Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
7. Суспензионная культура способы получения и культивирования
Суспензионные культуры - отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.
Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.
Признаком "хорошей" линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования. Морфологические характеристики такой линии:
высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);
морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);
отсутствие трахеидоподобных элементов.
Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на качалке, имеющей скорость перемешивания 100 - 120 об/мин. При первом переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и крупные агрегаты, фильтруя через 1 - 2 слоя марли, нейлоновые сита, шприц с соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной культуры необходимо 2 - 3 г свежей массы каллусной культуры на 60 - 100 мл жидкой питательной среды. Однако для каждой линии культуры клеток существует минимальный объем инокулята, при меньшем размере которого культура не растет.
Для глубинного культивирования растительных клеток применимы способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем культивирования: открытую и закрытую.
Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания.
Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеточной массы.
Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т.д. Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования. При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость.
Для культивирования суспензий в производственных масштабах применяется аппаратура, разработанная для микробиологической промышленности, однако исследования последних лет показали, что растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования. Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий и грибов, кроме того, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Если в начале экспоненциальной фазы роста они мелкие и плотные, то в стационарной фазе роста они сильно увеличиваются в размерах и вакуолизируются. Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. В то же время клетки растений, крупные и тяжелые, требуют эффективного перемешивания. Оседание их приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток. Для культуры клеток женьшеня отрицательное влияние механического стресса при выращивании в ферментере с турбинными мешалками сказывалось на жизнеспособности клеток уже при скоростях мешалок свыше 100—350 об/мин, это отрицательно влияло на синтез ими антрахинонов. Устойчивость штамма к механическому стрессу является важным требованием к культуре и трудной задачей для исследователей.
Мягкое перемешивание и аэрацию обеспечивает пневматический способ перемешивания потоком сжатого стерильного воздуха, подаваемого в ферментер с восходящим током воздуха. К сожалению, и этот способ имеет свой недостаток, потому что в культуральной среде возникает избыток воздуха, приводящий к кислородному голоданию. От концентрации кислорода в среде зависят рост и вторичный метаболизм клеток. В микробиологических системах изучена взаимозависимость роста биомассы, выхода искомого продукта и снабжения кислородом. Для растений таких данных нет.
На рост клеток, кроме кислорода, могут влиять и другие газы. Например, углекислый газ может существенно влиять на длину лаг-фазы. Высокая степень аэрации может оказывать негативное действие на рост и синтез продуктов вторичного метаболизма, поскольку удаляются углекислый газ и летучие соединения. Клетки растений in vitro по сравнению с микроорганизмами имеют низкую интенсивность дыхания, что тоже должно учитываться при конструировании сосуда для культивирования. Сравнивали рост и образование метаболитов клетками в ферментерах разных типов. Клетки моринды лимонолистной, культивируемые в ферментерах с продувкой воздуха, содержали антрахинона на 30% больше, чем в перемешиваемых колбах, и в два раза больше, чем в ферментерах других систем. Выход биомассы клеток не менялся в зависимости от типа биореактора. Клетки барвинка розового (Catharantus roseus) также синтезировали больше индольных алкалоидов при культивировании в ферментере с продувкой воздуха, чем в биореакторах с механическим перемешиванием.
Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений — высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, со провождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии. Адгезия (прилипание) клеток друг к другу, на поверхностях культурального сосуда и погруженных в него мешалок и датчиков вызывает затруднения. В верхней части сосуда постепенно может образовываться пена, состоящая из выделяемых клетками белков и полисахаридов. В процессе культивирования клетки слипаются и часть из них скапливается в этой пене, образуя «корку», или «безе». С увеличением биомассы клеток увеличивается и эта «корка», снижая интенсивность перемешивания, что в конце концов может привести культуру к гибели.
Клетки растений обладают меньшей физиологической и метаболической активностью по сравнению с микроорганизмами. Время генерации (интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями) растительной клетки в 60—100 раз превосходит время генерации микробной клетки. Пул пролиферирующих клеток не превышает 50—60%, многие клетки быстро прекращают деление и переходят в фазу покоя.
Все эти обстоятельства определяют продолжительный рост популяции клеток при накопительном, или периодическом, выращивании. Поддержание стерильности длительное время также является одной из технических проблем, особенно при непрерывном культивировании.
Периодическое, или накопительное, культивирование — это самый простой способ выращивания клеток, являющийся пока традиционным. Суспензионные культуры используют для промышленного получения вторичных метаболитов. Вещества, продуцируемые растительными клетками используются в медицине, парфюмерной промышленности, растениеводстве и других отраслях промышленности. К ним относятся: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, пигменты, антиканцерогены (птотецин, харрингтонин), пептиды (ингибиторы фитовирусов). В настоящее время в разных странах около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения экономически важных веществ, среди них — женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, беладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, мак снотворный и др.
22. Асептика в микробиологии
Соблюдение мер асептики — это использование стерильного оборудования и растворов и предотвращение их загрязнения в процессе работы. Бактерии и споры грибов широко распространены в окружающей среде, в том числе и в лабораториях. Микробиологи должны постоянно заботиться о стерильности питательной среды и оборудования. Эти «неудобства» — неотъемлимая часть работы любого микробиолога. В лабораториях школ и колледжей учат только основным мерам предосторожности. Для рутинной микробиологической работы необходимы особым образом оборудованные лаборатории. Они должны иметь поверхности, которые легко очищать, и специально отгороженные места для работы (боксы), где обеспечивается подача фильтрованного стерильного воздуха. Заливка чашек Заливка чашек один из самых основных микробиологических методов. Чашкой называют чашку Петри, содержащую питательный агар. Чашки Петри — специально изготовленные неглубокие круглые контейнеры, которые могут быть стеклянными или пластиковыми. Они используются для роста бактерий, грибов или культуры тканей на твердой питательной среде. Обычно чашки Петри имеют около 9 см в диаметре. Стеклянные чашки можно использовать повторно после автокла-вирования. Пластиковые чашки выбрасывают после использования; обычно их автоклавируют, чтобы уничтожить культуру. При этом они плавятся. Чашки покупают в запечатанных упаковках, которые стерилизованы гамма-облучением. Крышки препятствуют загрязнению чашки, однако молекулы газов могут диффундировать между внутренним объемом чашки и окружающей средой через микроскопические неровности в местах соприкосновения донышка с крышкой. Поэтому кислород имеет доступ к культуре, а двуокись углерода выводится наружу. Процедура заливки расплавленного питательного агара («заливка чашки») представлена на рисунке. Подразумевается, что агар был приготовлен в небольших флаконах (флаконы Маккартни). Методы инокуляции Во избежание загрязнения при введении небольшого количества микроорганизмов в питательную среду — инокуляции (или посева) — необходимо использовать асептические методы. Процедуры посева различаются в зависимости от типа среды (жидкой или твердой). Посев на твердую среду Посев штрихом, или посев разведением Метод представлен на рисунке. Он применяется для выделения чистых колоний бактерий из смеси бактерий. Для посева используют проволочную петлю, которую сначала нужно прокалить, как показано на рис. 12.4,Л, чтобы про-стерилизовать. Затем с помощью петли берут тонкую пленку жидкой суспензии или небольшое количество твердого материала, содержащего исследуемые микроогранизмы, из предварительно выращенной культуры или другого источника микроорганизмов. Петлей мягко проводят по поверхности среды, делая серии штрихов. После каждой серии штрихов чашку немного поворачивают, так чтобы в каждой новой серии распределялись бактерии из предыдущей серии штрихов, истощая таким образом штрихи до отдельных бактерий. (Не надейтесь что-нибудь увидеть на финальных штрихах до окончания времени инкубации!) Когда метод отработан, штрихи можно делать очень быстро. С помощью этого метода можно выделять бактерии из естественных мест обитания, например из почвы, молока, воды. Образцы твердых субстанций, таких как почва, лучше суспендировать в небольшом количестве воды, либо предварительно проинкубировать в жидкой среде. Безопасным источником для рутинной работы является пастеризованное молоко. Перед тем как проводить эксперименты с бактериями или грибами, следует ознакомиться с инструкциями и правилами безопасности, чтобы снизить до минимума риск культивирования вредных организмов.
Источником микробов - контамининтов могут быть и компоненты питательных сред (фаги, дрожжи). Микробы контаминанты не только могут подавать развитие и функции био-объекта, но и дезорганизовать какую-либо ткань. Они способны продуцировать токсические вещества. ассмотрим виды защиты биотехнологических, процессов от микробов-загрязнителей.
I. Защита с помощью различных фильтров (мембранных фильтров).
Промышленные фильтры начались выпускаться в 40 годах прошлого столетия. Распространенными процессами фильтрации являются:
• обычная фильтрация;
• микрофильтрация;
• диализ (обратный осмос).
Для м.. обычной фильтрации применяются обычные бумажные или стеклянные фильтры. Отделяемые частицы находятся в пределах от 1 до 103 мкм. Для остальных типов используют нитроцеллюлозные, ацетиллцелюлозные, поливинильные, полиамидные мембраны с толщиной менее 0,1 мкм, с высокой степенью пористости.
Для микрофильтрации отделяемые частицы размерами 2×10-3 - 10 мкм,
Для ультрафильтрации размеры отделяющихся частиц находятся в пределах от 0,001 до 0,02 мкм. При диолизе размеры отдельных частиц должны быть равными с молекулами растворителя (10 - 3 мкм и менее - до 1 нм.).
При стерилизации растворов фильтрованием они должны содержатся перед разливом и при последующем разливе в антисептических условиях. И время между началом приготовления раствора и его стерилизацией должно быть минимальным.
2. Метод защиты - стерилизация.
Питательная среда перед засевом каким-то биообъектом должна быть стерильной.
В биотехнологии используют методы периодической и непрерывной стерилизации.
Периодическая стерилизация осуществляется в аппаратах малой емкости непосредственно в ферментаторах или паром под давлением в течение 30-40 мин при температуре 134°С после удаления воздуха из аппарата при нагреве до 100°С. Затем среду охлаждают водой через змеевик и засевают биообъектами.
Метод непрерывной стерилизации основан на том, что концентрат питательной среды подают насосом через систему конструкций (который включает нагреватель, выдерживатель (соо6ственно стерилизатор) и теплообменник (где происходит охлаждение). В некоторых условиях стерилизацию питательных сред осуществляют в автоклавах. Стерилизацию проводят паром под давлением.
Кроме тепловой стерилизации используют еще холодную химическую стерилизацию, (это когда материалы не могут подвергаться тепловой стерилизации) или газовую стерилизацию этиленоксидом (температура кипения +12, +12,5С).
23. Системы GLP I GMP в связи с качеством фармацевтическойпродукции
Стандарт GLP («Good Laboratory Practice», Надлежащая лабораторная практика) — система норм, правил и указаний, направленных на обеспечение согласованности и достоверности результатов лабораторных исследований. Система является утвержденным национальным стандартом РФ с 1 марта 2010 года - ГОСТ Р-53434-2009[1].
Главная задача GLP — обеспечить возможность полного прослеживания и восстановления всего хода исследования. Контроль качества призваны осуществлять специальные органы, периодически инспектирующие лаборатории на предмет соблюдения нормативов GLP.
GLP устанавливает очень строгие требования к ведению и хранению документации — значительно более жесткие, чем европейские стандарты серии EN 45000. Сферы применения норм GLP устанавливаются законодательно. В первую очередь это относится к разработке новых химических веществ, получению и использованию токсичных веществ и к здравоохранению. Настоящий стандарт устанавливает принципы надлежащей лабораторной практики, предназначенные для применения при проведении неклинических испытаний объектов, содержащихся в лекарственных веществах, пестицидах, косметической продукции, ветеринарных препаратов, пищевых и кормовых добавках, а также химических веществах промышленного назначения. Испытуемые препараты могут быть как синтетической природы, так и биогенного происхождения, а также представлять собой живые организмы.
В комплексе со стандартами GMP (Надлежащая производственная практика) и GCP (Надлежащая клиническая практика) призвана стандартизовать некоторые аспекты качества медицинского обслуживания населения.
История разработки
Система GLP действует уже более 20 лет. Первоначально система нормативов GLP , была разработана и введена в действие американским Управлением пищевой и медицинской промышленности (FDA) применительно к производствам, использующим токсичные вещества, с целью устранить имевшиеся несоответствия в нормативной документации. Нормы GLP стали обязательными для всех компаний в США, а впоследствии — и в странах, экспортирующих в США свою продукцию. Затем усилиями Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) эти нормы стали распространяться в международном масштабе. В частности, в Германии требования GLP являются обязательными при разработке любых новых видов химической продукции.
GМР - хорошая производственная практика. В первую очередь это четкая организация производственных процессов, соблюдение технологических регламентов, параметров мойки и дезинфекции оборудования, но не только.
Соблюдение производственной дисциплины достигается не только порядком действий каждого работника, регламентированным должностными инструкциями или инструкциями на рабочих местах. Личная ответственность работающих, строгий контроль со стороны руководителя предприятия и начальников подразделений - залог выпуска продукции гарантированного качества. Необходимыми составляющими этого процесса являются производственные учебы, повышение квалификации специалистов, аттестация рабочих мест.
Все производственные процессы должны быть максимально прозрачными, чтобы по информации на этикетке каждой партии готовой продукции можно было установить все исходные данные (а это значит - ведение всей технической и технологической документации должно всегда находится под строгим контролем). Таким образом, создается "Система обратного отсчета", которая позволяет в любое время для любой партии продукции проанализировать все факторы, повлиявшие на качество готового продукта, идентифицировать точки нежелательного воздействия и провести корректирующие действия.
24. Микроорганизмы используемые в биотехнологической промышленности
В природе существует огромное число микроорганизмов. Все они способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, которые могут быть полезны для биотехнологии. Однако практическое применение нашли не более 100 видов микроорганиз- ] мов (бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, водоросли), так как остальные мало изучены. Дрожжи широко используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из 500 известных видов дрожжей используется только несколько видов . Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.Среди бактерий чаще всего применяют в биотехнологии представителей следующих родов:
Acetobacter, которые превращают этанол в уксусную кислоту и уксусную кислоту в углекислый газ и воду; Bacillus . для получения ферментов (В. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis); Clostridium . для сбраживания Сахаров в ацетон, этанол, бута-
нол; молочнокислые бактерии (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus); псевдомонады .например P. denitrificans . для получения витамина В|2, Corynebacterium glutamatum . для получения аминокислот и др.Для получения разнообразных антибиотиков в биотехнологии применяют актиномицеты (род Streptomyces), грибы Penicillium chrysogenum, Cephalosporium acremonium и др.
Многие микроорганизмы . бактерии, дрожжи, вирусы . используют в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов .продуцентов биотехнологической продукции. Получены рекомбинан-тные штаммы Е. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа; штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы дрожжей, продуцирующих интерлейкин-2,антиген вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др. Для получения вакцин и диагностических препаратов используют также патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии, столбняка и др.). Микроорганизмы широко используются в пищевой и бродильной промышленности. В молочной промышленности очень широко используются молочные дрожжи. С их помощью приготавливают кумыс, кефир. Ферментами этих микроорганизмов молочный сахар разлагается до спирта и углекислоты, в результате этого улучшается вкус продукта и повышается его усвояемость организмом. При получении молочнокислых продуктов в молочной промышленности широко используются дрожжи, не сбраживающие молочный сахар и не разлагающие белки и жир. Они способствуют сохранению масла и увеличению жизнеспособности молочнокислых бактерий. Пленчатые дрожжи (микодерма) способствуют созреванию молочнокислых сыров. Грибы Penicillum roqueforti используют при производстве сыра рокфор, а грибы Penicillum camemberi – в процессе созревания закусочного сыра. В текстильной промышленности широко используется пектиновое брожение, обеспечиваемое ферментной активностью Granulobacter pectinovorum, Pectinobacter amylovorum. Пектиновое брожение лежит в основе начальной обработки волокнистых растений льна, конопли и других растений, используемых для изготовления пряжи и тканей. Практически все природные соединения разлагаются бактериями, благодаря их биохимической активности, е только в окислительных реакциях с участием кислорода, но и анаэробно с такими акцептора электрона, как нитрат, сульфат, сера, углекислый газ. Бактерии участвуют в циклах всех биологически важных элементов и обеспечивают круговорот веществ в биосфере. Многие ключевые реакции круговорота веществ (например, нитрификация, денитрификация, азотфиксация, окисление и восстановление серы) осуществляются бактериями. Роль бактерий в процессах деструкции является определяющей. Многие виды и разновидности дрожжей обладают способностью сбраживать различные углеводы с образованием спирта и других продуктов. Они широко используются в пивоваренной, винодельческой промышленности и хлебопечении. Типовыми представителями таких дрожжей являются Saccharomyces cerevisial, S.ellipsoides. Многие микроорганизмы, в том числе дрожжеподобные и некоторые виды микроскопических грибов, издавна использовались при превращении различных субстратов для получения различных видов пищевых продуктов. Например, использование дрожжей для получения из муки пористого хлеба, использование грибов родов Rhisopus, Aspergillus для ферментации риса и сои, получение молочно – кислых продуктов с помощью молочно – кислых бактерий, дрожжей и др. Ауксотрофные мутанты Candida guillermondii используются для изучения флавиногенеза. Гифальные грибы хорошо усваивают углероды нефти, парафина, n- гекасдекана, дизельного топлива. Для разной степени очистки этих веществ используются виды родов Mucorales, Penicillium, Fusarium, Trichoderma. Для утилизации жирных кислот используются штаммы Penicillium, а жирные вторичные спирты лучше перерабатываются в присутствии штаммов Penicillium и Trichoderma. Виды грибов Aspergillus, Absidia, Cunningham, Ella, Fusarium, Mortierella, Micor, Penicillium, Trichoderma, Periconia, Spicaria используются при утилизации парафинов, парафинового масла, дизельного топлива, ароматических углеводородов, многоатомных спиртов, жирных кислот. Penicillium vitale используется для получения очищенного препарата глюкозооксидазы, ингибирующего развитие патогенных дерматомицетов Microsporum lanosum, Achorion gypseum, Trichophyton gypseum, Epidermophyton kaufman. Промышленное использование микроорганизмов для получения новых пищевых продуктов способствовало созданию таких видов промышленности как хлебопекарская и молочная, производство антибиотиков, витаминов, аминокислот, спиртов, органических кислот и пр.
