Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
КАРТИРОВАНИЕ ЦИСТЕИНОВОГО ПРОТЕОМА: АНАЛИЗ РЕДОКС-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ТИОЛОВ
Цистеиновый протеом включает 214,000 остатков цистеина в тиольной или других формах. Относительно мало функций клеточной сигнализации по сравнению с большим количеством координирующих функций в ответ на редокс состояние. Первые-это редокс-сигнализирующие тиолы, последние определяются как редокс-чувствительные тиолы. Масса размеров не очень информативна для системной биологии, т.к. реакционность тиолов в белках варьируется в семи соответствующих значениях. Базы данных белков содержат данные о цистеине, например, дисульфиды и цинк, но не включают количественную информацию, необходимую для развития функциональной модели. Дополнительные базы данных и карты цистеинового протеома нуждаются в объяснении тиол-редокс цикла и объединения этого с функциональными редокс-зависимыми путями. Статья суммирует достижения в количественной редокс-протеомике, способствующей развитию таких карт.
Введение
Окислительно-восстановительные системы являются значительной областью исследования, потому что ключевой сигнал механизмов трансдукции это редокс-чувствительность, а новые omics интрументы обеспечивают мощные средства для изучения глобальных системных реакций. Однако, несмотря на значительные достижения в специфических областях, таких как идентификация белков на основе проведения нитрозилирования, глутатионилирования, электрофильного присоединения и устойчивого окисления, возможности привести эти данные в систему ограничены из-за всеобъемлющей комплексности цистеинового протеома.
Это может быть существенно упрощено, если функциональный цистеиновый протеом будет ограничен мелкими фракциями в 214,000 остатков цистеина, зашифрованных в человеческом геноме. Однако, подтверждение основывается на противоположном заключении – большинство остатков цистеина функциональны. Содержание цистеина увеличивалось с развитием комплексности, от 0,41% до 2,26% от всех закодированных аминокислот. Часть их подлежит возрастанию в стабильной структуре, такой как дисульфид и цинк содержащих сайтах, общий рост в содержании консервативного сохраненного цистеина предполагает эволюцию функций цистеина в клеточной регуляции. Такая эволюция подтверждена изучением химии белков, что показало, что остатки цистеина варьируются в семи соответствующих значениях при взаимодействии с перекисью водорода. Большинство цистеинов представлены в последовательностях, содержащих проксимальные катионоактивные аминокислоты, которые увеличивают реакционную способность цистеина. Кроме того, разнообразие в ковалентных модификациях (глутатионилирование, нитрозилирование, цистеинилирование, сульфгидрирование и ацилирование), которые происходят в клетке, показывают, что свойства цистеина используются для разнообразных функций. Эта статья охватывает недавние достижения в редокс-биологии и сфокусирована на количественном определении окисления цистеина в клетках и использовании этой информации для картирования цистеинового протеома. Результаты указывают, что сбор быстро накапливающихся данных о функциональных свойствах отдельных цистеинов в цистеиновом протеоме будет существенно улучшать возможности развития редокс-системы биологии для всех 214,000 остатков цистеина.
Редокс-чувствительные тиолы
Открытие редокс-сигнализируюих NADPH-оксидаз привлекло значительное внимание к остаткам цистеина в белке, которые функционируют как сульфидные переключатели. Схема редокс-сигнализирующих тиолов сложна, потому что специфичность в таких сигнализирующих механизмов встречается через локальную окислительную стадию. Активация экзогенных оксидантов часто нуждается в оксидантах, полученных при неспецифическом окислении остатков цистеина. К сожалению, эксперименты с неспецифическим окислением остатков обеспечивают малую механистическую поддержку для специфических сигнализирующих взаимодействий, когда тысячи цистеинов одновременно подвергаются окислению и восстановлению без высокореакционных белковых цепей.
