Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
PAGE 5
Фаги
С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 тпн. Для работы с более крупными фрагментами ДНК (5-25 тпн) разработаны векторы на основе бактериофагов. Трансформирующая активность фагов в 1000 раз выше, чем у плазмид.
После проникновения фага в клетку бактерии развитие фага может идти по двум путям. Если реализируется литический цикл, то фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин клетка разрушается (лизируется) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц. Это хорошо видно по осветлению культуральной суспензии. При другом пути (лизогенном) фаг включается в хромосому бактерии как профаг и реплицируется в клетке вместе с бактериальной хромосомой. При неблагоприятных условиях (недостаток питательных веществ и т.д.) интегрированная фаговая ДНК высвобождается и запускается литический цикл развития. В природе основной приток генов в бактерии за счет трансдукции обусловлен лизогенными умеренными фагами. Для клонирования в клетках E. сoli широко используются фаги λ и М13.
Рисунок 1 ФАГ (сollar-воротник; sheath - ножны)
Фаговые частицы, содержащие упакованную ДНК, способны проходить литический цикл развития внутри бактерий и, следовательно, образовывать стерильные пятна (бляшки) на газоне бактерий (пояснить). Такие бляшки содержат в концентрированном виде как сами фаги с упакованными в них рекДНК, так и все продукты метаболизма зараженных бактерий, включая белки и ферменты, которые появляются в результате экспрессии клонированных бактериальных генов. Каждая бляшка возникает вследствие развития индивидуальной фаговой частицы, содержащей рекДНК только одного типа, а, следовательно, все фаговые частицы одной бляшки (примерно 1010) представляют собой, как правило, клон идентичных фаговых частиц. Все это позволяет легко обнаруживать в фаговых бляшках искомые ферментативные активности или последовательности нуклеотидов и идентифицировать клонированные последовательности ДНК.
Рисунок 2 (бляшки на газоне)
В основе конструирования фаговых векторов лежат следующие принципы. В середине молекулы ДНК фага λ (длиной около 50 тпн) расположен участок хромосомы (около 15 тпн), который не является необходимым для литического развития бактериофага. Его можно заменить на любой фрагмент ДНК аналогичного размера и осуществить клонирование фрагментов путем размножения рекомбинантного бактериофага.
РИСУНОК 3 (фаговый геном)
На концах фаговой ДНК находятся одноцепочные 5-штрих хвосты из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами. Они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом. После того как фаговая ДНК проходит через отросток и попадает в E. coli cos-концы соединяются с образованием кольцевой молекулы. На раннем этапе литического цикла в результате репликации кольцевой молекулы ДНК образуется линейная молекула, состоящая из нескольких сегментов длиной около 50 тпн. Каждый из этих сегментов упаковывается в белковую головку фага, после чего к ней прикрепляется отросток и образуется новая фаговая частица. Белковая оболочка фага называется капсидой. Разрезание ДНК по сos сайтам осуществляет фермент, находящийся у входа в головку.
РИСУНОК 4 (сборка фага)
Чтобы получить лизаты (т.е. суспензии с фагами) бактерии, несущие лизогенные фаги, обрабатывают ультрафиолетом, митомицином С или повышенной температурой. Хранят лизаты фагов над хлороформом, который убивает все неинфицированные и неиндуцируемые клетки донора.
Для упаковки молекул ДНК в фаговую частицу in vitro смешивают в пробирке бесклеточные экстракты двух штаммов E. coli, лизогенных по дефектным бактериофагам λ. В одном штамме содержится мутация, приводящая к инактивации одного из белков фагового капсида, а в другом штамме – мутация, препятствующая включению фаговой ДНК в головку бактериофага. Таким образом, хотя экстракт каждого по отдельности штамма содержит пустые головки, фаговую ДНК и отростки, полноценный фаг в этих экстрактах не образуется. Объединение бесклеточных лизатов обоих штаммов E. coli приводит к взаимной комплементации недостающих функций и сборке полноценных фаговых частиц. При этом образуется 104 – 105 фаговых частиц на 1 мг упаковываемой ДНК.
Для работы в качестве вектора фаг λ содержит температурно-чувствительную мутацию в репрессоре сl, что приводит к индукции фага при повышении температуры до 42°С. Другая мутация вызывает инактивацию гена, кодирующего лизоцим, что препятствует преждевременному выходу бактериальных клеток после индукции профага и позволяет концентрировать клетки перед получением упаковочных экстрактов. Бактериальные лизогенные клетки содержат также мутацию recA, которая предотвращает гомологичную рекомбинацию между ДНК профага и рекомбинантными ДНК, упаковываемыми в фаговые частицы (пояснить). Замещаемый фрагмент фаговой хромосомы имеет с обоих концов полилинкеры, содержащие сайты рестрикции EcoRI, BamHI и SalGI, по которым встраивают клонируемую ДНК.
Другой вид фага, используемого в ГИ это М13 – нитевидный колифаг (пояснить) обладающий однонитевой кольцевой ДНК из 6.4 тпн. Этот фаг также имеет межгенный участок (спейсер), в который можно вставлять чужеродные гены. Фаг М13 позволяет клонировать фрагменты ДНК до 15 тпн и образует фаголизаты с высокой концентрацией (до 1012 частиц в 1 мл), что позволяет получать большие количества векторной и клонируемой ДНК.
Одна из задач генной инженерии состоит в идентификации структурных генов, кодирующих определенные белки, в т.ч. у растений и животных. Для решения этой задачи суммарную ДНК гидролизуют рестриктазой и каждый из получившихся фрагментов встраивают в вектор. Далее необходимо обнаружить и выделить специфическую клеточную линию (клон), которая несет нужную нам последовательность. Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введение этих элементов в клетки хозяина называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов). Полная библиотека содержит весь геном данного организма.
Рисунок 6-9
Для разрезания ДНК на фрагменты используют рестриктазу, например, Sau3A1, которая вносит один разрыв на 256 пар оснований. Гидролиз проводят так, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так, что образуются фрагменты всевозможных размеров, в т.ч., содержащие целые гены. В случае необходимости смесь обрабатывают вторично другой рестриктазой. Для поиска нужного клона используют:
а) скрининг с помощью гибридизации;
б) иммунологический скрининг и
в) скрининг по активности белка, кодируемого геном-мишенью.
В первом случае ДНК-мишень подвергают денатурации тепловой обработкой или щелочью. Полученные одноцепочные ДНК необратимо «пришивают» к твердой подложке (нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр) при высокой температуре. Затем фильтры инкубируют с одноцепочным ДНК-зондом, меченым радиоизотопом или другой меткой. Происходит спаривание комплементарных последовательностей ДНК-мишеней и зондов. Гибридные молекулы обнаруживаются по метке. В качестве нерадиоизотопной метки часто используют биотин, который присоединяют к одному из четырех оснований. На фильтр наносят конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой. Стрептавидин образует комплекс с биотином, который обнаруживается по окраске или люминесценции.
Если нет ДНК-зонда применяют иммунологический скрининг. В этом случае на фильтр наносят выросшие колонии лизируют а высвободившиеся белки фиксируют на фильтре. Затем на фильтр наносят антитела, которые специфически связываются с данным белком, а все несвязавшиеся антитела удаляют, а фильтр помещают в раствор вторых антител, специфических в отношении первых антител и производят окрашивание, позволяющее выделить нужные участки.