Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
1. Введение: Клетка – это ограниченная активной мембраной, упорядоченная структурировання система биополимеров(белков, НК) и их макромолекулярных комплексов, участвующих в единой совокупности метаболических и энергетических процессов, осуществляющих поддержание и воспроизведение всей системы в целом.
Первым клетки увидел Роберт Гук на срезе пробки в 1665 году. В 1838-1839 Маттиас Шлейден и Теодор Шванн сформулировали основные положения клеточной теории. Позже Рудольф Вирхов добавил в теорию ещё один постулат
Есть различные методы изучения клеток:
Современный световой (а) и электронный (б) микроскопы
1 — конденсор; 2 — объективный столик; 3 — объектив; 4 — окуляр; 5 —осветитель; 6 — винты подачи; 7 — фотокамера; 8 — проекционная электромагнитная линза
Световая микроскопия – ограничение – максимально увеличение в 1000 раз (обусловлено длиной волны света) Если использовать ультрафиолетовый свет, то можно ещё немного повысить разрешающую способность. Есть способ увидеть и частицы, меньшие чем 0,2 мкм, это использовать боковое освещение, тогда свет отражается даже от самых мельчайших частиц.(эффект тиндаля)
Фазовоконтрастный микроскоп (в микроскопе дополнительная пластинка, проходя через которую лучи света сдвигаются по фазе +к тому сдвигу, который был после прохождения через объект) При построении изобр вз-ют лучи, наход. В одной фазе или в противофазе – создаётся светло-темная картинка.
Интерференционный – два пучка, один через объект, другой мимо, воссоединяются, интеферируют. Участки разной плотности отличаются друг от друга по степени контрастности
Поляризайционный – изучение упорядоченных субмикроструктур. Перед конденсором поляризатор, потом обхектив, препарат и анализатор (по 90градусов) – тоже пропускает только свет с той же плоскостью поляризации, что и поляризатор. (Поляриз и анализатор из Исландского шпата)
Если объект между линзами способен поляризовать свет – то он будет виден как светящееся пятно.
Электронная микроскопия.
Электронная микроскопия позволяет достигнуть разрешения в 1Ангстрем. Микроскоп устроен так: Раскаленная нить выпускает электроны, их поток фокусируется магнитным полем. (есть много общего с устройством светового микроскопа) просто вместо оптических линз магнитные, а в конце фотопластинка, а не глаз. В ЭМ поддерживается вакуум (во избежание столкновения эл-нов с др частицами и их отклонения и чтобы катодная пушка не окислялась) Эл-ны ускооряются высоким напряжением (от 50 до 5000 кВ)
Далее они фокусируются электромагнитом, потом проходят через объект, фокусируются объективной линзой. Та увеличивает полученную картинку, направляя эл-ны на фотопластинку или люминисцентный экран. Максимальное увеличение эл.микроскопии не реализуется при изучении биологических объектов из-за их низкой контрастности. Поэтому их контраст повышается, используются тяжелые металлы и их соли. Есть разные методы контрастирования и электронной микроскопии:
1. Оттенение металлами – атомы металла распыляются с определенной точки, они больше осаждаются на поверхностях, перпендикулярных напр-ю полета. Минус этого метода – объект увеличивается на толщину напыленного слоя – на 10-15 А. Также он дает информацию только о внешнем виде и форме. Используют платину, палладий, их сплавы, уран.
2. Негативное контрастирование ФосфорноВольфрамовойКислотой, уранилацетатом. Водные растворы этих в-в смешиваются с биологич объектами, затем высушиваются – т.е. вокруг объекта среда из плотного вещ-ва. Соотв. Изображение светлое на темном фоне. Плюсы, что соли могут проникать в объект и выделять т.о. тонкие детали его строения. Нуклеиновые кислоты выявляются плохо – оч. Тонкие.
3. Позитивное контрастирование уранилацетатом в спирте или ацетоне. Связывается непосредственно с в-ввом, хорошо прокрашивает НК.
4. Замораживание-скалывание. Объект замораживают жидким азотом (-196), в вакууме скалывается холодным ножом, вода возгоняется, скол покрывается испаренным углеродом, потом металлом – получается реплика. Объект растворяется кислотой, реплика остается – позврляет изучать рельеф клеток, в т.ч. и мембран.