Дополнительная сложность в идентификации редокс-сигнализирующих тиолов в том, что некоторые белки, содержащие остатки цистеина, регуляторные, не определяющие активность, но воздействующие на активность при окислении или восстановлении. Это может быть рассмотрено не определяющим, потому что устранение сайт-ориентированных мутагенов не устраняет активность. Например, человеческий Trx1 содержит C32,35 мотивы в активных сайтах, необходимые для активации, и дополнительные C62, C69, и C73 остатки, которые могут быть замещены без потери ферментативной активности. Химические преобразования C73 изменяют взаимодействие с целевыми субстратами и окисление C62,69 изменяет восстановление Trx редуктазами. Следовательно, редокс-чувствительные тиолы, являющиеся обязательными элементами при сигнализировании, отличаются от редокс-чустчительных тиолов, которые участвуют в регулировании и координации клеточных функций, но не являются обязательным элементов в этих механизмах. В настоящее время, только небольшое количество цистеинов может ясно продемонстрировать функции в редокс сигнализировании, тогда как большее число проявляется в редокс чувствительности.
Несколько методов используются для идентификации тиолов, чувствительных к окислению и вероятно ограниченных чувствительностью к методам сепарации и детекции. Иммунологические методы, включая 1D и 2D гель электрфорез, часто более чувствительны к определенному количеству изменений в специфических белках, но недостаточно способны к изучению специфических остатков цистеина. Следовательно, тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) все чаще используется для изучения специфических остатков цистеина в белках. Хотя некоторые из этих исследований критичны в виду того, что высоко уровневые окислители обуславливают неспецифическое окисление, более умеренные условия окисления, такие ишемическая реперфузия в сердце, также показывают белковое окисление. Исследования, использующие MS/MS методы последовательно показывают окисление специфических остатков цистеина в белках всех субклеточных компартментов и их функции, включая цитоскелетные белки, такие как актин, миозин, тубулин, виметин, профилин и кофилин; шапероны, такие как белки теплового шока; рибосомальные белки, такие как факторы инициации, элонгации; протеолитические белки такие как убиквитин соединенный с ферментами; транпортеры, такие как аденин нуклеотид транслоказа; ферменты, такие как глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, пироксидоксидаза, дисульфид изомераза, циклофилина, супероксид дисмутаза и изоцтрат дегидрогеназа.
Исследование различных модификаций цистеина, например, глутатионилирование, окислительный кросслинкинг, нитрозилирование и сульфирования также показывают аналогичные большие спектры цистеиновых остатков в различных белках. Однако Leonard с коллегами сравнил белки после сульфирования с другими модификациями и нашел относительно мало совпадений, около 20-40%. Результаты предполагают вероятность того, что модификации не просто влияют на реакционную способность цистеина, а и то, что различные модификации цистеина обеспечивают биологические важные переключения функций. Например, нитрозилирование C118 Ras может иметь иное биологическое значение, чем глутатионилирование этого остатка. Это позволяет отдельные остатки цистеина использовать как переключатель биологических функций, а также как клапан для контроля биологических функций. Таким образом, количество модификаций цистеина и комплексность различных модификаций усложняет понимание при отсутствии систематических средств исследований. Это подчеркивает необходимость в комплексных базах данных модификаций цистеина. В частности, качественная информация, доступная сейчас в UniProt и других базах, должна быть заменена количественными данными, что позволит выяснить и истолковать функциональные связи.
Частичное восстановление редокс-чувствительных тиолов
Мы сфокусировали внимание на развитии количественных методов измерения частичного восстановления цистеина в биологических системах как средства обнаружения последствий экзогенного воздействия. Первоначальным мотивирующим фактором было желание определить, действительно ли окислительные процессы старения и связанные с возрастом болезни усугубляются этими проблемами. Поскольку механизмы окислительно-восстановительной сигнализации являются частью нормальной физиологии, нарушения окислительно-восстановительного сигнализации и контроля лежат в основе экзогенных механизмов заболевания. Если продолжающееся окисление в клетке имеет функцию передачи сигнала и контроля, то специфические цистеины, которые окисляются в специфических условиях, должны представлять наиболее чувствительные тиолы в цистеиновом протеоме. Результаты этих исследований удивили, т.к. они показали, что большое количество белков имело цистеиновые остатки, частично окисленные в течение функционирования нормальной клетки и, следовательно, устойчивых к мягким стрессорным факторам.
