Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Ингибиторами называют вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций, катализируемых ферментами.
Ингибирование ферментов
Изучение подавления активности ферментов служит одним из способов расшифровки механизма их действия. Подходом к решению последней задачи является изучение специфичности действия ферментов. В свою очередь, это требует корректного измерения кинетических параметров в присутствии изучаемого аналога субстрата. Рассмотрим способы определения характера взаимоотношений субстратов, их аналогов и ингибиторов ферментативной активности путем вычисления ряда кинетических параметров.
При этом, если константа диссоциации комплекса Ks = Km равна:
Ингибиторы ферментов можно разделить на две основные группы: обратимые и необратимые. После удаления ингибитора первого типа активность фермента восстанавливается; во втором случае ингибитор удалить не удается или активность фермента не восстанавливается даже после удаления ингибитора. Необратимое ингибирование достигает максимума, когда весь фермент связан с ингибитором. Обратимое ингибирование достигает состояния равновесия, положение которого определяется константой ингибирования, характеризующей сродство фермента к ингибитору. Схема обратимого ингибирования приведена ниже:
При конкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с одним и тем же активным центром фермента. В присутствии ингибитора снижается сродство фермента к субстрату. Величина не изменяется, так как при «насыщающей» концентрации субстрат вытесняет ингибитор из комплекса с ферментом.
При неконкурентном ингибировании субстрат и ингибитор связываются с разными центрами фермента. При этом величина Кга не изменяется, а величина Vmax снижается.
Для определения типа ингибирования обычно используют график Лайнуивера–Берка, полученный для данного субстрата в отсутствие и в присутствии ингибитора.
При конкурентном ингибировании, если определена величина Кт в присутствии ингибитора, можно рассчитать константу ингибирования по следующей формуле:
При неконкурентном ингибировании с помощью определения измененной величины V можно рассчитать К. по следующей формуле:
При необратимом ингибировании - ингибитор прочно (необратимо) связывается с активным центром фермента ковалентными связями, изменяет конформацию фермента. Таким образом, могут действовать на ферменты соли тяжелых металлов (ртути, свинца, кадмия и др.), соединения мышьяка и другие токсические вещества, способные привести к необратимой денатурации апофермента (неспецифические ингибиторы).
Специфический необратимый ингибитор может связываться с ферментом и инактивировать в его активном центре функциональную группу, которая необходима для проявления его каталитической активности. Например, диизопропилфторфосфат, йодацетат и ион ацетамида.
Обратимое ингибирование - это такой тип ингибирования, когда активность ферментов может восстанавливаться. Обратимое ингибирование бывает 2-х типов: конкурентное и неконкурентное. При конкурентном ингибировании обычно субстрат и ингибитор очень похож по химическому строению. При этом виде ингибирования субстрат (S) и ингибитор (I) одинаково могут связываться с активным центром фермента. Они конкурируют друг с другом за место в активном центре фермента. Классический пример, конкурентного ингибирование - торможение действия сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой (см. наглядный материал).
Изучение действия различных ингибиторов на ферментативные реакции имеет очень большое значение в медицине. Например, сульфамидные препараты обладают бактериостатическим действием и применяются для лечения многих инфекционных заболеваний. Сульфамидные препараты похожие по строению на п-аминобензойную кислоту, ингибируют синтез фолиевой кислоты, которая необходима для синтеза нуклеиновых кислот в бактериальных клетках. Благодаря этому сульфаниламидные препараты тормозят процесс деления бактерий, оказывая бактериостатическое действие.
Неконкурентные ингибиторы связываются с аллостерическим центром фермента. Вследствие этого происходят изменения конформации аллостерического центра, которые приводят к деформации каталитического центра фермента и снижению ферментативной активности. Часто аллостерическими неконкурентными ингибиторами выступают продукты метаболизма.
2 вопрос Кинетика действия ферментов
Кинетические исследования ферментативных реакций необходимы не только для количественного определения ферментов и сравнения скоростей их функционирования, но, в еще большей степени, для расшифровки механизмов ферментативных реакций. В этих целях, прежде всего, необходимо уметь корректно вычислять кинетические параметры ферментативных реакций, оценивать конкурентный или неконкурентный характер действия ингибиторов. Рассмотрим основные уравнения, описывающие ферментативную кинетику и способы вычислений. Основное внимание будет уделено не строгости математического вывода уравнений, а правильному их использованию для получения достоверных результатов.
