Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
23
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ
ЛУШНІКОВА ІРИНА ВАСИЛІВНА
УДК 612.35:612.014.3:615.015.44
ВИВЧЕННЯ УЧАСТІ ПРОДУКТІВ МЕТАБОЛІЗМУ АРАХІДОНОВОЇ КИСЛОТИ У ФУНКЦІОНУВАННІ ГЕПАТОЦИТІВ ЩУРІВ В КУЛЬТУРІ ТА КОКУЛЬТУРІ З КЛІТИНАМИ КУПФЕРА
Спеціальність
.00.13 - Фізіологія людини і тварин
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ 1999 р.
Роботу виконано у відділі імунології та цитотоксичних сироваток
Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України
Науковий керівник: доктор біологічних наук,
Алексєєва Ірина Миколаївна
Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,
завідувач відділу імунології та цитосироваток
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
Жаліло Любов Іванівна
Українська Академія державного управління при
Президентові України, професор кафедри валеології
кандидат біологічних наук
Марченко Галина Іванівна
Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України,
старший науковий співробітник відділу
експериментальної кардіології
Провідна установа: Київський університет ім.Т.Г.Шевченка,
кафедра фізіології людини та тварин
Захист відбудеться “30”листопада 1999 р. о “14” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024 Київ, вул.Богомольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України
Автореферат розісланий “20”жовтня 1999 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук З.О.Сорокіна-Маріна
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми
Печінка здійснює свої численні функції як цілісна система, яка складається з різних видів клітин, що взаємодіють між собою [Маянский Д.Н., 1992; Щеголев А.И., 1992; Spitzer J., 1995]. Гепатоцити виконують основні метаболічні функції, такі як підтримка в організмі гомеостазу вуглеводів, білків та ліпідів, детоксикаційну та екзокринну функції. Серед клітин сполучної тканини ключове положення займають макрофаги печінки (клітини Купфера) - є високореактивні клітини, біологічні якості яких вар”юють в широких межах в залежності від конкретної ситуації, а тому вони мають унікальну можливість реагувати та миттєво включатися в регуляцію гомеостазу і розвиток патологічного процесу. Показано, що важливими ендогенними регуляторами функцій клітин печінки та медіаторами їх взаємодії є продукти метаболізму арахідонової кислоти, цитокіни, NO. Аутокринна та паракринна регуляція функцій клітин печінки, поряд з нервовими та ендокринними впливами, забезпечує діяльність цього органу в фізіологічних умовах, а їх порушення в умовах патології є одним з найважливіших патогенетичних механізмів.
Відомо, що печінка синтезує простагландини та лейкотрієни з арахідонової кислоти за циклооксигеназним та ліпоксигеназним шляхами метаболізму, відповідно[Huber M., 1990; Hagmann W., 1991; Kawada N., 1990; Meng X., 1994], а також є основним органом елімінації та деградації ейкозаноїдів системного походження [Brass E., 1988; Hagmann W., 1989; Keppler D., 1989; Leier I., 1992; Parthe S., 1990; Stene D., 1988; Shirley M, 1990; Shirley M., 1992; Tran-Thi T., 1994; Wettstein M., 1995; Wheelan P., 1995]. Дія простагландинів на печінку вивчена в більшій мірі, ніж лейкотрієнів. Показана участь простагландинів в регуляції вуглеводного обміну та деяких інших функцій гепатоцитів [Huber M., 1990; 4, Bjornsson O., 1992; Decker K. 1990; Kanemaki T., 1993; Mitkov D. 1990; Muschol W., 1991; Okumura T., 1990; Plumley D., 1995; Satoh M., 1993], а також в регуляції функціонального стану непаренхіматозних клітин печінки [Callery M., 1990; Georgakopoulos E., 1995; Goss J., 1993; Lysz T., 1990; Karck U., 1989; Peters T., 1989; West M., 1993]. Є окремі дані про вплив лейкотрієнів на функції печінки в нормі, а саме на процеси секреції жовчі [Rodriguez-Ortigosa C., 1995]. При виникненні пошкоджень печінки змінюється метаболізм арахідонової кислоти. Підвищення рівня лейкотрієнів в печінці було показано на цілому ряді видів її ураження in vivo, а блокада синтезу лейкотрієнів призводила до суттєвого зменшення пошкождень, що свідчить про участь цих похідних арахідонової кислоти в розвитку патологічного процесу [Kawada N., 1990; Meng X., 1994; Agha A., 1995; Gonzalez R., 1994; Hiroichi N., 1989; Kawada N, 1990; Parry E. 1993; Reyes M., 1995]. Показана також патогенетична роль тромбоксану - продукту циклооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти. Його концентрація підвищується при дії чотирихлористого вуглецю на печінку in vivo та на культивовані гепатоцити. Введення мишам тромбоксану призводило до ураження печінки, а блокада рецепторів до тромбоксану попереджала ушкодження [Meng X., 1994; Engin A., 1995; Marinovich M., 1989; Nagai H., 1989]. Поряд з патогенетичною дією метаболітів арахідонової кислоти виявлена і протективна дія таких простагландинів, як ПГЕ1, ПГЕ2 та простациклін [Bang S., 1991; Chamulitrat W., 1994; Chamulitrat W., 1995; Jones D., 1995; Kaminski D., 1989; Lim S., 1995; Masaki N., 1992; Nakano H., 1994;Totsuka E., 1995; Quiroga J., 1993]. Протективна чи ушкоджуюча дія ейкозаноїдів in vivo може бути пов”язана зі змінами мікроциркуляції, з міграцією та активацією або інгібіцією нейтрофілів, дією NO, що показано в ряді досліджень [Fukumura D., 1996; Gaudio E., 1997; Herbert K., 1989; Kurose I., 1996; Kurose I., 1997; Stadler J., 1995; Zhang B., 1997], а також з прямим впливом ейкозаноїдів на функції клітин печінки, що практично не досліджено. Адекватною моделлю для вивчення безпосередньої участі ейкозаноїдів в регуляції функцій клітин печінки є культура клітин. Культивування різних типів клітин печінки сумісно дозволяє вивчати взаємодію між ними. Вважають, що в печінці основними продуцентами ейкозаноїдів є клітини Купфера [Kuiper J., 1988; Mion F., 1995]. Останнім часом доведено, що гепатоцити також синтезують простагландини та лейкотрієни, які можуть виконувати роль аутокринних регуляторів [Huwyler J., 1990; Otomo Y., 1993; Yu M., 1998]. Таким чином, представляє особливий інтерес вивчення участі ейкозаноїдів в ауто- та паракринній регуляції функцій гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера. На сучасному етапі змінам синтезу інформаційних молекул, в тому числі ейкозаноїдів, та порушенню міжклітинної взаємодії надається важливе значення в розвитку патологічних процесів у печінці. Для виявлення ролі продуктів метаболізму арахідонової кислоти в експерименті широко використовується фармакологічний підхід із застосуванням блокаторів синтезу відповідних ейкозаноїдів.