Устойчивые уровни окисления цистеина оцениваются при помощи Изотопных аффинных меток (ICAT) с протоколом последовательной обработки. Реагенты ICAT являются биотин-содержащими, связанными с тиол-реакционным иодацетамидом. Две формы, тяжелая (H) и легкая (L), отличаются по молекулярной массе из-за наличия девяти атомов 13C в H-ICAT, а в L-ICAT 12C. По маркировке клеток и тканей, экстрагированных с H-ICAT, с последующим удалением избытка реагентов, редукцией и обработкой L-ICAT, можно получить оценку частичного восстановления специфических остатков цистеина в отдельных белках с использованием протеомных методов, основанных на масс-спектрометрии (Рисунок 1а).
Этот подход имеет преимущество перед количественными протеомными методами, которые сочетают примеры измерения отличий, т.к. это позволяет избежать возможного неверного результата из-за изменения относительного содержания белка путем протеолиза или белкового синтеза. Таким образом, частичное восстановление специфических цистеинов в белке в определенной ткани и их состояние может быть включено в таблицы данных для сравнения с другими предыдущими измерениями цистеинов (Рисунок 1b). Общая информация такого типа позволит картировать цистеин в соответствии с редокс-чувствительностью(Рисунок 1с). Такой анализ не дает информации относительно форм цистеина, то есть является ли этот дисульфид с GSH (глутатион) свободным цистеином или измененным каким-либо способом, но предоставляет информацию о балансе тиольных и нетиольных форм.
Кинетические ограничения: неравновесные устойчивые состояния редокс-чувствительных тиолов
В химии доминируют быстрые реакции. В биологии, однако, самая медленная реакция определяет скорость всего метаболизма. Более медленные реакции особенно важны в биологической регуляции, и это представляет собой серьезную задачу о связывании химии тиолов и биологии окислительно-восстановительных реакций в описаниях цистеинового протеома. С точки зрения общих взглядов на окислительные стрессорные факторы, восстановление-это хорошо, а окисление-это плохо. Биологические системы эволюционировали так, чтобы сохранять систему восстановления несмотря на аэробные условия, и многие клетки имеют большую способность к восстановлению H2O2, чем O2. Таким образом, телеология говорит нам, что цистеиновый протеом должен сохраняться в полностью восстановленном состоянии для здоровья системы. Однако, ошибочность этого утверждения была доказана несколько десятилетий назад.
GSH является одним из основных тиоловых антиоксидантов и часто характеризуется как “окислительно-восстановительный буфер” для сохранения восстановленного состояния белков. Sies и Summer в 1975 году показали, что окислетильно-восстановительный потенциал для пары GSH / GSSG (глутатион/глутатиондисульфид) в печени(около -255 мВ) был более положителен (окислен), чем значение для пары NADPH/NADP (-405 мВ). Они пришли к выводу, что это было результатом кинетического ограничения GSSG редуктазы из-за относительно высокого значения Км для GSSG. Данные показывают, что концентрация GSSG в печени в пять раз выше, чем это могло бы быть, если бы реакция была в равновесии с NADPH/NADP+. Значения Eh для тиоредоксина-1 (Trx1; -270 mV) и тиоредоксина-2 (Trx2; -350 mV) также смещены от соответствующих значений NADPH / NADP+ в цитоплазме, ядре и митохондрии. Хотя и значения отличаются, общее состоит в том, что тиольные/дисульфидные пары сохраняются при кинетически-контролируемых, неравновесных условиях, то есть vокисления = vвосстановления . Эти результаты показывают, что при аэробных условиях значительные темпы тиольного окисления белка продолжаются.