25.Субстраты и сырье, используемые в микробиологических производствах
Для приготовления питательных сред микробиологической промшленности используют сырье минеральное, животного и растителъного происхождения, а также синтезированное химическим путем. Вещества, входящие в состав питательной среды, обеспечивающие развитие культуры и биосинтез определяемых продуктов, не должны содержать вредных примесей.
При выборе сырья необходимо учитывать его себестоимость, так как в микробиологическом синтезе важное значение имеет стоимость исходных веществ и материалов. Источники углерода. Наиболее доступны для микроорганизмов углеводы, поэтому в лабораториях, а также во многих промышленных биотехнологических процессах (в производстве ферментов, антибиотиков, аминокислот и др.), используют глюкозу, сахарозу, лактозу и другие углеводы. Однако перечисленные углеводы являются ценным пищевым сырьем и достаточно дороги. В этой связи в большинстве крупнотоннажных микробиологических производств чистые углеводы заменяют более доступными по стоимости продуктами: отходами крахмало-паточного производства (меласса, гидрол), гидролизатами торфа и растительных отходов, побочными продуктами молочной промышленности и др. Меласса — отход производства сахара из сахарной свеклы, богатый углеводами и другими ценными органическими и минеральными веществами. Меласса содержит 70—80% сухого вещества, в т. ч. 45—60% сахарозы, 0,25—2% инвертного сахара, 0,2—3% раффинозы, 1,2—3,4% азотистых веществ. В ее состав входят аминокислоты, органические кислоты и соли, минеральные вещества, некоторые витамины. Меласса широко используется в производстве аминокислот, ферментов, дрожжей. Гидрол — отход производства глюкозы из крахмала. Содержание глюкозы составляет до 80% суммы Сахаров, а остальные 20% — в основном продукты неполного гидролиза крахмала. Наряду с сахарами гидрол содержит органические кислоты, минеральные элементы (фосфор, магний, железо, натрий). Гидрол используют как дешевый заменитель в химикоармацевтических производствах. Крахмал картофельный (или кукурузный) содержит 98,5— 98,8% собственно крахмала, 0,4—0,6% белков, 0,6—0,7% жиров, 0,12 — 0,17% зольных элементов. Крахмал используют в ферментной, химико-фармацевтической промышленности для выращивания микроорганизмов, обладающих амилолитической активностью. Кукурузная мука — крахмалосодержащий субстрат, содержащий 60—70% крахмала, около 10% других углеводов, 10—12% белков, 3% жиров, 0,8—1% зольных элементов. Ее используют в основном в производстве антибиотиков. Пшеничные отруби — отход мукомольного производства используется для приготовления питательных сред при твордофазном способе культивирования. Отруби содержат 16—20% крахмала, 10—12% белков, 3—4% жиров, 10% клетчатки. Источники органического азота. Для выращивания микроорганизмов широко используют субстраты, содержащие органические источники азота (аминокислоты, белки). Наиболее распространенные в биотехнологии натуральные субстраты — кукурузный экстракт, соевая мука, свекловичный жом и другие — достаточно доступные по стоимости. Кукурузный экстракт — побочный продукт крахмалопаточного производства, содержащий 40—50% азотистых веществ, в основии аминокислоты, и 10—12% углеводов, витаминов, микроэлемента Соевая мука — богатый источник органического азота, в основном в виде белков. Помимо белков, в ней содержатся до 20% углеводов, большей частью трудноусвояемых организмов 4,5—6,5% минеральных элементов, некоторые витамины. Свекловичный жом — отход сахарного производства из сахарной свеклы. Он содержит: белки — 8,9, жиры — 0,23, целлюлозу 21,7, зольные элементы — 4,2, кальций — 4,7, фосфор — 1,2% . Другие виды сырья. Помимо основных компонентов питательных сред, в процессе ферментации нередко используют. дополнительные виды сырья — предшественники, поверхностно-активные вещества (ПАВ), антибактериальные препараты и др. Предшественники — синтетические продукты, входящие в состав молекулы целевого продукта и добавляемые в ферментационную среду для интенсификации процесса биосинтеза. Например, при биосинтезе пенициллина в культуральную жидкость добавляют в качестве предшественника фенилуксусную кислоту, при биосинтезе эритромицина — пропиловый спирт, витаминов В12 — 5,6-диметилбензимидазол.
Поверхностно-активные вещества в биологических производствах используют главным образом для пеногашения. Антибактериальные препараты (фурадонин, фурацилин) — для поддержания асептических условий.
26.Стерилизация сырья Стерилиза́ция — полное освобождение какого-либо предмета от всех видов микроорганизмов, включая бактерии и их споры, грибы, вирионы, а также от прионного белка, находящихся на поверхностях, оборудовании, в пищевых продуктах и лекарствах. Осуществляется термическим, химическим, радиационным, фильтрационным методами. Методы стерилизации
Уничтожение микроорганизмов-один из необходимых элементов микробиологической работы и основа консервирования пищевых продуктов; поэтому стоит остановиться на нем подробнее. Освобождение какого-либо материала от живых микроорганизмов или их покоящихся форм называют обеспложиванием или стерилизацией. От стерилизации следует отличать частичное обеспложивание (пастеризацию), а также консервирование. Если стерильная среда или микробная культура загрязняется случайно попавшими в нее микроорганизмами, то говорят о контаминации, или загрязнении. Такие понятия, как дезинфекция (уничтожение всех патогенных микроорганизмов), асептика и антисептика, а также инфекция, употребляются главным образом в гигиене, а не в микробиологии.
Микроорганизмы проявляют разную чувствительность к средствам, применяемым для их уничтожения. Существуют видовые различия в чувствительности, а также различия, зависящие от влажности и рН среды, от возраста вегетативных клеток или спор и т.д. Эффективность различных агентов, применяемых для уничтожения микроорганизмов, характеризуют величиной D10 (время, необходимое для того, чтобы в определенной популяции при определенных условиях среды вызвать гибель 90% клеток (см. табл. 6.5j.
Полная или частичная стерилизация осуществляется с помощью влажного жара, сухого жара, фильтрации, облучения или различных химических средств.
Влажный жар. Вегетативные клетки большинства бактерий и грибов гибнут через 5-10 мин уже при температуре около 60°С, споры дрожжей и мицелиальных грибов-лишь при температурах выше 80°С, а споры бактерий - выше 120°С (15 мин). Время воздействия влажным жаром, необходимое для уничтожения спор некоторых видов бактерий, отличающихся чрезвычайной термоустойчивостью, можно вывести из данных, приведенных в табл. 6.5. При этом следует учитывать, что окончательный результат стерилизации зависит также от степени загрязнения обрабатываемого материала, т.е., например, от числа терморезистентных спор: чем их больше, тем длительнее должен быть нагрев. Для достижения температур выше точки кипения воды пользуются автоклавом. Температура насыщенного пара зависит от давления (рис. 6.12). При доступе воздуха определенному давлению соответствует значительно более низкая температура. Поскольку гибель микроорганизмов под действием влажного жара зависит от температуры, а не от давления, необходимо закрывать автоклав лишь после того, как воздух будет из него вытеснен водяным паром. Воздух удаляется вместе с выходящим паром или в результате отсасывания. При автоклавировании следует измерять температуру, а не давление, хотя по соображениям простоты и безопасности обычно все еще измеряют давление. Продолжительность стерилизации, естественно, зависит от объема (теплоемкости) сосудов, в которых ее проводят.
Тиндализация Нередко удается достичь того же эффекта дробной стерилизацией в текучем паре при 100°С (тиндализация). Жидкость стерилизуется в этом случае при 100°С три дня подряд по 30 мин ежедневно; в промежутках между нагреваниями ее хранят в термостате, для того чтобы споры проросли, а затем вегетативные клетки были уничтожены при следующем нагревании.
Для многих целей довольствуются частичной стерилизацией, т.е. уничтожением вегетативных форм микроорганизмов. Такого эффекта обычно достигают путем пастеризации - выдерживания в течение 5-10 мин при 75 или 80°С. Пастеризацией частично стерилизуют, в частности, молоко; однако, чтобы не испортить его вкуса, время воздействия в этом случае сокращают. Применяют два метода пастеризации молока: кратковременное нагревание (20 с при 71,5-74°С) и сильное нагревание (2-5 с при 85-87°С). Стерилизации молока добиваются в результате сверхсильного нагревания. При этом в молоко вводят перегретый водяной пар, доводя температуру смеси до 135-150°С. Молоко подвергается действию этой температуры в течение 1 -2 с. Затем, пропуская молоко через форсунку, понижают давление и одновременно охлаждают молоко; при этом из него удаляется вода, введенная в виде пара.
Основная статья: Тиндализация
Тиндализацию применяют для стерилизации растворов, неустойчивых к действию высокой температуры. Она состоит в неоднократном нагревании до температуры 70—100°С с промежутками в 24 ч.
27.Методы стерилизации воздуха в микробиологических производствах
Фильтрация. В практике работы микробиологических производств наиболее распространен метод стерилизации воздуха путем фильтрации, предполагающий использование фильтров различных конструкций с различными материалами для задержки посторонней микрофлоры. Рассмотрим некоторые из этих фильтров.
По-видимому, до сих пор в промышленности чаще всего применяют волокнистые фильтры для получения стерильного воздуха, оптимальная конструкция которых достаточно полно была описана еще в 161 г. 2. Существует несколько способов характеристики эффективности работы этих фильтров. Данные табл. 2позволяют сделать некоторые замечания, имеющие практическое значение. Во-первых, задерживающая эффективность фильтров в отношении спор зависит от скорости воздушного потока. Во-вторых, существует скорость, при которой задержка спор минимальная. Снижение и увеличение этой скорости повышают эффективность фильтра. В-третьих, при задержке фага не наблюдается зависимость, характерная для задержки спор микроорганизмов, следовательно, конструкции фильтров для фагов и спор должны быть различными. При необходимости удаления из воздуха фаговых частиц и бактерий нужна последовательная установка фильтров отличающихся конструкций. Конструкции ферментеров (биореакторов)
В микробиологических производствах в зависимости от особенностей процесса применяют разнообразные ферментеры, или биореакторы.
Аппараты для аэробной поверхностной ферментации широко применяются для производства органических кислот. Поверхностная жидкофазная ферментация протекает в так называемых бродильных вентилируемых камерах, в которых на стеллажах размещены плоские металлические кюветы. В кюветы наливают жидкую питательную среду (высота слоя составляет 80–150 мм), затем с потоком подаваемого воздуха среду инокулируют спорами продуцента. В камере стабилизируется влажность, температура и скорость подачи воздуха. После завершения процесса культуральная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днище штуцеры и поступает на обработку.
При твердофазной ферментации процесс также протекает в вентилируемых камерах, но вместо кювет на стеллажах размещают лотки, в которые насыпают сыпучую твердую среду слоем 10–15 мм. Для лучшей аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит через перфорированное днище лотков.
Аппараты для аэробной глубинной ферментации наиболее сложны как конструкционно, так и с точки зрения их эксплуатации. Главная задача — обеспечение высокой интенсивности массо и энергообмена клеток со средой.
По структуре потоков ферментеры (биореакторы) могут быть аппаратами полного перемешивания или полного вытеснения.
Конструктивные различия ферментеров (биореакторов) определяются в основном способами подвода энергии и аэрации среды:
• ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к газовой фазе;
• ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к жидкой фазе;
• ферментеры (биореакторы) с комбинированным подводом энергии.
Ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к газовой фазе. В аппаратах этого типа аэрация и перемешивание культуральной жидкости осуществляются сжатым воздухом, который подается в ферментер (биореактор) под определенным давлением. К таким ферментерам (биореакторам) относят:
• барботажные ферментеры (биореакторы), подача воздуха в которых осуществляется через барботажные устройства, расположенные в нижней части аппарата;
• аппараты с диффузором (эрлифтные аэраторы), имеющие внутренний цилиндр-диффузор, который обеспечивает перемешивание поступающих по распределительным трубам в нижнюю часть аппарата субстрата и воздуха;
• трубчатые ферментеры (биореакторы) (газлифтные), состоящие из реактора кожухотрубчатого типа, через который жидкость потоком воздуха перемещается в верхнюю часть аппарата и, попадая в сепаратор, возвращается в реактор, где снова увлекается воздухом, подвергаясь таким образом циркуляции;
• ферментеры (биореакторы) с форсуночным воздухораспределением, оборудованные форсунками для подачи воздуха, расположенными в нижней части аппарата, и находящимся над ними диффузором, который обеспечивает внутреннюю циркуляцию жидкости;
• ферментеры (биореакторы) колонного типа, представляющие собой цилиндрическую колонну, разделенную горизонтальными перегородками (тарелками) на секции; воздух барботирует через слой жидкости каждой тарелки, а перемещение жидкости через кольцевую щель обеспечивает противоточное движение жидкой и газовой фаз.
Ферментеры (биореакторы) с подводом энергии к жидкой фазе. К таким аппаратам относят:
• аппарат с самовсасывающей турбиной, имеющий цилиндрический диффузор и мешалку с полыми лопастями и валом, при вращении которой за счет создаваемого разрежения происходит самовсасывание воздуха, благодаря чему происходит подъем жидкости в кольцевом зазоре между диффузором и стенками аппарата с последующим ее возвращением в диффузор;
• ферментер (биореактор) с турбоэжекторными перемешивающими устройствами — аппарат, разделенный вертикальными перегородками на секции, в каждой из которой имеется самовсасывающая мешалка турбинного типа (эжектор) и диффузор; для перемещения жидкости из секции в секцию в перегородках сделаны окна.
28. Культивирование оценка роста и развития микроорганизмов, влияние физико-химических параметров на рост культуры
Искусственные питательные среды, применяющиеся для культивирования микроорганизмов, должны содержать все питательные вещества — белки, жиры, углеводы; вещества, необходимые для роста и размножения микробов. Источниками азота могут быть различные неорганические и органические соединений, источником углерода — углеводы, спирты, определенные кислоты. Для культивирования некоторых микроорганизмов необходимо добавление жиров, парафина, воска. Большинство гетеротрофов, особенно патогенных, культивируют в средах, содержащих кровь, сыворотку, сложные органи¬ческие вещества, витамины, ионы металлов.
Осмотические условия, необходимые для жизнедеятельности микробов, создают в питательной среде добавлением хлорида натрия или определенным сочетанием солей фосфата натрия и фосфата калия. Для большинства микробов изотонична питательная среда, содержащая 0,5% хлорида натрия. При повышенном содержании солей наблюдаются явления плазмолиза, когда клетка отдает воду, сморщивается и погибает. При пониженном содержании соли, наоборот, отмечаются явления плазмоптиза: клетка набухает, впитывая в себя воду, и лопается. Определенная реакция среды — водородный показатель, который определяется соотношением водородных (Н+) и гидроксильных (ОН-) ионов, является непременным условием успешного культивирования микробов. Водородный показатель обозначается символом рН. Он представляет собой логарифм числа абсолютной концентрации водородных ионов в среде, взятый с обратным знаком. В принятом обозначении рН нейтральной реакции соответствует 7,0. В этом случае число водородных ионов равно числу гидроксильных. Показатель ниже 7,0 указывает на кислую реакцию, выше 7,0 — на щелочную. Большинство патогенных микроорганизмов успешно культивируют при слабощелочной реакции питательных сред, рН которой равен 7,2—7,4. Однако холерный вибрион растет при рН 7,8—8,5, а для культивирования дрожжей и плесеней необходима кислая реакция среды (рН 5,0—5,5).
Питательные среды должны содержать также достаточное количество воды, быть по возможности прозрачными обязательно стерильными, т. е. до посева в них не должны находиться микроорганизмы.
Температура выращивания должна быть оптимальной для данного вида микроорганизмов. Большинство возбудителей инфекционных заболеваний размножается при 37°С. Однако для отдельных видов оптимальная температура культивирования несколько ниже: для возбудителя чумы 28°С, для спирохет и некоторых простейших — лейшманий 28—29°С. Грибы можно выращивать и при более низких температурах. Выращивание микроорганизмов на питательных средах производят в специальных аппаратах — термостатах, в которых и поддерживают оптимальную температуру. Активность воды
Важным количественным показателем доступности воды, которая необходима микроорганизмам для осуществления метаболизма, является активность воды аw. Она определяется как отношение давления паров раствора к давлению паров чистой воды. Этот показатель зависит как от самого наличия воды, т.е. от степени высушивания, так и от содержания в ней растворенных веществ. Некоторые микроорганизмы столь чувствительны к понижению активности воды, что даже не способны расти на твердых средах. Другие, называемые ксерофилами, предпочтительно растут при низких значениях аw.
Природными средами с высокими концентрациями разных солей являются соленые и содовые озера, солонцы, солеварни, Мертвое море. При заготовке продуктов издавна используют высокие концентрации поваренной соли и сахара. Микроорганизмы, способные существовать в растворах с высокой концентрацией веществ, называются осмофилами. Наиболее изучены среди них те, которым необходимо повышенное содержание поваренной соли (галофилы). Они подразделяются на несколько групп. Галотолерантные микроорганизмы (например, из рода Streptococcus) выдерживают до 10% (2,0 М) соли в среде, но предпочитают расти при низкой ее концентрации. Слабогалофильные представители, в частности из рода Vibriо, растут при содержании соли от 2 до 5% (0,2-0,5 М). Большинство морских обитателей относится к умеренным галофилам. Интервал солености для них составляет 5-15% (0,5-2,5 М) NaCl. Экстремальные галофилы (например, галоархеи) растут при содержании соли от 15% (2,5-5,2 М) и до насыщения. Негалофильные (пресноводные) микроорганизмы растут при содержании соли не более 0,01%, а более высокие концентрации подавляют их развитие.
↑рН
Показатель кислотности среды (рН) представляет собой отрицательный логарифм концентрации ионов водорода, принимающий значения от 0 до 14. Концентрация водородных ионов воздействует на ионное состояние вещества и, следовательно, на доступность для клетки многих метаболитов, т.к. в незаряженном состоянии они легче проникают через мембрану.
