Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
16
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна
ВАДЗЮК ОЛЬГА БОГДАНІВНА
УДК 577.352
КІНЕТИЧНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ТРАНСПОРТУ ІОНІВ Са
В МІТОХОНДРІЯХ МІОМЕТРІЯ ТА ВПЛИВ КОФЕЇНУ
НА ЦЕЙ ПРОЦЕС
03.00.04 –біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2006
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Науковий керівник –доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України
КОСТЕРІН Сергій Олексійович,
завідувач відділу біохімії м’язів,
заступник директора з наукової роботи
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Офіційні оппоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
ЛІТОШЕНКО Олександр Якович,керівник лабораторії молекулярної генетики Інституту геронтології АМН України;
кандидат хімічних наук
АКОПОВА Ольга Валеріївна,
старший науковий співробітник
відділу фізіології кровообігу Інституту фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України.
Провідна установа –Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії
Захист відбудеться 25 вересня 2006 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна
НАНУ (01601, Київ, вул. Леонтовича, 9).
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В. Палладіна (Київ, вул. Леонтовича, 9).
Автореферат дисертації розісланий 23 серпня 2006 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Гладенькі м’язи відіграють суттєву роль у забезпеченні життєдіяльності організму. Серед гладеньком’язової мускулатури важливе значення має міометрій з огляду на функцію, яку він виконує в організмі при виношуванні плоду та пологах. Вважають, що виникнення різноманітних патологій репродуктивної функції (спонтанні аборти, гіпо- і гіпертонус матки тощо) пов’язане з порушенням гомеостазу іонів Са, яким, як відомо, належить фундаментальна роль у забезпеченні контролю скоротливої активності м’яза [Burdyga T., Wray S., 2002; Бабіч Л.Г., 1999].
Внутрішньоклітинний гомеостаз Са+ забезпечується узгодженим функціонуванням Са+-транспортуючих систем, локалізованих у мембранних структурах клітини [Bernardi P, 1999; Lee A.K, 2005]. Ідентифікація цих систем, вивчення їхніх властивостей, особливостей регуляції транспортної активності та фізіологічної ролі у кальцієвому гомеостазі має виключно важливе значення для розуміння іонних, молекулярних та мембранних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження в гладеньких м’язах [Kosterin S. et al, 1999; Kosterin S., 2003].
Серед субклітинних структур, що бeруть участь у внутрішньоклітинному гомеостазі Са+, важливу роль відіграють мітохондрії (МХ). Зокрема доведено, що вони здатні регулювати цитоплазматичну концентрацію іонів Са, підтримуючи постійну амплітуду її коливань [Grubelnik V. et al, 2002]. Участь МХ у внутрішньоклітинному гомеостазі Са+ обумовлюється їх переважним розміщенням у тих частинах клітини, де виникають локальні високі концентрації Са+, що необхідні для активації мітохондріального Са+-уніпортера - біля кальцієвих каналів ендо/саркоплазматичного ретикулуму (ЕР, СР) та плазматичної мембрани (ПМ) [Gunter E. et al, 2004; Rizutto R. et al, 2004].
Електрофоретична Mg+,АТР-залежна Са+-акумулююча система МХ характеризується високою швидкістю транспорту катіону, що разом із великою кальцієвою ємністю матриксу дозволяє цим субклітинним структурам накопичувати значну кількість Са+ за короткий проміжок часу [Коsterin S. et al, 1994; Bernardi P., 1999; Gunter E. et al, 2004;]. Ця динамічна властивість системи енергозалежного транспорту Са+ у МХ визначає їх особливу роль у регуляції гомеостазу цього катіону в цитоплазмі при різноманітних патологіях, що супроводжуються зростанням його концентрації в клітині [Ткачук В.А., 1999; Sward K., 2002].
Не дивлячись на те, що питання про роль МХ у підтримці внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са у гладеньких м’язах вже давно привертає увагу дослідників, ряд експериментальних задач потребують подальшого з’ясування. Так, важливим є дослідження динамічних закономірностей трансмембранного переносу іонів Са в МХ гладеньком’язових клітин, визначення кінетичних характеристик процесів активного та пасивного транспорту цих іонів у зазначених субклітинних структурах. Зокрема, мова йде про розрахунок такого важливого характеристичного параметру, як константа швидкості транспортного процесу k, яка не залежить від часу інкубації. З іншого боку, бракує інформації щодо закономірностей впливу різноманітних ефекторів, фізіологічно-активних та фармакологічних сполук на транспорт Са+ в МХ гладеньких м’язів.
Клінічні спостереження свідчать про розвиток кардіосудинної патології і порушень репродуктивної функції при зловживанні напоями, що містять алкалоїд кофеїн: зокрема, встановлено зв’язок між його вживанням та підвищеним ризиком спонтанного аборту [Fenster Z. et al 1998; Fernandes O. et al, 1998; Koren G., 2000]. Така дія кофеїну може бути обумовлена його впливом на скоротливу активність гладенької мускулатури [Burdyga T. et al, 1995]. Приймаючи до уваги провідну роль Са+ у розвитку процесу скорочення, вбачається корисним дослідити вплив даного алкалоїду на мембранозв’язані Са+-транспортуючі системи, що беруть участь у регуляції внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са у гладеньких м’язах. Зокрема, для розуміння біохімічних механізмів дії кофеїну доцільним є вивчення закономірностей впливу цієї сполуки на транспорт Са+ на рівні такої експериментальної моделі, як ізольовані субклітинні мембранні структури.