Степень окисления любого цистеина определяется относительными скоростями окисления и восстановления в контексте реакционной способности, концентрации и распределения других 214,000 цистеинов и эффективности GSH, Trx1 и Trx2 антиоксидантов, которые защищают цистеиновый протеом. Антиоксиданты защищают двумя способами: вытесняя окислители и восстанавливая окисленные остатки (Рисунок 2а). Например, быстрое восстановление Н2О2 пероксиредоксином (Prx) и GSH пероксидазой (Gpx) сохраняет концентрацию Н2О2 в наномолярном диапазоне, тем самым защищая белки от окисления. Кинетические модели, включающие GSH пероксидазы, пероксиредоксины и окисление белков являются доступными. Легко увидеть, что вовлечение отдельных белков может быть сделано путем включения частичного восстановления, которое будет зависеть от индивидуальных норм окисления и восстановления (Рисунок 2а). Поскольку GSH и Trx системы регулируются независимо, они могут контролировать различные цистеиновые протеомы.
Результаты измерений окисления белков были получены разнообразными методами, но несмотря на обширные исследования, все еще относительно мало информации, чтобы описать окислительно- восстановительные схемы, контролирующие отдельные остатки цистеина. Метаболизм Trx зависит от Trx-редуктаз, но и другие системы могут также этому способствовать, Trx-восстановление поддерживается добавлением siРНК для уменьшения TrxR. Trx восстанавливает многие белки, и есть сведения, что белки посредники участвуют в восстановлении. Например, Abate и коллеги показали, что восстановление AP-1 - Trx1-зависимо, но требует окислительно-восстановительного фактора-1 (Ref-1; эндонуклеазы) в качестве посредника носителей электронов. Подобные пути были обнаружены для других факторов транскрипции. Кроме того, тионин, металл-свободная форма металлотионина, функционирует как восстановитель для метионин сульфоксид редуктазы. Другие редокс-активные белки участвуют в секреции, митохондриальном импорте белков, эндоцитозе, рецепции при активации тромбоцитов, окислительно-восстановительном ремоделировании в иммунорегуляции. Многообразие этих систем показывает сложность окислительно-восстановительных реакций, контролирующих цистеиновый протеом.
Применение окислительно-восстановительных вестерн подходов к последовательности NADPH→тиоредоксин редуктаза-1→ Trx1→ редокс фактор-1→ p50 (NF-kB) в карциноме толстой кишки HT29 также показывает, что кинетические ограничения могут осуществляться в несколько шагов в тиольной окислительно-восстановительной цепи. Подобные кинетические ограничения наблюдались для митохондриальной последовательности от NADPH→тиоредоксин редуктаза-2→ Trx2→ Prx3. Ввиду того, что существует вероятность разветвления в цепях (например, TRX1 восстанавливает более одного белка и Ref-1 восстанавливает более, чем один фактор транскрипции), окислительно-восстановительные системы будут вероятно непрерывно взаимосвязаны. В то время как обобщение небольшого числа примеров может быть рискованным, они являются наиболее активными тиольными редокс-системами в клетке. Следовательно, ограничения скорости восстановления в рамках переноса электронов предполагает, что кинетические ограничения -это общая характеристика взаимодействий цистеинового протеома.
Исследования частичного восстановления белков в культивируемых эндотелиальных клетках подтверждают этот вывод, показывая, что сотни белковых цистеиновых остатков не полностью восстанавливаются. Частичное восстановление обнаруженных при методе редокс-ICAT белков в среднем 85-90%. Хотя окисление или восстановление может произойти и во время отбора и анализа проб, независимые редокс вестерн-блот исследования с более строгим контролем подтверждают эти данные. Результаты показывают, что несмотря на эффективность GSH-зависимых и Trx-зависимых систем восстановления, большая часть цистеинового протеома не находится в полностью восстановленном состоянии в клетках.
