Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
28
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
БУРД Наталя Борисівна
Фармакогностичне вивчення деяких
представників роду амарант
15.00.02 –фармацевтична хімія та фармакогнозія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків-2006
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі хімії природних сполук Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров’я України
|
Науковий керівник: |
доктор фармацевтичних наук, професор Кисличенко Вікторія Сергіївна Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри хімії природних сполук |
|
Офіційні опоненти: |
доктор фармацевтичних наук, професор Сербін Анатолій Гаврилович Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри ботаніки; |
|
доктор фармацевтичних наук, старший науковий співробітник Мартинов Артур Вікторович Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, вчений секретар |
|
|
Провідна установа: |
Запорізький державний медичний університет, кафедра фармакогнозії |
Захист відбудеться "_9_" ___червня_____ 2006 року о ________годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).
Автореферат розісланий "5" травня 2006 року.
Вчений секретар
спеціалізованої Вченої ради
професор Л.М.Малоштан
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Одним з важливих завдань фармації є розробка нових лікарських засобів. Фітозасоби з лікарської рослинної сировини широко використовуються в медичній та ветеринарній практиці для профілактики та лікування захворювань. Пошук рослин з достатньою сировинною базою, які можуть доповнити номенклатуру офіцинальних видів, раціональне та комплексне використання сировини, а також створення на їх основі нових лікарських засобів –актуальне завдання сучасної фармації. Особливої уваги фітохіміків заслуговують рослини, які мають багатовікове використання в сільському господарстві та народній медицині.
До таких рослин відноситься амарант (щириця), дикорослі та культивовані види якого широко застосовуються у народній та науковій медицині, кормовиробництві, харчовій промисловості, як цінна кормова культура, сировина для отримання білку, пектину та жирної олії, завдяки високому вмісту біологічно активних речовин (БАР).
Найбільш повне використання добре відомих рослин та наявність достатньої сировинної бази пояснюють інтерес до вивчення сільськогосподарської культури –амаранту.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом проблемної комісії "Фармація" МОЗ України і є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи „Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, зокрема продуктів бджільництва, для дорослих і дітей” Національного фармацевтичного університету (№ держреєстрації 0198У007008).
Мета і задачі дослідження. Метою роботи є вивчення представників роду амарант флори України, розробка способу комплексного застосування рослинної сировини, створення на її основі нових лікувально-профілактичних засобів, а також розробка методів аналізу сировини і фітозасобів. Для досягнення цієї мети вирішувались наступні завдання:
Об’єктом дослідження стали надземні частини трьох видів роду амарант і групи БАР –амінокислоти, вуглеводи, мікроелементи, фенольні сполуки і ліпофільні речовини, що обумовлюють фармакологічну активність досліджуваних представників роду амарант.
Предметом дослідження стали аналіз, виділення і встановлення структури флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, ліпофільних речовин, мікроелементів, амінокислот; розробка технології отримання лікувально-профілактичного засобу з надземної частини амаранту; проведення морфолого-анатомічного дослідження представників роду амарант.
Методи дослідження. БАР визначали фармакопейними методами аналізу, а також використовували тонкошарову і паперову хроматографію, високоефективну рідинну (ВЕРХ) і газорідинну (ГРХ) хроматографії з застосуванням приладів "Міліхром А-01", "Міліхром-02", "Альфа плюс", "Shimadzu" і "Хром-5". Для виділення БАР з рослинної сировини використовували колонкову хроматографію на поліаміді, а також препаративну хроматографію на силікагелі та на папері. Хімічну будову виділених речовин встановлювали методами УФ- і ІЧ-спектрального аналізу за допомогою спектрофотометрів типу СФ-46. Тривимірні спектри флюоресценції ліпофільних сполук записували на спектрофлюориметрі Hitachi F 4010. Температуру плавлення фенольних сполук визначали на блоці Кофлера - Franz Kustner nqch K:G:Dresden; N.K. 70/3314 k. Для анатомічного дослідження вегетативних та генеративних органів представників роду амарант використовували мікроскопи МБР-1 і МБР-2, препарати фотографували фотоапаратом "ФЕД-5" на плівку "Фуджіколор Superia". Фармакологічні дослідження проводили in vitro та in vivo.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичне фітохімічне, фармакологічне та анатомічне вивчення деяких представників роду амарант флори України. Визначено якісний склад та кількісний вміст вуглеводів, амінокислот, стероїдів, фенольних сполук: гідроксикоричних кислот, гідроксикумаринів, флавоноїдів, ліпофільних речовин (хлорофілів, каротиноїдів, жирних кислот, стеринів). З надземної частини амаранту виділено та ідентифіковано 23 сполуки, серед яких астрагалін, нікотифлорин, кверцитрин, ізокверцитрин, умбеліферон, герніарін виділені вперше для досліджуваних видів роду амарант. Визначено наявність 20 мікро- та макроелементів, 16 амінокислот, ідентифіковано 15 жирних кислот.