Добре відома здатність кофеїну індукувати викид іонів Са через ріанодин-, кофеїн-чутливі канали ЕР/СР [Yaras N., 2005]. На скелетних м’язах було продемонстровано не тільки вивільнення Са+ із ретикулуму під дією кофеїну, але й пригнічення його акумуляції у внутрішньоклітинних кальцієвих депо та внаслідок цього стимуляцію м’язового скорочення Bassani R.A. et al, 1992. Втім, у ряді робіт були наведені переконливі докази, що кофеїн викликає ряд порушень функціонування МХ (пригнічення дихання, руйнування структури внутрішньої мембрани) та безпосередньо впливає на гомеостаз Са+ у клітинах [Bruyere H. et al, 1988; Sardao V. et al, 2002]. У літературі існують експериментальні дані щодо впливу кофеїну на структурно-функціональні властивості МХ кардіоміоцитів. Мова йде за порушення структури крист, пригнічення здатності МХ окислювати сукцинат Bruyere H. et al, 1988. На кардіоміоцитах щурів було показано індукцію під дією кофеїну т. зв. мітохондріальної пори перехідної проникності (permeability transition pore, РТР) Sardao V. et al, 2002. Але вцілому дані щодо мембранних механізмів дії кофеїну, зокрема на гладенькі м’язи, в тому числі на міометрій, потребують подальшого дослідження. У статтях клінічного профілю неодноразово відмічалась залежність між вживанням вагітними кофеїну у високих концентраціях та підвищеним ризиком спонтанного аборту [Fenster Z. et al 1998; Fernandes O. et al, 1998; Koren G., 2000].
Втім, дані щодо впливу кофеїну на транспорт Са+ в ізольованих МХ гладеньком’язових клітин практично відсутні. Зокрема, для виявлення можливої ролі цього алкалоїду в індукції РТР у МХ міометрію вбачається корисним дослідити сукупну дію кофеїну та інгібітора РТР циклоспорину А (ЦсА) [Betandier C. et al, 2004] на транспорт Са+ у даних субклітинних структурах.
Отже, дослідження кінетичних властивостей трансмембранного обміну Са+ у МХ міометрія, вивчення чутливості цього процесу до дії кофеїну є важливим для подальшого розвитку сучасних уявлень щодо іонних та мембранних механізмів контролю скоротливої функції матки.
Проте, необхідно відзначити, що прогрес у вивченні цих механізмів потребує вдосконалення експериментальних методів реєстрації не лише динаміки трансмембранного обміну іонів Са, але й змін у концентраціях реагентів - компонентів середовища інкубації, перш за все –АТР. На теперішній час серед розповсюджених методів визначення концентрації АТР найбільш відомим є спектрофлуориметричний метод з використанням ферменту люциферази у присутності молекулярного кисню. Даний спосіб є незручним, тому що вимагає створення спеціальних умов для проведення аналізу та наявності дорогого ферменту люциферази [T. Sakakibara, et al, 1999]. Тому перспективною є розробка нових методів, перш за все, флуоресцентних, визначення вмісту зазначеного нуклеозидтрифосфату як у водних розчинах, так і безпосередньо у МХ. Такий метод може бути корисним для подальшого вивчення спряження транспорту іонів Са з енергетичними перетвореннями, що відбуваються в цих субклітинних структурах.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії м’язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (зав. –член-кор. НАН України, докт. біол.наук, професор Костерін С.О.), проблема “Біохімія тварин та людини”, тема № 5, № 0199И000270 “Вивчення біохімічних механізмів електро- та фармакомеханічного спряження у гладеньких м’язах та ролі систем енергозалежного транспорту Са+ у забезпеченні цього процесу (І кв. 1999 - ІV кв. 2003); тема № 5, № 0104И003281 “Вивчення властивостей та регуляції АТР-залежних кальцієвих помп мембранних структур гладеньких м’язів” (І кв. 2004 - ІV кв. 2008).
Мета роботи: дослідити кінетичні закономірності трансмембранного обміну іонів Са в МХ матки щурів, його чутливість до дії кофеїну.
Головні задачі:
Об’єкт дослідження - МХ гладеньком’язових клітин.
Предмет дослідження –активний та пасивний транспорт Са+ у МХ міометрія.
Методи дослідження –лазерна кореляційна спектрометрія (ЛКС), спектрофотометрія, флуоресцентна спектрофотометрія, методи ензимології, біохімічної мембранології, хімічної та біохімічної кінетики, статистичного аналізу.
Наукова новизна одержаних результатів. У дослідах, виконаних на фракції МХ міометрія щурів, доведено, що протонофор- та азид-чутлива складові збільшення флуоресцентного сигналу тетрацикліну (ТЦ), які не залежать від наявності тапсигаргіну, віддзеркалюють Mg+,АТР-залежну оборотну акумуляцію іонів Са у цих субклітинних структурах. Вперше в термінах константи швидкості транспортного процесу k досліджено кінетику акумуляції іонів Са у МХ гладенького м’яза матки, продемонстровано, що цей процес задовольняє закономірностям хімічної реакції першого порядку, (k = (4,8 ± 0,7)x10-2 с-1). Протонофор СССР та азид здатні викликати пасивне вивільнення іонів Са із МХ за умов попереднього накопичення цього катіону в них; при цьому дія протонофору була більш ефективною, ніж дія азиду. Для константи швидкості транспортного процесу k є властивою куполоподібна залежність від концентрації Mg+ (оптимальна величина –- 5 мМ). Транспортний процес характеризується абсолютною специфічністю щодо АТР та залежністю константи швидкості від концентрації цього нуклеозидтрифосфату, але практично не є чутливим до присутності сукцинату. Кофеїн дозозалежно гальмує акумуляцію іонів Са (константа інгібування І.5 становить 10,4 ± 1,8 мМ) та Н+-АТРазну активність в МХ. Інгібуючий вплив кофеїну на накопичення іонів Са виявляється як у зменшенні його платового (у часі) значення, так і у зменшенні кінетичних параметрів транспортного процесу –початкової швидкості V та константи швидкості k накопичення Са+. Кофеїн пригнічує накопичення Са+ навіть за умов попередньої його дії на МХ в режимі, коли Са+-уніпортер не функціонує. Ця сполука стимулює пасивний вихід Са+ з мітохондріального матриксу у середовище за умов попереднього навантаження ними МХ.