Тиольные редокс карты
Попытка объединить принципы Рисунка 2а представляет собой интересную дилемму. Сетевая модель содержит ядра и узлы, определяющиеся числом и силой взаимодействий компонентов. Узлы- это компоненты с разнообразными взаимодействиями, а ядра -это центральные компоненты, соединяющие узлы. Биологические сети имеют безмасштабные характеристики, это означает, что количество соединений/узлов не увеличивается с увеличением числа компонентов в системе (Рисунок 2b). Модули организованы в иерархическую структуру так, что более крупные субъединицы менее сплочены, число и степень кластеризации следуют постепенно (Рисунок 2b). Это определенно отличается от организации на Рисунке 2а, которая основана на сведениях о двух основных тиоловых антиоксидантных системах. Таким образом, внимание к быстрым окислительно-восстановительным реакциям, которые зависят от тиоредоксинов и GSH, возможно, привело к неправильной интерпретации структуры тиольных окислительно-восстановительных цепей. Вместо двух параллельных GSH-зависимых и Trx-зависимых систем, которые непосредственно контролируют частичное восстановление цистеиновых остатков в белках, GSH и Trx могут быть компонентами иерархической системы, в которой цепи гораздо более взаимосвязаны. В такой сети быстро взаимодействующие тиолы формируют модули, то есть частичное восстановление тиолов будет определяться взаимодействием с несколькими белками и только косвенно контролироваться Trx или GSH.
Это изображено как гипотетическая модель на Рисунке 2с, где Trx-редуктазы-1 (TrxR1) представлены в виде ядер и Trx1 является одним из проксимальных узлов. Trx1 обеспечивает восстановление факторов транскрипции с помощью окислительно-восстановительного фактора-1 (Ref-1), как правило, изображается в виде линий. Тем не менее, во взаимосвязанных сетях, особенно для окислительно-восстановительных реакций с низкой специфичностью, возможны разнообразные взаимодействия. Таким образом, модульные структуры, содержащие разнообразные взаимодействия, могут обеспечивать лучшее представление тиольных окислительно-восстановительных цепей, чем обычное отображение биохомических реакций. Довольно быстрые реакции, катализируемые Trx и глутатредоксином (Grx) возможно привели к неправильной интерпретации структуры окислительно-восстановительных систем, то есть как параллельных, линейных цепей вместо иерархических сетей. Исследования кинетики Trx-катализируемых и Grx-катализируемых реакций с различными белками показали значительные различия скоростей реакций, соответствующее иерархической безмасштабной структуре. Хотя, может показаться, это противоречит биохимическим данным, но возможность включения в сеть зависит не только от реакционной способности, но и от концентрации реагентов и геометрических ограничений. Таким образом, иерархическое описание в целом верно, даже если это так не кажется с точки зрения энзимологии. Это подчеркивает необходимость в проведении исследований для определения схемы передачи электронов, то есть схемы окислительно-восстановительных реакций, контролирующих цистеиновый протеом, чтобы понять организацию окислительно-восстановительной сети.
Хотя это еще не достигнуто, такой анализ должен быть с частичным восстановлением данных (Рисунок 1b), используя такие программы, как Modulated Modularity Clustering (MMC). Это программное обеспечение было разработано для оценки взаимодействия транскриптомов. Ко-регулируемые гены могут быть идентифицированы, и взаимодействия второго порядка также могут быть определены (Рисунок 3). Применение этого подхода к редокс протеомическим данным может обеспечить полезной информацией о структуре тиольных окислительно-восстановительных цепей, детально показывая ко-регулируемые модули цистеиновых остатков в протеоме (Рисунок 2а) или малые ко-регулируемые модули и взаимодействия более высокого порядка (Рисунок 2с).
Функциональные карты окислительно-восстановительных реакций
Второй тип окислительно-восстановительных карт основан на анализах. Они используются для идентификации редокс-зависимых систем, например, путем измерения изменений в мРНК при окислении. Такие связи основаны на степени изменений в мРНК и не требуют знаний отдельных окислительно-восстановительных аспектов тиолов, что важно механистически.
Функциональный анализ также может быть осуществлен с помощью количественных окислительно-восстановительных протеомических данных, таких как на Рисунке 1b. В принципе, можно использовать этот подход, чтобы соединить некоторые окислительно-восстановительные изменения цистеинов белка с генной экспрессией. Можно разработать функциональные редокс карты с окислительно-восстановительными протеомическим данными, используя те же инструменты анализа, как и Ingenuity Pathway Analysis, которые используются для данных генной экспрессии. Анализированные данные показывают, являются ли белки с более окисленным или восстановленным цистеином ассоциированными. Таким образом, частичное восстановление белков может быть использовано для идентификации механизмов, связанных с окислительно-восстановительными реакциями.