Визначені оптимальні умови одержання комплексу ліпофільних речовин з надземної частини амаранту. Встановлено, що ліпофільна фракція амаранту та крем на її основі мають протизапальну та ранозагоювальну дії. Розроблено спосіб аналізу отриманого крему. На розроблений склад крему подано заявку на патент України № u 200510012 від 24.10.2005 (Рішення про видачу деклараційного патенту від 31.01.2006). Вперше визначено анатомічні ознаки сировини амаранту.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані фітохімічні та фармакологічні дані вказують на можливість застосування надземної частини амаранту як сировини для отримання окремих біологічно активних речовин та для виготовлення емульсії на основі ліпофільної фракції амаранту. Розроблено проект АНД на траву амаранту. Розроблено технологію одержання ліпофільної фракції амаранту, а також склад і технологію отримання і лікувально-профілактичного крему. Технологія лікувально-профілактичного крему опрацьована в умовах ТОВ фірми "Продукт", м. Харків. Результати роботи впроваджені в навчальний процес кафедр ботаніки Національного фармацевтичного університету, кафедри якості, стандартизації та сертифікації ліків Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.Горбачевського.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено: ретельний аналіз джерел сучасної наукової літератури щодо хімічного складу представників роду амарант, їх розповсюдження та використання у медицині, ветеринарній практиці, сільському господарстві та харчовій промисловості; виділення та ідентифікацію 23 біологічно активних речовини різної хімічної природи з надземної частини амаранту; встановлення кількісного вмісту БАР у надземній частині досліджуваних представників роду амарант; вивчення анатомічної будови вегетативних та генеративних органів амаранту; розробка технології отримання крему на основі ліпофільної фракції амаранту, а також методів його аналізу; розробку проектів АНД на лікарську рослинну сировину “Трава амаранту” та “Ліпофільний екстракт амаранту".
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на науково-практичній конференції, присвяченій ювілею Ярославського фармацевтичного інституту (Ярославль, 2004), міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні питання фармацевтичної науки та практики" (Запоріжжя, 2004), VI З’їзді фармацевтів України (Харків, 2005), ІІ Міжнародному симпозіумі "Методи хімічного аналізу (Ужгород, 2005), Науково-практичній конференції "Актуальные проблемы образования, науки и производства в фармации" (Ташкент, 2005).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 14 наукових робіт, в тому числі 3 статі у фахових журналах та 10 тез доповідей. Отримано Рішення про видачу деклараційного патенту на лікувально-профілактичний крем.
Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 157 сторінках і складається з вступу, огляду літератури, 4 розділів експериментальних досліджень, висновків, списку використаних джерел, який містить 147 найменувань, у тому числі 47 іноземних, та додатків. Робота ілюстрована 23 таблицями та 23 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Аналіз літературних даних показав, що представники роду амарант є перспективними для отримання біологічно активних речовин для застосування у фармацевтичній промисловості. Але хімічний склад різних видів амаранту вивчено не досить повно: мало вивчені вуглеводи, ліпофільні речовини, фенольні сполуки. Це стосується і видів амаранту, що є дуже поширеними в Україні –A. paniculatus, A. hypochondriacus та A. retroflexus. Тому, актуальним є вивчення хімічного складу зазначених видів амаранту, розробка аналітичної нормативної документації для стандартизації сировини, що дасть змогу створення лікувально-профілактичних засобів на її основі.
Дослідження хімічного складу вегетативних органів
амаранту з виділенням і встановленням структури біологічно активних сполук
За допомогою якісних реакцій та хроматографії з використанням водних, водно-спиртових, хлороформних, етилацетатних, бутанольних екстрактів у надземній частині трьох видів амаранту встановлено наявність вуглеводів, амінокислот, фенолкарбонових кислот, флавоноїдів, дубильних речовин, органічних кислот, сапонінів, хлорофілів, каротиноїдів, фосфоліпідів, стероїдів, кумаринів.
Для вивчення якісного складу ліпофільної фракції методом тривимірної скануючої спектрофлуореметрії в ультрафіолетовому та видимому діапазонах спектру отримали тривимірний спектр флуоресценції, який відображено на рис. 1.
Рис. 1. Тривимірний спектр флуоресценції ліпофільного екстракту з надземної частини амаранту та його логарифмічна проекція
Примітка: Emission –довжина хвилі випромінювання, нм;
Excitation –довжина хвилі збудження, нм
Для ліпофільної фракції з надземної частини амаранту притаманні піки в областях лexc –нм, лemi –-330 нм, що характерні для ненасичених ліпідів (фосфоліпідів), та простих фенолів. Друга серія піків спостерігається в області лexc –-320 нм та лemi –-460 нм і характерна для агліконів флавонів та флавонолів. Третя серія піків лexc –-680 нм та лemi –-680 нм –область флуоресценції хлорофілу.
Для виділення БАР і розділення їх на індивідуальні компоненти використовували методи рідинно-рідинної екстракції, колонкової адсорбційної хроматографії на силікагелі та поліаміді, препаративної хроматографії на папері і в тонкому шарі сорбенту.
В результаті з надземної частини амаранту виділено в індивідуальному стані 23 сполуки: 4 похідних коричної кислоти –кофейна, хлорогенова, п-кумарова та ферулова кислоти; 8 похідних 2-фенілбензо-г-пірону –кемпферол, трифолін, астрагалін, нікотифлорин,кверцетин, рутин, кверцитрин, ізокверцитрин; 2 похідних 2-фенілбензопірану - (+)-катехін та
(-)-епікатехін; 2 похідних бензо-б-пірону –умбеліферон і герніарін; 1 тритерпенова сполука –олеанолова кислота; а також стероїд –-ситостерин, фосфоліпід –лецитин, хлорофіли А і В та каротиноїди -каротин та лютеїн. Деякі фізико-хімічні властивості цих речовин наведено у таблиці 1.
Речовини умбеліферон, герніарін, астрагалін, нікотифлорин, кверцитрин, ізокверцитрин, (+)-катехін та (-)-епікатехін були виділені з досліджуваних видів амаранту вперше.
Структуру виділених речовин встановлювали за допомогою фізичних, хімічних та фізико-хімічних методів аналізу.
Гідроксикоричні кислоти. Речовини 2.1-2.4 за результатами якісних реакцій, даними хроматографічної поведінки, УФ- та ІЧ-спектрів віднесені до гідроксикоричних кислот.