ЦсА (5 мкМ) стимулює акумуляцію іонів Са в МХ міометрія приблизно на 30 %, але не впливає на індуковане азидом пасивне вивільнення Са+ з них. На фоні інгібуючої дії кофеїну на накопичення іонів Са ЦсА не стимулює цей процес.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблено та апробовано в дослідах експериментальний підхід до вивчення активного та пасивного транспорту іонів Са в МХ міометрія, який грунтується на реєстрації чутливої до дії протонофору, кальцієвого іонофору та азиду, але резистентної до дії тапсигаргіну Mg+,АТР-залежної флуоресцентної відповіді ТЦ. Результати щодо дії кофеїну на трансмембранний обмін іонів Са в ізольованих МХ можуть бути корисними для подальшого дослідження мембранних механізмів впливу цього алкалоїду на електро- та фармакомеханічне спряження в гладеньких м’язах. Розроблено флуоресцентний метод визначення концентрації АТР у водних розчинах, на який отримано патент N 75448 “Спосіб флуориметричного визначення аденозин-5-трифосфату (АТР) у розчині”
Особистий внесок здобувача. Дисертантка особисто одержувала фракцію МХ міометрія, підбирала умови для роботи з флуоресцентним зондом ТЦ, проводила досліди по вивченню акумуляції іонів Са в цих субклітинних структурах із використанням методу флуоресцентної спектроскопії, безпосередньо проводила кінетичний та статистичний аналіз фактичних результатів, аналіз та узагальнення літературних даних. У співпраці з к.х.н. Пивоваренком В.Г. розробила метод флуориметричного визначення концентрації АТР у водних розчинах.
Головна ідея та задачі дослідження були сформульовані науковим керівником –член-кор. НАН України проф. Костеріним С.О. З ним разом було проведено аналіз власних експериментальних результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків роботи.
Всі розділи та автореферат дисертації написані дисертанткою самостійно.
Апробація результатів дослідження. Результати досліджень, що викладено в дисертації, були заслухані та обговорені на таких наукових конференція та симпозіумах: конференція молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”, Київ, Інституту біохімії НАНУ (2003); школа-конференція молодих вчених “Биология –наука 21 века”, Пущино, Росія (2003); 2ий Міжнародний симпозіум “Фізіологія та біофізика гладеньких м’язів”, Київ, Україна (2003); Конгрес Федерації Європейських Біохімічних Товариств, Варшава, Польща (2004); Парнасівська польсько-українська конференція з біохімії, Київ (2005), конкурс на здобуття стипендій імені видатних вчених, Інституту біохімії НАНУ (2005); загальноінститутські семінари та засідання Вченої Ради Інституту біохімії НАНУ (2001 –). Результати експериментів неодноразово доповідались на наукових семінарах відділу біохімії м’язів Інституту біохімії НАНУ (2001 –).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та 5 тез доповідей у матеріалах міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій. Отримано патент N 75448 UA, 7МПК, GO 21/64, GO1N 33/52, C07D 311/30, C07D221/06. Спосіб флуориметричного визначення концентрації аденозин-5’-трифосфату (АТР) у розчині
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 146 сторінках машинописного тексту і складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, “Результати та їх обговорення”, “Заключний розділ”, “Висновки” та “Список використаних джерел”, який містить 218 посилань. Робота ілюстрована 53 рисунками та однією таблицею.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури складається з двох розділів. Перший розділ присвячений загальним уявленням щодо молекулярних та мембранних механізмів транспорту іонів Са в МХ. Розглянуто системи активного та пасивного транспорту Са+ у цих субклітинних структурах, модуляцію їх активності фізіологічно-активними та фармакологічними речовинами, функціональну роль, деякі особливості транспорту Са+ в МХ гладеньких м’язів. У другому розділі розглянуто вплив кофеїну на різноманітні біохімічні процеси в клітині, особливий акцент зроблено на дослідженні ефекту кофеїну на внутрішньоклітинний гомеостаз іонів Са, зокрема - на дії алкалоїду на транспорт іонів Са у МХ гладеньких м’язів. Окрему увагу присвячено ролі кофеїну у виникненні репродуктивних патологій.
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Фракцію МХ міометрія невагітних щурів, естрогенізованих за добу до експерименту, одержували шляхом двох послідовних центрифугувань при 1000 та 12000 g у середовищі інкубації, що містило 10 мМ HEPES (рН 7,4), 250 мМ сахарозу, 1 мМ ЕДТА. Осад ресуспендували у середовищі інкубації без ЕДТА.