У зв”язку з вищенаведеним уявляєтся актуальним вивчення впливу блокаторів метаболізму арахідонової кислоти на функціональний стан гепатоцитів, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера, в нормі та при їх ураженні.
Зв”язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Тема дисертації пов”язана з дослідженнями, які виконуються відділом імунології і цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України “Вивчення участі продуктів метаболізму арахідонової кислоти у взаємодії імунокомпетентних клітин та антитіл з клітинами печінки, серця, статевих залоз” (1993-1998рр.).
Мета і задачі дослідження
Вивчити вплив блокаторів метаболізму арахідонової кислоти на функціональну активність гепатоцитів щурів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера в нормі та при дії гепатотоксичного агенту - чотирихлористого вуглецю. Для досягнення поставленої мети були поставлені слідуючі завдання:
Наукова новизна одержаних результатів
Вперше проведено комплексні дослідження по вивченню впливу продуктів циклооксигенази в порівнянні з впливом продуктів ліпоксигенази на життєздатність, функціональну активність мітохондрій та синтез сечовини в гепатоцитах при їх окремому та сумісному з клітинами Купфера культивуванні.
Вперше виявлено, що блокада ліпоксигенази призводить до змін показників загальних характеристик функціонального стану гепатоцитів - активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій та життєздатності інтактних культур гепатоцитів, а блокада циклооксигенази змінює специфічну функцію гепатоцитів - синтез сечовини.
Вперше показана протективна дія нордігідрогуаяретової кислоти - блокатора ліпоксигенази та протективна дія бензилімідазолу - блокатора тромбоксансинтетази в дослідах in vitro на гепатоцитах, культивованих окремо та в кокультурі з клітинами Купфера при ураженні їх ССl.
Практичне значення одержаних результатів
Результати дослідження мають фундаментальне значення для виявлення деяких механізмів ауто- і паракринної регуляції функцій клітин печінки. В прикладному аспекті одержані дані важливі для розуміння розвитку токсичного ураження печінки, опосередкованого ейкозаноїдами, що надасть можливість обгрунтувати методи впливу на його перебіг за допомогою використання специфічних блокаторів метаболізму арахідонової кислоти.
Особистий внесок здобувача
При виконанні роботи здобувачем проведено науковий пошук та обгрунтування вибраного напрямку досліджень. Виконано експерименти по вивченню впливу блокаторів метаболізму арахідонової кислоти на гепатоцити в культурі та кокультурі з клітинами Купфера. Проведено аналіз одержаних результатів. Експериментальна робота по одержанню та культивуванню клітин проведена спільно з співробітниками відділу імунології та цитосироваток Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України.
Апробація результатів дисертації
Основні положення дисертації слухали та обговорювали на Пленумі науково-медичного товариства патофізіологів України (Львів, 1993); 3-му Міжнародному симпозіумі “Системно-антисистемная регуляция в живой и неживой природе” (Київ, 1993); 14-му з”їзді Українського фізіологічного товариства ім.І.П.Павлова (Київ, 1994); ХV з”їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998); Пленумі товариства патофізіологів України (Чернівці, 1998).
Публікації
Результати дисертації викладені в 13 публікаціях: статті - 4, тези конференцій, сімпозиумів, з”їздів, пленумів - 9.
Обсяг та структура дисертації
Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень та їх обговорення, висновків, списку використаної літератури. Робота викладена на 131 сторінці, ілюстрована 22 рисунками і таблицею. Список літератури охоплює 280 джерел.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Матеріали і методи
Об”єктом дослідження була первинна культура гепатоцитів, клітин Купфера та їх сумісна культура. Для отримання клітин печінки були використані дорослі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г та в деяких експериментах (дослідження дозозалежної дії блокаторів) - миші лінії СВА масою 18-20 г. Гепатоцити (Г) та клітини Купфера (КК) виділяли за допомогою двохетапної колагеназної перфузії з подальшим очищенням в градієнті густини Перколу. Клітини Купфера додатково очищали за допомогою адгезії. Ступінь очищення одержаних фракцій гепатоцитів оцінювали за морфологічними ознаками, клітин Купфера - за допомогою забарвлення суспензії клітин на пероксидазу та неспецифічну естеразу.