При выводе кинетических уравнений количественно характеризующих ферментативную активность, обычно делают следующие допущения.
1. Фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс за счет сил физической природы. Из этого комплекса в дальнейшем освобождаются фермент и продукт. Таким образом, химической реакцией является только второй этап - распад фермент-субстратного комплекса:
2. Концентрация субстрата обычно значительно выше концентрации фермента. Поэтому при рассмотрении начальных скоростей реакции, когда
3. Константа диссоциации определяется соотношением:
концентрация продукта очень низка, обратимостью второй стадии можно пренебречь. Следовательно, - const., а скорость образования продукта равна:
Поскольку общая концентрация фермента равна сумме концентраций свободного фермента и фермента, связанного в комплекс, то + или = -.
Подставляя значение [Е] = [Е0] -- [ES] из (4), получаем:
С другой стороны, из уравнения следует:
В уравнении выражение к+2 можно рассматривать как максимальную скорость, достигаемую, когда концентрация фермент-субстратного комплекса численно равна общей концентрации фермента. Следовательно:
Выражение есть не что иное, как уравнение Михаэлиса-Ментен для ферментативной кинетики, а величина Кга = Ks представляет собой меру сродства фермента к субстрату. Численно она равна такой концентрации субстрата, при которой начальная скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной скорости. Уравнение графически выражается гиперболой.
3 вопрос
Активаторы – повышают скорость реакции и иногда модифицируют ее.
Активаторы – вещества, которые повышают скорость ферментативных реакций, увеличивают активность ферментов. Они бывают органической и неорганической природы.
Активаторы органической природы: желчные кислоты (активируют поджелудочную ли пазу), энтерокиназа (активирует трипсиноген), глутатион, цистеин, витамин С (повышают активность оскидоредуктаз).
Активаторы неорганической природы: например, HCl активирует пепсиноген, ионы ме таллов (Na, Cl, K, Mg, Mn, Zn) активируют очень многие ферменты. Ионы металлов: а) спо собствуют образованию ферментсубстратного комплекса; б) служат донорами и акцептора ми электронов; в) принимают участие в образовании активного центра ферментов (Zn в со ставе карбангидразы, Fe – в составе цитохромов, каталазы, пероксидазы); г) выступают в ро ли аллостерических регуляторов.
4 вопрос
Изоферменты, или изоэнзимы,– это множественные формы фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся друг от друга по физическим и химическим свойствам, в частности по сродству к субстрату, максимальной скорости катализируемой реакции (активности), электрофоретической подвижности или регуляторным свойствам.
Состоят из нескольких полипептидных цепей (субъединиц), которые, комбинируясь различными способами, образуют четвертичную структуру фермента.
«»»»»»»»
Изоферменты. Часть ферментов состоят не из одной белковой цепочки, а из нескольких субъединиц. Изоферменты – это семейство ферментов, которые катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по строению и физикохимическим свойствам. Например: лактатде гидрогеназа (ЛДГ) состоит их 4 субъединиц 2хтипов: субъединица Н, выделенная из сер дечной мышцы (heart – сердце), субъединица М, выделенная из скелетных мышц (musculus – мышца). Эти субъединицы кодируются разными генами. В разных органах имеются различ ные формы ЛДГ с различным набором субъединиц. Известно 5 изоферментов ЛДГ:
ЛДГ1: ЛДГ2: ЛДГ3: ЛДГ4: ЛДГ5: (Н4) (Н3М) (Н2М2) (НМ3) (М4)
ЛДГ1 экспрессируется в сердечной мышце и мозге, а ЛДГ5 – в скелетных мышцах и печени. Остальные формы в других органах. Появление ЛДГ в крови свидетельствует о повреждении органов (фермент из разрушенных клеток поступает в кровь – гиперферментемия) Повыше ние активности фракции ЛДГ1 в крови наблюдается при повреждении сердечной мышцы (инфаркт миокарда), а повышение активности ЛДГ5 в крови наблюдается при гепатитах и повреждении скелетных мышц. То есть благодаря изоферментам можно определить локали зацию поврежденного органа. Наиболее чувствительным тестом на инфаркт миокарда явля ется повышение в крови сердечного изофермента креатинкиназы.
Изоферменты, как правило, высоко гомологичны по аминокислотной последовательности и/или подобны по пространственной конфигурации. Особенно консервативны в сохранении строения активные центры молекул изоферментов. Все изоферменты одного и того же фермента выполняют одну и ту же каталитическую функцию, но могут значительно различаться по степени каталитической активности, по особенностям регуляции или другим свойствам.