Функціональну активність електрофоретичної Mg+,АТР-залежної Са+-транспортуючої системи МХ міометрія тестували в експериментах, що були виконані на фракції цих субклітинних структур, за допомою спектрофлуориметричного методу з використанням Са+-чутливого зонду ТЦ (на приладах Hitachi MPF-4 (Японія), Signe-4 (Латвія), а також методом ЛКС (використовували прилад “ZetaSizer-3” Malvern Instrument (Великобританія). Контролем слугувало середовище інкубації з 10 мМ NaN або 1 мкМ СССР. Транспортний процес тестували як збільшення флуоресцентного сигналу ТЦ, яке гальмувалось у присутності NaN чи СССР, але було резистентним до наявності селективного інгібітора кальцієвої помпи ЕР/СР тапсигаргіну (0.1 мкМ).
Активність мітохондріальної Mg+-залежної АТР-гідролази визначали спектрофотометрично, реєструючи процес гідролізу АТР по накопиченню Рі. При цьому контролем на неферментативний гідроліз АТР слугувало стандартне середовище інкубації, що не містило МХ.
Транспорт іонів Са у МХ міометрія вивчали за допомогою Са+-чутливого зонду ТЦ методом флуоресцентної спектрофотометрії (умови проведення процесу - див. розділ “Результати та їх обговорення”). Акумуляцію Са+ ініціювали внесенням аліквоти суспензії МХ у стандартне середовище інкубації, що містило (мМ): 10 HEPES (рН 7,4), 3 MgCl, 0.01 CaCl, 3 АТР, 3 сукцинат, 0.01 ТЦ; температура 37 С.
У дослідах з використанням різноманітних ефекторів (Са+-іонофор А-23187, протонофор СССР, кофеїн, ЦсА) ці речовини вносились також у контрольну кювету (із 10 мМ NaN) у відповідній концентрації.
При дослідженні дії кофеїну на транспорт Са+ у МХ попередньо було показано що дана сполука у використаних концентраціях (5 –мМ) не впливає на рН середовища та практично не впливає на флуоресцентні властивості ТЦ. Досліди по вивченню впливу кофеїну на Mg+,АТР-залежну акумуляцію іонів Са проводили у стандартному середовищі інкубації (див. вище), у якому попередньо розчиняли цю сполуку до потрібної концентрації (5 –мМ). У дослідах з вивчення дії кофеїну у випадку його попередньої інкубації з МХ аліквоту суспензії цих субклітинних структур (об’єм 20 - 40 мкл) інкубували з 10 мМ кофеїном протягом 2 хв. за умов, які унеможливлювали транспортний процес (тобто за відсутності Mg+, Ca+ та АТР). При цьому кінцева концентрація мітохондріального білка після розведення у досліджуваному об’ємі становила 0,2 мг/мл, а концентрація кофеїну –.3 –.6 мМ. Транспортний процес у обох випадках ініціювали внесенням у середовище аліквоти суспензії МХ.
У дослідженні впливу кофеїну на пасивний вихід іонів Са з матриксу МХ кофеїн попередньо розчиняли у робочому буфері до концентрації 0.3 М. Аліквоту концентрованого розчину кофеїну об’ємом 50 –мкл вносили у середовище інкубації (1,5 мл), що містило МХ, на 2 –хвилині інкубації разом із азидом натрію. Кінцеві концентрації речовин після розведення становили: кофеїну ––мМ, азиду натрію –мМ. У контрольні проби, які попередньо містили 10 мМ азид, також додавали азид та кофеїн у відповідних концентраціях у відповідний проміжок часу (на 2-3 хв. від моменту внесення МХ).
Концентрацію АТР у водному розчині визначали за допомогою флуоресцентного зонду 3-гідрокси-4’диметиламінофлавону (3ГАФ), який було синтезовано на кафедрі органічної хімії хімічного факультету Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка та надано доцентом к.х.н. Пивоваренком В.Г.
Експериментальні дані були оброблені із застосуванням загальноприйнятих методів кінетичного аналізу із використанням програми Microcal Origin 5.0. При визначенні кінетичних параметрів аналізували саме азидчутливу компоненту флуоресцентної відповіді ТЦ. При аналізі кінетичних кривих у термінах необоротної хімічної реакції першогопорядку типові значення коефіцієнту кореляції r становили 0,95 –,99.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
1.Підбір умов застосування ТЦ до реєстрації акумуляції іонів Са в МХ міометрія та вивчення кінетичних властивостей цього процесу. За даними ЛКС, збільшення ефективного діаметру МХ у середовищі інкубації, в якому відбувається акумуляція іонів Са, по відношенню до МХ у середовищі, яке не містить Са+ або містить 10 мМ NaN, свідчить про те, що у випадку акумуляції Са+ відбувається набухання МХ внаслідок накопичення в них води. Внесення аліквоти суспензії МХ міометрія (кінцева концентрація - 100 мкг білка/мл) у стандартне середовище інкубації (див. “Методи досліджень”) індукувало збільшення флуоресцентної відповіді Са+-чутливого зонду ТЦ; ця відповідь монотонно прогресувала у часі до стаціонарного значення, яке встановлювалось приблизно на 2 хв. інкубації (рис.1 та 2 А, графік 1). Ефектори, що спричиняють дисипацію мембранного потенціалу - азид натрію (10 мМ) чи СССР (1 мкМ), додані у середовище інкубації перед внесенням суспензії МХ, гальмували збільшення флуоресцентного сигналу (рис. 1 та 2 А, графік 2). У подальших дослідженнях використовували саме азид- або СССР-чутливу компоненту флуоресцентної відповіді ТЦ (рис. 2, графік 3). Як можна бачити із рис.2, чутливе до дії СССР збільшення флуоресцентної відповіді ТЦ відповідає закономірностям хімічної реакції першого порядку: маємо висококорелятивну лінеаризацію зростання СССР-чутливої флуоресцентної відповіді у часі у напівлогарифмічних координатах ln [( Imax –I)/Imax]; t (коефіцієнт кореляції r = 0.98 –.99). Константа швидкості збільшення флуоресцентного сигналу, яку розраховували за величиною тангенса кута нахилу лінійного графіку, становить (4,8 + 0,7) x10-2 с-1, а початкова швидкість V –,8 + 0,6 у.о./с (n = 8) (рис. 2).