5. Ультрамикротомия – Создание ультрамикротонких срезов. Клетки сначала фиксирую (часто буферными р-рами альдегида и окисью осмия) после обезвоживания ткани пропитываются эпоксидной смолой или пластиками в мономерной форме, затем полимеризация и затвердение. Резка с термической подачей объекта.
6. Сканирующая электронной микроскопии. 3х мерное изображение поверхности. Тонкий пучок электронов пробегает по всей поверхности объекта, отраженные электроны попадаю на ЭЛТ. Объект покрывается тонким слоем золота. Разрешение 3-5 нм. Вакуум послабже чем в ТЭМ.
Другие методы исследования:
1. Флуорисцентное окрашивание. К веществу добавляются определенные флуорохромы, используют низкие концентрации. Многие флуорохромы избирательно связываются с определенными структурами клетки, например Акридиновый оранжевый связывается с НК ( в мономере – зеленым с ДНК, а в димере красным с РНК) Есть флюорохромы, избирательно связывающиеся с липидами, кератином и др. Иммунофлуорисцениция ( прямое и непрямое окрашивания)
2. Цитохимические методы – методы, направленные на выявление специфических химических веществ. Реакция Фёльгена на ДНК. 1.Создание реактива Шиффа (основной фуксин + сернистая = неокрашенный основной фуксин) 2. Кислый гидролиз ДНК соляной кислотой – образование альдегидных групп, 3. вз-е с реактивом Шиффа, переход в окрашенное состояние. Даёт красное окрашивание на ДНК. Митохондрии не красятся заметно – слишком мало ДНК Есть PAS- реакция – гилролиз полисахаридов перииодной кислотой, а затем реактив Шиффа. Реакция количественна
3. Цитофотометрия – определение концентрации по интенсивности окрашивания. Разработаны и методы флуорометрии.
4. Радиоавтография. Вводится аминокислота или нуклеотид,т содержащий изотоп С14 или тритий. В процессе синтеза в биополимер включится и молекула с радиоактивным изотопом. Клетки в пласте покрывают фотоэмульсией AgBr. Зёрна засвечиваются, Затем проявка – серебро восстанавливается только в засвеченных гранулах, Фиксация – незасвеченные гранулы растворяются, смотрим в микроскоп – фидим изображение над участками, содержащими меченый объект. Ограничения метода – величина зерна и энергия частицы. Нужна высокая концентрация, т.к. низкая – длительная экспозиция – фон космическим излучением. FISH метод – молекулярная гибридизация. Помещение к объекту меченой НК, создание денатурирующих условий, ренатурация, автография. Позволяет локализовать места в хромосоме с конкретной нуклеотидной последовательностью.
Культура клеток – выращивание клеток в искусственных условиях, питательной среде. Иногда помещается группа клеток, иногда клетки «отмывают», разобщают, действуя на них трипсином или хелатоном версеном. Эмбртональные клетки растут много лучше взрослых. Прижизненные фотографии через микроскопы.
Микрохирургия.
В Цитологии используются методы биохимии, биофизики, цитология связана с молекулярной биологией т.к. например Электронная микроскопия это уже изучение макромолекул.
Применение достижений клеточной биологии – в медицине , стволовые клетки и клетки-предшественники и др.
Центрифугирование – разделение по плотности. Позволяет получить органеллы отдельно.
2. Клеточная теория: 1. Клетка - элементарная единица живого: вне клетки нет жизни.
2. Клетки - сходны (гомологичны) по строению и основным свойствам.
(Клетка 1. упорядоченная и структурированная система биополимеров (нуклеиновые кислоты, белки, липиды, полисахариды). 2. (система) отграниченная от внешней среды (внеклеточной) активной липопротеидной мембраной. 3. (система) участвующая в единой совокупности химических процессов (обмен веществ – метаболизм), ведущих к поддержанию всей системы в целом.)
3. Клетка - единая система сопряженных функциональных единиц (субструктур-органелл).
4. Клетки увеличиваются в числе путем деления исходной клетки после удвоения ее генетического материала.
