Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
Харківський державний медичний університет
УДК 616.611-002-008.9:612.014.1]-036-092.4/.9
Козар Валентина Вікторівна
Зміни складу інозітолфосфатів, клітинного метаболізму при
гломерулонефриті в експерименті і клініці
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Спеціальність - 14.01.02 внутрішні хвороби
Харків - 2000
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Інституті терапії АМН України, м.Харків
Науковий керівник:
Д. мед.н., старший науковий співробітник Топчій Іван Іванович, Інститут терапії АМН України, м.Харків, зав. відділом нефрології
Офіційні опоненти:
Д. мед.н., доцент Власенко Михайло Антонович, Харківська медична академія післядипломної освіти, зав. відділом нефрології
Лауреат Державної премії України, д. мед.н., професор Гольцев Анатолій Миколайович, Харківський інститут кріобіології і кріомедицини НАН України, зав. відділом кріопатофізіології
Провідна установа:
Інститут урології та нефрології АМН України, м.Київ, відділ нефрології та еферентних методів лікування
Захист дисертації відбудеться 13 квітня 2000р.о 12-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.04 при Харківському державному медичному університеті за адресою:
61022, м.Харків,пр.Леніна,4.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Харківського
державного медичного університету (61022, м.Харків,пр. Леніна,4)
Автореферат розісланий 10 березня 2000р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат медичних наук,
доцент Л.І. Овчаренко
Загальна характеристика роботи.
Актуальність теми. В структурі хвороб нирок особливе значення набули хронічні запальні захворювання, які являються найбільш поширеною причиною вторинної артеріальної гіпертензії і термінальної ниркової недостатності (Тареєва І.Є., 1996, Мухін Н.А., 1997, Abboud H.E., 1993).
Нирки схильні до розвитку різних імунопатологічних процесів, тому що мають ряд анатомічних і функціональних особливостей ( Йегер Л., 1990, Рябов С.И., 1996, Соколов Є.І., 1998). Це відноситься, передусім, до гломерулярного і тубулярного апарату з перитубулярними судинами та інтерстицієм. Не зважаючи на значні успіхи та нові знання, які, перш за все, були одержані в ході численних експериментів на тваринах, а також стали можливими в результаті впровадження сучасних морфологічних та імунологічних методів в клінічну практику і діагностику, ряд етіологічних, патогенетичних питань у розвитку запальних захворювань нирок залишаються ще не з’ясованими ( Брайер Д.А., 1995, Стефані Д.В., Вельтищев Ю.Є., 1996).
В подальшому розвитку гломерулонефриту (ГН) поряд з активацією гуморальних імунних процесів, основну роль відводять медіаторам запалення, що виробляються клітинами імунної системи - лімфоцитами, моноцитами, макрофагами, а також нейтрофілами, тромбоцитами і, головне, власними клітинами клубочка; процесам коагуляції ( тісно зв’язаними з імунним запаленням) та неімунним механізмам - гемодинамічним і метаболічним ( Тареєва І.Є., 1996, Головізін М.В., 1993, Simonson M.S., 1991).
Таким чином, ушкодження тканин може бути викликано різними причинами: безпосередньо через специфічні імунологічні реакції, або опосередковано через активацію медіаторів та при участі імунокомпетентних клітин. Установлено, що при утворенні комплексу антиген-антитіло відбувається активація макрофагів, тучних клітин, лімфоцитів, тромбоцитів, активація комплементу та ін., що призводить до звільнення клітинами цитокінів, вазоактивних амінів, медіаторів (Громихіна Н.Ю., Козлов В.А., 1996, Arend W.P., 1991). Ці біологічно активні речовини впливають на метаболізм тканин шляхом зв’язування зі специфічними рецепторами, які знаходяться на поверхні цитоплазматичних мембран клітин, і подальшій активації вторинних месенджерів (циклічних нуклеотидів, інозітолфосфатів , Са+2 та ін.), які опосередковують сигнал ( Adler S., 1992, Butcher E.C., 1990).
Вторинні месенджери, являючись регуляторами активності ферментів, впливають на метаболічні процеси шляхом зміни активності ферментів ( Авдонін П.В.,Ткачук В.А.,1994, Berridge M.J., 1989).
Вивчення ролі вторинних месенджерів при різних патологічних процесах є цікавим і перспективним напрямком наукових досліджень. За останні роки проведена велика кількість досліджень по визначенню ролі вторинних месенджерів в патогенезі ГН. Проте основна увага приділялась вивченню системи циклічних нуклеотидів та простагландинів (Ляшенко В.А., 1988, Талако С.А., 1993, Wolf S.C. et all., 1997).
Роль інозітолфосфатів (ІФ), питання взаємозв’язку регуляторних систем з метаболічними процесами в клітинах при ГН залишається недостатньо вивченим (Левицький О.Д., 1990, Berridge M.J. ,Irvine R.F., 1989).
Тому доцільним є вивчення особливостей змін складу ІФ, рівня обмінних та енергетичних процесів при ГН.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Вибраний напрямок досліджень зв’язаний з науковою діяльністю та входить до тематичного плану Інституту терапії АМН України, як фрагмент НДР “Розробка методів лікування хронічного гломерулонефриту з урахуванням мембраноцитоплазматичних взаємовідношень, імунокомпетентних клітин крові та застосування методів еферентної терапії”(Держ. реєстр. №0194U0035070).
Мета і задачі дослідження.
Метою роботи є визначення прогностичних маркерів розвитку ГН на підставі змін складу інозітолфосфатів, метаболічних процесів при ГН в експерименті та клініці, а також оцінка впливу мембранотропної терапії на досліджувані показники.
Задачі:
1. Визначити у хворих ХГН вміст ІФ в крові та лімфоцитах.
2. Визначити у хворих ХГН активність ферментів КП-N, y-ГТ, концентрацію фібронектину, фібріногену, стан клітинного та гуморального імунітету.
3. В експериментальній частині у щурів з індукованим аутоімунним ГН дослідити вміст ІФ і особливості метаболічних процесів в плазмі крові та гомогенаті ниркової тканини, зміни показників імунного статусу, кінінової системи.