Як вказують наші дані, речовини, що спричиняють диссипацію Δмн+ на мітохондріальній мембрані, також викликають падіння флуоресценції Са+-чутливого зонду за умов транзитного внесення їх у середовище інкубації. Імпульсне внесення у стандартне середовище інкубації 1мкМ СССР (рис.3, А) або 10 мМ азиду натрію (рис.4, А) на платовому значенні інтенсивності флуоресценції зонду після ініціації транспортного процесу викликає падіння флуоресцентного сигналу ТЦ. Аналіз кінетичних параметрів зменшення флуоресцентної відповіді вказує на те, що протонофор СССР індукує більш швидке її падіння, ніж азид натрію (рис. 3, Б; 4, Б). Дійсно, значення константи швидкості k для СССР- індукованого зменшення сигналу ТЦ в два рази перевищує значення цього параметру для азид-індукованого: (8,6 ± 0,9) x 10-2 с-1 та (3,8 ± 0,2) x 10-2 с-1 відповідно. Значення початкової швидкості для СССР- та NaN-індукованого падіння флуоресценції ТЦ становлять 8.6 ± 0.9 та 2.32 ± 0.6 у.о./c відповідно (n=3).
Виявилось, що імпульсне додавання у середовище інкубації 0,2 мкМ Са+-іонофору А-23187 також індукувало падіння флуоресцентного сигналу ТЦ. Ми продемонстрували також, що СССР- та NaN-чутливі складові флуоресцентної відповіді ТЦ за умов моделювання акумуляції іонів Са в МХ міометрія є нечутливими до дії тапсигаргіну (0,1 мкМ) –селективного інгібітора ЕР/СР.
Отже, вищенаведені дані (рис. 1 - 4) вказують на те, що чутливе до гальмуючої дії протонофору СССР та азиду натрію, але резистентне до дії тапсигаргіну Mg+,АТР-залежне оборотне збільшення флуоресцентного сигналу ТЦ віддзеркалює акумуляцію іонів Са в ізольованих МХ міометрія. Фактори дисипації мітохондріального мембранного потенціалу –протонофор СССР, азид, а також кальцієвий іонофор А-23187 індукують падіння флуоресцентної відповіді зонду, і, відповідно, вивільнення іонів Са з МХ міометрія.
З літератури відомо, що іони Mg є ефекторами Са+-уніпортеру МХ багатьох тканин [Bernardi P. et al, 1999]. Тому важливим є дослідження закономірностей впливу цих іонів на кінетику акумуляції Са+. За нашими даними, залежність константи швидкості k накопичення іонів Са в МХ міометрія від концентрації Mg+ має куполоподібний характер: при відсутності іонів Мg у середовищі інкубації акумуляція Са+ у МХ не відбувається зовсім, а із збільшенням концентрації Mg+ до 5 мМ значення k зростає; але подальше збільшення концентрації Mg+ до 10 мМ призводить до повного гальмування накопичення іонів Са (рис.5).
Оскільки Са+-акумулююча система МХ міометрія характеризується абсолютною субстратною специфічністю до АТР [Kosterin et al, 1994], то важливим є дослідження концентраційної залежності впливу цього нуклеозидтрифосфату на накопичення іонів Са МХ (рис. 6). У відсутності АТР у середовищі інкубації транспортний процес не відбувався зовсім. Із зростанням концентрації АТР від 0 до 3 мМ значення константи (k) акумуляції іонів Са збільшувалось.
Відсутність сукцинату, на відміну від АТР, суттєво не позначилась на кінетичних параметрах транспорту Са+. Так, в присутності 3 мМ сукцинату значення константи швидкості транспортного процесу становило (4,0 ± 0,4) x10-2 с-1, тоді як при мінімальній концентрації сукцинату - 30 мкМ, значення k зменшилось лише до (3,7 ± 0,2) x10-2 с-1 .
Отже, нами доведено, що Mg+,АТР –залежна СССР- та азид-чутлива, але нечутлива до дії тапсигаргіну зміна інтенсивності флуоресценції Са+- чутливого зонду ТЦ у середовищі інкубації, що містить МХ міометрію, віддзеркалює акумуляцію іонів Са у цих субклітинних структурах (рис. 1 –). Показано, що ефектори, які дисипують мембранний потенціал на внутрішній мітохондріальній мембрані (протонофор, азид натрію), а також кальцієвий іонофор А-23187 не тільки пригнічують флуоресцентний сигнал ТЦ (рис.1, 2), але й індукують його падіння (рис. 3, 4). Накопичення іонів Са у МХ міометрія є практично нечутливим до присутності сукцинату, але суттєво чутливим до зміни концентрації іонів Mg та АТР у середовищі інкубації (рис. 5, 6).