Функциональный анализ окислительно-восстановительных реакций способствует пониманию механистической связи между окислением плазмы, где окислительно-восстановительный потенциал определяется концентрацией окисленных и восстановленных цистеинов (EhCySS), воспалительной сигнализацией, неблагоприятными сердечно-сосудистыми заболеваниями. Например, окисление внеклеточной EhCySS вызвало окисление белков, связанных со структурой клетки, и гибель клетки (Рисунок 4а). Удивительно, но окисление остатков цистеина в пяти субъединицах NADH дегидрогиназы (Комплекс-1) (Рисунок 4b), соответствующее митохондриальное окисление Trx2 и увеличение скорости окисления, как измерено с помощью MitoSox, способствует активации NF-kB и Nrf2. Аналогичные результаты были получены при совмещении исследований окислительно-восстановительной протеомики и генной экспрессии в моноцитных клетках человека THP-1.
Функциональные редокс- карты, созданные без сведений о механистических связях, могут быть использованы с редокс-данными протеомики для создания пробных механизмов. Например, функциональные ответные механизмы могут ассоциироваться вместе, т.к. два различных белка имеют сходную окислительно-восстановительную зависимость, или экспрессия двух различных генов контролируется одним редокс-зависимым фактором транскрипции. Функциональные карты могут быть использованы с редокс-картами для экспериментов по отделению этих механизмов. Следует отметить, что лишь небольшая часть цистеинового протеома определяется методами масс-спектрометрии, так что необходимо увеличение охвата и объединение с молекулярными и иммунологическими методами для точной модели развития. Широкая применимость связи химии цистеиновых остатков и функций целостной системы подчеркивает значение баз данных редокс систем и карт цистеинового протеома.
Проблемы картирования цистеинового протеома
Аналитические инструменты, опирающиеся на методы масс-спектрометрии, сейчас доступны для осуществления скорого прогресса в картировании цистеинового протеома. Особое значение окислительных механизмов во многих хронических заболеваниях, поражающих большинство органов и систем служит обоснованием систематических попыток использования этих методов для развития количественных данных цистеинового протеома и карт для поддержания редокс систем биологии. При планировании таких попыток необходимо обязательно включить полный спектр реакционных свойств цистеина, таких как глутатионилирование, нитрозилирование и других модификаций. В настоящее время существует малая возможность осуществления модификаций одного и того же цистеина; однако такие возможности появляются для исследований, в которых некоторые модификации (окисление бензола или ацетоминофена) одного цистеина (С34 в альбумине или Сb93 в гемоглобине) используются для идентификации подверженности к химическому воздействию. Связывание данных реакционной способности, таких, которые обеспечиваются систематическим сравнением малемида и йодацетамида, будет поддерживать химико-биологический интерфейс, который в настоящий момент отсутствует.
Для оценки полноты цистеинового протеома необходимо понять воздействие цистеина с высокой и низкой реакционной способностью. Значительное внимание было уделено окислению цистеинового протеома перекисью водорода. Однако белковые тиолы могут быть окислены и другими соединениями, включая эндопероксиды и хиноны, окислителем, заслуживающим особое внимание, является цистин (CySS). CySS медленно реагирует с GSH; но многие остатки цистеина более реакционней. Поглощение CySS карциномой толстой кишки HT29 было измерено и составило 0,7 нмоль / мин на 106 клеток. Скорость поглощения кислорода этими клетками около 2 нмоль O2/мин на 106 клеток. Если это предполагает, что только 1 % О2 превращается в Н2О2, то скорость вырабатывания H2O2 (0,02 нмоль / мин) является только частью скорости поглощения CySS (0,7 нмоль / мин). Поскольку CySS редуктаза не известна и только определенная ферментативная активность способствует восстановлению CySS в клетках млекопитающих, существует вероятность, что восстановление CySS способствует устойчивому окислению белков клетки. Cys/CySS трансфер участвует в регулировании внеклеточных запасов тиолов/дисульфидов. Этот трансферный механизм также может обеспечить механизм поддержания внутриклеточного окислительно-восстановительного равновесия белков, т.е. устойчивую скорость окисления для балансирования с продолжающимся восстановлением.
