВРН не ограничен объемом спинов при определенной установке частоты, а усиливается диффузией в течение периода времени импульса насыщения.
3. Зависимость эффекта ВРН от скорости диффузии делает возможным использование эффекта ВРН в присутствии SPIO как метода оценки скорости диффузии. В клинических применениях этот подход может быть полезен для диагностики заболеваний, в которых на диффузию может влиять какая-либо патология, например, ишемические очаги, дифференциация между раковыми и абсцессными инфекционными заболеваниями.
4. Эффект ВРН зависит как от мощности облучения, так и от магнитных характеристик самих частиц, поскольку как различные магнитные свойства, так и различные характеристики покрытия частиц влияют на процесс диффузии вокруг этих частиц.
5. Поскольку эффекты ВРН, обусловленные SPIO и переносом ядерной намагниченности, особенно в случае химического обмена, взаимно дополняют друг друга, то перспективно в случае контрастных частиц на основе SPIO комбинировать оба эти эффекта для повышения контрастности изображений.
Теоретическое изучение эффекта внерезонансного насыщения (п. 1.3) в молекулярно-клеточных структурах, содержащих нанодисперсные частицы оксида железа, показало, метод внерезонансного насыщения, применяемый для SPIO наночастиц, по своей технической реализации в случае слабых магнитных полей идентичен методу внерезонансного насыщения, применяемого для наблюдения эффекта переноса ядерной намагниченности. Выполненные в п. 2.1 экспериментальные исследования эффекта переноса ядерной намагниченности в модельных образцах бионаноструктур показали также эффективность и эквивалентность двух методов переноса ядерной намагниченности: внерезонансного и резонансного насыщения. Поэтому с целью проверки эффективности метода резонансного насыщения для контрастирования МР изображений молекулярно-клеточных структур, содержащих нанодисперсные частицы оксида железа, нами были проведены экспериментальные исследования эффекта резонансного насыщения на модельных образцах водных растворов и гелей агар-агара разной массовой концентрации с добавлением суперпарамагнитных наночастиц оксида железа с различными средними эффективными размерами и концентрациями.
Хотя и теоретические модели переноса спиновой ядерной намагниченности в присутствии SPIO наночастиц и без них существенно отличаются друг от друга вследствие разных механизмов переноса (п. 1.1 и 1.3), но для количественной оценки эффекта переноса намагниченности можно использовать коэффициент переноса намагниченности (КПН), вычисляемый по формуле (8). По смыслу этот коэффициент аналогичен коэффициенту ВРН, определяемому в методе внерезонансного насыщения для SPIO наночастиц, что дает возможность сравнивать эффективность двух методов насыщения. Значения КПН являются важным источником диагностической информации при патологиях головного мозга, в частности при опухолях, и демиелинизирующих заболеваниях. Существенное затруднение в количественной МРТ с переносом намагниченности обусловлено тем, что величины КПН в значительной степени подвержены влиянию аппаратурных факторов (параметры импульсной последовательности, мощность и длительность импульсов РЧ насыщения).
Значение КПН даёт информацию о полном насыщении, с учётом прямого насыщения протонов свободной воды в образце. Чем меньше прямое насыщение, тем больший вклад в параметр КПН вносит перенос ядерной намагниченности. Полностью исключить прямое насыщение свободных протонов (узкая линия спектра) биологических образцов в эксперименте невозможно, в том числе и во время томографических исследований. Важно, чтобы относительная доля переноса ядерной намагниченности в КПН была бы максимальна. По мере увеличения вклада переноса ядерной поляризации, изображения, полученные с помощью импульсной последовательности с переносом намагниченности, будут становиться более взвешенными по протонной плотности макромолекул в тканях. Поэтому параметры эксперимента, как и в п.2.1, подбирались из соображений получения максимального эффекта переноса ядерной намагниченности с учётом требования минимизации прямого насыщения.
Для оценки частичного прямого насыщения (релаксационный вклад без учёта неоднородности поля) были построены кривые насыщения за счёт релаксации для модельных образцов 8% гелей агара с добавлением суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в концентрации 1 миллимоль/литр при различных значениях времени обмена ядерной намагниченностью (рис.48). В соответствии с алгоритмом, изложенным в п.2.1, было проведено моделирование кривых насыщения для указанных выше образцов и параметров импульсной последовательности (рис.49). Из сравнения экспериментальных кривых с модельными графиками можно сделать вывод, что оптимальным временем обмена ядерной намагниченностью является texch1 = 5 мс, а оптимальное необходимое для установления насыщения количество насыщающих импульсов n = 40.