4. Встановити вплив глюкозаміну гідрохлориду (глюкозаміну), який має мембранопротекторну та антиоксидантну дію, на рівень ІФ, клітинний метаболізм, показники імунного статусу при експериментальному аутоімунному ГН у щурів.
Наукова новизна.
3. Виявлена тісна залежність між посиленням гідролізу мембранних фосфоліпідів, зміною рівня ІФ в крові та гомогенаті ниркової тканини і активацією процесів перекисного окислення ліпідів, зміною енергетичних, біосинтетичних процесів, показників АОС, імунної, кінінової систем в умовах експериментального аутоімунного ГН.
4.Визначена прогностична значимість та інформативність підвищення активності ферментів КП-N i -ГT в кровi, як критерiїв вираженостi iмунозапальних i деструктивних процесiв при ГН.
5.При оцінці досліджуваних параметрів був використаний системний аналіз, який дозволив встановити численні зв’язки між різними підсистемами при ГН.
.Вивчено вплив глюкозаміну гідрохлориду, що має мембраностабілізуючу та антиоксидантну дію, на перебіг експериментального ГН. Показано, що препарат нормалізує показники регуляторно-енергетичних процесів, і це дає підставу рекомендувати проведення клінічних досліджень глюкозаміну в комплексному лікуванні хворих ГН.
За результатами проведених досліджень виявлено охороноздатне рiшення “Спосіб диференційної оцінки впливу лікарських засобів на організм людини” (співавтор Топчій І.І.) –реєстраційний номер заявки 97031469, дата подання 28.03.97; прийняття рішення 15.10.97.
Практична значимість роботи. В цілях поліпшення діагностики, прогнозування перебігу імунозапального процесу та контролю за ефективністю проведеної терапії у хворих гломерулонефритом рекомендується визначення рівня інозітолфосфатів в плазмі крові і лімфоцитах. В результаті проведенного дослідження показана важлива роль вивчення активності ферментів КП-N та у-глутамілтрансферази при гломерулонефриті, що дозволяє оцінити стан біосинтетичних та деструктивних процесів в нирках. Позитивний вплив на перебіг експериментального гломерулонефриту глюкозаміну гідрохлориду дозволяє рекомендувати проведення клінічних досліджень препарату для лікування хворих на гломерулонефрит.
Результати проведеного дослідження впроваджені у практичну роботу клініки Інституту терапії АМН України, Харківської обласної клінічної лікарні, 13 Харківської міської лікарні, що дозволило знизити частоту рецидивів захворювання ХГН та уникнути ускладнень терапії. Розроблено і впроваджено методичні рекомендації: “Застосування методів плазмаферезу в лікуванні хворих на гломерулонефрит” (спіавт. Пиріг Л.А., Топчій І.І., Величко М.Б., Тітова Т.А., Несен А.О.); “Діагностика алергічних та імунотоксичних реакцій на введення лікарських засобів”(співавт. Топчій І.І.) .
Декларація особистого внеску в розробку наукових результатів.
Представлені у роботі наукові матеріали та фактичні дані є самостійним внеском автора в розроблену тему. Автор самостійно провела патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури з дослідженої теми, імунологічне обстеження хворим ХГН, брала участь в проведенні клінічних та біохімічних обстежень хворих, в організації банку даних хворих, у проведенні експериментальної роботи по моделюванню аутоімунного ГН у щурів, самостійно провела системний аналіз показників та інтегральну оцінку участі досліджуваних систем організму в патогенезі ГН.
Апробація результатів дисертації
Матеріали дисертації доповідались на 10 підсумковій науковій сесії Інституту Терапії АМН України (1996), науково-практичній конференції по актуальним проблемам клініки внутрішніх хвороб (Харкiв, 1996), IV міжнародній науково-практичній конференції урологів та нефрологів (Харкiв, 1996), науково-практичній конференції “Нирки та інфекції” (Івано-Франківськ, 1997 р.), XIV міжнародному конгресі по нефрології (Сідней, 1997 р.), XIV з’їзді терапевтів України (Київ, 1998 р.), XV Міжнародному Конгресі по нефрології (Буенос-Айрес, Аргентина, 1999р.), товаристві імунологів (м. Харків, 1999р.), 13-й Всеукраїнській конференції нефрологів (Харків, 1999р.)
Публікації
По темі дисертації опубліковано 14 друкованих робіт: 5 статей в журналах, 4 статті в збірнику наукових праць, 2 статті –в матеріалах з’їзду, 2 надруковано тез доповідей, 1 патент на винахід України.
Структура та обсяг дисертації
Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, розділу огляду літератури, розділу власних досліджень, підсумків, висновків, практичних рекомендацій. Список використаної літератури містить 203 джерела, з них 116 на українській та російській мовах, 87 зарубіжних. Робота ілюстрована 5 рисунками (4 сторінки) та 22 таблицями (16 сторінок).
Зміст роботи
Матеріали і методи.
Для вирішення поставлених завдань проведено комплексне обстеження 88 хворих ХГН віком від 21 року. З них:
III групу (контрольну) склали донори (30 чоловiк).
Діагноз ХГН встановлювався на основі скарг хворого, анамнезу захворювання, даних об’єктивного обстеження, лабораторних та інструментальних методів дослідження (ехосонографія, радіосцинтіграфія). Клiнiчна форма ХГН встановлювалась згідно класифікації І.Є.Тареєвої (1995).Стадії ХНН встановлювали згідно класифікації М.Я.Ратнер (1980).
У хворих досліджували склад інозітолфостфатів в крові і лімфоцитах, активність ферментів КП-N, у-ГТ, показники лiпiдного, бiлкового обмiну, імунного статусу.