В продуктах лужної деструкції речовини 2.1 (кофейна кислота) і 2.2 (хлорогенова кислота) знайдено 3,4-дигідроксибензойну (пірокатехову) кислоту, речовин 2.3 (п-кумарова кислота) і 2.4 (ферулова кислота) –п-гідроксибензойну кислоту. Порівняння фізико-хімічних властивостей речовини 2.1 і кофейної кислоти вказало на їх ідентичність. Лужний гідроліз речовини 2.2 призводить до утворення еквімолекулярних кількостей кофейної і D-хінної кислот. Місце приєднання кофейної кислоти до D-хінної встановлено лактонізацією речовини 2.2. При метилюванні речовини 2.4 отримали похідне з однією ацетильною групою. Речовиною, що має в своїй структурі гідрокси- та метоксигрупи є ферулова кислота.
На підставі проведених досліджень і результатів порівняння з вірогідними зразками речовини 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 відповідно ідентифіковані з 3,4-дигідроксикоричною (кофейною), 5-О-кофеїл- D-хінною (хлорогеновою), 4-гідроксикоричною (п-кумаровою) та 3-метокси-4-гідроксикоричною (феруловою) кислотами (табл. 1).
Таблиця 1
Основні фізико-хімічні властивості речовин,
виділених з надземної частини A. paniculatus
|
Речовина, її структурна характеристика |
Загальна формула |
Т топл., |
, град. |
Rf у системах розчинників* |
|
|
Система |
Rf |
||||
|
1 |
|||||
|
Похідні коричної кислоти |
|||||
|
2.1. Кофейна кислота (3,4-дигідрокси-корична кислота) |
СНО |
-195 |
- |
А Б |
0,81 ,32 |
|
2.2. Хлорогенова кислота (5-О-кофеїл-D-хінна кислота) |
СНО |
-205 |
-32 метанол |
А Б |
0,62 ,66 |
|
2.3. n-кумарова кислота (4-гідроксикорична кислота) |
СН6О∙ |
212-214 |
А Б |
0,48 ,89 |
|
|
2.4. Ферулова кислота (3-метокси-4-оксикорична кислота) |
СНО |
-170 |
- |
А Б |
0,43 ,86 |
|
Бензо-б-пірони |
|||||
|
2.5. Умбеліферон (7-оксикумарин) |
СНО |
-234 |
- |
Ж З |
0,64 ,36 |
|
2.6. Герніарін (7-метоксикумарин) |
СНО |
-119 |
- |
И К |
0,41 ,15 |
|
2-фенілбензо-г-пірони (флавоноли) |
|||||
|
2.7. Кемпферол (3,5,7,4’-тетраоксифлавон) |
СНО |
-277 |
- |
А Е |
0,80 ,36 |
|
2.8. Трифолін (кемпферол-3-О-в-D-галактопіранозид) |
СНО |
А Е |
0,41 ,61 |
||
|
2.9. Астрагалін (кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозид) |
СНО |
-176 |
-12 етанол |
А Е |
0,37 ,69 |
|
2.10. Никотіфлорин (кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозил-(6→1)-О-б-L-рамнопіранозид) |
СНО |
-222 |
-66 метанол |
А Е |
0,58 ,49 |
|
2.11.Кверцетин (3,5,7,3’,4’-пентаоксифлавон) |
СНО |
-312 |
- |
А В |
0,71 ,44 |
|
2.12. Рутин (кверцетин-3-О-в-D- глюкопіранозил-(6→1)-О-б-L-рамнопіранозид) |
СНО |
-190 |
-33 етанол |
А В |
0,54 ,46 |
|
2.13. Кверцитрин (кверцитин-3- О-б-L-рамнопірано-зид) |
СНО |
-220 |
А В |
0,49 ,63 |
|
|
2.14. Ізокверцитрин (кверцитин-3-О-в-D- глюкопіранозид) |
СНО |
-231 |
-33,0 |
А В |
0,52 ,36 |
|
Похідні 2-фенілбензопірану (флавани) |
|||||
|
2.15.(+)-катехін (3,5,7,3’,4’-пентагідроксифлаван) |
СНО |
-176 |
+17,2 етанол |
А В |
0,72 ,50 |
|
2.16.(-)-катехін (3,5,7,3’,4’-пентагідроксифлаван) |
СНО |
-245 |
- 60,8 етанол |
А В |
0,55 ,45 |
Продовження таблиці 1
|
1 |
|||||
|
Тритерпеноїди |
|||||
|
2.17. Олеанолова кислота |
СНО |
-303 |
+79,0 хлороф. |
А Г |
0,90 ,44 |
|
Стерини |
|||||
|
2.18. в-ситостерин |
СНО |
134-136 |
+37,5 хлороф. |
А Г |
0,95 ,54 |
|
Фосфоліпіди |
|||||
|
2.19. Лецитин (фосфотидилхолін) |
- |
воско-подібна |
- |
Д |
0,28 |
|
Хлорофіли |
|||||
|
2.20. Хлорофіл А |
СНОNMg |
-120 |
- |
Л |
0,9 |
|
2.21. Хлорофіл В |
СНОNMg |
-130 |
- |
Л |
0,93 |
|
Каротиноїди |
|||||
|
2.22. в-каротин |
СН |
190-192 |
- |
Ж |
0,73 |
|
2.23. Лютеїн |
СНО |
-194 |
- |
Ж |
0,75 |
*Примітка: системи розчинників при паперовій та тонкошаровій хроматографії виділених сполук:
|
А. н-бутанол –оцтова кислота –вода (4:1:2) Б. 2 % розчин оцтової кислоти В. 5 % розчин оцтової кислоти Г. толуол –етиловий ефір оцтової кислоти –оцтова кислота (12:4:0,5) |
Д. хлороформ –метанол –вода (65:25:4) Е. хлороформ –етанол (19:1) Ж. 15 % розчин оцтової кислоти З. хлороформ –оцтова кислота –вода (4:1:1) |
Бензо-б-пірони. Речовини 2.5 та 2.6 за якісними реакціями та блакитною і блакитно-зеленою флюоресценцією в УФ-світлі були віднесені до похідних кумаринів.