Культивування клітин проводили в оброблених колагеном планшетах для культур клітин (Sigma) в поживному середовищі RPMI 1640 з 15 ммоль HEPES, 15 % ембріональної телячої сироватки та антибіотиками (у 96-, 24- або 6-лункових планшетах в залежності від умов експерименту). Посадка клітин: 96-лунковий планшет - 410 Г на лунку та 410 КК на лунку, 24-лунковий планшет - 110Г на лунку та 110КК на лунку, 6-лунковий планшет - 110Г на лунку. Через 3 години після посадки прикріплені гепатоцити відмивали шляхом заміни середовища. Для сумісного культивування до гепатоцитів додавали клітини Купфера в співвідношенні 1:10. Після 18 годин культивування при 37оС у вологій камері з 5 % СОклітини відмивали, замінювали середовище інкубації на середовище RPMI 1640 без ембріональної телячої сироватки і інсуліну та здійснювали відповідні впливи, а саме: додавали нордігідрогуаяретову кислоту (НДГК) - блокатор ліпоксигенази; індометацин (ІНД)- блокатор циклооксигенази; бензилімідазол (БІА) - блокатор тромбоксансинтетази (кінцева концентрація блокаторів складала 210-5 моль). Розчинений в DMSO CClдодавали в культури гепатоцитів та кокультури гепатоцитів та клітин Купфера до кінцевої концентрації 5 ммоль через 30 хвилин після блокаторів.
Біохімічний аналіз культурального середовища (активність аланін-амінотрансферази в культуральному середовищі, синтез сечовини гепатоцитами, концентрація малонового діальдегіду, концентрація NO-) проводили на протязі 24 годин. Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій вимірювали через 4 та 24 години культивування після впливів.
Морфологічну оцінку культур проводили за допомогою світлової мікроскопії з використанням імерсійного об”єктиву ( х 100) на фіксованих ізопропанолом препаратах, забарвлених азур-еозином за Романовським.
Активність аланін-амінотрансферази (АЛТ) в культуральному середовищі визначали колориметричним методом в мікромодифікації [Коровкин Б.Ф., 1965]. Активність АЛТ виражали у ммоль пірувату/годмл культурального середовища.
Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів оцінювали за допомогою МТТ-тесту та виражали в умовних одиницях (У.О.), що відповідали значенню оптичної густини розчину формазану, утвореного в культивованих гепатоцитах (410 клітин) за одну годину, 1000 [Reichner J., 1995].
Концентрацію сечовини в культуральному середовищі вимірювали колориметричним методом за допомогою тест-системи “Біо-Ла-Тест” (Брно). Кількість сечовини виражали в мкг/10 клітин.
Перекисне окислення ліпідів оцінювали за накопиченням в культуральному середовищі одного з кінцевих продуктів - малонового діальдегіду - колориметричним методом в мікромодифікації [Ohkawa H., 1979].
Продукцію NO оцінювали через визначення концентрації його метаболіта - NO-в культуральному середовищі колориметричним методом з використанням реактива Грісса [Archer S., 1993].
Представлені дані є результатом трьох-шести незалежних експериментів для кожного показника. В кожному експерименті вплив досліджуваних речовин здійснювали паралельно в триплікатах культур клітин. Статистична обробка матеріалу проведена з обчисленням критерію Стьюдента для пар даних [Ойвин И., 1960].
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Проведена морфологічна та цитохімічна оцінка гепатоцитів та клітин Купфера свідчить, що клітини, використані для одержання культур, мали високий ступінь життєздатності та чистоти. Виділені клітини Купфера давали виражену специфічну реакцію на маркерні ферменти клітин макрофагально-моноцитарного ряду - неспецифічну естеразу та пероксидазу. Після початкового культивування первинна культура гепатоцитів мала вигляд моношару полігональних клітин, яку можна віднести до культур високої щільності. Гепатоцити, культивовані на протязі 24 годин, зберігали функції, притаманні їм in vivo.
На основі аналізу літератури та наших досліджень встановлена ефективна доза блокаторів ліпоксигеназного та циклооксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти - 2х10-5 моль.
Зміни функціональної активності інтактних та уражених ССl гепатоцитів, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера під впливом блокаторів метаболізму арахідонової кислоти за циклооксигеназним та ліпоксигеназним
шляхами
Зміни активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в культурі і кокультурі
Як інтегральну характеристику фізіологічного стану гепатоцитів оцінювали активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій за МТТ-тестом. Результати, одержані за допомогою МТТ-тесту, корелюють з даними споживання клітинами кисню, одержаними полярографічним методом, що дає змогу використовувати МТТ-тест, як показник мітохондріального дихання [Klostergaard et.al., 1987]. Мітохондріальне дихання є основним, поряд з гліколізом, процесом, в ході якого генерується АТФ, що забезпечує енергією глюконеогенез в гепатоцитах, синтез сечовини, синтез білків, дію АТФаз та інші. В нормі активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій культивованих клітин була: гепатоцити - 644, 897 (У.О.), гепатоцити в кокультурі з клітинами Купфера - 1096, 7512 (У.О.) через 4 та 24 години культивування, відповідно. Виявлено, що в присутності НДГК цей показник суттєво підвищується через 4 години після впливу: в культурах гепатоцитів з 644 до 12310 (У.О.), в кокультурах з 1096 до 20515 (У.О.), р0,01 в усіх випадках. Після 24 годин культивування НДГК пригнічувала активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів, культивованих окремо з 897 (У.О.) в інтактних клітинах до 302 (У.О.) при дії блокатора (р0,01). Імовірно, деякий рівень лейкотрієнів та інших продуктів ліпоксигенази є необхідним для тривалої підтримки функціонування гепатоцитів, а інгібіція ліпоксигенази на протязі 24 годин може призводити до зниження мітохондріальної активності. В той же час, при сумісному культивуванні гепатоцитів та клітин Купфера не виявлено вірогідного зниження активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій при тривалій блокаді ліпоксигенази; цей показник в інтактних культурах становив 7512 У.О., при дії НДГК на протязі 24 годин - 588. Ці дані свідчать, що продукти ліпоксигенази відіграють фізіологічну ауторегулюючу роль по відношенню до мітохондріального дихання гепатоцитів і, таким чином, приймають участь в регуляції функціонального стану інтактних клітин.