В експериментальній частині роботи були використані щури-самці лінії Вістар вагою 150-170 г., віком 3 місяці, яким була введена ксеногенна нефротоксична сироватка. Ксеногенна антисироватка була одержана шляхом імунізації кроликів матеріалом, що містить базальні мембрани ниркової тканини щурів. Моделювання ГН проводилося по методу, запропонованому Саркісовим Д.С., Ремізовим П.І.(1960). Тварин розділили на 3 групи: 1 група (n=5) –інтактний контроль; 2 група –(n=7) – конроль на розвиток патології (у щурів моделювали тільки аутоімунний ГН); щурам 3 групи (n=9), починаючи з 15 діб від початку відтворення ГН, щодня на протязі 5 діб один раз в день вводили глюкозамін внутрішньобрюшинно в дозі 2 мг/100г маси тіла. По закінченню цього терміну (в цілому через 20 діб від початку експерименту на висоті протеїнурії, гематурії, циліндрурії) тварин всіх груп забивали і відбирали для дослідження кров та ниркову тканину.
Кров використовували для визначення ІФ, активності ферментів, продуктів ПОЛ, постановки імунологічних тестів. Методом диференційного центрифугування виділяли мітохондрії та цитоплазматичні мембрани. В мітохондріях визначали активність ферментів СДГ, ізоцітрат –ДГ, глутамат –ДГ, Са+2, Mg+2 –АТФази. В мембранах нирок визначали вміст фосфоліпідів, активність фосфоліпази А2. В гомогенаті ниркової тканини визначали вміст АТФ, ІФ, активність ферментів АСТ, АЛТ, гексокінази, вміст початкових і кінцевих продуктів ПОЛ (дієнових кон’югатів-ДК, малонового альдегіду-МДА), концентрації Са+2.
Активність трансаміназ АСТ, АЛТ, у-ГТ досліджували за допомогою наборів фірми “Labsistems” по доданим інструкціям. Білкові фракції, холестерин, тригліцеріди визначали за допомогою наборів фірми “Lachema” (Чехія). ІФ –визначали методом колоночної хромотографії, фракційний склад ліпідів мембран –методом тонкослійної хромотографії; загальні кініни, тіолові групи ферментів, активність гексокінази, каталази, фосфоліпази А2, КП-N, СДГ, ізоцит-ДГ, глутамат-ДГ, продукти ПОЛ (ДК, МДА), рівень АТФ, SH-груп, активність ЛДГ, ФЛ А2, СОД, –спектрофотометрично; активність Са+2, Mg+2 –АТФази –фотоколориметрично.
Дослідження показників Т-клітинної ланки імунітету проводилось методом розеткоутворення з ерицтроцитами барана (Jondal M. etal, 1972), і навантаження теофіліном (Shohat, 1982), кількісне визначення імуноглобулінів (Ig A, Ig M, Ig G) в сироватці крові –методом радіальної імунодифузії (по Manchini, 1965), вміст ЦИК –методом нефелометрії (в модифікації Гріневич Ю.А., Алфьорова Н.Н., 1981), активність комплементу –по 50%-му гемолізу (Л.С.Резнікова, 1967) спектрофотометрично, фагоцитарну активність нейтрофілів –з дріжжами, функціональний стан нейтрофілів крові –в НСТ –тесті. Визначення В-лімфоцитів –методом спонтанного розеткоутворення з зимозаном –Е –РОК (Stathononlos, Elliot, 1974).
Весь одержаний матеріал опрацьований на ПЕВМ ІВМ РС/АТ по пакету статистичних програм з використанням критерія t Стьюдента і критерія згоди К.Пірсона.
Результати дослідження і їх обговорення.
На підставі клінічного обстеження хворих ХГН та моделювання експериментального аутоімунного ГН у щурів встановлено, що між зміною рівня інозітолфосфатів і метаболічними, енергетичними порушеннями мається тісний кореляційний зв’язок.
Як відомо, в період антигенної активації відзначається значне прискорення гідролізу мембранних фосфоліпідів, що призводить до порушень структурно-функціональної організації клітинних мембран .
Як показав експеримент, при аутоімунному ГН вміст загальних фосфоліпідів (ФЛ) в цитоплазматичних мембранах нирок щурів зменшився в 1,5 рази в порівнянні з інтактними тваринами. При цьому більша питома вага належить фосфоінозитидам (ФІ), вміст яких зменшився в 2,16 разів та фосфатидилетаноламіну (ФЕ), вміст якого зменшився в 1,84 рази. Вміст фосфатидилсерину (ФС) і фосфатидилхоліну (ФХ) зменшився в 1,3 рази.
Посилення гідролізу ФЕ, ФС, ФХ, активація ферменту ФЛ Асвідчать про активне утворення ейкозаноїдів –продуктів гідролізу арахідонової кислоти, які, поряд з лізоФХ, вміст якого підвищився в 1,8 рази, приймають активну участь в підтримці запального процесу в нирках.
Стимуляція обміну ФІ, як відомо, супроводжується утворенням вторинних мессенджерів (інозітолфосфатів, діацилгліцеролу), які являються важливими регуляторами кальцієвого обміну.
Однією з задач, що поставлені для виконання визначеної теми, було встановити роль ІФ в процесах розвитку та перебігу ГН, в зв’язку з чим їх визначення проводили хворим ХГН в плазмі крові та лімфоцитах, у щурів з експериментальними ГН –в крові та гомогенаті ниркової тканини.
Вивчення фракційного складу інозітолфосфатів в крові і лімфоцитах хворих ХГН, в крові і гомогенаті ниркової тканини щурів при експериментальному ГН показало, що система вторинних месенджерів зазнає значних змін в умовах визначеної патології. В результаті проведених досліджень встановлено, що при ГН рівень інозітолфосфатів в дослідженому матеріалі перевищує показники контрольних груп, окрім ІФ2 в гомогенаті ниркової тканини, вміст якого зменшився (рис. 1). Підвищення рівня інозітолфосфатів відбулося, в основному, за рахунок ІФ1 в крові хворих ХГН і експериментальних тварин (відповідно в 1,9 і 2,3 рази), ІФ3 в лімфоцитах хворих і гомогенаті ниркової тканини щурів (відповідно в 2,5 і 1,6 рази). Рівень ІФ2 в крові хворих та щурів збільшився відповідно в 1,3 і 2,0 рази, в лімфоцитах –в 1,2 рази, в гомогенаті ниркової тканини зменшився в 1,5 рази.