В УФ-спектрі речовини 2.5 проявлялися максимуми поглинання в області 230, 257 і 326 нм. При додаванні натрію гідроксиду спостерігався батохромний зсув смуг 240 і 361 нм. У ІЧ-спектрі речовини 2.5 спостерігалися смуги поглинання в області 3200 см-1, що дозволяє припустити наявність гідроксильної групи в С-7 положенні. Речовину 2.5 ідентифікували як 7-гідроксикумарин (умбеліферон).
Речовина 2.6 має характерні максимуми поглинання в УФ-спектрі в області 218-256 нм і 298-344 нм, які обумовлені сполученням піронового та бензольного кільця. В ІЧ-спектрі речовини 2.6 проявляються смуги поглинання, які належать ароматичним подвійним зв’язкам (1610-1575 см-1), та максимуми при 2985 та 2843 см-1, які відповідають метоксильній групі. Відсутність депресії температури плавлення суміши речовини 2.6 з герніаріном вказує на їх ідентичнсть.
Флавоноїди. Флавоноїдна природа речовин 2.7-2.16 підтверджується якісними реакціями, даними хроматографічного, спектрального аналізу, продуктами гідролізу, фізико-хімічними характеристиками. В ІЧ-спектрах цих сполук присутні смуги поглинання, характерні для флавоноїдів: в області 3400-2900 см-1 (фенольні гідроксили), 1665-1615 см-1 (карбонільна група г-пірону), 1640-1450 см-1 (валентні коливання ароматичних кілець).
Результати якісних реакцій та УФ-спектроскопії свідчать про належність досліджуваних речовин до похідних флавонолу. За рухомістю на хроматограмах в різних системах розчинників, а також за результатами ціанідинової реакції за Бріантом речовини 2.7 і 2.11 віднесені до агліконів, 2.8, 2.9, 2.13 та 2.14 до глікозидів та 2.10 і 2.12 до біглікозидів.
Речовини, що досліджувалися, у результаті ферментного і кислотного гідролізу утворювали цукрові компоненти та аглікони, які були ідентифіковані як кемпферол та кверцетин. Їх тотожність підтверджували хімічними перетвореннями з подальшою ідентифікацією продуктів повного метилювання та повного ацетилювання, а також за продуктами лужної деструкції, внаслідок якої утворюються флороглюцин та протокатехова кислота.
Таким чином, за даними фізико-хімічних досліджень, УФ- та ІЧ-спектроскопії, а також за продуктами лужної деструкції та кислотного гідролізу, ацетилювання, метилювання ідентифіковано: речовину 2.7 як 3,5,7,4’-тетрагідроксифлавон, або кемпферол; речовину 2.8 як кемпферол-3-О-в-D-галактопіранозид (трифолін); речовину 2.9 як кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозид (астрагалін); речовину 2.10 як кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозил-(6→1)-О-б-L-рамнопіранозид (нікотифлорин); речовину 2.11 як 3,5,7,3’,4’-пентаоксифлавон (кверцетин); речовину 2.12 як кверцетин-3-О-в-D-глюкопіранозил-(6→1)-О-б-L-рамнопіранозид (рутин); речовину 2.13 як кверцетин-3- О-б-L-рамнопіранозид (кверцитрин); речовину 2.14 як кверцетин-3-О-в-D-глюкопіранозид, або ізокверцитрин (табл.1).
Катехіни. Речовини 2.15 та 2.16 за якісними реакціями, забарвленням плям на хроматограмах після проявлення 1% розчином ваніліну у концентрованій хлористоводневій кислоті і 3% спиртовим розчином n-толуолсульфокислоти та даними УФ-спектрів віднесені до катехінів.
Максимуми поглинання УФ-спектрів речовин 2.15 та 2.16 містяться в діапазоні хвиль 278-280 нм. Невеликий батохромний зсув довгохвильового максимуму в присутності етилату натрію (12-14 нм) свідчить про відсутність в молекулах речовин супряження гідроксилу з карбонільною групою. На відміну від флавонолових агліконів досліджувані речовини оптично активні.
На підставі проведених досліджень та порівняння з достовірними зразками речовина 2.15 ідентифікована як (+)-катехін (D-3,5,7,3’,4’-пентагідроксифлаван), а речовина 2.16 –як (-)-епікатехін (L-3,5,7,3’,4’-пентагідроксифлаван) (табл. 1).
Речовини ліпофільної фракції. На підставі фізичних, фізико-хімічних властивостей та даних хроматографічного аналізу, ІЧ-спектрів речовина 2.17 ідентифікована як олеанолова кислота; речовина 2.18 як в-сітостерин; речовина 2.19 як фосфатидилхолін (лецитин); речовини 2.20 і 2.21 віднесені до хлорофілів А і В відповідно; а речовини 2.22 і 2.23 ідентифіковані як каротиноїди –в-каротин та лютеїн відповідно (табл. 1).
Визначення кількісного вмісту різних груп БАР
в надземній частині амаранту
Наступним етапом нашої роботи стало визначення кількісного вмісту тих груп біологічно активних речовин, що містяться в надземній частині амаранту в значній кількості, або відомості про вміст яких суперечні чи відсутні.
Методом атомно-абсорбційної спектроскопії визначений якісний склад та кількісний вміст мінеральних сполук у надземній частині досліджуваних видів амаранту у фазу повної стиглості насіння та фазу масового плодоношення. Встановлено наявність 20 макро- та мікроелементів. Вміст більшості елементів у фазу масового плодоношення був у 1,5-3 рази вищий, ніж у фазу повної стиглості у всіх видів амаранту. В значній кількості містяться елементи К, Са, Mg, P.