По отношению к оптимальным для роста значениям рН микроорганизмы делятся на ацидофильных (0-5,5), нейтрофильных (5,5-7,5) и алкалифильных (7,5-12,0). Большинство грибов и водорослей развивается при пониженных значениях рН, значительная часть цианобактерий относится к алкалифилам, а основная масса бактерий – нейтрофилы. Даже при экстремальных значениях рН окружающей среды внутри клетки поддерживается постоянная кислотность. У растительных клеток реакция цитоплазмы слабокислая (5,0-6,0), у животных ~ 7,0. Алкали- и ацидофильные микроорганизмы имеют рН цитоплазмы на уровне ~ 7,5. Поддержанию постоянного внутриклеточного рН способствует малая проницаемость ЦПМ для протонов и наличие механизмов их выброса из клетки. рН-Толерантные микроорганизмы могут в определенных пределах изменять рН среды, образуя кислые или щелочные продукты. Например, E. coli реагирует на повышение кислотности синтезом декарбоксилаз аминокислот. Образующиеся в результате амины подщелачивают среду. Наоборот, повышение рН среды стимулирует синтез дезаминаз аминокислот, что ведет к подкислению среды. Ярким примером регулирования рН среды бактериями является двухфазный процесс маслянокислого и ацетонобутилового брожения.
↑Температура
Физиологическая активность микроорганизмов в значительной степени определяется температурой окружающей среды. Для каждого микроорганизма обычно указывают минимальную, оптимальную и максимальную температуры роста. Нижние пределы роста по температуре ограничены температурой «застывания» мембраны, когда она теряет свои функции, а верхние – тепловой денатурацией жизненно важных молекул. К низкотемпературным местам обитания относятся регионы Арктики, Антарктики, тундра, глубины океанов, где температура имеет постоянное значение около +4оС. Высокая температура поддерживается в гейзерах, вулканических источниках, на выходах вулканических горячих газов из разломов земной коры в глубинах океанов, где температура при высоком давлении может достигать +360оС. Существуют и искусственно созданные, экстремальные по температуре места обитания (морозильные камеры, ферментеры, автоклавы и т.д.). Большинство земных организмов имеет низший температурный предел 0оС. По отношению к температуре все микроорганизмы условно подразделяются на несколько групп (табл.).
29.Посевной материал, значение качества и количества инокулята для ферментации. Способы получения посевного материала.
Известный традиционный способ получения посевного материала для производства продуктов микробного синтеза состоит в последовательном выращивании в несколько стадий исходной культуры до получения требуемого титра клеток. Как правило, для выращивания микроорганизмов используются природные компоненты (мелласа, различные виды муки, сусло, пептон и т.д.) неопределенного состава: аминокислоты, минеральные вещества, стимуляторы роста. Несмотря на это среды с неопределенным химическим составом довольно часто обогащаются витаминами, микроэлементами и источниками азота и фосфора в виде неорганических солей [Г. И. Фертман, М.И.Шойхет. Технология продуктов брожения. М.:Высшая школа, 1976, стр. 120-126, 220-224]. Недостатком традиционного способа получения посевного материала состоит в том, что он не устраняет одну из проблем культивирования микроорганизмов - морфолого-физиологическую гетерогеннность. В итоге с помощью традиционного способа нельзя получить высокоактивный посевной материал, т.к. одновременно с размножением продуктивных клеток развиваются малопродуктивные варианты.Известен способ получения посевного материала микроорганизмов путем снижения уровня множественной гетерогенности микробных популяций. Сущность способа состоит в насильственной дискриминации особей по их прочностным свойствам и отбором элитарных вариантов популяции клеток по этому признаку. Для гибели клеток используется дезинтегрирующее воздействие, например, декомпрессия [Г. А. Гуревич, Б.А.Фихте. Пороговая механическая дезинтеграция как способ однофакторной детергенизации микробных популяций в витальных условиях. В сб. "Биофизика микробных популяций". Тезисы конференции. Красноярск, 1987 г., стр. 110]. Рассмотренный способ принят за прототип.Недостаток прототипа состоит в том, что он не позволяет регулировать химический состав клеток популяции в нужном для практики направлении, т.е. в сторону увеличения физиологической активности организма. Следовательно, способ по прототипу не позволяет существенно увеличить выход целевого продукта.
Цель изобретения состоит в переводе культуры в новое устойчивое состояние, интегрально характеризуемое повышением физиолого-биохимической активности клеток и, следовательно, увеличение выхода целевого продукта.Сущность изобретения состоит в получении активности посевного материала микроорганизмов с повышенными физиолого-биохимическими свойствами. Это достигается выращиванием популяции на среде со смешанно-лигандными комплексами биогенных металлов, вызывающих изменение химического состава клеток и увеличение катализа окислительно-восстановительных и других внутриклеточых ферментов, насыщение липидами мембран и т.д. После выращивания культуральная жидкость подвергается замораживанию в интервале температуры от минус 9oC до минус 20oC, т.е. в интервале температуры, в котором формируется крупнокристаллический лед, раздавливающий клетки. После замораживания суспензию клеток размораживают при температуре выращивания культуры. Размораживание проводят при непрерывном встряхивании культуры для предотвращения рекристаллизации, вызывающей дополнительную гибель клеток. Затем этими клетками засеивается питательная среда, содержащая смесь комплексов различной композиции, и проводят выращивание культуры до получения требуемого титра клеток.
30. Периодическое культивирование, преимущества и недостатки стадии роста периодической культуры, дифференциальное культивирование.При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия. Постепенно увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена, т.е. условия существования микроорганизмов изменяются. Периодическую культуру обычно рассматривают как замкнутую систему, переживающую разные фазы развития. Каждая фаза характеризуется определенными физиологическими параметрами. Лаг-фаза – это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходит увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду. Лаг-фаза сокращается (или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки перенести в свежую среду того же состава и той же температуры. На средах, содержащих смесь субстратов, наблюдается диауксия, при которой после исчерпания одного субстрата культура переходит во вторую лаг-фазу для подготовки к потреблению другого субстрата. В экспоненциальной (логарифмической) фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. Для бактерий эта фаза достигается при концентрации в среднем 109 клеток/мл, для водорослей и простейших – 106 клеток/мл. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма преодолеют некие пороговые концентрации, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается. При периодическом методе культивирования Весь объем питательной среды засевают чистой культурой, и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Поскольку культивирование ведется на ненозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), клетки все время находятся в меняющихся условиях. Сначала они имеют в избытке все питательные вещества, затем постепенно наступает недостаток питания и (правление вредными продуктами обмена. В связи с этим культура в своем развитии проходит четыре фазы роста и размножения, в течение которых изменяются скорость размножения, морфологические и физиологические свойства (рис. 1).Первая стадия - лаг-фаза, или фаза задержки роста, следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду. В этой фазе микроорганизмы не размножаются, а приспосабливаются к среде, происходит повышение содержания нуклеиновых кислот в клетках, увеличение их размера. Эта стадия является подготовкой к дальнейшему интенсивному синтезу белка клеткой, т.е. ее росту и размножению.втория стадия - фаза логарифмического роста (экспоненциальная) характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена. Время, необходимое для удвоения числа клеток, называется продолжительностью генерации. В благоприятных условиях клетки бактерий делятся каждые 20-30 мин, их число увеличивается в геометрической прогрессии (1, 2, 4, 8, 16 и т.д.).Третья стадия -стационарная (фаза зрелости), когда размножение микроорганизмов замедляется, и скорости размножения и отмирания уравновешиваются, в результате чего число клеток остается постоянным.Четвертая стадия - фаза отмирания, когда начинается гибель клеток и их количество снижается за счет отмирания и автолиза (самопереваривания).Периодическое культивирование осуществляется во многих производствах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов.Недостатком периодического культивирования являются нерациональные затраты времени на прохождение всех четырех стадий развития культуры, причем период самой активной жизнедеятельности - фаза логарифмического роста - занимает небольшую часть производственного цикла.В течение последних тридцати лет все большее значение приобретает метод непрерывного культивирования микроорганизмов, который состоит в том, что культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает свежая питательная среда и с такой же скоростью отводится культуральная жидкость. Посевной материал выращивается до стадии логарифмического роста и вносится в питательную среду. Длительность периода погарифмического роста зависит от количества питательных веществ в среде, а также от количества вредных продуктов обмена, выделяемых клеткой.При большой скорости притока среда быстро обновляется, питательные вещества не успевают накопиться, и культура поддерживается сколь угодно долго в активном состоянии, не достигая стадии отмирания. Несмотря на значительное аппаратное усложнение технологического процесса, метод непрерывного культивирования имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим способом. В последние годы активно разрабатывается и применяется метод непрерывного культивирования клеток микроорганизмов в иммобилизованном (прикрепленном) состоянии - на пленках, гранулах, волокнах специально подобранных синтетических полимерных материалов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов функционируют многократно и в течение длительного времени сохраняют высокую биохимическую активность. Периодическая ферментация позволяет поддерживать постоянную температуру, равномерное распределение растворенных веществ по всему объему биореактора. В то же время периодические процессы связаны с рядом проблем:• большие затраты времени в связи с необходимостью загрузки и разгрузки биореактора;• низкая продуктивность, связанная с малой концентрацией клеток в среде, ингибированием конечным продуктом и исчерпанием субстрата;• длительность процесса ферментации.
51Непрерывное культивирование ,преимущества, хемостатное и турбидостатное культивирование ,разновидности непрерывного культивирования
Непрерывное культивирование обеспечивает длительное состояние «физиологической молодости» культуры благодаря постоянному притоку свежей среды и удалению продуктов обмена. Применяют непрерывное культивирование в виноделии, в спиртовой, ацетонобутиловой промышленности, в производстве кормовых дрожжей и уксусной кислоты. Метод непрерывного культивирования микроорганизмов применяется как технологический прием ряда микробиологических процессов, осуществляемых на промышленной основе; для исследований закономерностей роста микробных популяций и влияния внешних факторов на физиологическое состояние микроорганизмов.Преимущества непрерывного культивирования: 1. Постоянный режим, исключающий влияние времени. Культура может длительно находиться в определенной фазе роста, а следовательно, в физиологическом состоянии, необходимом для синтеза определенного продукта. Это позволяет изучить влияние питательных веществ, температуры, pH, скорости перемешивания, аэрации и других условий на развитие культуры более детально, чем в обычных статических культурах, где условия постоянно изменяются.2. Относительная однородность культуры, т. е. микробной популяции и ее продуктов.3. Математическое выражение кинетики отдельных реакций, а значит, и всего процесса в целом проще и легче.4. Возможна эффективная и направленная регуляция путем использования соответствующих приборов для культивирования и применения физических, физико-химических и других средств.5. Возможности автоматизации процесса гораздо шире, чем при периодическом культивировании.6. Метод экономичен и, как правило, эффективен, так как размеры аппаратуры могут быть уменьшены при той же мощности; исключены потери времени между отдельными циклами, которые неизбежны при периодической ферментации; культура развивается в наиболее эффективном физиологическом состоянии.7. Стоимость оборудования несколько выше, чем при периодическом процессе, однако компенсируется непрерывной работой системы.8. Приготовление среды и процессы выделения продукта эффективны и экономичны благодаря непрерывности.Метод непрерывного культивирования успешно применяют для исследований адаптации микробов к различным физическим и химическим веществам, так как в этих условиях адаптация проходит в 3—4 раза быстрее, чем в условиях стационарной культуры. Этот метод чрезвычайно ускоряет работы по селекции активных рас. При непрерывном культивировании микроорганизмов отсутствует смена фаз развития культуры. В таких процессах скорость потока питательной среды и отвода культуральной жидкости из системы необходимо отрегулировать, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной. В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.Поддержание динамики равновесия в реакторе осуществляется двумя методами: турбидостатным и хемостатным. При хемостатном режиме культивирования саморегулируемая система возникает в силу следующих причин: если первоначальное поступление свежей питательной среды и вымывание биомассы превышает скорость деления клеток, то в результате разбавления культуры снижается концентрация веществ, ограничивающих ростовые процессы и скорость роста культуры повышается; увеличивающаяся популяция начинает активнее "выедать" субстрат, что в свою очередь приводит к торможению роста культуры.Турбидостатный режим культивирования базируется на прямом контроле концентрации биомассы. Наиболее распространенным методом ее определения является измерение светорассеивания с помощью фотоэлементов. Повышение концентрации клеток и соответственно оптической плотности автоматически ускоряет проток жидкости и наоборот. По своей конструкции турбидостаты отличаются от хемостатов лишь системами контроля скорости протока.Хемостаты применяются в процессах, характеризующихся малым протоком, когда концентрация клеток изменяется незначительно с изменением скорости протока, что облегчает саморегулировку системы.Область использования турбидостатов – высокие скорости разбавления, обусловливающие быстрое и резкое изменение концентрации биомассы. С технической точки зрения турбидостат может применяться только для культивирования одноклеточных микроорганизмов. При длительном культивировании в турбидостате возникает довольно серьезная проблема, связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу.Непрерывное культивирование может быть нескольких видов: открытые непрерывные системы, одноступенчатые и многоступенчатые, замкнутые непрерывные системы и полунепрерывные системы.
52 Продукты биотехнологического производства Центральное звено любого биотехнологического процесса – штамм, то есть совокупность микроорганизмов одного вида, обладающих специфическими физиолого биохимическими признаками.Биотехнологическое производство может быть направлено либо на получение максимально возможного количества биомассы (например, производство хлебопекарных дрожжей), либо на достижение максимума выхода продуктов жизнедеятельности клеток. В естественных условиях обмен веществ в клетках осуществляется по принципам строжайшей экономии, что 17. Углеводы – обширная группа органических соединений, входящих в состав всех живых организмов. Представители этого класса веществ по составу отвечают общей формуле CmH2nOn, то есть углерод + вода (отсюда название). Примерами углеводов являются глюкоза: C6H12O6, сахароза C12H22O11, крахмал C6H10O5 и др.Углеводороды – органические соединения, молекулы которых состоят только из атомов углерода и водорода. Углеводороды являются основным компонентом большинства нефтей и природных газов. Общая формула для предельных углеводородов: CnH2n+2 Например, метан СH4, этан С2H6, пропан С3H8, бутан С4H10 и т. п. обеспечивается сложной системой его регуляции. Поэтому задача промышленных микробиологов состоит в создании мутантных форм микроорганизмов – сверхпродуцентов соответствующих веществ. Для выделения из природных популяций сверхпродуктивных штаммов используются разнообразные методы.Селекция – это искусственный отбор организмов с лучшими в своем поколении показателями. Главный недостаток этого метода – его чрезвычайная длительность.Более эффективен индуцированный мутагенез, основанный на мутагенном воздействии рентгеновского и УФ_излучения или некоторых химических соединений. Мутагены вызывают изменения ДНК, приводящие к сдвигу метаболических реакций, в результате чего часть обычных клеток превращаются в сверхпродуцентов.Как правило, методы мутагенеза и селекции используются в совокупности. Например, так были получены высокопродуктивные штаммы бактерий Bacillus subtilis, способные выделять до 75 кг витамина В2 из тонны питательной смеси.Достижения в области генетики и молекулярной биологиипозволили биотехнологам начиная с 70_х гг. прошлого века, перейти от слепого отбора штаммов мутантов к сознательному конструированию геномов, используя для этой цели технологию рекомбинантной ДНК – основу современной генной инженерии.Подробнее об этих механизмах будет рассказано чуть позже, а пока ознакомимся с общей схемой микробиологического производства и вкратце «пройдемся» по достигнутым результатам.Общая схема микробиологического производства состоит из следующих основных этапов:
1. Подготовка питательной среды.Питательная среда служит источником органического углерода – основного строительного элемента жизни. Микроорганизмы поглощают широкий спектр органических соединений – от метана (СH4), метанола (СH3OH) и углекислоты (СO2) до Биотехнологи добиваются сверхсинтеза необходимого продукта метаболизма, что достигается как путем изменения генетической программы организма, так и посредством нарушения его регуляторных систем. природных биополимеров. Кроме углерода клетки нуждаются в азоте, фосфоре и других элементах (K, Mg, Zn, Fe, Cu, Mo, Mn и др.) Важный элемент подготовки питательных сред – стерилизация с целью уничтожения всех посторонних микроорганизмов. Ее проводят термическим, радиационным, фильтрационным или химическим методами.
2. Получение чистых штаммов для внесения в ферментерПрежде чем начать процесс ферментации, необходимо получить чистую высокопродуктивную культуру. Чистую культуру микроорганизмов хранят в очень небольших объемах и в условиях, обеспечивающих ее жизнеспособность и продуктивность (обычно это достигается хранением при низкой температуре).
Необходимо все время поддерживать чистоту культуры, не допуская ее заражения посторонними микроорганизмами.
3. Ферментация – основной этап биотехнологического процесса.Ферментация – это вся совокупность операций от внесения микробов в подготовленную и нагретую до необходимой температуры среду до завершения биосинтеза целевого продукта или роста клеток. Весь процесс протекает в специальной установке – ферментере. бычный ферментер представляет собой закрытый цилиндр, в котором механически перемешиваются среда вместе с микроорганизмами.Через него прокачивают воздух, иногда насыщенный кислородом. Температура регулируется с помощью воды или пара, пропускаемых по трубкам теплообменника. Конструкция ферментера должна позволять регулировать условия роста: постоянную температуру, pH (кислотность или щелочность) и концентрацию растворенного в среде кислорода. По окончании ферментации образуется смесь рабочих микроорганизмов, раствора непотребленных питательных компонентов и продуктов биосинтеза. Ее называют культуральной жидкостью или бульоном.