Не виявлено вірогідних змін активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій при дії ІНД на культивовані клітини в усі терміни досліджень. Відсутність змін цієї загально-фізіологічної характеристики культивованих клітин може бути пов”язана з тим, що ІНД блокує синтез цілого ряду простагландинів, серед яких є як протективні, так і патогенетичні. Досліди з блокадою тромбоксансинтетази за допомогою БІА, проведені в 24-годинний термін, показали, що БІА, на відміну від ІНД, підвищує активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій культивованих гепатоцитів на 25 % по відношенню до інтактних клітин, р0,05. Спостерігається деяке підвищення цього показника в кокультурі (на 16 %). Це свідчить про аутокринну down-регулюючу роль тромбоксану по відношенню до мітохондріального дихання гепатоцитів.
Виходячи з встановленої in vivo патогенетичної ролі лейкотрієнів, ми вивчали дію блокатора ліпоксигенази в умовах токсичного ураження гепатоцитів чотирихлористим вуглецем. СС1(5 ммоль) пригнічував активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій культур гепатоцитів на 84 % через 4 години та на 90 % через 24 години після його застосування (р0,01). В кокультурі цей показник також зменшувався на 88 % та 73 % через 4 та 24 години, відповідно (р0,01, по відношенню до інтактних клітин). Блокада ліпоксигенази за допомогою НДГК запобігала викликаному СС1 порушенню функцій мітохондрій. Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів, уражених СС1, збільшувалось в присутності НДГК з 102 до 816 (У.О.) на 4 годині та з 92 до 6211 (У.О.) на 24 годині досліджень (р0,01 в усіх випадках). Аналогічна картина спостерігалася в умовах сумісного культивування. В присутності НДГК активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в кокультурі, оброблених СС1, підвищувалась з 132 до 13112 (У.О.) та з 205 до 657 (У.О.) через 4 та 24 години впливу блокатора, відповідно (р0,01). Ці дані відносно протективної дії НДГК погоджуються з дослідами, проведеними in vivo, коли введення тваринам інгібіторів синтезу лейкотрієнів, зокрема НДГК, запобігало ушкодженню печінки СС1[Reyes M., 1995; Perez-Alvarez V., 1993]. При цьому суттєво знижувався вихід цитозольних ферментів з гепатоцитів, а також рівень ПОЛ в печінці. Патогенетична роль лейкотрієнів показана в багатьох дослідженнях in vivo [Kawada N., 1990; Agha A., 1995; Hiroichi N., 1989; McGuire G., 1996]. В цьому випадку їх дія може бути пов”язана з впливом на судини, з залученням нейтрофілів. Наші дані свідчать, що продукти ліпоксигенази можуть безпосередньо здійснювати ушкоджуючий вплив на гепатоцити, без участі систем органу та організму. Одним з механізмів прямої уражуючої дії лейкотрієнів чи інших продуктів ліпоксигенази на гепатоцити при їх підвищеному синтезі в умовах патології може бути пригнічення мітохондріального дихання клітин, оскільки блокада синтезу продуктів ліпоксигенази, за нашими даними, призводить до посилення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів.
При дії ІНД в умовах застосування СС1не було виявлено суттєвих змін активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій. На відміну від ІНД, блокатор тромбоксансинтетази - БІА проявляв виражену протективну дію, відновлюючи значення цього показника в гепатоцитах, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера майже до рівня в інтактних культурах (р0,05 по відношенню до дії СС1). Це свідчить про ушкоджуючу дію тромбоксану при токсичному ураженні культивованих клітин. Переважна більшість даних, пов”заних з впливом тромбоксану, отримані в системі in vivo. Показано, що блокада рецепторів до тромбоксану має протективну дію [Meng X., 1994; Engin A., 1995]. Отримані нами результати свідчать на користь того, що блокатор тромбоксансинтетази має протективний вплив при безпосередній дії на гепатоцити, що не опосередкована судинними та іншими реакціями.