Примером фермента, имеющего изоферменты, является гексокиназа, имеющая четыре изотипа, обозначаемых римскими цифрами от I до IV. При этом один из изотипов гексокиназы, а именно гексокиназа IV, экспрессируется почти исключительно в печени и обладает особыми физиологическими свойствами, в частности её активность не угнетается продуктом её реакции глюкозо-6-фосфатом.
Ещё одним примером фермента, имеющего изоферменты, является амилаза — панкреатическая амилаза отличается по аминокислотной последовательности и свойствам от амилазы слюнных желёз, кишечника и других органов. Это послужило основой для разработки и применения более надёжного метода диагностики острого панкреатита путём определения не общей амилазы плазмы крови, а именно панкреатической изоамилазы.
Третьим примером фермента, имеющего изоферменты, является креатинфосфокиназа — изотип этого фермента, экспрессируемый в сердце, отличается по аминокислотной последовательности от креатинфосфокиназы скелетных мышц. Это позволяет дифференцировать повреждения миокарда (например, при инфаркте миокарда) от других причин повышения активности КФК.
Старая тема
В старой теме повторяются вопросы из новой, такие: 1)активаторы и ингибиторы 2)кенетика ферментативных реакций
В основу теории механизма действия ферментов положено образование фермент-субстратного комплекса.
Различают три основных этапа ферментативного катализа.
1 этап.
На этом этапе происходит взаимодействие адсорбционного центра фермента с молекулой субстрата. При этом и субстрат подвергается конформационной перестройке. Все это происходит за счет возникновения слабых типов связей между субстратом и адсорбционным центром фермента. В результате этого молекула субстрата подается на каталитический центр в наиболее удобном для него положении. Этот этап является легко обратимым, потому что здесь участвуют только слабые типы связей. Кинетическая характеристика 1-го этапа ферментативного катализа - константа Михаэлиса (Км).
2 этап.
Химические превращения молекулы субстрата в составе фермент-субстратного комплекса с образованием комплекса фермента с химически преобразованным субстратом. На этом этапе разрываются одни ковалентные связи и возникают новые. Поэтому этот этап протекает значительно медленнее, чем 1-й и 3-й этапы. Именно скорость второго этапа определяет скорость всей ферментативной реакции в целом. Значит, скорость ферментативного процесса в целом характеризуется величиной k+2, которая является почти всегда самой маленькой из всех частных констант скоростей. Кинетическая характеристика 2-го этапа - максимальная скорость.
3 этап.
Десорбция готового продукта из его комплекса с ферментом. Этот этап протекает легче, чем 2-й. Он, как и 2-й этап, тоже необратим. Исключение - обратимые ферментативные реакции.
Попроще написано (скорочено)
Различают три стадии в механизме ферментативного катализа:
Этапы ферментативного катализа
Этапы ферментативного катализа. I - этап сближения и ориентации субстрата относительно активного центра фермента; II - образование фермент-субстратного комплекса (ES) в результате индуцированного соответствия; III - деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР); IV- распад комплекса (ЕР) с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента и освобождением фермента.
Следующий вопрос
Под специфичностью ферментов понимают способность каждого из них катализировать одну или несколько близких по природе хими-ческих реакций.
Специфичность у разных ферментов выражена в неодинаковой степени. Различают следующие типы специфичности.
1. А б с о л ю т н а я с п е ц и ф и ч н о с т ь. При этом типе специфичности фермент катализирует превращение только одного субстрата. Фермент каталаза катализирует расщепление пероксида водорода на воду и кислород; ее действие ограничивается только этим субстратом.
2. Г р у п п о в а я с п е ц и ф и ч н о с т ь. Основным признаком для ферментов этого типа специфичности служит характер разрушаемой или создаваемой связи в близких по строению группах веществ. К ферментам с групповой специфичностью относятся липазы, катализирующие гидролиз сложных эфиров глицерина и карбоновых кислот; фосфатазы, действующие на эфиры фосфорной кислоты; пептидгидролазы, катализирующие гидролиз пептидных связей в белках и пептидах и др.
3. С т е р е о х и м и ч е с к а я с п е ц и ф и ч н о с т ь. Ферменты этого типа специфичности действуют на определенный изомер одного и того же вещества: D- или L-, a- или b- , транс- или цис- . Пептидгидролазы действуют только на пептиды, образованные аминокислотами L-ряда.