5. Клетки многоклеточных организмов тотипотентны
- равнозначны по объему генетической информации, обладают всеми потенциями клеток данного организма
- отличаются друг от друга разной экспрессией (активностью) различных генов (дифференцировка).
6. Многоклеточный организм – новая система - сложный ансамбль из множества клеток, объединенных и интегрированных в подсистемы тканей и органов, связанных друг с другом с помощью химических факторов (молекулярная регуляция, гуморальная и нервная).
Прокариоты/эукариоты
Нуклеоид – зона, заполненная ДНК/ ядро
1-5 мкм/ 10-ки мкм
?/органеллы(энд. Сеть, Гольджи, митохондрии)+мкт, мкф, центриоли
Гомологичность; Подсистемы:
– Ядро: система хранения, воспроизведения и реализации генетической информации (хромосомы – ДНК, РНК).
- Гиалоплазма(цитозоль):система основного промежуточного обмена.
- Рибосомы: молекулярные машины синтеза белка.
- Цитоскелет: опорно-двигательная система.
- Вакуолярная система: синтез и транспорт биополимеров (белков).
- Митохондрии: синтез АТФ – энергообеспечение.
- Пластиды: фотосинтез углеводов и АТФ.- Плазматическая мембрана: барьерно-рецепторно-транспортная система
Основные компоненты клетки: ядро - система хранения, воспроизведения и
реализации генетической информации; гиалоплазма - система основного
промежуточного обмена, рибосомы - органеллы синтеза белка, цитоскелет -
опорно-двигательная система; вакуолярная система - (ЭПР, АГ, лизосомы,
эндосомы)- система синтеза и внутриклеточного транспорта биополимеров;
митохондрии - органеллы энергетики клетки; пластиды - органеллы фотосинтеза
и синтеза АТФ; плазматическая мембрана - барьерная, рецепторная и транспортная
система.
3. Клеточное ядро (1). Ядерный аппарат прокариотических клеток Нуклеоид- зона локализации ДНК. 80%днк, 20% – белки и рнк. Кол-во ДНК меньше, чем у эукариот. Днк имеет кольцевую структуру. При репликации - одна исходная точка репликации, две репликационные вилки - вся ДНК = единица репликации = репликон. Хромосомы связаны с мембраной с помощью спец. мембранных белков. Компактизация (ок. 1000р) связана со связками, содержащими рнк и белки (почти как гистоны, но не они) – образуются петли. (одна из моделей – в центре неактивн. ДНК, а по периферии – десприрализованные петли, синтез рнк). Синтез рнк и синтез белка могут происходить одновременно! Т.к. рнк не подвергается процессингу, в отличие от эукариот. + цитотомия не связана с окончанием синтеза ДНК – дочерние клетки могут получить 1-2 ДНК.
(2). Ядро эукариотических клеток Отличия от прокариот: 1. ДНК отделено от цитоплазмы ядерной оболочкой 2. ДНК в 1000 раз больше 3. ДНК – сложный нуклеопротеидный комплекс, образующий хроматин 4. есть несколько не связанных физически хромосом, каждая содержит 1 линейную днк 5. каждая хромосома – полирепликонная структура, т.е. куча автономно реплицирующихся участков. 6. вторичная перестройка транскриптов – фрагментация (процессинг) и сращивание фрагментов (сплайсинг) 7. В ядре не идёт синтез белков.
Компоненты ядра:
Хроматин - структура, выполняющая генетическую функцию клетки.
Ядерная оболочка – барьерно-рецепторная, транспортная и каркасная ф-ии.