|
3,0 |
,0 |
|||||||||||||||
|
2,5 |
,5 |
|||||||||||||||
|
,3 |
||||||||||||||||
|
2,0 |
,0 |
|||||||||||||||
|
,6 |
||||||||||||||||
|
,7 |
||||||||||||||||
|
,6 |
||||||||||||||||
|
1,5 |
||||||||||||||||
|
,3 |
,3 |
,3 |
||||||||||||||
|
,2 |
||||||||||||||||
|
1,0 |
||||||||||||||||
|
ІФ1 |
ІФ2 |
ІФ3 |
||||||||||||||
|
-1,5 |
||||||||||||||||
|
Плазма |
Кров тварин |
Лімфоцити |
Гомогенат |
Рисунок 1. Співвідношення динаміки ІФ при ГН в эксперименті та клініці
Найбільша питома вага серед інозітолфосфатів в досліджуваних матеріалах належить ІФ3 в лімфоцитах хворих (53,8%) , ІФ1 в гомогенаті ниркової тканини щурів (55,8%) і ІФ3 в крові щурів (53,7%). При цьому, серед контрольних груп значна питома вага належить рівню ІФ3 в крові людей і щурів (відповідно 49,7% і 66,0%) та ІФ2 в гомогенаті - 56,7% (табл.1). Значні зміни питомої ваги ІФ відзначаються: в лімфоцитах хворих ХГН (значне збільшення показників ІФ1 –,8% проти 34,1%), в гомогенаті ниркової тканини щурів (ІФ1 - 55,8% проти 26,7%, ІФ2 –,6% проти 56,7% (табл.1).
Це свідчить про те, що визначення вмісту ІФ може служити важливим критерієм активності імунозапального процесу при ГН.
Як відомо, ІФ являються регуляторами кальцієвого обміну. ІФ1 і ІФ2 забезпечують “вхід” кальцію через плазматичну мембрану, ІФ3 –“вихід” кальцію із внутрішніх клітинних депо. При експериментальному ГН відзначається підвищення концентрації кальцію в гомогенаті ниркової тканини щурів та зниження активності мітохондріального ферменту Са+2, Mg+2 –АТФази. Між рівнем ІФ, концентрацією Са+2 та активністю Са+2, Mg+2 –АТФази мається тісний зв’язок.
Таблиця 1
Питома вага інозітолфосфатів при гломерулонефриті
|
ІФ |
Плазма |
Лімфоцити |
Кров |
Гомогенат |
|
Здорові |
ХГН |
здорові |
ХГН |
Інтактні тварини |
з ГН |
Інтактні тварини |
з ГН |
|
|
ІФ1 |
25,5 |
,6 |
,9 |
,5 |
,0 |
,3 |
,7 |
,8 |
|
ІФ2 |
24,8 |
,7 |
,0 |
,7 |
,0 |
,0 |
,7 |
,6 |
|
ІФ3 |
49,7 |
,7 |
,1 |
,8 |
,0 |
,7 |
16,6 |
,6 |
Практично всі хронічні захворювання нирок, центральне місце серед яких належить ХГН, протікають на фоні виражених порушень обміну ліпідів. Гіпертригліцерідемія, гіперхолестеринемія створюють сприятливі умови для стимуляції перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) та призводять до абсолютної або відносної недостатності факторів системи антиоксидантного захисту (АОЗ).
В першу чергу перекисні процеси стосуються ліпідів, що входять до складу мембранних структур.
В ході експерименту було установлено, що при ГН відзначається підвищення рівня початкових і кінцевих продуктів ПОЛ –ДК і МДА –як в крові, так і в гомогенаті ниркової тканини майже в 2 рази.
Також майже в 2 рази підвищилась активність ланки АОЗ, що приймає участь в знешкодженні активних форм кисню (СОД, каталаза), і в 1,7 рази зменшився рівень загальних тіолових груп в крові, що пов’язаний із зниженням активності ланки АОЗ, яка відповідає за знешкодження продуктів пероксидації. В умовах надмірної активації ПОЛ та недостатньо ефективної системи АОЗ, перекисне окислення виявляє пошкоджуючу дію. Змінюється проникливість мембран, порушується функціонування різних мембранозв’язаних ферментів і рецепторів. Пероксидація ліпідів супроводжується утворенням високотоксичних проміжних сполук, наприклад, токсичних альдегідів, які інгібірують синтез білків, активність багатьох ферментів, сприяють підвищенню гемокоагуляції, викликають оксидаційну деструкцію білків і, відповідно, їх пов’язують з патогенезом аутоімунних захворювань, в тому числі ГН.
Окрім цього, при зниженні активності генерації радикальних продуктів, підвищується відновлений потенціал клітин за рахунок субстратів, коферментів, які знаходяться у відновленому стані що приводить до зниження рН. В цих умовах порушується система дихальних ферментів, синтез АТФ, спостерігається часткова деполяризація мембран та перерозподіл в тканинах іонів Са+2.
Порушення структурної організації мембран призводить до підвищення рівня цитозольного Са+2 і запуску каскаду кальційзалежних реакцій. Висока концентрація Са+2 призводить, в свою чергу, до роз’єднання окисленого фосфорилювання, стимуляції розщеплення глікогену, що супроводжується підвищенням рівня коферментів і субстратів в відновленій формі та зниженням рН і посилює дефіцит АТФ.
Як показав експеримент, вміст АТФ в гомогенаті ниркової тканини у щурів з експериментальним ГН зменшився в 2,9 разів, що свідчить про порушення енергетичного обміну в умовах досліджуваної патології. Зниження концентрації АТФ та підвищення концентрації Са+2 в нирках мають тісні зв’язки з підвищенням активності процесів ВРО ліпідів.