В літературі є дані про те, що блокада одного шляху метаболізму арахідонової кислоти може призводити до посиленого утворення продуктів іншого шляху [Meng X., 1994; Griswold Don E., 1996]. Perez-Alvarez з співавторами [Perez-Alvarez V., 1993] вважають, що протективна дія інгібіторів синтезу лейкотрієнів на уражену печінку частково опосередковується збільшенням синтезу простагландинів. Можна припустити, що НДГК, інгібуючи ліпоксигеназу, посилює синтез простагландинів, частина з яких є цитопротективними, тобто захисний вплив НДГК опосередкований дією відповідних простагландинів. Ми, одночасно з блокадою ліпоксигенази за допомогою НДГК, блокували циклооксигеназу індометацином. Виявлено, що НДГК як сама по собі, так і при використанні сумісно з ІНД мала однакову дію на активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в нормі та при ураженні СС1, тобто дія НДГК на гепатоцити пов”язана саме з пригніченням утворення продуктів ліпоксигенази, а не з посиленням синтезу простагландинів.
Таким чином, наведені результати виявляють відмінність дії блокаторів ліпоксигенази та циклооксигенази на активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера в нормі та при ураженні СС1. НДГК суттєво змінювала цей показник, тоді як індометацин практично не впливав на нього. БІА, на відміну від індометацину, посилював активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій в нормі та при ураженні СС1. Була виявлена відмінність дії НДГК на інтактні та СС1-уражені клітини: активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій інтактних гепатоцитів при дії НДГК підвищувалась в 4-годинний термін та знижувалась в подальшому, тоді як в умовах дії СС1, НДГК поліпшувала функціональний стан мітохондрій гепатоцитів в усі терміни дослідженнь. Присутність клітин Купфера в культурі гепатоцитів запобігала зниженню активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій при дії НДГК на протязі 24-годин.
Зміни активності АЛТ в культуральному середовищі
Активність цитозольного ферменту гепатоцитів АЛТ в культуральному супернатанті відображає вихід ферменту з клітин в результаті їх ушкодження. Менший рівень АЛТ свідчить про більшу життєздатність гепатоцитів в культурі. Оскільки в первинній культурі гепатоцитів відбувається закономірний процес поступової деградації частини клітин, з часом спостерігається поступове збільшення активності АЛТ в середовищі.
Показано, що внесення НДГК в культуру гепатоцитів призводило до зменшення на 38 % виходу АЛТ з клітин через 24 години (р0,01). Зниження активності АЛТ проявлялось в сумісній культурі вже через 4 години після впливу (на 29 % , р0,05 по відношенню до контролю), та було вираженим через 16 та 24 години (р0,01 в обох випадках). Ці дані свідчать, що продукти ліпоксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти здатні безпосередньо ушкоджувати гепатоцити. Не виявлено суттєвих змін активності АЛТ при дії ІНД та БІА на культивовані гепатоцити та кокультуру в фізіологічних умовах.
Введення СС1 (5 ммоль) в культуральне середовище призводило до токсичного ураження гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера. Це проявлялося в підвищенні активності АЛТ в супернатантах гепатоцитів на 88 %, на 130 % та 92 % через 4, 16 та 24 години, відповідно (р0,01 по відношенню до інтактних клітин, в усіх випадках). В кокулькурі це підвищення складало 110 %, 119 % та 120 % через 4, 16 та 24 години, відповідно (р<0,01 по відношенню до інтактних клітин). В цих умовах НДГК проявляла виражену протективну дію, знижуючи рівень АЛТ в супернатантах культур гепатоцитів та їх кокультур в усі терміни дослідження (гепатоцити - на 44 %, 19 % та 25 % через 4, 16 та 24 години, р<0,05 по відношенню до клітин, уражених СС1; гепатоцити + клітини Купфера - на 20 %, 41 % та 45 % через 4, 16 та 24 години, відповідно, р<0,05 по відношенню до клітин, уражених СС1). Виходячи з цього можна припустити, що НДГК, знижуючи рівень ендогенних продуктів ліпоксигенази в гепатоцитах, запобігає ушкоджуючій їх дії, що проявляється в підвищенні життєздатності культивованих гепатоцитів. Таким чином, в умовах патології лейкотрієни, напевно, можуть безпосередньо здійснювати ушкоджуючий вплив на гепатоцити.
ІНД не змінював вихід АЛТ з гепатоцитів. Хоча інгібіція циклооксигенази за допомогою ІНД не викликала змін життєздатності уражених гепатоцитів, блокада окремої ланки цього шляху - тромбоксансинтетази - за допомогою БІА мала суттєвий ефект. Показано, що БІА призводив до зменшення на 22 % виходу АЛТ з гепатоцитів, уражених СС1, через 24 години (р0,05). Зниження активності АЛТ в супернатанті кокультур виявлялося вже через 4 години після впливу (на 36 %, р0,05 по відношенню до гепатоцитів, уражених СС1), та було вираженим на 24-й годині дії БІА (на 28 % по відношенню до кокультур, уражених СС1, р0,05).
Таким чином, була встановлена відмінність дії блокаторів ліпоксигенази та циклооксигенази на активність АЛТ в культуральному середовищі як в нормі, так і при ураженні СС1. НДГК знижувала цей показник, тоді як ІНД істотно не впливав на нього. В той же час БІА, блокатор тромбоксансинтетази, знижував активність АЛТ в культуральному середовищі гепатоцитів та кокультур в умовах дії СС1, що свідчить про ушкоджуючу дію тромбоксану при виникненні токсичного ураження. Протективна дія НДГК та БІА була більш вираженою в кокультурі гепатоцитів з клітинами Купфера, ніж в окремо культивованих гепатоцитах та проявлялася раніше.