Амарант є відомою кормовою культурою, тому було визначено вміст білку та полісахаридів у надземній частині досліджуваних видів амаранту.
Таблиця 2.
Вміст амінокислот у надземній частині різних видів амаранту, %
№ |
Амінокислота |
Загальна формула |
Вміст, % |
|||||
A. paniculatus |
A. hypochondriacus |
A. retroflexus |
||||||
|
на суху вагу |
на |
на суху вагу |
на білок |
на суху вагу |
на |
|||
|
1. |
Аспарагінова |
CHON |
,683 |
5,266 |
,181 |
,127 |
,179 |
,392 |
|
2. |
Треонін* |
CHON |
,382 |
2,945 |
,668 |
,031 |
,206 |
,198 |
|
3. |
Серин |
CHON |
,485 |
3,739 |
,784 |
,731 |
,381 |
,953 |
|
4. |
Глутамінова |
CHON |
,873 |
22,151 |
,246 |
,555 |
,573 |
,401 |
|
5. |
Гліцин |
CHON |
,689 |
5,312 |
,678 |
,092 |
0,866 |
,733 |
|
6. |
Аланін |
CHON |
,011 |
7,795 |
,507 |
,095 |
,172 |
,362 |
|
7. |
Валін* |
CHON |
,583 |
4,495 |
,806 |
,864 |
,083 |
,668 |
|
8. |
Метіонін* |
CHONS |
,206 |
1,588 |
0,280 |
,690 |
,509 |
,194 |
|
9. |
Ізолейцин* |
CHON |
,188 |
1,449 |
,679 |
,098 |
,261 |
,435 |
|
10. |
Лейцин* |
CHON |
,926 |
7,139 |
,641 |
,9038 |
,300 |
,603 |
|
11. |
Тірозин |
CH11ON |
,346 |
2,668 |
,572 |
,452 |
,026 |
,422 |
|
12. |
Фенілаланін* |
CHON |
,484 |
3,732 |
,709 |
,279 |
,896 |
,862 |
|
13. |
Гістидин* |
CHON |
0,194 |
1,496 |
,475 |
,867 |
,601 |
,591 |
|
14. |
Лізин* |
CHON |
0,491 |
3,786 |
,737 |
,448 |
,125 |
,849 |
|
15. |
Аргінин* |
CHON |
,486 |
3,747 |
,860 |
,190 |
,178 |
,078 |
|
16. |
Пролин |
CHON |
- |
- |
,994 |
,999 |
,175 |
,065 |
|
Загальний білок |
12,97 |
16,57 |
,20 |
* Незамінні амінокислоти
Визначено якісний склад та кількісний вміст амінокислот і загального білку у надземній частині досліджуваних видів амаранту. Результати досліджень представлені в таблиці 2.
У зразках A. paniculatus було знайдено 15, а у зразках A. hypochondriacus і A. retroflexus –зв’язаних амінокислот, у тому числі 9 незамінних. Максимальну кількість складають аспарагінова кислота, глутамінова кислота, аланін та лейцин. Максимальний вміст незамінних амінокислот міститься у надземній частині амаранту волотистого і складає 53 % від загального вмісту амінокислот, у амаранту темного –% та у щириці запрокинутої –,5 %.
Загальний вміст білково-полісахаридного комплексу з надземної частини досліджуваних видів амаранту склав біля 8-10 %, також було визначено кількісний вміст полісахаридів за фракціями –водорозчинні полісахариди біля 5 %, пектинові речовини –біля 4 % та геміцелюлоза –-52 %.
Після кислотного гідролізу було визначено мономерний склад фракцій полісахаридів. Водорозчинні полісахариди містили арабінозу, галактозу, рамнозу, глюкозу, фруктозу), пектинові речовини –галактуронову кислоту, рамнозу, арабінозу, глюкозу, галактозу. геміцелюлоза –глюкозу. Вміст полісахаридів у досліджуваних видах амаранту майже не відрізнявся (табл. 3).
Таблиця 3.
(m=5, %, в перерахунку на абсолютно суху сировину)
|
Група БАР |
Об’єкт дослідження |
|
А. paniculatus |
A. hypochondriacus |
A. retroflexus |
|
|
Вміст полісахаридів |
|||
|
Водорозчинні полісахариди (арабіноза, галактоза, рамноза, глюкоза, фруктоза) |
5,31±0,02 |
4,90±0,02 |
5,21±0,02 |
|
Пектинові речовини (галактуронова кислота, рамноза, арабіноза, глюкоза, галактоза) |
4,39±0,05 |
4,17±0,02 |
4,06±0,04 |
|
Геміцелюлоза (глюкоза) |
45,01±0,05 |
48,08±0,03 |
52,36±0,01 |
|
Вміст фенольних сполук |
|||
|
Сума окислювальних фенолів |
5,01±0,05 |
6,55±0,02 |
4,97±0,01 |
|
Гідроксикоричні кислоти |
2,99±0,01 |
2,98±0,01 |
1,04±0,05 |
|
Флавоноїди |
1,81±0,02 |
1,99±0,01 |
1,21±0,02 |
Зі сполук фенольного комплексу було визначено кількісний вміст суми окислювальних фенолів (за методом Левенталя), вміст гідроксикоричних кислот та флавоноїдів (спектрофотометричним методом у перерахунку на хлорогенову кислоту і рутин відповідно) (табл. 3). Несортовий зразок щириці запрокинутої незначно поступався сортовим видам амаранту волотистого та амаранту темного за вмістом фенольних сполук.
З метою комплексного дослідження нами було отримано ліпофільну фракцію амаранту та визначено якісний склад та кількісний вміст біологічно активних речовин.