2. Дослідження впливу кофеїну на системи активного та пасивного транспорту іонів Са в МХ міометрія. У дослідах, виконаних на МХ печінкита серцевогом’яза було показано пригнічення клітинного дихання та акумуляції Са+, продемонстровано зміну структури внутрішньої мітохондріальної мембрани та індукцію РТР під дією кофеїну [Bruyere H et al, 1988; de la Cruz M. Et al, 1988; Sardao V. et al, 2002]. Приймаючи до уваги, що цей алкалоїд здатен змінювати структурно-функціональні властивості МХ, на другому етапі наших досліджень ми вивчили кінетичні закономірності впливу даної речовини на транспорт іонів Са в МХ міометрія. Ми знайшли, що внесення у стандартне середовище інкубації (див. “Методи досліджень”) кофеїну у концентрації 5, 10, 15 та 20 мМ призводило до прогресуючого, в залежності від концентрації цієї речовини, гальмування Mg+,АТР-залежного накопичення іонів Са відносно контрольної кінетичної кривої. Кофеїн не тільки дозозалежно зменшує платовий рівень накопичення Са+ у МХ (рис. 7, А, криві 1 - 3), його вплив виявляється також і у зниженні такого кінетичного параметру, як константа швидкості k (рис. 7, Б): значення kза наявності 20 мМ кофеїну дорівнює (2,1 + 0,4) x10-2 с-1, тоді як у стандартному середовищі інкубації (без кофеїну) значення k становило (4,5 + 0,3) x10-2 с-1. Таким чином, ця величина у середньому в 2 рази менша, ніж у контролі. Константа інгібування кофеїном транспорту Са+ у МХ (І0.5) становить 10.41 1.81 мМ (n = 7), (рис. 7, Б)
Як виявилось, інгібуюча дія кофеїну на накопичення іонів Са має місце і за умов його попередньої інкубації із фракцією МХ (рис. 8). Так, при попередній інкубації аліквоти суспензії МХ (20 - 40 мкл) з 10 мМ кофеїном протягом 2-х хвилин за умов, що унеможливлюють акумуляцію Са+ у МХ (відсутність АТР, іонів Mg та Са), та наступного розведення аліквоти у стандартному середовищі інкубації (залишкові концентрації кофеїну після розведення становили 0,3 - 0,6 мМ) спостерігалось зниження як платового (у часі) рівня накопичення іонів Са (рис. 8, А, криві 1 - 3), так і величини константи швидкості k цього процесу (рис. 8, Б) відносно контрольних кривих, одержаних у випадку непреінкубованих МХ у стандартному середовищі інкубації та у середовищі інкубації, що містило 0,6 мМ кофеїн. Значення константи швидкості k накопичення Са+ для контрольних умов, тобто у стандартному середовищі інкубації та у середовищі, що містило 0.6 мМ кофеїн, становили (4,4 ±0,2)x10-2 с-1, (рис.8, Б, графік 1) та (4,1 ± 0,3)x10-2 с-1 (рис. 8, Б, графік 2) відповідно (n = 4). Тоді, як величина k для процессу накопичення Са+ преінкубованими МХ знизилась до (1,4 ± 0,1) x10-2 с-1 (рис. 8, Б, графік 3). Отже, можна припустити, що мішенню інгібуючої дії кофеїну на транспорт Са+ в МХ не є уніпортер. Скоріш за все під дією алкалоїду збільшується проникність внутрішньої мітохондріальної мембрани для Са+. Дійсно, як виявилось, кофеїн активує індукований азидомазидом натрію (10 мМ) пасивний вихід іонів Са з мітохондріального матриксу, (рис. 9, А). Транзитне додавання азиду разом з 20 мМ кофеїном викликає швидке і практично повне вивільнення іонів Са, флуоресцентна відповідь ТЦ при цьому спадає майже до нульових значень (рис. 9, А, крива 2). Можна бачити, що кофеїн впливає на кінетичні параметри азид-індукованого виходу іонів Са з МХ (рис. 9, Б): значення константи швидкості k виходу іонів Са із МХ за наявності 20 мМ кофеїну дорівнює (5,8 + 0,5) x 10-2 с-1 (рис. 9, Б, графік 2). Ця величина у середньому в 1,5 рази більша, ніж у контролі: значення константи виходу Са+ у відсутності кофеїну становило (3,8 + 0,3) x10-2 сек-1 (n = 6) (рис. 9, Б, графік 1).
Треба відзначити, що у наших дослідах, виконаних разом з к.б.н. Г.В. Данилович, було показано, що кофеїн у концентрації 5 –мМ інгібує Н+-АТРазу мітохондрій міометрія, яка, як відомо, бере участь у створенні мітохондріального мембранного потенціалу [Литошенко А.Я., 2001].Тому не можна виключати і того, що свій внесок у зменшення накопичення іонів Са у МХ може робити і гальмування кофеїном активності Н+-АТРази.
З літературних даних відомо, що кофеїн індукує мітохондріальну пору перехідної проникності у кардіоміоцитах, пригнічуючи накопичення іонів Са+ у МХ цих клітин [Sardao V. et al, 2002]. Тому для дослідження можливої участі кофеїну в індукції РТР у МХ міометрію ми вивчали сукупний вплив кофеїну та інгібітора РТР ЦсА. Ми знайшли, що додавання 5 мкМ ЦсА в стандартне середовище інкубації, що містить МХ міометрію, забезпечує невелике, у середньому на 25 - 30 %, збільшення платового рівня акумуляції іонів Са відносно контрольної величини (рис.10). В той же час, ЦсА (50 мкМ), доданий у середовище інкубації, не впливає на пасивний вихід іонів Са, що був викликаний додаванням NaN(рис.11). За умов сукупної присутності ЦсА (5 мкМ) та кофеїну (20 мМ) у середовищі інкубації інгібуючий ефект кофеїну на накопичення Са+ не зникає, але спостерігається відсутність активуючої дії ЦсА на цей процес (рис. 12). Інгібування накопичення Са+ на 30 - 35 % відносно контрольних умов (k = (4,8 ± 0,7)x10-2 с-1 та вповільнення кінетики цього процесу відбувається під дією кофеїну як у відсутності ЦсА (k = 2,1 ± 0,1)x10-2 с-1) (рис. 12 А, Б, крива 2), так і за його присутності (k = (4,8 ± 0,7)x10-2 с-1) (рис. 12 А, Б, крива 3).