По даним експерименту, на фоні зниження АТФ, посилення процесів ПОЛ відзначається зниження активності дихальних ферментів (СДГ-в2,24 рази, ізоцит-ДГ- в 2,16 рази) і підвищення активності гліколітичних ферментів (ЛДГ –в 2,35 рази, гексокінази –в 1,98 рази). В умовах гіпоксії відзначається солюбілізація та активація лізосомальних ферментів, що призводить до інтенсивного переварювання власних тканин. Про посилення некротичних процесів в нирках свідчить підвищення активності трансаміназ АСТ і АЛТ в гомогенаті ниркової тканини (відповідно в 2,6 і 2,14 разів). Підвищення активності АСТ, АЛТ в гомогенаті має тісний зв’язок з підвищенням активності у-ГТ в крові. У щурів з експериментальним ГН активність -ГТ підвищилась в 1,75 рази, у хворих ХГН –в 2,24 (I група) i 1,4 (II група) рази. Це свідчить про те, що визначення активності -ГТ у хворих являється важливим критерієм активності запального процесу в нирках (рис.2). Про порушення біосинтетичних процесів при ГН свідчить також зниження активності мітохондріальної глутамат-ДГ (в 2,34 рази), протеолітичної активності лейкоцитів (за рахунок кислих гідролаз –в 2,9 рази, лужних –в 2,2 рази).
Пiдвищення активностi трансамiназ, порушення енергетичних процесiв мають тiснi кореляцiйнi зв’язки iз змiною рiвня iнозiолфосфатiв в кровi i гомогенатi ниркової тканини щурiв.
Із зміною рівня вторинних месенджерів, метаболічними порушеннями та імунним запаленням має тісні кореляційні зв’язки активація кінінової системи. Так, рівень загальних кінінів підвищився у експериментальних тварин в 3,4 рази, активність кінінази КП-N –в 2 рази, активність кініногеназ лейкоцитів в 2 рази. У хворих ХГН активність КП-N збільшилась в 1,7 (I група) та 1,5 (II група) рази. Таким чином, підвищення активності КП-N при ГН у хворих ХГН і щурів відображає активність процесу при ГН і може бути використано як критерій активності запального процесу в нирках.
Рисунок 2. Активність КП-N і трансаміназ при ГН
Як відомо, різноманітні механізми прогресування ГН пов’язані з механізмами імунного запалення.
Дестабілізація клітинних мембран посилення процесів ВРО ліпідів, підвищення рівня інозітолфосфатів, Са+2, порушення енергетичного та біосинтетичного процесів мають важливе значення в порушеннях імунного статусу при ГН, про що свідчать тісні кореляційні зв’язки між цими системами.
Як у хворих ХГН, так і щурів з експериментальним аутоімунним ГН відзначається активація Т-клітинної ланки імунітету і зниження показників В-ланки імунітету (рис.3). Активація Т-клітинної ланки супроводжується підвищенням кількості Т-лімфоцитів, Тф-стійких (ТфС) лімфоцитів, зниження кількості Тф-чутливих (ТфЧ) лімфоцитів і підвищенням показника ТфС/ТфЧ. Відносно В-ланки імунітету відзначається зниження В-лімфоцитів, концентрації ІgG.
|
Иммунологічні показники |
Контрольна група |
Хворі ХГН |
Інтактні тварини |
Експеримен-тальний ГН |
|
Т-РОК |
||||
|
В-РОК |
||||
|
О-клітини |
||||
|
ТфС |
||||
|
ТфЧ |
||||
|
Ig A |
||||
|
Ig M |
Ig G
Рисунок 3. Показники імунного статусу при ГН
Визначення у хворих фагоцитарної активності нейтрофілів показало, що у хворих ХГН, особливо в 1 групі, відзначається зниження показників цієї ланки, а також підвищення кисневозалежних механізмів бактерицидності нейтрофілів (НСТ-тест), що має важливе значення в підтримці запального процесу при ГН. Показники фагоцитарної ланки мають тісні кореляційні зв’зки з рівнем фібронектину в плазмі крові хворих.
Таким чином, посилення гідролізу мембранних фосфоліпідів, зміна рівня ІФ, порушення енергетичних, біосинтетичних процесів, активація процесів ПОЛ, імуної, кінінової систем призводить до порушень структурно-функціональної організації клітинних мембран, трансмембранних механізмів регуляції метаболічних процесів в нирках, порушенню функції мембранозв’язаних ферментів. Все це впливає на показники фільтрації та реабсорбції в нирках, секреції гормонів та ін., а також сприяє підтримці імунозапального процесу в нирках.
Враховуючи, що в біосистемах між різними підсистемами утворюються численні зв’язки, нами був проведений системний аналіз всіх вивчаємих показників за допомогою кореляційних структур (Зосімов А.М., 1993).
Інтегральна оцінка участі різних систем організму в патогенезі експериментального аутоімунного ГН показала, що найбільш значні відхилення в процесі розвитку захворювання виявлені для системи ПОЛ, Т-ланки імунітету, кінінової системи, протеолітичної активності лейкоцитів, енергетичному обміні, рівня ІФ в крові. (табл. 2).
Таблиця 2.
Середній розмір відхилення від норми параметрів різних систем організму при експериментальному ГН
|
№ п/п |
Параметри |
Середнє значення t-критерію |
|
1 |
Кінінова система |
,0 |
|
2 |
Т-система імунітету |
9,3 |
|
3 |
ПОЛ |
8,87 |
|
4 |
Протеолітична активність лейкоцитів |
8,2 |
|
5 |
ІФ, кров |
7,6 |
|
6 |
Енергетичний обмін |
7.06 |
|
7 |
Мембранні фосфоліпіди |
6,6 |
|
8 |
Кальцієвий обмін |
6,5 |
|
9 |
АОС |
5,42 |
|
10 |
Біосинтетичні процеси |
5,0 |
|
11 |
ІФ, гомогенат |
4,9 |
|
12 |
В-система імунітету |
2,8 |
Ступінь відхилення від норми показників цих систем майже в 4-5 разів перевищував пороговий рівень достовірності (t=2,0) Для інших систем визначені помірні відхилення –на рівні 2-3-кратного перевищення порогового значення t-критерію. Відносно низькі зміни відзначені в цілому для В- системи імунітету, хоча при цьому відхилення значень В-РОК і IgG перевищували пороговий рівень відповідно в 4,3 та 2,3 рази.