4. Выделение и очистка конечного продукта По завершении ферментации продукт, который желали получить, очищают от других составляющих бульона. Для этого используют различные технологические приемы: фильтрацию, сепарирование (осаждение частиц взвеси под действием центробежной силы), химическое осаждение и др.5. Получение товарных форм продукта Последней стадией биотехнологического цикла является получение товарных форм продукта. Они представляют собой либо смесь, либо очищенный продукт (особенно если он предназначен для использования в медицинских целях).Примеры биотехнологических производств
Получение аминокислот.Среди веществ, получаемых методами биотехнологии, аминокислоты занимают первое место по объему производства – более полумиллиона тонн в год, однако и это – лишь небольшая доля от потребности в них. Аминокислоты – это структурные единицы, из которых рибосомы строят все необходимые белки организма. Природные аминокислоты вовлечены в биосинтез ферментов, гормонов, витаминов, антибиотиков, токсинов и других азотсодержащих соединений. Белки, в свою очередь, способны синтезировать различные аминокислоты из органического сырья. Но все же половина из необходимых аминокислот не синтезируются в организме человека и животных. Они называются незаменимыми аминокислотами. Недостаток этих аминокислот в питании приводит к нарушению обмена веществ, замедлению роста и развития.Аминокислота Потребность, мг/кг массы в сутки младенцы взрослые
Валин 92 14
Гистидин 33 10
Изолейцин 83 12
Лейцин 135 16
Лизин 99 12
Метионин и цистеин 49 10
Фениланин и тирозин 141 16
Треонин 68 8
Трептофан 21 3
Белки яиц и молока обладают высокой пищевой ценностью – это и неудивительно, ведь растущим детенышам необходим весь спектр аминокислот. Многие белки растительного происхождения имеют дефицит некоторых незаменимых аминокислот. Так, белки пшеницы и риса обеднены лизином и треонином, а белки кукурузы – лизином и триптофаном. Внесение промышленных аминокислот в кормовые концентраты позволяет балансировать корма сельскохозяйственных животных по уровню белка. При добавлении 2_4 кг дефицитных аминокислот к 1 т. комбикорма общий расход кормов уменьшается на 15_20%, а выход мяса и молока увеличиваетсяна 20%. Это позволило перевести животноводство на промышленную основу. Помимо применения в качестве пищевых добавок, приправи усилителей вкуса аминокислоты используют как сырье в химической, парфюмерной, фармацевтической промышленности и т. п. Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия у некоторых микроорганизмов способности вырабатывать их во внешнюю среду.
Так, штамм Corynebacterium glutamicum является продуцентом глутамата. Его использовали при организации первого в мире крупномасштабного биотехнологического производства самой популярной пищевой добавки, глутаминовой кислоты, в Японии в 1956 году.Промышленными продуцентами лизина являются штаммы бактерий вида Corinebacterium glutamicum. Лизин относится к числу незаменимых аминокислот. В России недостаток этой аминокислоты не может быть восполнен за счет богатой ею сои, поэтому в нашей стране производство лизина было организовано первым, в первую очередь – для удовлетворения потребностей животноводства.Перспективные штаммы продуцентов постоянно улучшают селекцией мутантов с измененной генетической программой и регуляторными свойствами.
Получение витаминов.Витамины – незаменимые соединения различной химической природы, выполняющие каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию патологических состояний. В организме человека и животных витамины не образуются. К их синтезу способны только растения и ряд микроорганизмов. Способность последних вырабатывать необходимые человеку витамины легли в основу их промышленного производства. Получение органических кислот Методы промышленной микробиологии широко применяются для производства некоторых органических кислот, необходимых человеку. Вырабатываемая микробами уксусная кислота используется в пищевой промышленности, производстве каучука, пластмассы, волокон, инсектицидов. Лимонную кислоту широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности, а также для очистки металлов. Производство лимонной кислоты принадлежит к числу старейших микробиологических процессов, оно было организовано в 1893 году. С 20_х годов прошлого века налажено промышленное производство D глюконовой кислоты из глюкозы при участии Aspergillus niger. Ее используют для извлечения металлов, борьбы со ржавчиной, как моющее средство и в качестве медицинского препарата. Также из глюкозы получают итаконовую кислоту, использующуюся для производства пластмасс и красителей. Получение антибиотиков Антибиотики – это вещества биологического происхождения, способные убивать микроорганизмы или угнетать их рост. В природе при помощи антибиотиков микроорганизмы борются друг с другом. Антибиотики делят на бактерицидные, вызывающие гибель микроорганизмов, и бактериостатические, нарушающие способность микроорганизмов делиться. Первый антибиотик – пенициллин, образуемый плесневым грибом Penicillium notatum, открыл английский бактериолог А.Флеминг (1928). «Оружие микробов» развеяло представления о неизлечимости многих бактериальных заболеваний (туберкулез, сепсис, сифилис и др.) Организация крупномасштабного производства антибиотиков в 40_х годах ХХ века сыграло решающую роль в становлении промышленной биотехнологии. Количество открываемых антибиотиков постоянно растет.В 1940 году было известно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано более 12 000 аналогичных соединений, из которых в медицине применяют около 200 препаратов. 97% антибиотиков токсичны и для человека, поэтому на практике не используются. Ежегодно в мире производится антибиотиков почти на 20 млрд. долларов. Антибиотики продуцируются плесневыми грибами, актиномицетами, эубактериями и другими микроорганизмами. Среди актиномицетов наибольший вклад вносит род Streptomyces, один из видов которого, Streptomyces griseus, синтезирует более 50 различных антибиотиков.Получение ферментов. Ферменты (от лат. fermentum – закваска), или энзимы (от греч. еn – внутри + zyme – закваска) – белки_катализаторы, присутствующие в каждой клетке. Ускоряя биохимические реакции, ферменты направляют и регулируют все процессы обмена веществ. Ничтожное количество ферментов способно вызывать разложение больших масс других органических веществ, не расходуясь при этом. Будучи самостоятельными химическими веществами, ферменты сохраняют каталитическую активность и вне клеток. В отличие от химических катализаторов, ферменты нетоксичны, используют доступное сырье (в т. ч. отходы), в связи с чем их применение в промышленности выгодно и с экологической, и с экономической точек зрения. Ферменты находят широкое применение в текстильной, кожевенной, целлюлознобумажной, медицинской, химической и пищевой промышленности. В медицине распространена практика использования ферментов в диагностических целях, например, для выявления инфаркта миокарда или заболеваний печени.Источником ферментов могут выступать все живые существа. Для их получения пригодны некоторые растительные организмы на определенной фазе их развития (проросшие зерна злаков и бобовых), а также отдельные ткани и органы животных (поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочнокишечного тракта, сычуг рогатого скота, семенники половозрелых животных). Однако для массового производства ферментов используют микроорганизмы.
53 Принципы масштабирования процессов ферментации .Критерии масштабного перехода Ферментация – основная стадия в биотехнологическом процессе, на которой происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образуются целевые продукты. Она осуществляется в биохимическом реакторе (ферментаторе) и может быть организована различными способами, в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к качеству и типу конечного продукта.Любой биотехнологический процесс проходит в три основных стадии: • предферментационная,• ферментационная • постферментационная Предферментационная стадия.На этой стадии осуществляется хранение и подготовка культуры продуцента (инокулята). Инокулятом называется микроорганизм или биомасса, которая будет производить целевой продукт; иными словами, это «посевной материал», который будет основным участником производства. В производстве биопрепаратов обычно используются бактерии и низшие грибы, однако иногда в качестве продуцентов могут выступать клетки высших эукариот (насекомых, млекопитающих, растений). Продуцент, его физиолого-биохимические свойства и характеристики определяют эффективность всего биологического процесса.[2]Также на предферментационной стадии проводится подготовка и получение питательных субстратов и сред, технологических и рециркулируемых воды и воздуха, настройка ферментационной аппаратуры. Компоненты питательных сред выбирают на основании расчета материального баланса, связанного с трансформацией источника питания в клеточную биомассу и/или метаболит с учетом расходуемой (выделяемой) энергии.[2]Промышленный штамм Подготовленный к процессу инокулят носит название промышленного штамма. В идеале промышленный штамм должен удовлетворять следующим требованиям: • стабильности структурно-морфологических признаков, физиологической активности и эксплуатации в производстве; • повышенной скорости роста и биосинтеза целевого(-ых) продукта(-ов);• достаточно широкому диапазону устойчивости к неблагоприятным внешним факторам (колебаниям температуры, перемешиванию, рН, вязкости среды); умеренной требовательности к ограниченному числу источников питания; чем более широкий набор источников азота, углерода и других элементов может использовать производственный штамм, тем легче и с большей выгодой его культивируют.
При выращивании посевных доз инокулята используют принцип масштабирования, т.е. проводят последовательное наращивание биомассы продуцента в бутылях, колбах, далее – в серии последовательных ферментаторов. Как правило, каждый последующий этап процесса на порядок отличается по объему от предыдущего. Полученный продуцент направляется по стерильной посевной линии далее в аппарат, где реализуется ферментационная стадия.Приготовление питательных сред. Приготовление питательных сред происходит в специальных реакторах, оборудованных мешалками, обеспечивающими массообмен. В зависимости от совместимости и растворимости компонентов сред могут быть использованы отдельные реакторы. Технология приготовления значительно усложняется, если в состав сред входят нерастворимые компоненты.Ферментация .Ферментация может происходить в строго асептических условиях или без соблюдений правил стерильности (т.н. незащищенная ферментация); на твердых и жидких средах, аэробно и анаэробно.Аэробная ферментация протекает глубинно (во всей толще питательной среды) или поверхностно. Культивирование биологических объектов может осуществляться в проточном или периодическом режимах, полунепрерывно с подпиткой субстратом.Постферментационная стадия Получение готовой товарной продукции, а также обезвреживание отходов побочных продуктов обеспечивает постферментационная стадия. Культуральная жидкость, которая образуется в процессе ферментации - это сложная многофазная система: в водной фазе содержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, мельчайшие капельки жира и пузырьки воздуха, не потребленные компоненты питательной среды. Концентрация целевого продукта обычно составляет в ней не более 1,5%, то есть 10% сухого остатка и меньше.В зависимости от целевого назначения конечного продукта, его вида (культуральная жидкость или клетка) и его природы, на постферментационной стадии используют различную аппаратуру, способы выделения и очистки. Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках.Виды ферментаторов
Основное назначение ферментатора состоит в том, чтобы обеспечить оптимальные условия для развития инокулята и образования целевого продукта. Если рассматривать общее устройство данного аппарата, то он, как правило, выглядит в виде вертикального стального цилиндра с полукруглым дном. В верхней части находится крышка с отверстиями для ввода питательной среди, а из нижней сливается культуральная жидкость. Конструкция аппарата позволяет создать наилучшие условия для производства: он оснащен мешалками, трубками для подачи и вывода воздуха, приспособлениями, обеспечивающими равномерность концентрации растворимых веществ и коллоидных частиц в среде.Ферментаторы классифицируются по способу ввода энергии для перемешивания:
• ФГ с подводом энергии газовой фазой. Аппараты характеризуютсяконструктивным оформлением и высокой надежностью в связи с отсутствием движущихся узлов и деталей. Тип ферментатора: барботажный, барботажно-эрлифтный, колоночный (колонный), форсуночный.[2]
• ФЖ с подводом энергии жидкой фазой. В аппаратах энергия передается жидкой фазе самовсасывающейся мешалкой или насосом. Тип аппарата: эжекционный, с циркуляционным контуром, с всасывающей мешалкой.[2]
• ФЖГ (комбинированные), где основным элементом является перемешивающее устройство, которое обеспечивает высокую интенсивность растворения кислорода и высокую степень диспергирования газа. В то же время, энергия газовой фазы выводится обычным способом. Тип аппарата: барботажный с механическим перемешиванием.[2]
• масштабные переходы предлагается делать на основе сохранения постоянства некоторых геометрических, гидродинамических, тепловых и химических критериев подобия. При этом предполагается возыокность любого масштабного перехода, например одностадийный переход от лабораторного к заводскому масштабу. • Выше уже отмечалось, что масштабные переходы и оптимальное проектирование возможны, если постоянные коэффициенты математического описания не зависят ( или зависят незначительно) от размеров установкой описан метод определения допустимой величины масштабного перехода. Для того, чтобы осуществить надежные масштабные переходы, необходимо выполнение двух условий. Во-первых, характер режима должен быть четко определен. Например, силы сопротивления должны определяться или вязкостью, или поверхностным натяжением, или весом, но не комбинацией этих трех факторов. При этом в случае масштабного перехода динамическое подобие определяется одним безразмерным комплексом, который представляет собой отношение приложенной силы к силе сопротивления. • Критерии подобия являются основой для масштабного перехода. Критерии часто вступают в противоречие друг с другом. При рассмотрении процессов, протекающих в химических реакторах, важную роль играет понятие сопротивления, определяемое как отношение некоторой движущей силы к переносимым за единицу времени количеству движения, массе, теплу или к количеству превратившегося химического вещества. При увеличении масштаба относительные величины соответствующих сопротивлений меняются. • Ни один из приведенных критериев масштабных переходов несовместим с любым другим. Это проиллюстрировано на рис. III-4, где дана зависимость скорости вращения мешалки от мощности для смесителей различных объемов, соответствующих по форме аппарату стандартной конструкции. • Поиски законов подобия для осуществления масштабного перехода закончились, как известно, безрезультатно: обилие констант, входящих в выражения для скоростей реальных химических реакций, делает масштабное моделирование невозможным. Попытки математического моделирования работы химических реакторов, наоборот, почти всегда заканчиваются успешно. Основной результат, как правило, состоит в следующем: если имеются экспериментально полученные профили температуры и концентрации реагентов в аппарате, то путем численных расчетов можно подобрать значения эффективных коэффициентов переноса и скоростей реакций, при которых расчетные кривые будут примерно совпадать с исходными экспериментальными зависимостями. Последнее воспринимается как свидетельство работоспособности использованной математической модели процесса; но этого условия вовсе недостаточно. Основным критерием работоспособности модели является экспериментальное подтверждение предсказанных результатов. Определенные из сравнения с одним экспериментом значения коэффициентов модели должны описывать все другие эксперименты в достаточно широком диапазоне изменения параметров системы, например при изменении линейных размеров аппарата на один-два порядка. • При моделировании должна решаться проблема масштабного перехода. С увеличением размера аппарата обычно ухудшается его эффективность по сравнению с эффективностью лабораторной модели. [7]
•Кинетическое и диффузионное подобие при масштабном переходе определяется тем, что в модели и в натуре очистке подвергают сточные воды, содержащие одни и те же ингредиенты.
54Перемешивание в биотехнологических производствах,проблемы возникающие при перемешивании культурной жидкости и пути преодоления перемешивание в биотех производствах.проблемы, возникающие при перемешивании культуральной жидкости и пути преодоления.Одним из важных факторов процесса глубинного культивирования микроорганиз¬мов является перемешивание культуральной жидкости (к.ж.), способствующее вы¬равниванию растворенных компонентов пи¬тающего субстрата, кислорода и продуктов метаболизма по всему объему аппарата. В результате оптимизации этого процесса может быть сильно повышена его производительность и снижены энергетические затраты. Тщательное перемешивание культуры необходимо, во-первых, для равномерной доставки питательных веществ к клеткам и, во-вторых, для предотвращения накопления токсичных побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом отсеке биореактора.Эффективное перемешивание относительно легко обеспечить при культивировании в небольших объемах, при крупномасштабном же культивировании поддержание гомогенности культуральной среды становится одной из главных проблем. Перемешивание культуральной среды влияет и на другие параметры: скорость переноса кислорода из пузырьков газа в жидкую среду, а затем из среды в клетки; эффективность теплопередачи; точность измерения концентрации метаболитов в культуральной жидкости; эффективность диспергирования добавляемых реагентов (кислот, оснований, питательных веществ и т.Однако при чрезмерном перемешивании среды в ней могут возникнуть гидромеханические эффекты, губительные для бактериальных клеток. При интенсивном перемешивании культуральной среды в процессе ферментации часто происходит ее вспенивание. Проблемы возникающие при перемешивании культуральной среды пытались решить разными способами: изменением конструкции биореакторов, повышением интенсивности продувания воздуха и перемешивания, добавлением в среду веществ, увеличивающих растворимость кислорода, усовершенствованием устройств для перемешивания.
55 Этапы завершающей стадии биотехнологического процесса .Принципы разделения веществ .отделение биомассы от культурной жидкости Завершающая стадия биотехнологического процесса — выделение целевого продукта. Эта стадия существенно различается в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса (рис. И). Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от куль-туральной жидкости, разрушить (дезинтегрировать) и далее целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток. Выделение продукта облегчается, если он высвобождается (экскретируется) продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому понятно стремление биотехнологов получить методами генетической инженерии промышленные штаммы микроорганизмов, экскретирующих возможно большее количество ценных продуктов.Технология выделения и очистки в значительной степени зависит от природы целевого продукта. Так, ферменты (протеазы, целлюла-зы и т. д.) выделяют путемосаждения органическими рис п основные этапы отделения и растворителями ИЛИ СуЛЬфа- очистки биотехнологических продуктов том аммония. Имеется возможность обойтись без их полной очистки, поскольку в народном хозяйстве широко используют смешанные ферментные препараты, содержащие несколько белков, близких по физико-химическим свойствам. В то же время т?-кие ферменты, как эндо- и экзонуклеазы, лигазы, требукУг сложной многоэтапной очистки с применением тонких методов препаративного разделения. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще не включают этапа отделения продукта. Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание основного компонента и наличие многих примесных веществ.В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки культуральной жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию. Жидкость далее также подвергается переработке, если содержит метаболиты, представляющие практическую ценность. В производствах, где целевым продуктом являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается лишь очистке, позволяющей использовать водную фазу многократно и снизить образование сточных вод.Технологические приемы, используемые для отделения клеток от среды зависят от природы продуцента. Например, сахаромицеты (хлебопекарные дрожжи) имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и получают продукт с высоким содержанием живых клеток, имеющих высокую хлебопекарную активность.Дрожжи же рода Candida, служащие источником кормового белка плохо флотируются и фильтруются. Поэтому дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты белка на основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются, причем в несколько ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все компоненты жидкой фазы остаются в конечном продукте. К аналогичному приему прибегают и при производстве бактериальных энтомопатогенных препаратов и удобрений. Конечный продукт удается получить в активной форме лишь в принципе отказавшись от выделения его из культуральной жидкости: содержимое реактора выпаривают и сушат в условиях, обеспечивающих жизнеспособность конечного продукта. Неутилизированные компоненты культуральной жидкости могут отразиться на способности продукта к хранению.При выделении и очистке метаболитов биомасса, если она не содержит заметных количеств целевого продукта, осаждается добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно - физическое осаждение.Отделение твердой фазы (мелкодисперсный клеточный материал, внутриклеточные биополимеры возможно и методом фильтрации. Так как фильтруемая суспензия склонная к гелеобразованию, то производительность фильтров быстро падает. Предотвратить это можно добавлением в смесь или на фильтрующую ткань размолотых вулканических пород, содержащих оксиды кремния и алюминия, тогда осадки приобретают пористую структуру.Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость.Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор.Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента (например интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы.К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпресия (сжатие с последующим резким снижением давления).Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Культуральную жидкость освобождают от сопутствующих растворимых веществ и фракционируют.Освобождение от растворимых веществ производят несколькими способами:1. Осаждение – физическое (нагревание, охлаждение, разбавление, концентрирование) или химическое (с помощью органических и неорганических веществ).Осаждение органическими растворителями основано на снижении диэлектрической постоянной среды. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного слоя у молекулы. Если его разрушить, белки осаждаются. Для этого молекулы добавляемых веществ должны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50% этанол осаждает 80% протеазы и 3-5% амилазы, 70% спирт осаждает 98% амилазы.Высаливание - механизм тот же, что и при действии органических веществ, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия.2. Экстракция.При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидкожидкофазной – из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Для извлечения антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов применяют жидкожидкофазную экстракцию, когда культуральную жидкость смешивают с органическими растворителями.
3. Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент – твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: - катионит - карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит - диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному механизму.Отделение биомассы от культуральной жидкостиПервым этапом на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы — сепарация. Иногда сепарации предшествует специальная обработка культуры — изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белков или флокуллянтов для более эффективного отделения биомассы и стабилизации продуктов. Существуют различные методы сепарации.1. Флотация. Метод может быть применен, если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости. -Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоящую из пузырьков газа с прилипшими к ним клетками. Повышение эффективности отбора биомассы в виде концентрированной суспензии достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя. Флотацию широко используют как первый этап отделения дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости. К достоинствам метода относятся экономичность, высокая производительность, возможность применения в условиях непрерывного процесса.2. Фильтрация. Все применяемые в настоящее время виды фильтров, барабанные, дисковые, ленточные, тарельчатые, карусельные вакуум-фильтры, фильтр-прессы различных конструкций, мембранные фильтры (В.А.Быков и др., 1985; В. Sikyta, 1984 е) используют один и тот же принцип — задержание биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Диаметр пор может превышать размеры клеток, что практически не снижает эффективность фильтрации. Даже если первая небольшая порция биомассы проскакивает через фильтр, в дальнейшем по мере прохождения жидкости диаметр капиллярных каналов сужается из-за прилипания частиц к стенкам, образуются скопления клеток у фильтрующей поверхности, препятствующие прохождению новых порций биомассы через фильтр. По мере утолщения слоя биомассы на фильтре скорость протока жидкости через него падает.Для фильтров непрерывного действия, рассчитанных на длительное пользование, предусматривают системы автоматического удаления слоя биомассы, забивающего поры. Биомассу сдувают с поверхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным ножом. Такие способы удаления биомассы характерны, в частности, для барабанного вакуум-фильтра, представляющего собой полый цилиндр, погруженный в культуральную жидкость. Внутренний объем барабана отделен от жидкости фильтрующим мелкопористым материалом. Ток жидкости через фильтрующий слой создается путем откачивания воздуха изнутри барабана вакуумным насосом.Существуют также фильтры, предназначенные для однократного или многократного периодического использования. Среди них выделяются мембранные (например, тефлоновые) фильтры, позволяющие проводить фильтрацию очень разбавленных клеточных суспензий. Однако проблемой при использовании мембранных фильтров является их закупорка клетками, белками, коллоидными частицами. Приемы срезания или сдувания материала, закупоривающего поры, здесь непригодны, поскольку при этом мембранные фильтры повреждаются. Один из путей преодоления проблемы — покрытие мембран гидрофильным слоем, препятствующим контакту белков (коллоидов) с мембраной (S. Le Minh, Y. P. Billigheimer, 1985).3. Центрифугирование. Метод основан на осаждении взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Ценрифугирование требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя (B.Sikyta, 1984 е), если: а) суспензия фильтруется медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие. Центрифугирование и фильтрация в некоторых производственных процессах реализуются в комбинации — речь идет о фильтрационных центрифугах. Широко применяют центрифуги, где разделение жидкой и твердой фаз не связано с фильтрацией и основано лишь на центробежной силе. Используют центрифуги различных типов, классифицируемые по скорости вращения сосуда (стакана) для разделения биомассы и культуральной жидкости, по способу выгрузки осевшей биомассы и по другим критериям. Наиболее перспективны для осаждения биомассы центрифуги-сепараторы, в которых биомасса оседает на стенках вращаемого цилиндра или на тарелках специальной тарельчатой вставки
56 Этапы завершающей стадии биотехнологического процесса.Методы разрушения клеток Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными. Далее приводится характеристики каждой из стадий промышленного микробиологического синтеза Методы разрушения клетокРазрушение клеток (дезинтеграцию) проводят физическим, химическим и химико-ферментативным методами.Наибольшее индустриальное значение имеет физическое разрушение: 1) ультразвуком; 2) с помощью вращающихся лопастей или вибраторов — метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках (В. Sikyta, 1984е); 3) встряхиванием со стеклянными бусами; 4) продавливанием через узкое отверстие под высоким давлением; 5) раздавливанием замороженной клеточной массы; 6) растиранием в ступке; 7) осмотическим шоком; 8) замораживанием — оттаиванием; 9) сжатием клеточной суспензии с последующим резким снижением давления (декомпрессия).Физические способы разрушения более экономичны, чем химические и химико-ферментативные. Они осуществляются без применения дорогостоящих и дефицитных реактивов и ферментных препаратов. В то же время этим способам дезинтеграции клеток присуща определенная неизбирательность: обработка может отрицательно влиять на качество получаемого продукта. При тонкой регулировке условий дезинтеграции некоторые из физических методов позволяют целенаправленно выделить какую-либо одну фракцию внутриклеточного содержимого.Осторожное и избирательное разрушение клеточной стенки возможно при использовании химических и химико-ферментативных методов. Так, клетки грамотрицательных бактерий обрабатывают лизоцимом в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты, а клетки дрожжей—зимолиазой улитки или ферментами грибов, актиномицетов. К разрушению клеточной стенки микроорганизмов ведет обработка клеток толуолом или бутано-лом, что находит промышленное применение при получении дрожжевого автолизата и ряда ферментов (инвертаз, пеницил-линамидазы). Эффективный лизис клеток вызывают антибиотики полимиксины, тироцидины, новобиоцин, нистатин и другие, некоторые поверхностно-активные вещества, а также глицин. Можно использовать автолиз клеток при лимитированном по определенному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагами. Последний вариант сопряжен с риском неконтролируемого распространения фага в промышленных установках и поэтому не получил применения.За дезинтеграцией клеток следует этап отделения фрагментов клеточных стенок. Используют те же методы, что и при сепарации клеток: центрифугирование или фильтрацию. Однако, соо-образуясь с размерами субклеточных частиц, п рименяют более высокоскоростные центрифуги и фильтры с меньшим диаметром пор (часто мембранные), чем при сепарации клеток. В большинстве биотехнологических процессов клеточные стенки отбрасывают как балласт, но возможно и промышленное получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта.
57 Мембранные методы разделения продуктов биотехнологического производства .Мембранные технологии – технологии, относящиеся к процессу разделения жидких смесей на полупроницаемых перегородках (их называют баромембранными технологиями). Внешне они похожи на обычную фильтрацию, так как движущей силой процесса является разность давлений. В действительности с помощью полунепроницаемых мембран разделяются истинные растворы (гомогенные системы), в то время как фильтрованием можно лишь разделить суспензию, т.е. отделить твердую фазу от жидкой.Считая мембранные методы фильтрованием на молекулярном уровне, можно условно разместить мембранные методы следующим образом: обратный осмос, нанофильтрация, ультрафильтрация и микрофильтрация по порядку увеличения размера и молекулярной массы задерживаемых частиц.В настоящее время мембранные методы широко распространены в биотехнологической, пищевой, фармацевтической, химической промышленности. Ни одно современное производство ферментов не обходится без ультрафильтрационной очистки и концентрирования продукта.Физико-механический процесс мембранных методов заключается в следующем. Растворение вещества в растворителе происходит при их сродстве друг к другу. При этом на уровне межмолекулярного взаимодействия происходит сольватация молекулами растворителя молекул или ионов растворяемого вещества. Если речь идет о водных растворах, то процесс называется гидратацией. Молекулы воды представляют собой крохотный диполь.Ее энергия связи с частицей растворимого вещества тем больше, чем больший заряд несет эта частица на себе. С возрастанием заряда иона увеличивается количество молекул воды, связанной с ионом в виде многослойной гидратной оболочки. Образованием гидратных оболочек объясняется явление, называемое прямым осмосом.Ультрафильтрация – это фильтрация под давлением с помощью полупроницаемых мембран, изготовленных на основе синтетических полимерных (ацетат целлюлозы, полиамид, полисульфон) и керамических материалов.Обратный осмос – это разделение растворов через полупроницаемые мембраны с порами размером менее 50 нм при давлении 1-10 МПа. Применяется для концентрирования молочного сырья [Крусь, 2006].Электродиализ – перенос ионов из одного раствора в другой, осуществляется через мембрану под действием электрического поля, создаваемого электродами, расположенными по обе стороны мембраны.
58 Выделение и очистка продуктов биотехнологического производстваПродукты микробиологического синтеза, будь то клетки, споры или метаболиты, поступают из биореактора в виде водных суспензий или растворов; в обоих случаях характерно невысокое содержание основного компонента и наличие многих примесных веществ. В большинстве промышленных производств, использующих клетки микроорганизмов без их предварительной иммобилизации, в качестве первого этапа переработки культуральной жидкости производят отделение биомассы продуцента от жидкой фазы, которая далее также подвергается переработке, если она содержит метаболиты, представляющие практическую ценность.распространенным методом оптимизации периодических технологических процессов в биотехнологии остается поэтому адаптационная оптимизация, когда с помощью достаточно мощной ЭВМ контролируется набор необходимых сведений о текущих параметрах культуральной среды, прогнозируется (на основании имеющегося формализованного опыта) дальнейший ход процесса и предпринимается корректировка условий и состава среды для обеспечения наиболее эффективного хода процесса на последующем этапе.Во многих случаях условием биотехнологического производства оказывается необходимость возможно более полного исчерпания компонентов питательной среды на стадии ферментации, с тем чтобы они не попадали на последующие стадии переработки. Это обстоятельство может быть связано с двумя основными причинами: дороговизной или дефицитностью субстрата или его вредным воздействием на качество готового продукта. Последний случай наиболее характерен для производства дрож-.жей на парафинах, когда выделение остаточных количеств углеводородов из клеточной массы затруднено, а количество примесей в конечном продукте жестко нормировано. Это приводит к необходимости оснащать ферментационное оборудование дополнительными секциями для так называемого дозревания, когда происходит утилизация клетками тех углеводородов, которые были запасены в цитоплазме на предыдущих стадиях роста.В ряде случаев необходимость полной утилизации компонентов питательной среды связана не только с их высокой стоимостью и влиянием на качество продукта, но и с затруднениями, возникающими на стадии выделения и очистки метаболитов как целевых продуктов при одновременном присутствии в культуральной жидкости каких-либо неутилизированных питательных веществ. Таким образом, технология ферментации тесно увязана и оказывает в ряде случаев решающее влияние на технологическое и аппаратурное оформление последующих стадий, прежде всего выделения целевого продукта, как это показано в соответствующих главах
59 Методы тонкой окчисти продуктов биотехнологического производстваМетоды тонкой очистки веществ: виды хроматографии, двумерный электрофорез , ВЖХ, ультрацентрифугированиеБолее тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами.Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта).По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул.Можно разделять молекулы методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные молекулы проходят через колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями.В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их:заряду (ионообменная хроматография),гидрофобности (гидрофобная хроматография),размеру (хроматография гель-фильтрацией)или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография).При ионообменной хроматографии нерастворимый матрикс содержит ионы, задерживающие молекулы с противоположным зарядом. Для разделения молекул используются следующие матриксы: диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) - заряжена положительно; карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюлоза) и фосфоцеллюлоза - заряжены отрицательно. Силы взаимодействия между молекулами в растворе и ионообменником определяются ионной силой и рН элюирующего раствора.Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи; в таких колонках задерживаются белки с обнаженными гидрофобными участками.Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми инертными шариками; при использовании таких колонок происходит разделение белков по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми. В качестве матрикса можно использовать зерна поперечно-сшитого полисахарида (декстран или агароза).Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров.Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок.Связываемые иммобилизованным субстратом молекулы фермента можно элюировать концентрированными растворами субстрата в свободной форме, а молекулы, связанные с иммобилизованными антителами, можно элюировать за счет диссоциации комплекса антитело-антиген концентрированными растворами соли или растворами низкого или высокого рН. Однократная хроматография на такой колонке позволяет зачастую достигнуть очень высокой степени очистки препарата.Разрешение обычной колоночной хроматографии ограничено негомогенностью матриксов (например, целлюлозы), что вызывает неравномерное протекание растворителя через колонку. Разработанные недавно хроматографические смолы (в основу которых обычно положен кремний) имеют форму мельчайших сфер от 3 до 10 мкм в диаметре, которые упакованы в специальный чехол и образуют гомогенную колонку. Такие колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ) обеспечивают высокий уровень разрешения. Поскольку частицы носителя в колонках для ВЖХ упакованы очень плотно, в отсутствие высокого давления скорость потока через них незначительна. По этой причине такие колонки обычно помещают в стальные цилиндры, соединенные со сложной системой насосов и шлангов, которые обеспечивают необходимое для высокой скорости протока давление.В традиционной колоночной хроматографии скорость протекания через колонку может быть довольно низкой (примерно один объем колонки в час), таким образом, у разделяемых растворов достаточно времени для уравновешивания с внутренним содержимым крупных частиц матрикса. В условиях ВЖХ происходит быстрое уравновешивание растворов с внутренним содержимым крошечных сфер, так что растворы, обладающие различным сродством к матриксу, эффективно разделяются даже при высокой скорости потока. Таким образом, ранее для достижения плохого разделения с помощью колоночной хроматографии требовались часы, а в настоящее время благодаря ВЖХ качественное фракционирование занимает минуты. Вот почему именно этот метод чрезвычайно популярен сейчас для разделения и белков, и малых молекул.Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их высокоскоростному центрифугированию. Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. Центрифугирование является, как правило, первым этапом фракционирования, с его помощью разделяются только значительно отличающиеся по размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций, необходимо гомогенат наслоить тонким слоем поверх солевого раствора.При ультрацентрифугировании различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют отдельные полосы, которые можно выделить. Во избежание перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать инертный и хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно увеличивается сверху вниз, формируя градиент плотности. При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно выделить.Скорость седиментации каждого из компонентов определяется его размерами и формой и обычно выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S. Скорость вращения до 80000 об/мин, так что на разделяемые частицы действуют силы, превосходящие силу тяготения более чем в 500000 раз. Под действием столь больших сил даже сравнительно небольшие макромолекулы, такие, как тРНК или простейшие ферменты, разделяются и распределяются в строгом соответствии со своими размерами. Измерение коэффициента седиментации макромолекулярных комплексов обычно используют для определения их общей массы и количества входящих в их состав субъединиц.Ультрацентрифуга разделяет клеточные компоненты не только по массе, но и по плавучей плотности. В этом случае образец седиментирует в крутом градиенте, образованном высококонцентрированным раствором сахарозы или хлористого цезия. Компоненты клеток опускаются по градиенту до тех пор, пока не достигнут участка, плотность раствора в котором равна собственной плотности компонентов. Дальнейшей седиментации компонентов не происходит и они «застревают» на этом уровне. Таким образом в центрифужной пробирке возникает набор различных полос.Метод центрифугирования в градиенте хлористого цезия был разработан в 1957 году для доказательства полуконсервативности репликации ДНК.Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот.Если белковые молекулы поместить в электрическое поле, они начинают перемещаться со скоростью, которая определяется их суммарным зарядом, а также формой и размерами. В середине 60-х годов был разработан модифицированный метод электрофореза - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ). При использовании данного метода белки мигрируют в инертном матриксе-полиакриламидном геле с высоким содержанием поперечных сшивок. Обычно гель готовят полимеризацией мономеров непосредственно перед использованием. Размеры пор геля могут быть подобраны произвольно с тем, чтобы гель мог замедлить миграцию определенных молекул. При этом белки находятся в растворе,содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецил-сульфат натрия или ДСН (SDS).Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. Каждая молекула белка связывает значительное количество молекул детергента, приобретая суммарный отрицательный заряд. По этой причине белок после того, как будет приложено напряжение, начнет двигаться в направлении положительного электрода.Белки одного размера ведут себя сходным образом, поскольку,во-первых, их природная структура полностью нарушена ДСН так, что их форма идентична, во-вторых, они связывают одинаковое количество ДСН и приобретают одинаковый негативный заряд. Крупные белки, обладающие большим зарядом, подвергаются действию значительных электрических сил, а также более существенному торможению. В обычных растворах эти эффекты, как правило, взаимно погашаются, но в порах полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие молекулы тормозятся значительно сильнее, чем малые, поэтому оказываются ближе к стартовой линии. Смесь молекул делится на ряд полос, расположенных в соответствии с их молекулярной массой.Выявить эти полосы можно путем окрашивания соответствующим красителем. Например, белки индентифицируются красителем кумасси синим. Известно, что близко расположенные полосы в геле могут перекрываться. Этот эффект препятствует выявлению большого количества белков (не больше 50) с помощью одномерных методов их разделения.Метод двумерного гель-электрофореза, в котором объединены две различные процедуры разделения, позволяет идентифицировать более 1000 белков. Результаты при этом получают в виде «двумерной» белковой карты.При работе данным методом на первом этапе белки разделяют по их заряду. Для этого образец помещают в небольшой объем раствора, содержащего неионный (незаряженный) детергент-меркаптоэтанол, и в качестве денатурирующего агента-мочевину. В этом растворе происходит солюбилизация, денатурация и диссоциация всех без исключения полипептидных цепей; при этом изменения заряда цепей не происходит.Диссоциированные полипептидные цепи разделяют затем методом изоэлектрического фокусирования, основанном на изменении заряда белковой молекулы при изменении рН окружающей среды. Каждый из белков может быть охарактеризован изоэлектрической точкой - значением рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю, и, следовательно, белок не способен перемещаться под действием электрического поля. При изоэлектрическом фокусировании белки подвергаются электрофорезу в геле, в котором с помощью специальных буферов создается градиент рН. Под действием электрического поля каждый белок перемещается в ту зону градиента, которая соответствует его изоэлектрической точке и остается в ней.