Таким чином, наші дані (рис.12) свідчать, що гальмуюча дія кофеїну на накопичення Са+ у МХ міометрія запобігає стимулюючому ефекту ЦсА на цей процес. Оскільки гальмуючий ефект кофеїну на накопичення Са+ у МХ міометрія спостерігається також і в присутності ЦсА, то можна припустити, що у механізмі цього ефекту не задіяна індукція РТР.
Отже, на підставі аналізу наведених вище даних (рис. 7 –), можна стверджувати, що інгібуюча дія кофеїну на акумуляцію іонів Са в МХ міометрію виявляється не через безпосередній вплив на уніпортер, але, скоріше за все, шляхом порушення бар’єрної функції внутрішньої мітохондріальної мембрани щодо іонів Са, що і спричиняє стимуляцію їх пасивного вивільнення (рис. 9). Але таке порушення бар’єрної функції мембрани не пов’язане із активацією РТР, оскільки інгібітор пори ЦсА не виявляє ніякого ефекту на виникнення цього порушення.
3. Розробка флуоресцентного методу визначення концентрації АТР у водних розчинах. Прогрес у вивченні кінетичних та енергетичних аспектів трансмембранного обміну іонів Са потребує вдосконалення експериментальних методів реєстрації змін у концентраціях компонентів середовища інкубації, перш за все АТР. Відсутність зручного флуоресцентного методу кількісного визначення АТР спонукала нас до пошуку зонду, який би у простих умовах взаємодіяв із цим нуклеозидтрифосфатом, змінюючи при цьому свої флуориметричні характеристики, що дало б можливість визначати концентрацію АТР. Такий зонд –-гідрокси-4-диметиламінофлавон (3ГАФ) було синтезовано доцентом кафедри органічної хімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка Пивоваренком В.Г.
Смуга збудження флуоресценції 3ГАФ у водному розчині знаходиться на 405 нм. Нами вперше було показано, що при взаємодії даного зонду з АТР відбувається зсув цієї смуги до 475-480 нм, що свідчить про утворення стабільного комплексу між 3ГАФ та АТР. Положення максимуму випромінювання флуоресценції при цьому не змінюється. Цей ефект є високоспецифічним для АТР і не відтворюється у присутності інших нуклеозидфосфатів, за виключенням ІТФ. Збільшення концентрації АТР у середовищі інкубації призводить до збільшення концентрації комплексу 3ГАФ-АТР, та відповідно, до зростання інтенсивності випромінювання флуоресценції при збудженні на 480 нм. Цей ефект був використаний нами для розробки методу кількісного визначення АТР у водному розчині. Для побудови калібровальної кривої використовували водний розчин (I), що містив 250 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES (рН 7,4) та 5 мкМ зонду 3ГАФ та розчин (II), що містив 250 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 5 мкМ зонду 3ГАФ і 40 мМ АТР. Задану концентрацію у аналітичному розчині (III) отримували шляхом додавання до 1,5 мл розчину (I) аліквоти розчину (II). Після цього реєстрували спектри емісії флуоресценції 3 ГАФ у розчині (III).
Інтенсивність емісії флуоресценції вимірювали на довжині хвилі 540 нм. Числові дані відношення інтенсивностей емісії при збудженні на 480 нм та 405 нм (I/I) наносили на графік. Як можна бачити з рис.14, в діапазоні концентрацій 10-4 –x10-3 маємо лінійну залежність відносного параметра I/Iвід lg [АТР], що дає можливість використовувати зазначену лінійність у якості калібровочного графіку.Похибка методу становить не більше 10 %.
Отже, розроблений нами метод можна використовувати для визначення концентрації АТР у водному розчині.
ВИСНОВКИ
ПЕРЕЛІК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
АНОТАЦІЯ
Вадзюк О.Б. Кінетика транспорту іонів Са у мітохондріях матки щурів та вплив кофеїну на цей процес.- Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 –біохімія. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2006.
Дисертація присвячена вивченню кінетичних властивостей транспорту іонів Са у мітохондріях міометрія. З використанням методу флуоресцентної спектроскопії вперше в термінах константи швидкості транспортного процесу k досліджено кінетику акумуляції іонів Са у мітохондріях гладенького м’яза матки, продемонстровано, що цей процес задовольняє закономірностям хімічної реакції першого порядку, k = (4,8 ± 0,7)x10-2 с-1. Протонофор СССР та азид здатні викликати пасивне вивільнення іонів Са із мітохондрій за умов попереднього накопичення цього катіону в них. Для константи швидкості транспортного процесу k є властивою куполоподібна залежність від концентрації Mg+ (оптимальна величина –- 5 мМ). Транспортний процес характеризується абсолютною специфічністю щодо АТР та залежністю константи швидкості від концентрації цього нуклеозидтрифосфату, але практично не є чутливим до присутності сукцинату. Кофеїн дозозалежно гальмує акумуляцію іонів Са (константа інгібування І.5 становить 10,4 ± 1,8 мМ) та стимулює пасивний вихід Са+ з мітохондріального матриксу у середовище за умов попереднього навантаження ними мітохондрій. Також показано інгібування Н+-АТРазної активності в мітохондріях під дією кофеїну.