Одержані дані про патогенетичну ієрархію систем організму при експериментальному ГН являються принципово новими, не мають аналогів в літературі і являються основою для подальших наукових досліджень.
В зв’язку з тим, що важливим фактором в реалізації цілого ряду патологічних процесів при ГН є порушення структурно-функціональної організіції клітинних мембран і пов’язана з цим активация системи вторинних месенджерів, нами було досліджено вплив мембранотропного препарату глюкозаміну на перебіг експериментального аутоімунного ГН у щурів. Визначення еффективності терапії експериментального ГН глюкозаміном показало, що величина динаміки параметрів (t-критерію) під впливом лікування залежала від ступеню відхилення їх від норми. Практично, всі параметри, що мали найбільше відхилення від норми (А) зайняли ведуче місце у відношенні до ступеню нормалізації в процесі лікування глюкозаміном (Б). Дані рангової кореляції між параметрами в групах А і Б свідчать про наявність тісного кореляційного зв’язку (r=-0,89) відхилення признаку від норми і його динаміки під впливом лікування.
Для урахування ступеня відношення динаміки признаку по відношенню до величини його відхилення від норми, нами був використаний показник ефективності лікування (ПЕЛ).
Таблиця 3
Ефективність впливу глюкозаміну на системи організму при експериментальному ГН
|
№ п/п |
Параметри |
Середнє значення ПЕЛ |
|
1 |
Кальцієвий обмін |
1,32 |
|
2 |
ПОЛ |
0,98 |
|
3 |
ІФ, кров |
0,92 |
|
4 |
Енергетичний обмін |
0,89 |
|
5 |
Білоксинтетичні процеси |
0,85 |
|
6 |
ІФ, гомогенат |
0,8 |
|
7 |
Мембранні фосфоліпіди |
,76 |
|
8 |
АОС |
0,6 |
|
9 |
Протеолітична активність лейкоцитів |
0,56 |
|
10 |
Кінінова система |
0,51 |
|
11 |
В-система імунітету |
0,35 |
|
12 |
Т-система імунітету |
0,25 |
Визначення ПЕЛ у відношенні всіх систем показало, що найбільший терапевтичний ефект глюкозаміну виявлений для системи інозітолфосфатів, енергетичного і кальцієвого обміну, ПОЛ, білоксинтетичних процесів, мембранних фосфоліпідів. Помірний ефект виявлений у відношені кінінової системи, АОС, протеолітичної активності лейкоцитів. У відношенні показників Т-, В-ланок імунітету виявлений незначний терапевтичний ефект (табл.3).
Отже, ефект глюкозаміну направлений, головним чином, на нормалізацію регуляторно-енергетичних процесів.
Одержані експериментальні дані не мають аналогів у літературі і дають підставу рекомендувати даний препарат для лікування ГН.
Висновки
1. При ГН відзначаються значні зміни в системі вторинних месенджерів -збільшення рівню ІФ в крові і лімфоцитах хворих ХГН та крові і гомогенаті ниркової тканини щурів з експериментальним аутоімунним ГН, що свідчить про їх активну участь в механізмах розвитку та перебігу захворювання. При цьому, у хворих ХГН відзначається значне збільшення питомої ваги ІФ3 в лімфоцитах (53,8% проти 34,1%). В умовах експериментального ГН значна питома вага належить ІФ1 в гомогенаті ниркової тканини (55,8% проти 26,7%). Зміни в складі вторинних месенджерів ІФ можуть служити критерієм вираженості імунозапального процесу при ГН.
.В експериментальній частині роботи в умовах моделювання аутоімунного ГН у щурів одержані дані, що свідчать про тісний зв’язок між порушеннями структурно-функціональної організації клітинних мембран нирок та зміною складу ІФ і розвитком метаболічних, енергетичних порушень в крові та нирках щурів.
.Метаболізм інозітолфосфатів тісно пов’язаний з регуляцією внутрішньоклітинної концентрації кальцію, як за рахунок активації Са+2 транспортних каналів плазматичної мембрани, так і мембран внутрішніх кальцієвих депо. Тісний кореляційний зв’язок між збільшенням концентрації кальцію в гомогенаті ниркової тканини, зниженням активності Са+2, Mg+2 –АТФази і зміною рівня вторинних месенджерів підверджують участь ІФ в регуляції кальцієвого обміну при ГН.
.Інтегральна оцінка різних систем організму в патогенезі ГН показала, що найбільш значні зміни маються в системах: ПОЛ, Т-ланці імунітету, кініновій системі, протеолітичній активності лейкоцитів, рівню ІФ в крові, енергетичному обміні. Ступінь відхилення від норми показників цих систем майже в 4-5 разів перевищував пороговий рівень достовірності (t=2,0).
.Критерієм активності запального процесу в нирках при ГН служить підвищення активності ферментів КП-N та -ГТ в крові.
.Використання мембранотропного препарату глюкозаміну в лікуванні тварин з експериментальним аутоімунним ГН показало, що даний препарат выявляє нормалізуючий вплив на регуляторно-енергетичні процеси, що дозволяє рекомендувати проведення клінічних досліджень по використнню препарату в комплексному лікуванні хворих ГН.
Практичні рекомендації:
1. З метою покращення діагностики та прогнозування перебігу імунозапального процесу і контролю за ефективністю здійснюваної терапії до плану комплексного обстеження хворих ГН рекомендується включити визначення рівня інозітолфосфатів в плазмі крові і лімфоцитах.
. Як інформаційний тест, що дозволяє оцінити стан біосинтетичних та деструктивних процесів в нирках, рекомендується визначення у хворих ГН активності ферментів КП-N i -ГT.
.В зв`язку з тим, що при ГН відзначається посилення гідролізу мембранних фосфоліпідів, що супроводжується підвищенням рівня вторинних месенджерів, активацією процесів ПОЛ, які впливають на функцію мембранозв`язаних ферментів, іонотранспортні системи, а це, в свою чергу, призводить до порушень процесів фільтрації, реабсорбції в нирках, секреції гормонів та ін., являється важливим застосування в лікуванні хворих ГН сучасних препаратів, що мають мембраностабілізуючу та антиоксидантну дію.