Так происходит разделение белков в одном направлении двумерного гель-электрофореза. На втором этапе гель, содержащий разделенные белки, снова подвергается электрофорезу, на этот раз в направлении перпендикулярном тому, что на первом этапе. В этом случае электрофорез ведут в присутствии ДСН и белки разделяют по их молекулярной массе, как в одномерном ДСН-ПААГ. Исходный гель пропитывают додецил-сульфатом натрия и, поместив его на блок ДСН-ПААГ-геля, проводят электрофорез, в ходе которого каждая из полипептидных цепей мигрирует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Неразделенными в результате остаются только те бели, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе; такое сочетание встречается очень редко.
60 Методы сушки продуктов микробиологического производства
Естественная сушка пищевого сырья используется при благоприятных климатических условиях. Осуществляется она простым раскладыванием продукта на стеллажах, щитах или сетках. Сушка проходит на открытом воздухе.Конвективная сушка. Подогретый сушильный агент движется через слой продукта. Скорость его составляет от 1 до 5 м/с.Распылительная сушка осуществляется быстрым испарением жидких пищевых продуктов при распылении в высокотемпературной среде. Распылением достигается большая площадь поверхности высушиваемого пищевого сырья. Это позволяет интенсивно подводить тепло к продукту сушки. В результате данный процесс занимает очень мало времени – от 1 до 10 с. В данном методе сушки теплопередача осуществляется в основном за счёт конвекции или радиации (инфракрасное излучение). Часто эти два способа используются совместно. Сушка распылением используется для производства порошковых продуктов питания. Например, осуществляется сушка яичного порошка, соков, крахмала. Для сухих фруктовых и овощных соков важно сохранить их аромат. Для этого сушильные установки работают с более низкими температурами испарения жидкости. Это вызывает необходимость создавать вакуум, что делает подобное оборудование достаточно сложным.
Вальцовая сушка сырья осуществляется нанесением тонкого слоя продукта на цилиндрическую поверхность вальцов, которые специально подогревают. Толщина слоя обычно рассчитывается так, чтобы он высыхал за 40-60 с. Дальше он соскабливается специальными ножами.Сушка вспененных продуктов осуществляется на перфорированных металлических поддонах с помощью конвекции. Данным способом сушат предварительно вспененное овощное и фруктовое сырьё. Для вспенивания продукта в миксер добавляют специальные присадки. Процесс вспенивания происходит в атмосфере инертных газов.
Вакуумная сушка проходит при пониженном давлении. Благодаря этому температура в сушильной камере может быть заметно снижена.Эксплозионная (взрывная) сушка основана на эффекте теплового шока. Весь содержащийся в пищевом сырье объём воды вскипает под воздействием резкого снижения давления в сушильной камере. Предварительно происходит нагревание до температуры близкой к температуре кипения воды. Так как давление падает, то вода, оказавшись в данных условиях в перегретом состоянии, моментально вскипает. Такой процесс разрушает внутреннюю структуру материала. Он становится вспененным, т.е. воздушным. Сушить продукт с такой структурой довольно просто. Взрывную сушку осуществляют либо снижением повышенного давления в сушильной камере до атмосферного, либо снижением давления, ниже атмосферного (созданием вакуума). В первом случае начальная температура сырья превышает 100 градусов, а во втором процесс осуществляется при более низких температурах.
Сушка в кипящем слое и аэрофонтанная сушка проходят при продувании сушильного агента через слой сыпучего продукта снизу вверх. Эти два метода схожи, но имеют следующие отличия. Аэрофонтанная сушка осуществляется при более высокой скорости сушильного агента и большем расстоянии между частицами высушиваемого продукта. Для реализации кипящего слоя (его ещё называют псевдоожиженным) необходимо чтобы скорость сушильного агента была от 1 до 5 м/с, а вот при аэрофонтанной сушке его скорость повышают до 12 – 14 м/с.
Инфракрасная сушка и сушка в поле токов высокой частоты имеют отличия только в способе подвода тепла. Сам процесс сушки может быть реализован любым указанным выше способом.
Чтобы исключить вероятность подгорания материала, процесс сушки делят на основной период сушки и досушку.
Сушильные установки классифицируются по различным признакам:
I. По конструктивным признакам (барабанные, коридорные, шахтные, ленточные, камерные, распылительные);
II. По направлению движения сушильного агента (поточные, противоточные, с перекрёстным током);
III. По устройству циркуляции сушильного агента (естественная, искусственная);
IV. По организации сушильного процесса (нормальный, с подогревом в сушильной камере, с промежуточным подогревом, с возвратом отработанного сушильного агента);
V. По уровню давления в зоне сушки (атмосферные, вакуумные, с глубоким вакуумом);
VI. По роду сушильного агента (воздух, топочные газы, перегретый пар);
VII. По агрегатному состоянию высушиваемого продукта (твёрдое, жидкое, пастообразное, пенообразное);
VIII. По способу подвода тепла (конвективные, кондуктивные, радиационные, высокочастотные);
IX. По режиму работы (непрерывные и периодического действия).
117.Опишите два прямых и два непрямых метода подсчета бактерий. Прямой подсчёт количества бактерий Проводят с помощью специальных камер либо электронных счётчиков. Посев на питательные среды. Менее точный метод, так как выявляет только группы микроорганизмов, растущих на определённых питательных средах и при определённой температуре.Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха). Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток. В основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших, после посева на плотную питательную среду определенного объема иссле¬дуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорга¬низмов. Результаты количественного определения м/о-в часто выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ). Определение числа м/о-в этим методом включает три этапа: приготовление разведений; посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний. Подсчет клеток в счетных камерах. Это метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов — дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и относительно крупных бактерий. В качестве примера можно привести камеру Горяева—Тома. Камера внешне представляет собой толстое предметное стекло, разде¬ленное бороздками. Углубление покрывают покровным стеклом и, прижимая, двигают покровное стекло до появления картины интерференции (ко¬лец Ньютона), камеру заполняют исследуемой суспензией микро¬организмов. Подсчет клеток повторяют 3 - 5 раз. Это обеспечивает большую точность. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле.Непрямые методы:Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом. Оптический (нефелометрический или турбидиметрический) метод определе¬ния биомассы нашел широкое применение. Позволяет опреде¬лить концентрацию клеток в суспензии или культурадьной жидкости. В основе метода лежит измерение ослабления светового пучка при его про-хождении через суспензию клеток. Величина этого показателя зависит от многих факторов (формы и раз¬меров клеток, оптических свойств культуральной среды и т.д.), поэтому оптический метод пригоден лишь для м/о-в, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопро¬вождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений. Изменение интенсивности света при прохождении через суспензию клеток измеряют с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК) иди спектрофотометра.Определение биомассы методом взвешивания. Этот метод применяют для оценки роста м/о-в в жид¬ких питательных средах. Можно использовать для определения массы клеток, выращенных на плотной пит. среде, однако в этом случае м/о-мы необходимо предварительно смыть с поверхности среды и перевести в суспензию. Метод не может быть использован при культивировании м/о-в на средах, в состав которых входят соединения, не растворимые в воде.Определение биомассы состоит из трех операций: дове¬дение массы центрифужных пробирок или фильтров до постоянного значе¬ния; отделение клеток микроорганизмов от культуральной жидкости; опреде¬ление их массы. Чаше всего определяют массу сухих клеток, хотя иногда мож¬но ограничиться определением сырой биомассы. Биомассу обычно выражают в граммах или миллиграммах на литр культуральной жидкости.
118. Разделение веществ, при котором биомасса всплывает на поверхности культуральной жидкости а) фильтрация б) флотация в)сепарация. Выберите правильный ответ и дайте пояснения по тесту и заданному вопросу. Как эта цель достигается на производстве? Ответ: флотация(б).Ответ: флотация(б).Если целевым продуктом является биомасса клеток, н-р пекарские дрожжи, необходимо их концентрирование. При этом прим флотацию, с пом кот увелич концентрацию дрожжей в 4-6 раз. К достоинствам метода относятся экономичность, высокая производ-ть, возможность применения в условиях непрерывного процесса. Применяют и в пивоварении, в производстве белка одноклеточных и др. Пример: т.к сахаромицеты имеют относительно большие размеры клеток , это позволяет после сгущения биомассы флотацией отделить клетки фильтрованием. Далее биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и получают продукт с высоким содержанием живых клеток. Пенная флотация ответственна за образование устойчивой пены на пиве за счет концентрирования растворенных белков на границе раздела «воздух-жидкость». Метод основан на всплывании твердых частиц на поверхность вместе с пузырьками воздуха-над слоем отработанной культуральной жидкости образуется пенный слой, в котором сконцентрированы биообъекты, н-р дрожжи.
119.Выделение и очистка продуктов биосинтеза и оргсинтеза имеют принципиальные различия на стадиях процесса а)всех, б)конечных, в)первых, г)принципиальных различий нет. Выберите правильный ответ и дайте пояснения по тесту и заданному вопросу. Как эта цель достигается на производстве? Ответ: конечных –б. Цель оргсинтеза и биосинтеза - получение веществ с ценными свойствами. Несмотря на то, что цель одна, процессы осуществления отличаются принципиально даже на стадиях выделения и очистки целевых продуктов. Биосинтез - это образование необходимых веществ в живых клетках. Если целевым продуктом является биомасса клеток, применяют следующие методы выделения: отстаивание, фильтрация, флотирование, сепарирование и т.д. (механические способы); выпаривание и сушка (физические способы). Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных суспензий, при этом характерно содержание основного компонента многих примесных веществ. На первом этапе переработки культуральной жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию. Жидкость далее также подвергается переработке, если содержит ценные метаболиты. Технолог. приемы, используемые для отделения клеток от среды зависят от природы продуцента. Применяют: флотацию, ферментацию, центрифугирование, а также хим. и физ. Осаждение.
Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор. Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы. Выделение продукта из культуральной жидкости или гомогената клеток производят способами: 1. Осаждение – физическое или химическое. 2. Экстракция. 3. Адсорбция. Т.о. завершающая стадия биосинтеза – выделение целевого продукта. Эта стадия существенно различается в зависимости от того, накапливается продукт в клетке либо выделяется в культ. жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культ. жидкости, разрушить и очистить целевой продукт от массы компонентов разрушенных клеток.Выделение продукта облегчается, если он высвобождается (экскретируется) продуцентом в культ. жидкость. Стадии выделения следует разделение веществ методами: хроматография, электрофорез, электрофокусировка. Стадия очистки необходима при получении очищенного целевого продукта. Она приводит к росту себестоимости получаемого целевого продукта. Главным отличием оргсинтеза является получение целевого продукта без нежелательных факторов (н-р как в биосинтезе: без биомассы). От примесей при орг.синтезе избавляются химическими способами.
120.Целевой белковый продукт локализован внутри иммобилизованной клетки. Добиться его выделения, не нарушая системы можно: а)усилив системы активного выброса, б) ослабив барьерные функции мембраны, в) присоединив к целевому белку лидерную последовательность от внешнего белка, г) повысив скорость синтеза белка. Выберите правильный ответ и дайте пояснения по тесту и заданному вопросу. Перечислите какие цели преследуются при иммобилизации ферментов и клеток в биотехнологическом производстве. Ответ:в. Если же целевой продукт является внутриклеточным, то для его извлечения из клеток приходится разрушать всю систему, поэтому возникает вопрос о целесообразности использования иммобилизации биообъекта. Однако в этом случае методами генетической инженерии может быть сконструирована и введена в продуцент система транспорта целевого продукта из клетки в среду. Как известно, секретируемые белки отличаются от несекретируемых тем, что имеют на N-терминусе так называемую лидерную последовательность аминокислотных остатков, которая способствует переносу их через мембрану клетки в среду. На последней стадии контакта секретируемого белка с поверхностью образовавшей его клетки лидерная последовательность отделяется от основной полипептидной цепи. В соответствии с этим вводимый в микробную клетку чужеродный ген (точнее оперон) подвергается модификации: либо его нуклеотидная последовательность целенаправленно увеличивается таким образом, чтобы в чужеродном белке оказывалась лидерная последовательность аминокислот, либо конструируются гибридные опероны с общим промотором, включающие ген чужеродного белка и ген секретируемого белка, лидерная последовательность которого извлекает из клетки чужеродный белок. Далее два белка разделяются принятыми химическими или ферментативными методами. В качестве продуцентов рекомбинантных белков человека чаще других в настоящее время используются: Escherichia coli , Bacillus subtUis , Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи). Изолированные ферменты не защищены системами клеточного гомеостаза, и большинство их в таком виде относительно быстро теряет активность, которая зависит даже от незначительных физико-химических изменений среды.С другой стороны, при цикличности производственных процессов требуется постоянно повторяющаяся наработка высокоочищенных ферментных препаратов, что связано с большой затратой сил и средств. Проблема была решена путем создания так называемых ≪промышленных биокатализаторов≫ — иммобилизованных ферментов. Иммобилизация Ф - это повышение их стабильности. Получение и использование иммобилизованных ферментов в промышленности, в том числе и в фармацевтической, составляет основу инженерной энзимологии. Иммобилизация ферментов не только существенно повышает их стабильность, но позволяет длительно использовать одну партию или серию промышленного биокатализатора. За последние десятилетия параллельно с иммобилизацией ферментов развивалось и другое направление — иммобилизация целых клеток (прежде всего микробных) для осуществления многостадийного метаболического процесса, например биосинтеза антибиотика. Такие клетки после иммобилизации могут ≪работать≫неделями и месяцами, не теряя при этом жизнеспособности. Экономические преимущества использования иммобилизованных биообъектов в условиях производства несомненны. Применение иммобилизованных систем позволяют сделать условия биосинтеза более стандартными, а все производство более компактным. Полученный биообъект работает длительно. При этом на единицу продукции расходуется меньше сырья. В случае производства фармацевтических препаратов целевое вещество не будет содержать компонентов культуральной жидкости (мицелия, продуктов частичного лизиса клеток, компонентов комплексной питательной среды и т.д.), что значительно облегчает задачу выделения иочистки целевого продукта, гарантирует отсутствие в получаемом препарате отсутствие белковых и других вредных примесей.