Таблиця 4.
Вміст речовин у ліпофільній фракції
(m=5, мг%, в перерахунку на ліпофільну фракцію)
|
Група БАР |
Об’єкт дослідження |
|
А. paniculatus |
A. hypochondriacus |
A. retroflexus |
|
|
Вміст каротиноїдів мкг/мл (у перерахунку на -каротин) |
50,80,01 |
33,020,02 |
37,800,01 |
|
Вміст хлорофілів мкг/мл (у перерахунку на хлорофіл А) |
81,20,01 |
,060,03 |
,840,04 |
|
Токофероли |
4,290,04 |
,140,01 |
,680,03 |
В результаті аналізу жирнокислотного складу ліпофільної фракції було ідентифіковано 24 сполуки (вільні жирні кислоти та їх ізомери. З насичених кислот найбільше міститься пальмітинової кислоти (32 %), а з ненасичених –лінолевої (20 %). Сумарний вміст олеїнової, лінолевої та ліноленової кислот складає 47 %, а загальний вміст ненасичених жирних кислот –майже 53 %, що дає підстави вважати, що ліпофільна фракція амаранту має F-вітамінну активність.
Визначили кількісний вміст каротиноїдів, хлорофілів та токоферолів у надземній частині амаранту. Вміст каротиноїдів та токоферолів був майже однаковий для досліджуваних видів, а за вмістом хлорофілів незначно переважає щириця запрокинута (табл. 4).
В неомилюваному залишку ліпофільної фракції з надземної частини амаранту визначили вміст 9 стеринів. Домінуючим компонентом стеринів є в-ситостерин (54,6 %).
Отримання та вивчення ліпофільної фракції
з надземної частини амаранту та стандартизація сировини
Дослідження хімічного складу надземної частини амаранту показали його перспективність для використання у якості лікарської рослинної сировини. Для розробки АНД ми визначили мікродіагностичні ознаки для досліджуваної сировини. Роботу проводили на кафедрі ботаніки під керівництвом професора Сербіна А.Г. та доцента кафедри ботаніки Руденко В.П. Анатомічне дослідження видів амаранту A. paniculatus, A. hypochondriacus, A. retroflexus проведено вперше. Визначені ознаки є характерними для трьох досліджуваних видів амаранту.До діагностичних ознак було віднесено:
- Пучки у стеблі розташовані під первинною корою по колу та по всьому осьовому циліндру - безладно.
- Основною опорною тканиною стебла і листків є субепідермальна кутова або пластинчасто-кутова коленхіма, яка в стеблі і черешках розташована частіше переривчастим колом, в великих жилках –тяжами.
- Ендодерма стебла та черешка містить дрібні складні крохмальні зерна.
- Зовнішні стінки адаксиальної епідерми листкової пластинки випуклі; клітинні оболонки абаксиальної епідерми - звивисті, з характерними петлеподібними потовщеннями; основним типом продихового апарату є аномоцитний; опушення незначне, волоски більш менш довгі, головчасті, з багатоклітинною ніжкою і одноклітинною голівкою, по краю листкової пластинки зустрічаються короткі прості волоски.
- Для основної паренхіми стебла, черешка, жилок, краю листкової пластинки характерні клітини-ідіобласти з кристалічним піском, для мезофілу листкової пластинки –крупні і дрібні друзи.
Визначені мікродіагностичні ознаки були використані при розробці АНД на лікарську рослинну сировину "Трава амаранту".
Для стандартизації ліпофільного екстракту з надземної частини амаранту були визначені його числові показники –кислотне число, число омилення, ефірне число, йодне число та перекисне число.
Розробка складу, технології та вивчення біологічної
активності лікувально профілактичного засобу на основі
ліпофільної фракції амаранту
Високий вміст хлорофілів, каротиноїдів та токоферолів, поліненасичених жирних кислот та стеринів дозволив нам прогнозувати репаративну та протизапальну активність ліпофільної фракції амаранту (ЛФА). Тому була розроблена рецептура емульсії за типом масло/вода, до гідрофобної фази якої було введено ЛФА. Попередні мікробіологічні дослідження показали відсутність протимікробної активності препарату, тому для розширення біологічної дії препарату ми ввели протимікробну речовину - етоній.
Було розроблено технологію отримання крему та визначено основні аналітичні показники. Технологію виробництва крему опрацьовано в умовах ТОВ фірми "Продукт", м. Харків.
На базі ЦНДЛ НФаУ під керівництвом проф. Яковлевої Л.В. було досліджено активність крему ЛФА. Крем показав високу протизапальну активність: майже на рівні зразків порівняння –гелю діклофенаку натрію 1% та мазі синафлану 0,025%.
Препарат пройшов випробування на базі Бабаївського пункту ветеринарної медицини, де застосовувався для лікування та профілактики захворювань шкіри вимені сільськогосподарських тварин.
На лікувально-профілактичний крем подано заявку на патент України № u 200510012 від 24.10.2005 (Рішення про видачу деклараційного патенту від 31.01.2006).
ВИСНОВКИ
1. Вперше проведено порівняльне фармакогностичне вивчення дикорослих та культивованих видів амаранту A. paniculatus, A. hypochondriacus, A. retroflexus флори України, яке показало можливість їх використання у науковій медицині.
2. За допомогою якісних реакцій, хроматографічних методів аналізу в надземній частині амаранту встановлено присутність таких груп біологічно активних речовин як органічні кислоти, амінокислоти, полісахариди, стерини, гідроксикоричні кислоти, кумарини, флавоноїди, дубильні речовини, тритерпенові сапоніни, хлорофіли, каротиноїди.