Альтернативная возможность объяснить поддержание белков с точки зрения неравновесного, кинетически-контролируемого устойчивого окисления, включает псевдооксидазную и/или псевдопероксидазную активность белков. Достаточно медленную окислительную и перикисную активность можно обосновать псевдооксидазной и псевдопероксидазной активностью, т.к. скорости реакций и специфичность реагентов более похожи на химические реакции, чем на ферментативные. Такие реакции могут зависеть от таких металлов как Cu2 + и Fe3 +. Например, Cu2 + может катализировать окисление тиолов в присутствии O2. Восстановление тиола с помощью Trx или GSH завершает цикл псевдо-оксидазы. Эта реакция затем может быть сопряжена с реакциями псевдо-пероксидазы.
При низких скоростях окисления цистеинового протеома, где продолжается выделение перекиси водорода, такую последовательность реакций трудно подтвердить или опровергнуть. Более ранние исследования показали, что выделение перекиси водорода растет пропорционально поглощению O2 и окисление белков зависит от содержания железа и меди в клетке. Следовательно, для разработки редокс карт цистеинового протеома, необходима дополнительная информация о влиянии реакций цистеинов, скоростей медленных биологических реакций, такая, которая будет соответствующим образом интерпретировать скорости реакций в биологических моделях.
Выводы и заключения
Наличие геномной информации, методов масс-спектрометрии, инструментов анализа создало возможность для картирования цистеинового протеома. Можно определить редокс-чувствительные тиолы и химические свойства тиолов 214,000 цистеинов, закодированных в геноме. Частичное восстановление около 1 % цистеинового протеома может быть определено за один эксперимент. Поскольку эта информация является безразмерной, полученные данные различных видов клеток, органов, видов, могут быть легко объединены в общие базы данных. Такие базы данных могут быть использованы для соединения микро констант скоростей определенных тиолов с их устойчивым восстановленим in vivo. В то же время, применение биоинформатики к значению устойчивого восстановления цистеиновых остатков, полученных при разных экспериментальных и физиологических условиях, может поддержать развитие функциональных карт, соединяющих цистеиновый протеом с интегрированным функционирующим организмом.
Хотя возможности будут лучше реализованы комплексным, системным подходом, некоторые методы могут быть использованы отдельными исследователями для полного понимания редокс биологии. Один из типов организации окислительно-восстановительного механизма является перенос электрона от NADPH (или NADH) к акцептору электронов (H2O2). Другой тип организационной структуры включает ассоциацию редокс-чувствительных цистеинов с функциональными механизмами. Только небольшая часть окислительно-восстановительных тиолов и механизмов уже определена.
Основные проблемы и задачи развития биологии окислительно-восстановительных систем включают неполное понимание редокс структуры и влияния цистеинов, которые резко отличаются в реакционной способности. Текущие данные поддерживают существование GSH и Trx систем как параллельных механизмов, но иерархические безмасштабные системы прдполагают лучшее описание метаболических систем и являются более стабильными. Таким образом, существует возможность того, что цистеиновый протеом существует как безмасштабная сеть, но это не является распознанным из-за компонентов с большими константами скоростей. Другие задачи заключаются в том, чтобы убедится, что количество Н2О2 играет важную роль в поддержании окисления-восстановления остатков цистеина; другие акцепторы электронов, такие как CySS также могут выполнять эту роль. Наконец, существует необходимость оценить роль механизмов переключения, зависимых от модификаций цистеина. Глутатионилирование, сульфиование, ацилирование, нитрозилирование, цистеинилизирование и сульфгидрирование теоретически могут происходить с одним цистеином, но продуцировать качественно разные сигналы. Разработка баз данных, содержащих количественные окислительно-восстановительные протеомические данные для различных модификаций, должна расширить возможности картирования цистеинового протеома. Это может стать бесценным источником для исследований механизмов сложных заболеваний, а также обеспечить основу для системной терапии.