Рисунок 48 – Значение максимума амплитуды ССИ 8% агара с добавлением суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в зависимости от количества насыщающих импульсов и времени обмена texch1=15 мкс…50 мс.
Рисунок 49 – Результат моделирования: значение максимума амплитуды ССИ 8% агара с добавлением суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в зависимости от количества насыщающих импульсов и параметра импульсной последовательности texch1=15 мкс…50 мс.
В таблице 6 показаны полученные в экспериментах коэффициенты переноса ядерной намагниченности (включая прямое насыщение) для различных модельных образцов с суперпарамагнитными наночастицами оксида железа и без них в зависимости от количества насыщающих импульсов.
Параметры насыщающей последовательности для всех образцов были одинаковыми: tbp = 15 мкс, texch1 = 5 мс. Длительности блоков биномиальных насыщающих импульсов равнялись 1 мкс и 3 мкс, что соответствует углам поворота 41° и 123°.
Из таблицы 6 видно, что добавление суперпарамагнитных наночастиц оксида железа уменьшает эффективный перенос намагниченности, что можно объяснить более короткими временами релаксации свободной воды в биопрепарате. Из-за уменьшения разницы в отличиях времён спин-спиновой релаксации импульсы становятся менее селективными. В дополнении к этой причине сокращения времени спин-решёточной релаксации узкой компоненты по сравнению с препаратами без наночастиц имеет место более быстрая продольная релаксация, что вуалирует эффект переноса намагниченности. Однако следует отметить, что при этом уменьшается и время достижения стационарного состояния, что можно использовать для ускорения получения МР-изображений и уменьшения поглощаемой энергии во время исследований.
Таблица 6. Сравнительная таблица коэффициентов переноса намагниченности КПН (включая прямое насыщение) для различных модельных образцов с суперпарамагнитными наночастицами оксида железа и без них в зависимости от количества насыщающих импульсов ( tbp = 15 мкс, texch1 =5 мс).
|
n (число насыщающих импульсов) КПН |
5 |
10 |
20 |
40 |
80 |
100 |
140 |
|
Agar 4% |
0,14 |
0,30 |
0,47 |
0,61 |
0,69 |
0,72 |
0,71 |
|
Agar 8% |
0,25 |
0,43 |
0,55 |
0,69 |
0,76 |
0,76 |
− |
|
Agar 8% + Fe3O4 |
0,21 |
0,34 |
0,48 |
0,52 |
− |
− |
− |
|
Вода |
0,07 |
0,09 |
0,03 |
− |
− |
− |
− |
|
Вода+ Fe3O4 |
0,08 |
0,07 |
0,07 |
0,09 |
− |
− |
− |
|
Рисунок 50 – Значение коэффициента переноса намагниченности для образцов 6% агара с добавлением нанодисперсных частиц оксида железа первой фракции после воздействия биномиальной насыщающей последовательности в зависимости от времени обмена (количество насыщающих импульсов n = 40). |
|||||||
|
Рисунок 51 – Значение коэффициента переноса намагниченности для образцов 6% агара с добавлением нанодисперсных частиц оксида железа четвертой фракции после воздействия биномиальной насыщающей последовательности в зависимости от времени обмена (количество насыщающих импульсов n = 40). |
|
Рисунок 52 – Зависимость коэффициента переноса намагниченности для 6% геля агар-агара и воды с добавлением наночастиц оксида железа после воздействия биномиальной насыщающей последовательности в зависимости от времени обмена (количество насыщающих импульсов n = 40). |
|
Рисунок 53 – Зависимость коэффициента переноса намагниченности для 6% геля агар-агара и воды с добавлением наночастиц оксида железа после воздействия биномиальной насыщающей последовательности в зависимости от времени обмена (количество насыщающих импульсов n = 40). |
Полученные экспериментальные зависимости коэффициента переноса намагниченности протонов свободной воды в образцах 6% геля агара с добавлением наночастиц оксида железа в различной концентрации (0,125; 0,250; 0,500 и 1,000 мМоль/литр) от времени обмена ядерной намагниченностью (рис.50-53) показывают, что оптимальное время обмена (максимальный эффект уменьшения намагниченности за счёт переноса поляризации от макромолекул) уменьшается с увеличением концентрации наночастиц (рис.54) и зависит от среднего эффективного диаметра наночастиц оксида железа. Средний эффективный диаметр наночастиц оксида железа для 1-ой фракции составлял порядка 30 нм, для 4-ой фракции – порядка 60 нм. Причем уменьшение оптимального времени обмена ядерной намагниченностью при увеличении концентрации для наночастиц 1-ой фракции носит более резко выраженный характер, чем для наночастиц 4-ой фракции. Таким образом, перенос намагниченности становится более эффективным уже на малых временах обмена, что позволяет уменьшить длительность импульсной последовательности.