. З надземної частини амаранту виділено в індивідуальному стані 23 сполуки. З використанням фізико-хімічних, хімічних, фізичник та біологічних методів встановлено структуру цих речовин: похідні коричної кислоти - кофейна (3,4-дигідроксикорична) кислота (речовина 2.1.), хлорогенова (5-О-кофеїл-D-хінна) кислота (речовина 2.2), n-кумарова (4-гідроксикорична) кислота (речовина 2.3), ферулова (3-метокси-4-гідроксикорична) кислота (речовина 2.4); похідні 2-фенілбензопірану (флавани) - (+)-катехін (3,5,7,3’,4’-пентагідрокси-флаван) (речовина 2.5), (-)-катехін (3,5,7,3’,4’-пентагідроксифлаван) (речовина 2.6); похідні 2-фенілбензо-г-пірони (флавоноли) - кемпферол (3,5,7,4’-тетраоксифлавон) (речовина 2.7), трифолін (кемпферол-3-О-в-D-галактопіранозид) (речовина 2.8), астрагалін (кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозид) (речовина 2.9), никотіфлорин (кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозил-(6→1)-О-б-L-рамнопіранозид) (речовина 2.10), кверцетин (3,5,7,3’,4’-пентаоксифлавон) (речовина 2.11), рутин (кверцетин-3-О-в-D- глюкопіранозил-(6→1)-О-б-L-рамнопіранозид) (речовина 2.12), кверцитрин (кверцитин-3- О-б-L-рамнопіранозид) (речовина 2.13), ізокверцитрин (кверцитин-3-О-в-D- глюкопіранозид) (речовина 2.14); похідні тритерпеноїідів –олеанолова кислота (речовиа 2.15); стерини –в-ситостерин (речовина 2.16); похідні бензо-б-пірону –умбеліферон (речовина 2.17) та герніарин (речовина 2.18); фосфоліпіди –лецитин (фосфатидилхолін) (речовина 2.19); пігменти –хлорофіл А (речовина 2.20), хлорофіл В (речовина 2.21), в-каротин (речовина 2.22), лютеїн (речовина 2.23).
З них речовини 2.5, 2.6, 2.9, 2.10, 2.13, 2.14, 2.17, 2.18 вперше виділені з досліджуваних видів амаранту.
. В надземній частині досліджуваних видів амаранту визначено кількісний вміст полісахаридів та їх мономерний склад, кількісний вміст білку та зв’язаних амінокислот, вміст макро-та мікроелементів на різних стадіях вегетації, вперше визначено кількісний вміст окислювальних фенолів, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, стеринів, що вказує на доцільність комплексного використання сировини.
. В ліпофільній фракції з надземної частини амаранту визначено кількісний вміст жирних кислот, стеринів, хлорофілів, каротиноїдів, токоферолів, кількість яких вказує на перспективність її використання для створення лікувально-профілактичного засобу.
. Вперше проведено порівняльне анатомічне дослідження видів амаранту A. paniculatus, A. hypochondriacus, A. retroflexus, встановлено їх діагностичні ознаки.
. Розроблено технологію отримання ліпофільного екстракту з надземної частини амаранту та встановлено її числові показники.
. На основі отриманих даних розроблено проекти аналітичної номативної документації на лікарську рослинну сировину "Трава амаранту" та "Ліпофільний екстракт амаранту".
. Вперше на основі ліпофільного екстракту амаранту розроблено та запропоновано для впровадження лікувально профілактичний засіб –крем протизапальної і ранозагоювальної дії та доведено його фармакологічну ефективність. Подано заявку на патент на корисну модель № u 200510012 від 24.10.2005 (Рішення про видачу деклараційного патенту від 31.01.2006).
. Оформлено технологічний регламент на отримання крему з ліпофільною фракцією амаранту та розроблено проект технічних умов. Технологію виробництва крему опрацьовано в умовах ТОВ фірми "Продукт", м. Харків.
. Результати роботи впроваджені в навчальний процес кафедр ботаніки Національного фармацевтичного університету, кафедри якості, стандартизації та сертифікації ліків Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації, Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.Горбачевського.
Список опублікованих за темою дисертації робіт
Бурд Наталя Борисівна. “Фармакогностичне вивчення деяких представників роду амарант”. –Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата фармацевтичних наук за фахом 15.00.02 –фармацевтична хімія та фармакогнозія. Національний фармацевтичний університет, Харків, 2005.
Вперше проведено порівняльне фармакогностичне вивчення надземної частини деяких представників роду амарант флори України. Досліджено якісний склад та кількісний вміст різних груп біологічно активних речовин у сировині та отриманій ліпофільній фракції з надземної частини амаранту.
З надземної частини амаранту виділено та встановлено структуру 23 індивідуальних речовин: 4 похідних коричної кислоти, 2 похідних кумаринів, 8 флавоноїдів, 2 катехіни, 1 тритерпенову кислоту, 1 речовину стеринової природи, 1 похідне фосфоліпідів, 2 хлорофілів та 2 каротиноїдів, а також 16 амінокислот, 20 макро- та мікроелементів.
Отримано ліпофільну фракцію з надземної частини амаранту, визначено її якісний склад та кількісний вміст 24 жирних кислот, хлорофілів та каротиноїдів. Розроблені проекти АНД на лікарську рослинну сировину “Трава амаранту” та “Ліпофільний екстракт амаранту”.
На основі ліпофільної фракції розроблено лікувально-профілактичний крем для застосування у ветеринарній практиці, встановлено його протизапальну дію.
Ключові слова: амарант, фармакогностичне вивчення, фенольні сполуки, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, амінокислоти, жирні кислоти, каротиноїди, хлорофіли, мінеральні речовини, протизапальна дія.
Бурд Наталья Борисовна. “Фармакогностическое изучение некоторых представителей рода амарант”. –Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фрмакогнозия. Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2005.