62.Использование клеточной культуры для промышленного получения биомассы и БАВ.В основе промышленного производства БАВ из культуры клеток растений лежит ряд последовательных стадий: получение высокопродуктивных продуцентов, разработка оптимальных условий культивирования продуцента БАВ, разработка и внедрение в практику соответствующих методов и условий выделения и очистки БАВ, создание готовых препаратов и контроль качества.Для промышленного производства БАВ необходимы штаммы растительных клеток с улучшенными ростовыми и продукционными свойствами. Опыт получения клеточных культур растенйй показывает, что содержание в них целевых веществ чаще всего ниже, чем необходимо для эффективного производства. С середины 88г. ХХ столетия большой интерес стали вызывать трансгенные культуры клеток растении, например с помощью агробактериальной трансформацией получали культуры «бородатых корней», активно продуцирующие некоторые БАВ. В настоящее время получено более 30 видов различных изолированных клеточных культур лекарственных растений, продуцирующих БАВ либо на уровне соответствующего интактного растения, либо в большем количестве. Первый отечественный биопродукт из культуры изолированных клеток - настойка «Биоженьшень» - разработан в лаборатории культуры тканей. Препарат получен на основе высокопродуктивного клеточного штамма культуры клеток женьшеня
103. Разграничьте термины:
1) Антисептический – означает дезинфицирующий, обеззараживающий. Антисептика (лат. anti — против, septicus — гниение) — система мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов в ране, патологическом очаге, органах и тканях, а также в организме больного в целом, использующая механические и физические методы воздействия, активные химические вещества и биологические факторы. Термин был введён в 1750 году английским хирургом Дж. Принглом, описавшем антисептическое действие хинина. Виды антисептики. Выделяют виды антисептики в зависимости от природы используемых методов: механическая, физическая, химическая и биологическая антисептика. В практике обычно сочетают разные виды антисептики. В зависимости от метода применения антисептических средств, химическую и биологическую антисептику делят на местную и общую; местная, в свою очередь, подразделяется на поверхностную и глубокую. При поверхностной антисептике препарат используется в виде присыпок, мазей, аппликаций, для промывания ран и полостей, а при глубокой — препарат инъецируется в ткани раневого воспалительного очага (обкалывания и т. д.).Под общей антисептикой подразумевают насыщение организма антисептическими средствами (антибиотиками, сульфаниламидами и др.). В очаг инфекции они заносятся током крови или лимфы и таким образом воздействуют на микрофлору.2) бактерицидный - способный убивать бактерии. Термин, указывающий на св-во химических (дезинфектантов, антисептиков, химиотерапевтических веществ, включая антибиотики), биологических (Ат, С, лизоцима, р-лизина, бактериоцинов, фагов, фагоцитов) и физических (УФЛ, ионизирующего излучения и др.) факторов вызывать гибель вегетативных форм бактерий. Аналогичный эффект указанных факторов в отношении спор называют спороцидным, микробов - микробоцидным, грибов - фунгицидным, вирусов -вирусоцидным, простейших - паразитоцидным.3) Стерилизация — полное освобождение какого-либо предмета от всех видов микроорганизмов, включая бактерии и их споры,грибы, вирионы, а также от прионного белка, находящихся на поверхностях, оборудовании, в пищевых продуктах и лекарствах. имеет большое значение в борьбе с госпитальной инфекцией, а также в профилактике возникновения послеоперационных гнойных осложнений, гепатита В, ВИЧ-инфекции и гнойных заболеваний. Стерилизуются все инструменты, дренажи, шприцы, перевязочный материал, контактирующие с раневой поверхностью, кровью или инъекционными препаратами, а также медицинские инструменты и приборы, которые в процессе эксплуатации соприкасаются со слизистой оболочкой и могут вызвать ее повреждение. Обеззараживаются воздух в операционной руки хирурга и операционной сестры). Современные методы подразделяют на физические и химические. К физическим методам относятся паровой, воздушный, радиационный. ультразвуковой. Химическая ст-я бывает газовой и растворами химических препаратов. С. при высоких температурах (паровая, воздушная) называют термической, а при температуре ниже 100° (радиационная, ультразвуковая и др.) — холодной. Стерилизация радиационным, ультразвуковым и некоторыми другими методами технически сложна и может осуществляться только в особых условиях. Выбор того или иного метода зависит от особенностей стерилизуемого объекта и самого метода. При этом в течение установленного времени (стерилизационной выдержки) обязательно должны погибнуть все микроорганизмы, как патогенные, так и сапрофиты, в т.ч. спороносные формы.4) Фунгицидный - способный убивать грибки. Термин относится как к препаратам, которые принимаются внутрь и убивают грибки, не нанося вреда инфицированному больному, так и к веществам, разрушающим грибки и их споры вне организма.5) Асептический - комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания возбудителей инфекции в рану, ткани или органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методами А. ведется борьба с экзогенной инфекцией, основными источниками которой являются больные с гнойно-воспалительными процессами и бациллоносители. Среди организационных мероприятий важное значение имеет расположение операционных блоков, перевязочных и процедурных кабинетов в максимально возможном удалении от так называемых септических зон.Профилактика воздушно-капельной инфекции включает правильную планировку операционных с целью обеспечения «подпора» воздуха — создания его потока из операционной в другие помещения. Важную роль играют кондиционирование воздуха с его бактериальной фильтрацией, создание ламинарного потока стерильного воздуха, рациональный режим работы в операционной, влажная уборка операционного блока с применением антисептических препаратов, аэрозольная стерилизация воздуха операционной, ограничение длительности рабочего дня, применение спецодежды и масок, нахождение в операционной только сотрудников, занятых в операции, сведение до минимума разговоров по ходу операции, санация полости рта и дыхательных путей больного и медперсонала.Для предупреждения контактного инфицирования необходимо, чтобы все, что соприкасается с раной, было стерильным.6) Дезинфицирующее средство – химическое соединение, используемое для уничтожения в окружающей среде возбудителей инфекционных болезней человека и животных. Хим. соед., используемые для уничтожения в окружающей среде возбудителей инфекционных болезней человека и животных. В концентрациях, более высоких, чем лечебные, в качестве Д. с. применяют также антимикробные лек. в-ва местного (наружного) употребления. Требования к Д.с.: малая токсичность; хорошая р-римость в воде; активность в небольших концентрациях; быстрота и широкий спектр действия; отсутствие отрицательного влияния на обрабатываемые объекты (напр., обесцвечивание); стабильность при хранении; удобство транспортирования; дешевизна и т.д. Обычно Д.с. используют в виде водных р-ров или порошков, реже - в газообразном состоянии (при высокой относит. влажности воздуха). Виды: Галогенсодержащие Д.с. наиб. широкоприменяются в дезинфекционной практике. Эффективность этих препаратов м.б. усилена активацией их р-ров солями (хлоридом, сульфатом, нитратом) аммония в соотношении 1:1 или 1:2 либо NH3(1:8, 1:10, 1:16). Это позволяет уменьшить концентрацию Д.с. и продолжительность обработки ими объектов. Ф е н о л ы - фенол (карболовая к-та); пентахлорфенолят Na; разл. ср-ва на основе сырых крезолов (в сочетании с конц. Н2SО4-серно-крезоловая смесь, с 16%-ным р-ром NaOH - щелочные крезолы, с калиевым мылом - мыльно-крезоловый р-р, со смоляными мылами - креолин) и очищенных крезолов (смесь о-, м- и n-крезолов - трикрезол, в сочетании с калиевым мылом - лизол, с нафтеновыми мылами - нафтализол) и др. Эти ср-ва употребляют в виде 0,3-10%-ных р-ров или эмульсий для обработки предметов домашнего и больничного обихода, медицинских инструментов, белья, выделений, стен, туалетов, содержимого выгребных ям, мусорных ящиков, дворовых санитарных установок, в ветеринарной дезинфекции. А л ь д е г и д ы. Наиб. распространены формальдегид и глутаровый альдегид. Формальдегид применяют в виде формалина (40%-ный р-р) для камерной дезинфекции, обработки обуви и перчаток при грибковых заболеваниях кожи. Глутаровый альдегид (2%-ный р-р) используют для стерилизации изделий из резины и др. полимерных материалов.
104. Способы удаления микроорганизмов из воздуха:1.Ионизация 2.Озонирование 3.Ультрафиолетовое Излучение4.Фильтрация (НЕРА)5. Электрические поля1) При искусственной аэроинизации химическая и физическая природа аэроионов, как правило, отличается от природной. Лечебной эффективностью обладают лишь аэроионы с определённой энергией ионизации и коэффициентом подвижности. С помощью искусственной ионизации можно добиться снижения концентрации микрофлоры в воздушной среде помещения на 32-52 % - исследования проведены в американской клинике. Эффект достигается благодаря ионизации биоаэрозолей и частиц пыли (которые могут нести на себе микроорганизмы), что заставляет их осаждаться более интенсивно. Загрязненный биологическими и механическими частицами воздух проходит через зону коронного разряда, где микроорганизмы и пылевые частицы получают отрицательный заряд. После этого они проходят с воздухом через осадителные пластины с положительным зарядом, на которых и высаживаются благодаря электрическим силам притяжения. Заряженные микроорганизмы осаждаются на осадительных пластинах устройства (если таковые имеются) и в непосредственной близости от него: на полу, потолке, стенах и предметах в помещении, а также на коже присутствующих людей, слизистой оболочке дыхательных путей и в самих легких... Таким образом, риск инфицирования людей, находящихся в одном помещении с человеком, болеющим воздушно-капельным заболеванием, при включённом аэроионизаторе резко возрастает. При работе устройств степень ионизации воздуха не контролируется, могут увеличиваться концентрация озона и генерироваться окислы азота, а в воздухе помещения происходить химические реакции, продукты которых оказывают прямое токсическое воздействие. Применение аэроионизаторов противопоказано людям, страдающим заболеваниями легочной и сердечно-сосудистой систем.2) ОЗОНИЗАЦИЯ Высокая эффективность применения озона для обеззараживания воды, но до сих пор не создано таких же доказано безопасных и эффективных приборов для обеззараживания воздуха. Озон (О3) ядовит и имеет очень низкую предельно-допустимую концентрацию в воздухе, соизмеримую с ПДК боевых отравляющих веществ. Генерируемый приборами озон перемешивается с воздушной средой и окисляет все органические соединения и микрофлору. При использовании озонаторов уничтожаются одни загрязнители, но появляются другие, включая токсины. В настоящее время воздушные озонаторы получили широкое распространение и малые озонаторы используются в присутствии людей. При очень незначительной концентрации озона воздух в помещении чувствуется приятным и свежим, а неприятные запахи ощущаются гораздо слабее. В противоположность распространенному мнению о благоприятном воздействии этого газа, которое приписывают в некоторых проспектах богатому озоном лесному и горному воздуху, в действительности озон даже при большом разбавлении представляет собой очень токсичный и опасный газ. Даже малые концентрации озона могут оказывать раздражающее действие на слизистые оболочки и вызывать нарушения центральной нервной системы, что ведёт к появлению бронхита и головных болей. В профессиональных целях для получения надежного обеззараживающего эффекта в помещениях с людьми генератор озона служить не может, поскольку требуемая для уничтожения патогенных агентов концентрация озона в несколько раз превышает ПДК для человека.3)УФ : Эффективность биоцидного действия УФИ зависит от длины волны, интенсивности облучения, времени воздействия, видовой принадлежности обрабатываемых микроорганизмов, расстояния от источника, а также от состояния воздушной среды помещения: температуры, влажности, уровня запылённости, скорости потоков воздуха.УФИ максимально эффективно если угол падения лучей на поверхность с микроорганизмами составляет 90 градусов, а микроорганизмы и частицы пыли расположены в один слой, при многослойном расположении верхние защищают нижележащие (явление экранирования). При несоблюдении этих условий гибель популяции облучаемых микроорганизмов может снизиться на 50 % и более. УФ-облучатели не могут использоваться в присутствии людей (если они осуществляют прямое облучение) и имеют низкую эффективность при использовании отраженного облучения. Чем мощнее облучатель, тем активнее выступает негативное воздействие озона, который сопутствует этому процессу (концентрация озона порой превышает ПДК), воздух деионизируется, инициируются процессы окисления и другие химические реакции, повышающие токсичность воздуха. При использовании УФ-облучателей лимитирующим фактором является предельно допустимая доза облучения людей, а не доза, требуемая для уничтожения микроорганизмов в воздухе помещения.4)Фильрация НЕРА : Специальные системы, использующие принцип высокоэффективной фильтрации подающегося в помещение воздуха с помощью НЕРА фильтров (HighEfficiency Particulate Air). “Чистое Помещение” с системой НЕРА фильтрации - это сложное и дорогостоящее (десятки тысяч USD) инженерное сооружение, предназначенное не для уничтожениямикроорганизмов, а для того, чтобы не допустить их в помещение и выдавить из него уже имеющиеся.Для эффективной эксплуатации такая система требует реконструкции помещения, предварительной 2-3 ступенчатой очистки воздуха, его подогрева и осушения, периодической замены фильтров и эксплуатации в непрерывном режиме, что ведёт к высокой стоимости 1м3 очищенного воздуха и большим энергозатратам. НЕРА фильтры не предназначены для задержания частиц с размерами менее 0,3 мкм, а это размеры всех вирусов и большинства нанобактерий. Осажденные на фильтре микроорганизмы и плесень размножаются и растут, проникая сквозь волокнистый слой фильтра далее в воздушную среду помещения. Высокая эффективность фильтрации твёрдых аэрозольных частиц данного метода общеизвестна, однако эффективность очистки воздуха от биологических аэрозолей весьма сомнительна.5)ЭЛЕКТР.ПОЛЕ: Принцип действия основан на непрерывном воздействии постоянными электрическими полями заданной ориентации и напряжённости на микроорганизмы и вирусы, что приводит к их инактивации. Следующим этапом осуществляется тонкая фильтрация уже стерилизованного воздуха от твердых аэрозольных частиц (включая токсины). Таким образом, накопление и размножение микрофлоры на фильтрующем элементе, а также последующая миграция из него инфекционных агентов после отключения устройства исключено.
109. Как осуществляется принцип масштабирования посевного материала в производствеПроцесс биотехнологического производства фармацевтических препаратов состоит из определенного количества составляющих (рис.9) и имеет разную степень сложности. Его сложность обусловлена слагаемыми конкретного биотехнологического процесса, которые варьируют в зависимости от продуцента – биообъекта (микроорганизма, растения, млекопитающего и др.), и зависит от целевого конечного продукта. Если целевым продуктом является биомасса (например, живые клетки молочнокислых бактерий), то технологическая линия короче; если это субстрат для производства высокоочищенных инъекционных препаратов, то схема производства сложнее (технологическая линия длиннее). Источником целевого продукта является микроорганизм (например, при производстве антибиотиков), то для его культивирования обязательны асептические условия, соответствующие оборудование и специальная подготовка к проведению процесса. Свои особенности имеет биотехнологическое производство, основанное на использовании микроорганизмов-рекомбинантов, которое требует усиленного контроля за стабильностью продуцента, и, кроме того, тщательного и постоянного соблюдения мер, предотвращающих возможность попадания этого биообъекта в окружающую среду. Такие меры предусматривают использование специального оборудования и соблюдения определенных правил, относящихся непосредственно к технологическому режиму. Процессы и аппараты периодического и непрерывного культивирования
Несколько подробнее об особенностях вышеуказанных процессов. Периодическое культивирование включает:
а) стерилизацию сред и всего оборудования;
б) загрузку биореактора питательной средой;
в) внесение посевного материала (клеток или спор);
г) выращивание культуры (это может совпадать во времени с последующим этапом или предшествовать ему);
д) синтез целевого продукта; е) отделение и очистку готового продукта.
Все этапы представлены во временном аспекте; после окончания последнего этапа производится мойка биореактора и подготовка его к новому циклу.
Приготовление посевного материала
Штаммы микроорганизмов для производства биологических препаратов поступают в ампулах, где они законсервированы в виде чистых культур. Каждая культура имеет паспорт с описанием питательных сред, морфологических, физиологических и других характеристик, условий для их поддержания, выращивания и срока хранения. Режим хранения культур предполагает охлаждение, замораживание или обезвоживание; во всех случаях должен быть резко сокращён или полностью прекращён клеточный обмен веществ. Культуры штаммов хранят:
- на косом агаре при температуре минус 1-50С;
- замороженными при температуре ниже – 20 0С (недопустимо повторное оттаивание и замораживание);
- лиофилизированными в ампулах, хранящимися в течение нескольких лет.
Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранить неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при температуре- 1800С.
Через определённое время, специфическое для каждого вида микроорганизмов и вида хранения, культуру пересеивают.
Перед началом технологического процесса культуру размножают в стерильных условиях при оптимальном составе питательной среды и режиме выращивания, длительность стадии выращивания -24 ч.
Многоэтапное выращивание посевного материала – обязательный принцип биотехнологического производства. Среда для выращивания посевного материала обычно не совпадает по составу с ферментационной средой, т.е. при выращивании посевного материала среда может быть обогащена для быстрого роста биомассы.
105. Какой из методов количественного определения роста микроорганизмов чтобы определить антисептик бактерицидное или бактериальное действие
106. Два метода предохранения пищи от порчи, создающие бактерицидные условия: абиоз и анабиоз. Для уничтожения микроорганизмов в продуктах используют: высокие температуры (пастеризация и стерилизация); облучение различными формами лучистой энергии; обработки ультразвуком, антибиотиками; фильтрование с помощью стерилизующих фильтров. Для приостановления жизнедеятельности микробов в пищевых продуктах создают следующие условия: используют охлаждение и замораживание, сушку, вяление, добавляют к продуктам соли, сахара, создающие высокое осмотическое давление, повышают кислотность продукта путем добавлниея уксусной кислоты, создают анаэробные условия. Эффективность всех мероприятий, направленных на предупреждение порчи пищевых продуктов зависит от степени обсеменности продукта микроорганизмами и от соблюдения общих саниторно-гигиенических т ребований и выполнения установленного режима хранения, товарной обработки и переработки.
107.GLP регламентирует
GLP (Good Laboratory Practice) – Надлежащая лабораторная практика (ГОСТ Р-53434-2009 "Принципы надлежащей лабораторной практики") — система норм, правил и указаний, направленных на обеспечение согласованности и достоверности результатов лабораторных исследований.Это стандарты, на основании которых осуществляется планирование, проведение доклинических исследований, составление протоколов и оформление отчетов исследований. Соблюдение правил GLP позволяет обеспечивать достоверность результатов исследований и их воспроизводимость. Правила GLP определяют технологию проведения доклинических испытаний, связанных с определением безопасности исследуемого вещества.Правила GLP включают в себя: требования к организации испытаний, к личному составу исследователей, к помещениям, в которых проводятся испытания, к лабораторному оборудованию и к его калибровке, к испытуемому и контрольному веществу, к составлению и проведению подробной стандартной методики экспериментальных работ (SOP – standard operating procedure) и к порядку проведения испытаний (протокол), к регистрации данных и оформлению отчета, к службе контроля за качеством испытаний, стандартные методики экспериментальных работ.Главная задача GLP - обеспечить возможность полного прослеживания и восстановления всего хода исследования. Контроль качества призваны осуществлять специальные органы, периодически инспектирующие лаборатории на предмет соблюдения нормативов GLP. GLP устанавливает очень строгие требования к ведению и хранению документации. Сферы применения норм GLP устанавливаются законодательно. В первую очередь это относится к разработке новых химических веществ, получению и использованию токсичных веществ и к здравоохранению.В настоящее время многие развитые страны регламентируют создание, испытания и производство препаратов своими национальными правилами и нормами, в основе которых лежат требования GLP.
111. Стабилизация продолжить предложение
Пищевые стабилизаторы - это особая группа добавок, применяемых в разных отраслях пищевой промышленности, главным назначением которых является формирование и сохранение консистенции, текстур, форм и потребительских качеств продуктов молочного, мясоперерабатывающего, хлебопекарного и кондитерского производств. Материалы нашего сайта содержат информацию о разновидностях и областях применения стабилизаторов консистенции пищевых продуктов. Обычно выделяют три главные группы пищевых стабилизаторов: пектины, каррагинаны и камеди. Все они являются производными натуральных веществ, хотя в последнее время объемы мирового производства продуктов питания потребовали и промышленного синтеза некоторых видов пищевых стабилизаторов. Пищевые стабилизаторы не представляют опасности для здоровья и являются очень важным подспорьем для наращивания мирового производства продуктов питания. Сырьем для них служат яблоки, плоды цитрусовых, пшеница, кукуруза, морские водоросли, смолы различных наземных растений и т.п. Отдельные виды стабилизаторов являются продуктами микробиологической промышленности. Стабилизация продукта направлена на сохранение свойств продукта в период его хранения и использования потребителем (добавление наполнителей, модификация и др.). Включает физико-химические воздействия на продукт Сушка повышает устойчивость продукта к внешним воздействиям. Обезвоживание ферментов вызывает их устойчивость к нагреванию.К стабилизации продуктов, в том числе кормового микробного белка, ведет добавление наполнителей из грибного мицелия, пшеничных отрубей, кукурузной муки, которые сами обладают питательной ценностью.
112. Недостатком природных носителей для иммобилизации является: Б.биодеградируемость. Какими свойствами должны обладать материалы для иммобилизации клеток и ферментов?
Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органичес¬кой природы. Существующие органические полимерные носите¬ли можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов орга-нических полимерных носителей подразделяется на группы в за¬висимости от их строения. Среди природных полимеров выделя¬ют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических- полиметиленовые, полиамидные и полиэфир¬ные.К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, низкую стоимость, а к недо¬статкам – биодеградируемость. Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто исполь¬зуют целлюлозу, декстран, агарозу (агар) и их производные. Для прида¬ния химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сет¬чатые структуры довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) син¬тезирован новый носитель - губчатый крахмал, обладающий по¬вышенной устойчивостью к гликозидазам.Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин, который в значительных коли¬чествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру. Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена - желатина. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значи¬тельных количествах, дешевы и имеют большое число функцио¬нальных групп для связывания фермента. Белки способны к био¬деградации, что очень важно при конструировании иммобилизо¬ванных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуногенность. Хорошим носителем считается агар. Его свойства улучшаются после химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой агар становится устойчивым к нагреванию, прочен, легко модифицируется.