. Позитивний вплив на перебіг експериментального ГН глюкозаміну (нормалізація процесів ПОЛ, активності АОС, покращення енергетичних, біосинтетичних процесів та ін.) дозволяє рекомендувати проведення клінічних досліджень препарату для лікування хворих на ГН.
Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації:
1. Козар В.В., Топчiй I.I. Спосiб диференцiйноi оцiнки впливу лiкарських препаратiв на органiзм людини // Патент на винахiд 22360 А вiд 28.03.1997р.
. Козарь В.В. Экспериментальное обоснование применения глюкозамина гидрохлорида в терапии гломерулонефрита. Сообщение1. Влияние на уровень инозитолфосфатов и показатели иммунного статуса при аутоиммунном гломерулонефрите у крыс // Фармаком.-1999.-№2.- С.65-68.
. Козарь В.В. Экспериментальное обоснование применения глюкозамина гидрохлорида в терапии гломерулонефрита. Сообщение 2. Влияние на показатели кининовой системы при аутоиммунном гломерулонефрите у крыс // Фармаком.-1999.-№5.- С.67-69.
. Козарь В.В., Горбач Т.В., Топчий И.И. Экспериментальное обоснование применения глюкозамина гидрохлорида в терапии гломерулонефрита. Сообщение 3. Влияние на фракционный состав липидов мембран почечных клеток, показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при аутоиммунном гломерулонефрите у крыс //Фармаком.-1999.-№6.- С.61-64.
. I.I.Topchy, T.V.Gorbach, V.V.Kozar. Phosphoinositide composition, the key-enzime of glikolisis and cycle Krebs activiti and eicosanoides biosyntesis limphocytes of glomerulonephritis patients during leucocytoplasmapheresis // School of Fundamental Medicine Journal.-1996.-V.2.-N1.-Р.42-45.
6. I.I.Topchy,T.V.Gorbach,V.V.Kozar. Changes of renal functional reserve, inositolphosphates and angiotensin - transforming peptidase composition in nephrogenic hypertensio patients with enalapril using //Аssisi, European Meeting on Cardionephrology.-1997.-N4.- Р.441-442.
.Топчий И.И., Козарь В.В., Горбач Т.В.. Влияние лейкоцитоплазмафереза на состав фосфоинозитоидов, активность ключевых ферментов гликолиза, цикла Кребса и синтез эйкозаноидов в лимфоцитах больных пиело- и гломерулонефритом //В кн.:Проблемы и перспективы развития клиники внутренних болезней.Сб.научн.труд.Харьков.-1996.-С.100-104.
8. Топчий И.И., Горбач Т.В., Козарь В.В. Влияние лейкоцитоплазмафереза на состав фосфоинозитидов, активность ферментов энергетического обмена и синтез эйкозаноидов в лимфоцитах больных нефрогенной гипертонией // В кн.:Нефрогенная гипертензия .Сборник научных трудов IY международной научно-практической конференции урологов и нефрологов.12-13 сентября 1996г. г.Харьков.-С.107-109.
9.Волос Б.Е., Топчiй I.I., Денисенко В.П., Снiгурська I.О., Козар В.В. Клiнiко-гемодинамiчнi та гуморальнi особливостi резистентностi артерiальноi гiпертонii, обумовленоi хронiчним пiелонефритом // Нирки та iнфекцiя: Матерiали науково-практ. конф., Iвано-Франкiвськ, 26-28 травня 1997 р.-С.77-78.
10. Topchy I.I., Gorbach T.V., Andryevsky G.V., Kozar V.V., Kolodub F.A. Fulerenes treatment in experimental glomerulonephritis therapy. //Abstracts XIVth International Congress of Nephrology. Sydney.-1997.-P.183.
11. Топчiй I.I., Горбач Т.В., Козарь В.В., Тiтова Т.А. Склад iнозiтолфосфатiв, активнiсть ферментiв глiколiзу i цикла Кребса при нефритi в експериментi та клihiцi // Матерiали XIV з`iзду терапевтiв. Украiна.Киiв.-1998.-С.517-518.
. Ж.Д.Семидоцька, О.С.Бiльченко, I.О.Чернякова, Т.С. Оспанова, О.I. Мiсюра, О.I.Ромаданова, В.В.Козар. Iнфекцiя, iмунiтет та перебiг гломерулонефриту // Матерiали XIV з`iзду терапевтiв. Украiна.Киiв.-1998.-С.513-515.
13.Topchy I.I., Gorbach T.VKozar V.V.The glukozamine treatment in the glomerulonephritis terapу // Abstracts XVth International Congress of Nephrology.Argentina.1999.-P.257.
14. Вплив глюкозаміну гідрохлориду на перебіг експериментального аутоімунного гломерулонефриту //Матеріали 13-ї Всеукраїнської конференції нефрологів,м.Харків.-1999р.-С.3-5.
гломерулонефрит,фосфоліпіди, інозітолфосфаті, імунітет, клітинний метаболізм, вільно-радикальне окислення ліпідів, лікування гломерулонефриту;
гломерулонефрит, фосфолипиды, инозитолфосфаты, иммунитет, клеточный метаболизм, свободно-радикальное окисление липидов, лечение гломерулонефрита;
glomerulonephritis; phospholipides; inozitolphosphates; immunity; cell metabolism; free radical etidation of lipids; treatment of glomerulonephritis;
Козар В.В. "Зміни складу інозітолфосфатів, клітинного метаболізму при гломерулонефриті в експерименті і клініці ".-Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.01.02. - внутрішні хвороби, Харківський державний медичний університет, Харків, 2000 р.
У роботі приведені результати досліджень зміни складу інозитолфосфатів, рівня обмінних, біосинтетичних процесів, імунного статусу при ГН в експерименті і клініці, а також оцінка впливу мембраностабілізуючої та антиоксидантної терапії на ці показники.