Зміни синтезу сечовини гепатоцитами
Нами не було виявлено суттєвих змін синтезу сечовини гепатоцитами при дії блокатора ліпоксигенази НДГК, у той час як активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій клітин значно змінювалась. Це свідчить про спрямований регулюючий вплив, який мають продукти ліпоксигенази на різні функції гепатоцитів. На відміну від НДГК, ІНД знижував синтез сечовини на 30 % та на 20 % в нормі та при ураженні СС1, відповідно (р0,05) при його дії на протязі 24 годин культивування. Ці дані свідчать про те, що сумарний вплив всіх продуктів циклооксигенази призводить до підвищення синтезу сечовини, здійснюючи, таким чином, регуляцію детоксикаційної функції печінки в нормі та при патології. При дії іншого блокатору метаболізму арахідонової кислоти за циклооксигеназним шляхом - БІА - також спостерігалося вірогідне зниження синтезу сечовини, тобто тромбоксан, напевно, грає up-регулюючу роль по відношенню до специфічної функції гепатоцитів - синтезу сечовини. Крім того, наші дані показують, що інгібуюча дія ІНД на синтез сечовини в значній мірі опосередкована зниженням синтезу тромбоксану.
Таким чином, було виявлено особливості дії блокаторів ліпоксигеназного та циклооксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти на синтез сечовини гепатоцитами: НДГК не впливав на цю функцію, тоді як індометацин та БІА пригнічували її. Виявлено також диференційовану дію ейкозаноїдів на різні функції гепатоцитів.
Зміни перекисного окислення ліпідів (ПОЛ)
Дія застосованих блокаторів ліпоксигенази та циклооксигенази є відносно специфічною. За деякими даними, НДГК та ряд інших блокаторів мають антиоксидантні властивості, тобто зменшують перекисне окислення ліпідів [Tang D., 1996]. Ми досліджували зміни інтенсивності процесів ПОЛ по накопиченню кінцевого продукту - малонового діальдегіду - в культуральних супернатантах від гепатоцитів при дії НДГК, ІНД та БІА. Цей показник є інформативним, оскільки показано, що 95 % МДА накопичується в зовнішньоклітинному середовищі культивованих гепатоцитів [Gunther T., 1995]. Наші дані свідчать, що всі використані блокатори знижують кількість МДА в культуральному середовищі від гепатоцитів. Хоча НДГК, ІНД та БІА знижують кількість МДА в східній мірі (на 46 %, 37 % та 27 %, відповідно), зміни виходу АЛТ з гепатоцитів та активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій виявляються тільки при дії НДГК та БІА, а зміни синтезу сечовини - тільки при дії ІНД та БІА. Ці дані свідчать, що вплив використаних блокаторів на функціональний стан гепатоцитів, в основному, обумовлений блокадою синтезу відповідних похідних арахідонової кислоти і в значно меншій мірі пов”язаний з притаманними блокаторам антиоксидантними властивостями та пригніченням ПОЛ.
Продукція оксиду азоту клітинами Купфера, культивованими окремо та сумісно з гепатоцитами
Досліджуючи механізми дії блокаторів метаболізму арахідонової кислоти, необхідно мати на увазі, що ця дія може бути опосередкована NO. Останнім часом широко дискутується питання про роль NO в функціонуванні печінки в нормі та при патології. В дослідах in vivo показана індукція NO при ураженні печінки мишей СС1 [Rockey D., 1997]. Показано, що викликана клітинами Купфера мітохондріальна дисфункція гепатомних клітин та гепатоцитів опосередкована, в значній мірі, дією NO [Fukumura D., 1996; Herbert K., 1989; Kurose I., 1996]. Є дані про уражуючий вплив NO на дихання мітохондрій гепатоцитів щурів in vitro [Fisch C., 1996]. Показане існування взаємозв”язку між синтезом ейкозаноїдів та NO [Harbrecht B., 1996; Harbrecht B., 1997; Rosa M., 1996]. Виходячи з цього, ми вважали доцільним виявити можливу участь NO в ефектах блокаторів синтезу ейкозаноїдів. Крім того, Studler з співавторами [Stadler J., 1995] показали, що в умовах підвищеного синтезу NO в гепатоцитах інгібується утворення сечовини, оскільки в даному випадку йде мова про конкуренцію за загальний субстрат L-аргінін. Важливо було встановити, чи опосередкована інгібуюча дія ІНД та БІА на синтез сечовини підвищеною продукцією NO. В окремій серії експериментів ми вимірювали рівень NO в культуральному середовищі при дії блокаторів на культивовані клітини. Продукція NO в інтактних Купферівських клітинах була незначною та складала 0,660,13 нмоль/10 клітин. В супернатантах окремо культивованих гепатоцитів NO- в даних умовах не визначався. При сумісному культивуванні гепатоцитів та клітин Купфера цей показник був наближений до кількості NO- в окремо культивованих клітинах Купфера. Не виявлено вірогідних змін концентрації NO- при дії НДГК та ІНД, тобто виявлені нами ефекти блокаторів ліпоксигенази та циклооксигенази на функції гепатоцитів не опосередковані NO.
Особливості змін функціонального стану гепатоцитів в умовах їх кокультивування з клітинами Купфера
Вивчення змін функціонального стану гепатоцитів, культивованих сумісно з клітинами Купфера при дії блокаторів метаболізму арахідонової кислоти, дозволяє оцінити паракринну регулюючу роль продуктів, синтез яких блокується, у функціонуванні гепатоцитів.