Впервые проведено сравнительное фитохимическое изучение надземной части некоторых дикорастущих и культивируемых видов амаранта флоры Украины. Установлено наличие групп биологически активных веществ (БАВ): углеводов, органических кислот, аминокислот, гидроксикоричных кислот, кумаринов, флавоноидов, окисляемых фенолов, тритерпеноидов, хлорофиллов, каротиноидов, макро- и микроэлементов.
Определен качественный состав и количественное содержание аминокислот и общего белка в надземной части исследуемых видов амаранта. Обнаружено 16 аминокислот, из них 9 незаменимых. Содержание незаменимых аминокислот составляет от 46 до 53% от их общей суммы.
Впервые проведено количественное определение содержания суммы окисляемых фенолов, гидроксикоричных кислот, флавоноидов и полисахаридов в надземной части исследуемых видов амаранта. Проведено фракцыонирование выделенных полисахаридных комплексов и определен их качественный и количественный состав: водорастворимые полисахариды –,9-5,3%, пектиновые вещества –,0-4,4%, гемицеллюлоза –,0-52,3% от общего содержания полисахаридов.
Из надземной части амаранта получена липофильная фракция, определены ее числовые показатели и качественный состав. Проведено изучение жирнокислотного состава. Установлено содержание 24 жирных кислот, из которых 15 идентифицированы. Ненасыщенные жирные кислоты составляют 53% от суммы. Определено количественное содержание каротиноидов, хлорофиллов, токоферола.
Из надземной части амаранта метельчатого выделено и установлено структуру 23 веществ: 4 производных коричной кислоты - кофейная (3,4-дигидроксикоричная) кислота, хлорогеновая (5-О-кофеїл-D-хинная) кислота, n-кумаровая (4-гидроксикоричная) кислота, феруловая (3-метокси-4-гидроксикоричная) кислота; 2 кумаринов - умбелиферон и герниарин; 8 флавоноидов –кемпферол (3,5,7,4’-тетраоксифлавон), трифолін (кемпферол-3-О-в-D-галактопіранозид), астрагалін (кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозид), никотіфлорин (кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозил-(6→1)-О-б-L-рамнопіранозид), кверцетин (3,5,7,3’,4’-пентаоксифлавон), рутин (кверцетин-3-О-в-D- глюкопіранозил-(6→1)-О-б-L-рамнопіранозид), кверцитрин (кверцитин-3- О-б-L-рамнопіранозид), ізокверцитрин (кверцитин-3-О-в-D- глюкопіранозид); 2 катехина –(+)-катехин (3,5,7,3’,4’-пентагидроксифлаван), (-)-катехін (3,5,7,3’,4’-пентагидроксифлаван), 1 производное тритерпеноидов –олеаноловая кислота, 1 вещество стериновой природы –в-ситостерин, 1 фосфолипид - лецитин, 2 хлорофилла –хлорофиллы А и В и 2 каротиноида - в-каротин и лютеин. Вещества умбеллиферон, герниарин, астрагалин, никотифлорин, кверцитрин, изокверцитрин, (+)-катехин и (-)-катехин были впервые выделены из исследуемых видов амаранта.
Впервые проведено анатомическое изучение вегетативных и генеративных органов исследуемых видов амаранта и определены их диагностические признаки.
На основе липофильной фракции из надземной части амаранта (ЛФА) получен крем “ЛФА”противовоспалительного действия для лечения и профилактики заболеваний кожи вымени сельскохозяйственных животных. Оформлен проект технологического регламента для получения крема “ЛФА”. Технология производства крема апробирована в условиях ООО фирмы “Продукт”, г. Харьков.
Фармакологическими исследованиями было подтверждено противовоспалительное действие крема.
Разработаны проекты АНД на “Траву амаранта”и “Липофильный экстракт амаранта”.
Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедр ботаники Национального фармацевтического университета, кафедры качества, стандартизации и сертификации лекарств Института повышения квалификации специалистов фармации и Тернопольского государственного медицинского университета им. И.Я. Горбачевского.
Ключевые слова: амарант, фармакогностическое изучение, фенольные соединения, гидроксикоричные кислоты, флавоноиды, аминокислоты, жирные кислоты, каротиноиды, хлорофиллы, минеральные вещества, противовоспалительное действие.
Burd Natalya Borisovna. “Pharmacognostic study of some species of Amaranth genus plants ”. Manuscript/ Thesis for the candidate of pharmaceutical science Degree in speciality 15.00.02 –pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. National University of Pharmacy, Kharkov, 2005.
This is the first time the competitive pharmacognostic study of overground organs of some Amaranthus L. genus plants of Ukrainian flora has been carried out.
Qualitative and quantitative analysis of different groups of biological active substances of Amaranth plant material and lipophilic fraction from over ground organs have been studied.
The 23 individual substances have been isolated and structure of 4 derivatives of cinnamic acid, 2 derivatives of coumarins, 8 flavonoides, 2 catechines, 1 triterpen acid, 1 steroid substance, 1 derivative of phospholipids, 2 chlorophylls and 2 carotinoids, 16 amino acids, 20 macro- and microelements has been determined.
Lipophilic fraction from Amaranth overground organs was obtained and its qualitative and quantitative analysis showed presence of 24 fate acids, chlorophylls and carotenoids. The draft Analytical Normative documentation was developed on plant material “Amaranth herb” and “Lipophilic extract of Amaranth”.
On the basis of lipophilic fraction treatment and preventive cream for usage in veterinary practice has been developed; the anti-inflammatory action of lipophilic extract has been determined.
Key words: Amaranthus spp., pharmacognostic study, phenolic compounds, oxycinnamine acids, flavonoides, amino acids, fatty acids, carotinoides, chlorophylls, mineral elements, anti-inflammatory action.