110.Методы очистки и обезвораживания воздуха в бт.производстве
При рассмотрении связанных с биотехнологией экологических проблем необходимо учитывать, что важной составной частью современной биотехнологии является очистка воды от загрязнений.Жидкие отходы в биотехнологических производствах достаточно разнообразны по своему составу. Например, в производстве антибиотиков, в состав жидких отходов могут входить углеводы и углеводистые продукты, масла, соевая мука, кукурузный экстракт, нитраты, соли аммония, серо- и фосфорсодержащие соединения, возможные предшественники антибиотиков (например, амид фенилуксусной кислоты в качестве предшественника пенициллина; н-пропанол в качестве предшественника эритромицина и т. д.), неорганические кислоты и щелочи, органические экстрагенты и пр.
Рис.1 Схема биологической очистки сточных вод
В зависимости от качества сточных вод возможна также их очистка до целесообразного уровня (например, получение оборотной воды, реализуемой повторно в том же биотехнологическом производстве). На рисунке 1 приведена схема очистки сточных вод. Методы очистки воды основаны на использовании специфических биологических сообществ, носящих общее название активного ила, для глубокой утилизации как органических, так и неорганических загрязнений, оставшихся в воде после осуществления всех других возможных вариантов ее очистки. Содержащиеся в технологической воде клетки продуцентов и продукты метаболизма легко утилизируются активным илом. Существует много видов одноклеточных микроорганизмов, перерабатывающих подобные отходы.
Растворенные органические вещества можно удалять с помощью активного ила в аэротенках или при
108. Культуральные среды. Твердые и жидкие среды. загрузка... Среда — это твердая или жидкая субстанция, содержащая питательные вещества для культивирования (роста) микроорганизмов, а также клеток животных или тканей растений. Культурой называют совокупность микробных клеток, растущих на среде (или в среде). Твердые и жидкие среды Микроорганизмы можно выращивать на твердой среде или в жидкой среде (бульоне). Твердые среды Твердые среды очень удобны для выращивания бактерий и грибов; их готовят путем смешивания жидкого питательного раствора с гелеобразующим компонентом (обычно агаром) в концентрации 1—2%; при этом получается питательный агар. Агар представляет собой экстракт из красных водорослей. В концентрации 1—2% агар плавится при 90—100 °С и застывает примерно при 44 °С. Агар можно предварительно простерилизовать нагреванием и затем остудить. Микроорганизмы рассевают по поверхности агара после его застывания, либо, если они выдерживают температуру около 44 °С, добавляют к агару непосредственно перед застыванием; тогда они равномерно распределяются по всей среде. Агар прозрачен и, будучи сложным полисахаридом, устойчив к разрушению микроорганизмами; это относится к его преимуществам. Примеры использования твердых и жидких сред будут приведены в последующих разделах. На твердых средах иногда выращивают и культуры тканей растений. Жидкие среды Жидкие среды часто используют для изучения роста популяции. Клетки помещают в пробирку, закрытую ватной пробкой или металлической крышкой, или в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой, такой как универсальный сосуд Маккартни, в который помещается около 25 см3 среды — как раз для заливки одной чашки. Перед тем, как среда будет использована для выращивания культуры клеток, она должна быть простерилизована. Добавление небольшого количества клеток к среде называется посевом (или инокуляцией). После инокуляции среду оставляют в термостате при оптимальной для роста данного микроорганизма температуре. Растущие клетки распределяются в среде случайным образом. При использовании больших объемов среды культуру перемешивают, чтобы предотвратить оседание клеток. Для этой цели применяют механические встряхиватели или магнитные мешалки. Кроме того, пропускают стерильный воздух через среду, чтобы обеспечить поддержание оптимальной концентрации кислорода по всей среде. Для фильтрации воздуха и его стерилизации используют имеющиеся в продаже фильтры либо фильтры из стеклянной или неабсорбирующей хлопковой ваты. Воздух поступает через распылитель — устройство с множеством маленьких отверстий, позволяющее получать идеальные пузырьки. Его крепят на конце трубки, идущей ко дну сосуда с культурой. Жидкие культуры можно выращивать в виде периодических культур или непрерывных культур.
102. Сравните три метода: а)автоклавирование б)горячий воздух в) УФ-излучения
Стерилизацию паровым методом проводят в паровых стерилизаторах (автоклавах), которые работают под избыточным давлением. По конструкции стерилизационной камеры они делятся на шкафные и цилиндрические; последние подразделяются на вертикальные и горизонтальные. В стерилизационную камеру закладывают стерилизационные коробки (биксы). Биксы изготавливают из тонкого листа металла, они имеют круглую или квадратную форму, с крышкой на петлях с фильтром или без него. В качестве фильтров используют лавсан (эффективность пылезадержания 98,7%). Биксы имеют в своих стенках отверстия, которые открываются во время стерилизации и закрываются специальным поясом после стерилизации.Кроме биксов, можно стерилизовать в двойном слое хлопчатобумажной ткани (бязи, полотна); в растительном пергаменте (марок А и Б); в бумаге мешочной влагопрочной; в полиэтиленовых пакетах высокой прочности; в поливинилхлоридном пластикате.Стерилизация паровым методом проводится по одному из режимов:1) 120±2°С (1,1 кг на сантиметр квадратный) - экспозиция 45 минут;2) 132±2°С (2 кг на сантиметр квадратный) - экспозиция 20 минут.Первый режим рекомендован для стерилизации изделий из резины, латекса и отдельных полимерных материалов. Второй режим применяется при стерилизации изделий из коррозионно-стойкого металла, изделий из текстильных материалов, резины..Основные преимущества парового метода стерилизации:• надежность;• высокая эффективность;• хорошая способность проникать в ткани;
• отсутствие токсичности;• низкая стоимость;• возможность использования для стерилизации жидкостей;Основные недостатки парового метода стерилизации:• ряд инструментов не выдерживает обработки водяным паром при высоких температурах;• паровой метод не применим для стерилизации порошков и масел.Воздушной стерилизации (сухим горячим воздухом) подвергают шприцы с пометкой 200° иглы, копья для забора крови, металлические катетеры, шпатели, инструментарий, изделия из металла и стекла. Для этих целей существуют воздушные стерилизаторы, состоящие из следующих узлов: корпуса с теплоизоляцией, крышки, подставки и стерилизационной камеры с загрузочными полками или сетками. Для контроля температуры внутри камеры имеется ртутный термометр, для поддержания заданного температурного режима используется электроконтактный термометр. По конструкции бывают круглые и прямоугольные и имеют объем 20, 40, 80 кубических дециметров.Стерилизацию в воздушных стерилизаторах осуществля ют при температуре 180°С в течение 60 минут, при температуре 160°С - в течение 150 минут.
Изделия, простерилизованные горячим воздухом в бумаге мешочной непропитанной и бумаге мешочной влагопрочной, бумаге для упаковывания продукции на автоматах марки Е, могут храниться в течение 3 суток. Изделия, простерилизованные без упаковки, должны быть использованы непосредственно после стерилизации.Основные преимущества стерилизации горячим воздухом:
• возможность использования для стерилизации порошков, безводных масел, стекла
• проникновение во все части инструментов, которые не могут быть механически разобраны
• отсутствие коррозийного эффекта• низкая стоимостьОсновные недостатки стерилизации горячим воздухом:• медленное и неравномерное проникновение в материалы,
• необходимость длительной экспозиции• повреждение резиновых изделий и некоторых тканевых материалов• ограниченный перечень упаковочных материалов для инструментов: нельзя использовать пергамент и ткани.• ограниченный перечень упаковочных материалов для инструментов: нельзя использовать пергамент и ткани.Обеззараживающее воздействие УФ-излучения основано на необратимых повреждениях нуклеиновых кислот, а именно ДНК и РНК, которые содержатся во всех клетках живых организмов и являются носителями наследственной информации. Конечно, время контакта и условия контакта (клеточных структур - ДНК/РНК) микроорганизмов, содержащихся в обеззараживаемой среде с источником УФ-излучения должно определяется определенными условиями. Но, об этих условиях мы поговорим позже … Однако, уже на стадии предварительных проектов было выяснено, что при длине волны 254 нм УФ-излучение эффективно поглощается любыми нуклеиновыми кислотами. Воздействие УФ на разные типы микроорганизмов имеет приблизительно одинаковую природу, основной механизм заключается в прямом воздействии излучения на нуклеиновые кислоты. Входящие в состав ДНК пиримидиновые основания - тимин и цитозин, отличающиеся высокой фотохимической активностью в области 250-280 нм, образуют под воздействием УФ-облучения «сшивки» (димеры). Этот фотопродукт обнаружен при использовании коротковолнового УФ-излучения в биологических дозах у самых различных объектов. Многочисленные факты свидетельствуют об определяющей роли димеров в летальном, мутагенном и других эффектах УФ-излучения, при этом внешняя структура микроорганизма оказывает минимальное влияние на эффективность УФ-излучения. Итак, в результате этого УФ-воздействия в структуре нуклеиновых кислот образуются «сшивки», которые делают невозможным удвоение ДНК/РНК, а, следовательно, невозможно и размножение клеточного микроорганизма. Инактивированный таким образом микроорганизм уже не представляет никакой опасности для других «живых» организмов, в т.ч. для организма человека. Здесь следует отметить, что УФ-излучение с различной степенью интенсивности негативно влияет и на другие клеточные структуры других «живых» организмов, однако, все-таки основным универсальным механизмом УФ-обеззараживания является повреждение нуклеиновых кислот. Поэтому при использовании УФ-стерилизаторов необходимо соблюдать определенные меры безопасности.25) При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35о-37оС в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК). Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.
113. При ад¬сорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нель-сон, Э.Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобили¬зованных ферментов с использованием главным образом таких но¬сителей, как кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетичес¬кие полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов. Пос¬ледние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается край¬ней простотой и достигается при контакте водного раствора фер¬мента с носителем (статистическим способом, при перемешива¬нии, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, напри¬мер, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Актив¬ность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невы¬сокую прочность связывания фермента с носителем. При измене¬нии условий иммобили-зации могут происходить десорбция фер¬мента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами - полимерами, белками, гид¬рофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фер¬мента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.
114. К методам иммобилизации согласно используемому физическому процессу относится прикрепление внедрение, включение и агрегация.как Уменьшить наличие в лекарственном препарате примеси, при использовании технологии основанной на иммобилизации клеток и ферментов.Ответ: агрегация. Избавиться с помощью этого метода можно от белков
115.Процесс биотехнологического производства фармацевтических препаратов состоит из определенного количества составляющих (рис.9) и имеет разную степень сложности. Его сложность обусловлена слагаемыми конкретного биотехнологического процесса, которые варьируют в зависимости от продуцента – биообъекта (микроорганизма, растения, млекопитающего и др.), и зависит от целевого конечного продукта. Если целевым продуктом является биомасса (например, живые клетки молочнокислых бактерий), то технологическая линия короче; если это субстрат для производства высокоочищенных инъекционных препаратов, то схема производства сложнее (технологическая линия длиннее). Если же Источником целевого продукта является микроорганизм (например, при производстве антибиотиков), то для его культивирования обязательны асептические условия, соответствующие оборудование и специальная подготовка к проведению процесса.Общая (принципиальная) технологическая схема получения продуктов микробиологического синтеза состоит из ряда основных (ОТС) и вспомогательных технологических стадий (ВТС):ВТС – 1. Подготовка культуральной среды: составление композиции питательных веществ (витаминов, микроэлементов, углерода, азота, солей и др.) и стерилизация.ВТС – 2. Подготовка посевного материала (осуществляется в инокуляторе).ОТС – 1. Культивирование (ферментация) биообъекта-продуцента.ОТС - 2. Отделение биомассы от культуральной жидкости (осуществляется фильтрованием, центрифугированием, сепарированием).
Если целевой продукт содержится, в основном, в биомассе, то в дальнейшем идет переработка биомассы (1-й путь). Обычно в биомассе содержатся липиды, фосфолипиды, некоторые витамины, белки и др. Тогда в культуральной жидкости целевой продукт содержится в незначительных количествах и его выделение становится нерентабельным.Если биосинтезируемый целевой продукт секретирует (переходит) из клеток во время ферментации, в основном, в культуральную жидкость (биосинтез внеклеточных продуктов), то в дальнейшем идет именно ее переработка (2-й путь). Обычно в культуральную жидкость из клеток выделяются антибиотики, ферменты и др. Тогда в биомассе содержание целевого продукта незначительное и проведение работ по его выделению становится нерентабельным.
105.При определении чувствительности диско-диффузионным методом на поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию определенной плотности (обычно эквивалентную стандарту мутности 0,5 и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 35о-37оС в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК). Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.
116.Уустановите соответствие стадия
2-б.Выпаривание — процесс концентрирования растворов путём испарения растворителя. Иногда выпаривание проводят до получения насыщенных растворов, с целью дальнейшей кристаллизации из них твердого вещества. Выпаривание чаще всего производится при повышенной температуре, иногда при кипении, и/или под вакуумом. На испарение растворителя расходуется тепловая энергия, которую следует подводить извне. Выпаривание - процесс, требующий затрат очень большого количества энергии.Выпарные аппараты с паровым обогревом.Вакуум-выпарные аппараты с тепловым насосом тепловой насос.вертикальные и горизонтальные цилиндрические выпарные аппараты с обогревом змеевиками или нагревательными рубашкамиаппараты с внутренними и выносными нагревательными камерами плёночные аппараты аппараты с принудительной циркуляцией Обогрев производится через стенку аппарата, с помощью змеевиков, в агрессивных средах — барботажем пузырьков газа сквозь раствор, распылением раствора в струе газа.Диализ — освобождение коллоидных растворов и субстанций высокомолекулярных веществ от растворённых в них низкомолекулярных соединений при помощиполупроницаемой мембраны. При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через мембрану, а неспособные диализировать (проходить через мембрану) коллоидные частицы остаются за ней. Простейший диализатор представляет собой мешочек из коллодия (полупроницаемого материала), в котором находится диализируемая жидкость. Мешочек погружают в растворитель (например в воду). Постепенно концентрация диализирующего вещества в диализируемой жидкости и в растворителе становится одинаковой. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей. Скорость диализа обычно крайне низка (недели). Ускоряют процесс диализа увеличивая площадь мембраны и температуру, непрерывно меняя растворитель. Процесс диализа основан на процессах осмоса и диффузии, что объясняет способы его ускорения.Диализ применяют в промышленности для очистки различных веществ, например в производстве искусственных волокон, при изготовлении лекарственных веществ.Материал, прошедший через мембрану, называется диализат
101.Существуют два основных способа стерилизации питательных сред – автоклавирование и фильтрование. В первом случае приготовленный раствор разливают в предварительно простерилизованную в сушильному шкафу посуду для культивирования, а затем стерилизуют в автоклаве при давлении 0,75–0,9 атм (температура 110-115°С) в течение 20-25 мин. Можно сначала методом автоклавирования простерилизовать большое количество среды в одном объеме, а затем в ламинарном боксе разлить ее в стерильную посуду для культивирования. Однако, на наш взгляд, последний вариант более трудоемок. Кроме того, при таком способе разлива среды увеличивается вероятность ее инфицирования. Подобная последовательность действий более приемлема при небольшом количестве среды.Во втором случае используют стерильные фильтры Зейтца, Беркефельда, свечи Шамберлана, мембранные фильтры, незаменимые для приготовления сред с термолабильными компонентами (некоторые стимуляторы роста, витамины, антибиотики, аминокислоты, растительные экстракты), которые разрушаются при авто- клавировании. Фильтрация сред (холодная стерилизация) применяется также для приготовления смесей ферментов и выделения изолированных протопластов, сред с биологически активными компонентами, жидких сред.Питательные среды, содержащие органические добавки, такие, как кокосовое молоко, картофельный отвар и пр., дезинфицируют путем фильтрования, используя специальные фильтры из диатомовой земли, плавленого стекла или сложных эфиров целлюлозы.Однако полной стерилизации можно достичь лишь в процессе тиндализации, которую обычно проводят в аппарате Коха. Суть методики состоит в 2-3-кратном нагревании посуды водным паром до температуры 90-100°С с 24-часовыми интервалами. Первое нагревание приводит к уничтожению вегетативных форм, а последующие – к гибели микроорганизмов, которые образовались при температуре 25°С из склероция в перерывах между нагревами.Тиндализацию также используют для стерилизации питательных сред, содержащих соединения, которые разрушаются при высоких температурах (например, гиббереллины инактивируются при температуре выше 90°С). То же относится и к сахарам, которые карамелизируются при высоких температурах.Время термической дезинфекции зависит от объема посуды, в которую разлита питательная среда. Пробирки со средой стерилизуют 15 мин при температуре 115°С. Колбы, содержащие 100-500 мл питательной среды, дезинфицируют 30 мин при температуре 121°С и 45 мин при температуре 115°С. Колбы, в которых находится от 500 до 5000 мл питательной среды, стерилизуют в автоклаве в течение 35-40 мин при температуре 121°С и 50 мин при температуре 115°С.Для стерилизации пищи применяют 2 метода стерилизацию и пастеризацию. Пастеризация - тепловая обработка продукта с целью уничтожения болезнетворных микроорганизмов, в частности неспорообразующих патогенных бактерий, или снижения общего их количества.Пастеризацию проводят при нагревании продуктов не выше 100 °С в пастеризаторах. Применяется также как промежуточный процесс в производстве некоторых пищевых продуктов (например, сыра, кефира, простокваши и др.). Иногда в пищевой промышленности применяют пастеризацию и в отношении малокислых продуктов. В этом случае споры микроорганизмов выживают, а уничтожаются лишь сами клетки микроорганизмов. Поэтому такие частично обеспложенные продукты (пастеризованное молоко) не могут долго сохраняться.Стерилизация - тепловая обработка, предназначенная для уничтожения всех микроорганизмов и их спор. Осуществляется при температурах выше 100 °С в течение определенного вре-мени. Применяется для подавления микроорганизмов в продуктах питания и производственных средах.