Наші дослідження показали, що спрямованість змін досліджуваних показників при дії НДГК, ІНД та БІА була однаковою як в гепатоцитах, культивованих окремо, так і в гепатоцитах, культивованих сумісно з клітинами Купфера, в нормі і при ураженні клітин СС1. Це свідчить про те, що блокада синтезу простагландинів і лейкотрієнів в гепатоцитах і в клітинах Купфера призводить до східних результатів, тобто аутокринні та паракринні ефекти ейкозаноїдів подібні. Хоча зміни показників функцій гепатоцитів, культивованих окремо та сумісно з клітинами Купфера, якісно не відрізнялися, слід відмітити цілий ряд кількісних особливостей дії блокаторів в кокультурі порівняно з культурою гепатоцитів. Так, протективна дія НДГК на життєздатність гепатоцитів в нормі була більш вираженою в кокультурі та проявлялася раніш - вже в 4 годинний термін дослідження. Протективна дія НДГК та БІА в умовах ураження СС1 була також більш вираженою при сумісному культивуванні. Важливо відмітити, що статистично вірогідний інгібуючий ефект НДГК на активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій у 24-годинний термін дослідження був виявлений тільки в культурі гепатоцитів. Присутність клітин Купфера в культурі гепатоцитів в деякій мірі запобігала зниженню активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій. Поясненням цього явища може бути більша в кокультурі, ніж в культурі, кількість продуктів ліпоксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти, які, певно, приймають участь в підтримці функціонування клітин. З іншого боку, паракринні впливи клітин Купфера можуть забезпечувати більшу резистентність гепатоцитів до дії зовнішніх факторів.
Таким чином, сукупність отриманих даних свідчить про те, що продукти ліпоксигеназного та циклооксигеназного шляхів метаболізму арахідонової кислоти приймають участь в ауто- та паракринній регуляції функціонального стану гепатоцитів в нормі; блокада ліпоксигенази та тромбоксансинтетази має протективний ефект на гепатоцити, уражені чотирихлористим вуглецем.
В И С Н О В К И
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Статті:
Тези:
АНОТАЦІЇ:
Лушнікова І.В. Вивчення участі продуктів метаболізму арахідонової кислоти у функціонуванні гепатоцитів щурів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера.- Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - Фізіологія людини та тварин.- Інститут фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України, Київ, 1999.
Досліджували вплив блокаторів ліпоксигенази - нордігідрогуаяретової кислоти (НДГК), циклооксигенази - індометацину (ІНД) та тромбоксансинтетази - бензилімідазолу (БІА) на функціональний стан гепатоцитів в культурі та кокультурі з клітинами Купфера в нормі та при ураженні CCl. Показано, що НДГК підвищує активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів, що характеризує мітохондріальне дихання, в 4-годинний термін та знижує цей показник через 24 години, підвищує життєздатність клітин (за даними активності АЛТ в культуральному середовищі), але не впливає на синтез сечовини. В умовах ураження гепатоцитів чотирихлористим вуглецем НДГК має протективну дію - знижує вихід АЛТ з клітин та запобігає пригніченню активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій. Ефект більш виражений в кокультурі гепатоцитів з клітинами Купфера. ІНД знижує синтез сечовини в гепатоцитах, але не викликає суттєвих змін їх життєздатності і активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій в нормі та при ураженні CCl. Встановлено, що БІА змінює функції гепатоцитів в нормі, підвищуючи активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій та знижуючи синтез сечовини, а також проявляє виражену протективну дію в умовах ураження ССl. Одержані дані свідчать, що ейкозаноїди є важливими ауто- та паракринними регуляторами функцій гепатоцитів в нормі, а також, що продукти ліпоксигенази та тромбоксансинтетази, напевно, мають безпосередній ушкоджуючий вплив на гепатоцити при токсичному ураженні печінки.
КЛЮЧОВІ СЛОВА: гепатоцити, клітини Купфера, блокатори ліпоксигенази, циклооксигенази та тромбоксансинтетази, чотирихлористий вуглець.
Лушникова И.В. Изучение участия продуктов метаболизма арахидоновой кислоты в функционировании гепатоцитов крыс в культуре и кокультуре с клетками Купфера. - Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - Физиология человека и животных. - Институт физиологии им.А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 1999.
Продукты метаболизма арахидоновой кислоты (эйкозаноиды) являются важными регуляторами функций клеток печени в физиологических условиях и при возникновении патологических процессов, а также медиаторами межклеточных взаимодействий. Большинство исследований, посвященных действию эйкозаноидов, проведены in vivo, когда их влияние может быть опосредовано изменениями на органном уровне. Вопрос о непосредственном действии простагландинов и лейкотриенов на функциональное состояние различных популяций клеток печени в норме и при патологии изучен недостаточно. Адекватной моделью для изучения непосредственного влияния простагландинов и лейкотриенов на функции клеток печени является первичная культура клеток. Для изучения участия продуктов метаболизма арахидоновой кислоты в ауто- и паракринной регуляции функций гепатоцитов в культуре и кокультуре с клетками Купфера в данной работе использовали фармакологический подход с применением блокаторов: циклооксигеназы - индометацина (ИНД), липоксигеназы - нордигидрогуаяретовой кислоты (НДГК) и тромбоксансинтетазы - бензилимидазола (БИА). Весь комплекс воздействий блокаторами проведен в физиологических условиях, а также в условиях повреждения клеток четыреххлористым углеродом (ССl). Èçìåíåíèÿ ôóíêöèé îòäåëüíî êóëüòèâèðóåìûõ ãåïàòîöèòîâ ïðè äåéñòâèè áëîêàòîðîâ ïîçâîëÿþò ñóäèòü îá ó÷àñòèè ýéêîçàíîèäîâ â àóòîêðèííîé ðåãóëÿöèè ôóíêöèé êëåòîê. Ñîâìåñòíîå êóëüòèâèðîâàíèå ãåïàòîöèòîâ ñ êëåòêàìè Êóïôåðà èñïîëüçîâàíî äëÿ èçó÷åíèÿ ó÷àñòèÿ ýéêîçàíîèäîâ â ïàðàêðèííîé регуляции.