Встановлено, що зміни показників метаболічних процесів в крові і ниркової тканині, клітинної і гуморальної ланок імунітету мають тісні кореляційні зв'язки з гідролізом мембранних фосфоліпідів і підвищенням рівня інозітолфосфатів. Виявлено, що підвищення активності ферментів -ГТ, КП-N в крові має тісний зв’язок з підвищенням активності АСТ, АЛТ в гомогенаті нирковій тканині. Це свідчить на користь того, що зміни рівня інозитолфосфатів, активності -ГТ, КП-N є критеріями виразності імунозапального процесу при ГН.
Показана ефективність глюкозаміну гідрохлориду для нормалізації регуляторно-енергетичних процесів в крові і ниркової тканині, що дозволяє рекомендувати застосування даного препарату в комплексному лікуванні хворих на гломерулонефрит.
Ключові слова: гломерулонефрит, фосфоліпіди, інозитолфосфати, імунітет, клітинний метаболізм, вільно-радикальне окислення ліпідів, лікування гломерулонефриту.
Козарь В.В. “Изменения состава инозитолфосфатив, клеточного метаболизма при гломерулонефрите в эксперименте и клинике ”.-Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.02. –внутренние болезни, Харьковский государственный медицинский университет, Харьков, 2000 г.
В работе приведены результаты исследований изменений состава инозитолфосфатов, уровня обменных, биосинтетических процессов, иммунного статуса при ГН в эксперименте и клинике, а также оценка влияния мембраностабилизирующей и антиоксидантной терапии на эти показатели.
В ходе выполнения работы обследовано 120 больных, в том числе 88 больных ХГН и 42 больных ГБ. Контрольную группу составили 30 человек (доноры).
Эксперимент проводился на крысах-самцах линии Вистар, массой 150-170 г, возраст 3 месяца, которым вводилась кроличья антисыворотка. Моделирование ГН проводилось по методу, предложенному Д.С. Саркисову и П.И. Ремизову (1960 г.).
У больных и экспериментальных животных определяли состояние клеточного и гуморального иммунитета, кининовой системы, показатели ПОЛ, АОС, энергетических процессов, кальциевого обмена, уровня инозитолфосфатов. Исследовали показатели у больных в крови и лимфоцитах, у экспериментальных животных –в крови и гомогенате почечной ткани.
Как показали исследования, при ГН отмечается повышение уровня ИФ во всех исследуемых системах, по отношению к контрольным группам, здоровым лицам и интактным животным. Исключением является содержание ИФ2 в гомогенате почечной ткани, которое уменьшилось, по сравнению с контрольной группой, в 1,5 раза. При этом более значительный удельный вес имеет увеличение уровня ИФ3 (53,8% против 34,1%) в лимфоцитах больных и ИФ1 (55,8% против 26,7%) в гомогенате почечной ткани крыс, снижение удельного веса ИФ2 в лимфоцитах больных (23,7% против 32%) и гомогенате почечной ткани крыс (25,6% против 56,7%).
Установлено, что изменения метаболических процессов в крови и почечной ткани, иммунологических показателей имеют тесные корреляционные связи с гидролизом мембранных фосфолипидов и повышением уровня вторичных мессенджеров –инозитолфосфатов.
О преобладании деструктивных процессов в почках свидетельствует увеличение активности трансаминаз (АСТ, АЛТ) в почечной ткани, преобладание гликолитических процессов, снижение уровня АТФ, повышение уровня Са+2 , начальных и конечных продуктов ПОЛ. Все это сказывается на функции почек и приводит к усугублению патологического процесса. Повышение активности АСТ, АЛТ в почечной ткани коррелирует с повышением активности в крови γ-ГТ, КП-N. Всё это свидетельствует в пользу того, что изменения уровня
инозитолфосфатов, активности γ-ГТ, КП-N являются критериями выраженности иммуновоспалительного процесса при ГН.
В процессе лечения глюкозамином гидрохлоридом, обладающим мембраностабилизирующим и антиоксидантным действием, наибольший эффект выявлен для тех систем, которые имели наибольшее отклонение от нормы: ИФ, ПОЛ, энергетического и кальциевого обмена, мембранные ФЛ, белоксинтетические процессы. Умеренное лечебное действие обнаружено в отношении АОС, кининовой системы и протеолитической активности лейкоцитов. В отношении иммунологических показателей, выявлен незначительный терапевтический эффект. Следовательно, эффект препарата направлен на нормализацию регуляторно-энергетических процессов, проницаемости мембран. Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать глюкозамин для комплексного лечения больных ХГН.
Ключевые слова: гломерулонефрит, фосфолипиды, инозитолфосфаты, иммунитет, клеточный метаболизм, свободно-радикальное окисление липидов, лечение гломерулонефрита.
Kozar V.V. Changes of the inozitolphosphates, cell metabolism by glomerulonephritis in experiment and clinic.-Manuscript.
Thesis for competition of candidates degree of medicine according to the specialty 14.01.02 –Internal diseases. Kharkov State University of Medicine 2000.
Investigation results of changes of inozitolphosphates, level of metabolic, biosynthetic processes and structure, of the immune status by glomerulonephritis (GN) in experiment and clinic as well as an estimation of the influence of membrane stabilizing and anti-oxidant therapy on these indices have been given in the work.
If has been determined that changes of indices metabolic processes in blood and renal tissue, of the cell and humoral links of immunity have tight correlative links with hydrolysis of the membrane phospholipides and decrease of inozitolphosphates level.
If has been proved that the decrease of ferments γ -GT, KP-N activity in blood is bound up with the decrease of AST, ALT activity in the homogenate of renal tissue. This fact testifies to the changes of the inozitolphosphates level and activity of γ-GT, KP-N as criteria of manifestation of immune-inflammatory process by GN.
An effectiveness of glucosamine hydrochloride for normalization of the regulator-energetic processes in blood and renal tissue has been shown, that allows to recommend this preparation in complex treatment of patients with GN.
Key words: glomerulonephritis; phospholipides; inozitolphosphates; immunity; cell metabolism; free radical etidation of lipids; treatment of glomerulonephritis.