|
Рисунок 54 – Значение времени обмена, при котором значение коэффициента переноса намагниченности является максимальным для образцов 6% агара с добавлением нанодисперсных частиц оксида железа 4-ой и 1-ой фракций после воздействия биномиальной насыщающей последовательности в зависимости от концентрации наночастиц (количество насыщающих импульсов n = 40). |
Также наблюдается зависимость прямого насыщения от концентрации наночастиц оксида железа (вследствие уменьшения времени спин-спиновой релаксации протонов свободной воды с увеличением концентрации наночастиц растёт величина прямого насыщения).
Максимальное значение КПН для оптимального времени обмена линейно возрастает при увеличении концентрации наночастиц оксида железа (рис.55), причем скорость возрастания КПНmax для 1-ой и 4- й фракций одинакова.
|
Рисунок 55 – Значение максимальной величины коэффициента переноса намагниченности для образцов 6% агара с добавлением нанодисперсных частиц оксида железа 4-ой и 1-ой фракций после воздействия биномиальной насыщающей последовательности в зависимости от концентрации наночастиц (количество насыщающих импульсов n = 40). |
Полученные экспериментальные зависимости коэффициента переноса намагниченности от концентрации наночастиц оксида железа разных фракций (рис.56 и 57) для образцов 6% геля агар-агара при различных временах обмена ядерной намагниченностью имеют сложный характер.
|
Рисунок 56 – Значение коэффициента переноса намагниченности для образцов 6% геля агар-агара с добавлением нанодисперсных частиц оксида железа 1-ой фракции после воздействия биномиальной насыщающей последовательности в зависимости от концентрации наночастиц и времени обмена (количество насыщающих импульсов n = 40). |
|
Рисунок 57 – Значение коэффициента переноса намагниченности для образцов 6% геля агар-агара с добавлением нанодисперсных частиц оксида железа 4-ой фракции после воздействия биномиальной насыщающей последовательности в зависимости от концентрации наночастиц и времени обмена (количество насыщающих импульсов n = 40). |
При малых и нулевой концентрациях наночастиц эффект переноса намагниченности мал при небольшом времени обмена (до 2 мс) и становится наиболее заметным при бóльших временах - около 6 мс и более. С увеличением же концентрации значение коэффициента переноса намагниченности становится наиболее значительным при маньших временах обмена (менее 2 мс), в то время как при времени обмена порядка 6 мс его величина уменьшается почти вдвое.
Таким образом, наблюдаемый коэффициент переноса намагниченности сложным образом зависит от многих факторов, таких как концентрация и размеры нанодисперсных частиц оксида железа, время обмена, состояния объекта (гель, жидкость, суспензия и пр.), величины постоянного магнитного поля и его однородности и т.д.
Тем не менее, из рассмотрения полученных зависимостей следует практический вывод, что обмен между протонами связанной фракции и протонами свободной воды усиливается при увеличении концентрации наночастиц. Однако, при этом следует контролировать время обмена, так как при увеличении концентрации наночастиц ускоряется релаксация протонов свободной воды, что приводит к ослаблению эффекта переноса. Соблюдение обоих условий позволит усилить контраст изображений в МРТ путем переноса ядерной спиновой намагниченности при использовании меньшего числа насыщающих импульсов,и, следовательно, сократить время обследования.