Оценивали жизнеспособность гепатоцитов по выходу в культуральную среду цитозольного фермента - аланинаминотрансферазы (АЛТ), митохондриальное дыхание по активности электрон-транспортной цепи митохондрий (МТТ-тест) и детоксикационную функцию по активности синтеза мочевины.
Показано, что НДГК повышает активность электрон-транспортной цепи митохондрий гепатоцитов через 4 часа и снижает этот показатель через 24 часа после воздействия. Присутствие клеток Купфера в культуре гепатоцитов предотвращает снижение активности электрон-транспортной цепи митохондрий при действии НДГК в 24 часовой срок исследования, что свидетельствует о паракринном стабилизирующем влиянии Купферовских клеток на гепатоциты. Блокада липоксигеназы повышает жизнеспособность клеток, но не влияет на синтез мочевины. СCl вызывает повреждение культивируемых гепатоцитов, снижая активность электрон-транспортной цепи митохондрий и повышая выход АЛТ в культуральную среду. В условиях повреждения гепатоцитов четыреххлористым углеродом НДГК оказывает протективное действие - предотвращает угнетение активности электрон-транспортной цепи митохондрий и снижает выход АЛТ из клеток. Протективный эффект более выражен в кокультуре гепатоцитов с клетками Купфера. ИНД, напротив, снижает синтез мочевины, но не вызывает существенных изменений жизнеспособности и активности электрон-транспортной цепи митохондрий гепатоцитов как в норме, так и в условиях действия СCl. Установлено, что БИА, блокатор отдельного звена циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты, изменяет функции гепатоцитов в норме, повышая активность электрон-транспортной цепи митохондрий и снижая синтез мочевины, а также проявляет выраженное протективное действие при повреждении гепатоцитов СCl. Поскольку снижение синтеза мочевины при действии ИНД и БИА было выражено в сходной степени, по-видимому, ингибирующее действие ИНД на эту функцию гепатоцитов в значительной степени опосредовано снижением синтеза тромбоксана. Нами показано, что особенности действия блокаторов на гепатоциты в культуре не опосредованы изменениями синтеза NO и перекисного окисления липидов.
Полученные данные свидетельствуют, что продукты липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты являются важными ауто- и паракринными регуляторами функций гепатоцитов, которые влияют на показатели функциональной активности клеток, такие как их жизнеспособность и активность электрон-транспортной цепи митохондрий. В то же время продукты циклооксигеназы, в частности тромбоксан, принимают учатсие в регуляции специфической функции гепатоцитов - синтеза мочевины. Выявленный протективный эффект блокады липоксигеназы и тромбоксансинтетазы в условиях повреждения культивируемых клеток СС1 свидетельствует, что продукты липоксигеназы и тромбоксансинтетазы оказывают непосредственное повреждающее действие на гепатоциты при токсическом повреждении печени, одним из механизмов которого может быть угнетение активности электрон-транспортной цепи митохондрий гепатоцитов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: гепатоциты, клетки Купфера, блокаторы липоксигеназы, циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы, четыреххлористый углерод
Lushnikova I.V. Effects of arachidonic acid metabolites on the functional activities of rat hepatocytes cultured alone and with Kupffer cells.- Manuscript.
Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.13 - physiology of human and animals.- Bogomoletz Institute of Physiology of the NAS of Ukraine, Kiev, 1999.
In order to study the contribution of eicosanoids to the regulation of the functions of normal and carbon tetrachloride (CCl) - injured liver cells, primary cultures of hepatocytes (HC) either alone or in coculture with Kupffer cells (KC) were exposed to lipoxygenase inhibitor (nordihydroguaiaretic acid - NDGA), cyclooxygenase inhibitor (indomethacin - IND) and thromboxane synthetase inhibitor (benzylimidazole - BIA) in the presence and absence of CCl. NDGA addition decreased the ALT release from HC, increased the mitochondrial electron transport chain activity (ETC activity) at 4 h and decreased this parameter at 24 h. Treatment with CClresulted in increased ALT release and decreased ETC activity in HC and their cocultures with KC. The addition of NDGA decreased ALT levels and increased ETC activity in CCl-injured cells. Urea production (UP) was not significantly affected by NDGA. In contrast, addition of IND decreased UP by HC, and did not alter ALT release and ETC activity in control and CCl-treated cells. BIA decreased ALT release from CCl-injured hepatocytes, increased ETC activity in control and CCl-injured cells and decreased urea production by cultured hepatocytes. These results indicate that arachidonic acid metabolites are involved in the regulation of HC functions. This work also shows that a protective action of lipoxygenase and thromboxane synthetase inhibitors on CCl-injured liver is mediated, at least in part, by their direct effects on HC, in particular by increasing the mitochondrial activity.
KEY WORDS: hepatocytes, Kupffer cells, lipoxygenase, cyclooxygenase and thromboxane synthetase inhibitors, carbon tetrachloride