Циклоспорин А (5 мкМ) стимулює акумуляцію іонів Са в МХ міометрія приблизно на 30 %, але не впливає на індуковане азидом пасивне вивільнення Са+ з них. На фоні інгібуючої дії кофеїну на накопичення іонів Са циклоспорин А не стимулює цей процес.
В ході виконання роботи був розроблений флуоресцентний метод визначення концентрації АТР у водних розчинах.
Отримані в роботі дані можуть бути корисними для подальшого дослідження мембранних механізмів, що задіяні у регуляції концентрації Са+ у гладеньких м’язах, ролі мітохондрій у забезпеченні електро- та фармакомеханічного спряження в гладеньких м’язах.
Ключові слова: транспорт іонів Са, мітохондрії, міометрій, кофеїн
АННОТАЦИЯ
Вадзюк О.Б. Кинетика транспорта ионов Са в митохондриях матки крыс и влияние кофеина на этот процесс.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 –биохимия. Институт биохимии им. О.В. Палладина НАН Украини, Киев, 2006.
Диссертация посвящена изучению кинетики транспорта ионов Са в митохондриях миометрия. С использованием метода флуоресцентной спектроскопии впервые в терминах константы скорости транспортного процесса исследована кинетика аккумуляции Са+ в митохондриях гладкой мышци матки, продемонстрировано, что этот процесс удовлетворяет закономерностям химической реакции первого порядка, (k = (4,8 ± 0,7)x10-2 с-1). Протонофор СССР и азид индуцируют пассивное освобождение предварительно накопленных ионов Са. Действие протонофора более выраженно, чем в случае азида –константа освобождения ионов Са под влиянием СССР составляет (8,6 ± 0,9)x10-2 с-1, тогда как для азида - (3,8 ± 0,2)x10-2 с-1 Для константы скорости транспортного процесса характерна колообразная зависимость от концентрации Mg+ (оптимальная величина –- 5 мМ). Транспортный процесс характеризуется абсолютной специфичностью к АТР и зависимостью константы скорости от концентрации этого нуклеозидтрифосфата, но практически не чувствителен к присутствию сукцината.
Кофеин дозозависимо ингибирует аккумуляцию ионов Са (константа ингибирования I,5 составляет 10,4 ± 1,8 мМ) и Н+-АТРазную активность в митохондриях. Ингибирующее влияние кофеина на накопление Са+ проявляется как в уменьшении его платового (во времени) значения, так и в уменьшении кинетических параметров транспортного процесса –начальной скорости V и константы скорости k накопления Са+. Кофеин угнетает накопление Са+ в митохондриях миометрия также и в условиях преинкубации с ним фракции этих субклеточных структур, в режиме, при котором Са+-унипортер не функционирует. Кофеин стимулирует пассивний выход предварительно накопленных ионов Са из митохондриального матрикса в среду.
Циклоспорин А (5 мкМ) стимулирует аккумуляцию ионов Са в митохондрии миометрия приблизительно на 30 %, но не влияет на индуцированный азидом пассивный выход Са+ из них. Стимулирующее влияние циклоспорина А на накопление ионов Са не проявляется в присутствии кофеина, но ингибирующее влияние кофеина остается.
В ходе выполнения дисертации был разработан флуоресцентный метод определения концентрации АТР в водном растворе.
Полученные данные могут быть полезными для дальнейшего исследования мембранных механизмов, задействованных в регуляции концентрации Са+ в гладких мышцах, роли митохондрий в обеспечении электро- и фармако-механического сопряжения в гладких мышцах.
Ключевые слова: транспорт ионов Са, митохондрии, миометрий, кофеин.
SUMMARY
Vadzyuk O.B. Kinetic regularity of the transport of Ca+ in mitochondria of the myometrium and the influence of caffeine on this process.- Manuscript.
PhD thesis on obtaining the scientific degree of PhD (Biology) ву the speciality 03.00.04 –biochemistry. O.V. Palladin Institute of Biochemistry of NAS of Ukraine, Kyiv, 2006.
Dissertation is devoted to the study of kinetic properties of Ca+ transport in the mitochondria of uterus. Using method of fluorescence spectrofotometry kinetics of the Ca+ accumulation in mitochondria of uterus was tested in term of the rate constant of the transport of Ca+. It was shown, that this process fits to the regularity of the first order chemical reaction (k = (4,8 ± 0,7)x10-2 s-1). Protonophore CCCP and sodium azide induced passive efflux of Ca ions. Rate constant of the transport of Ca+ bell-shaped depends on the concentration of Mg ions (optimal value is 3 –mM). Transport of Ca ions has absolute specificity to ATP and its constant depends on the concentration of this nucleosidethreephosphate in the concentration-depend manner, but is not sensitive to succinate.
Caffeine inhibits accumulation of Ca+ in dose-dependent manner (constant of inhibition I,5 is 10,4 ± 1,8 mМ) and enchances the passive efflux of Сa ions. Also inhibition of the mitochondrial Н+-АТPase by this substance was shown.
Cyclosporin A (5mcM) enchances accumulation of Ca ions to the mitochondrial matrix to the value of 30 %, but does not influence on the passive efflux of Ca+.
In the case of simultaneous presence of caffeine (10 mM) and cyclosporin A (5 mcM), stimulating effect of cyclosporin does not reveal, but inhibitory action of caffeine insists.
Data obtained in this study would be usefull for further investigation of the membrane mechanisms, which regulate concentartion of Ca+ in smooth muscles, for better understanding of the role of mitochondria in this process and the influence of caffeine on the electro-and pharmacomechanical coupling in smooth muscles.
New fluorometric method for quantitative detection of ATP in water solution was work out.
Key words: transport Ca ions, mitochondria, myometrium, caffein.