Ядерный матрикс (нехроматиновый ядерный белковый остов) – пространственное расположение хромасом + их активность
Ядрышко – синтез рРНК и образование клеточных рибосом
Kариоплазма (транспорт и метаболизм)
+рибонуклеопроотеидные стр-ры, содержащие разные типы рнк.,
Тельца Кохалля –(1-10 шт белок коилин, спиральные,) субдомен, где идет созревание РНК, сборка snRNP и snoRNP (м.ядерРНП – сплайсинг (удаление интронов и сшивание); м.ядрыш РНП – процессирование (модификация синтезированного рРНК))
GEM (уч-е в созревании snRNP, ядерные тела (функция не изучена))
PIKA ( репарация днк, высокая концентрация факторов транскрипции),
PML (от 10 до 30, фрагментируются при promyelocytic leukemia)
Speckles (модификация и сборка участников сплайсинга – белков и м-рнк)
У хроматина – кислотные свойства <=> воспринимает щелочные красители
Два состояния: деконденсированное в интерфазе и конденсированное( максимально уплотненное) в митозе. Разная степень деконденсации: 1.полностью деконденс. – диффузный хроматин 2.неполностью => участки конденсированного хроматина (или гетерохроматина). +периферичский хроматин. Есть. Точка.
Чем более диффузен хроматин, тем выше в нем синтетические процессы. (напр. в эритроцитах почти весь в конденсированом)
Гетерохроматин – постоянные участки кондесированного хроматина (в телофазе не деконденсируются). Остальные – эухроматин. Постоянно конденсированные участки – конститутивный гетерохроматин. – генетически не активен, не транскрибируется, реплицируется позже всех. В его составе – сателлитная ДНК с высокоповторяющимися последовательностями нуклеотидов. (у млекопитающих – 10-15% всего генома). Локализуется в центромерных, теломерных и интеркалярных зонах митотических хромосом. Эухроматические неактивные участки = факультативный гетерохроматин. (например, Х-хромасома – у мужчин активна, у женщин одна активна, а вторая - гетерохроматизирована)
Структура хромосом: плечо (тело), теломерный, конечный участок и центромера (первичная перетяжка).
Метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хр.
В области первичной перетяжки – кинетохор – пластинчатая структура в форме диска.
Вторичная перетяжка = ядрышковый организатор. (здесь же – ДНК, ответственная за синтез рРНК)
Теломерные концы не способны соединяться с др. хромосомами. (в них локализована ДНК, защищающая хромосому от укорачивания в процессе синтеза ДНК)
Размеры хромосом – от 0.2 до 50 мкм.
Число характерно для каждого вида. У радиолярий – 1000-1600, у аскариды – 2. У человека – 46, разделяются по размерам на 7 групп(A-G). 13я- акроцентрическая, 13, 14, 15, 21 и 22 – со вторичными перетяжками.
(Совокупность числа, вида и морфологии хромосом – кариотип вида.)
Дифференциальное окрашивание хромосом – своё для каждой хромосомы.
1.Флуорохром акрихиниприт – видна исчерченность –Q-окрашивание.
2.смесь по Гимза или гематоксилин– можно выявить окрашивание прицентромерных участков(С-полосы) или полос в плечах и теломерах(G-полосы).
3. Арлекин – одну хроматиду
=>составление хромосомных карт человека, т.е. расположение генов на хромосомах.
Клеточный цикл эукариот: T=G1+S+G2+M (пресинтетический + синтетический + постсинтетический периоды + митоз). Время протекания клеточного цикла больше, чем у прокариот (20-30мин / от10ч до 1.5 суток). Дифференцированные клетки теряют способность к делению (клетки цнс). Некоторые все время обновляются (эпителий, кровь). Некоторые начинают размножаться при процессах регенерации органов. (клетки печени?).
Клетки начинают делиться после множества подготовительных процессов, важнейший из которых – синтез ДНК. Смысл деления – в равномерном распределении ген. материала. (подтверждение того, что идет удвоение ДНК – радиоавтография – метка(Н3-тимидин) включается в те клетки, в которых шел синтез ДНК. График - %меченых митозов от времени: расстояние между вершинами – длительность клеточного цикла, время от начала до первых меч. митозов – G2 период (постсинтетический), от появления до 100% - митоз, от 50% до 50% - S-фаза. После этого можем вычислись G1.)
Различные периоды различаются по содержанию в клетках белка, ДНК, РНК и по интенсивности их синтеза. G1 – диплоидное содержание ДНК (2с), S – от 2с до 4с, G2 – 4с. (Те период определяется фотометрией). РНК: в интерфазе увеличивается в 2 раза, после деления – в каждой клетке половина белков и РНК от родительской, потом начинается рост и увеличение РНК и белков, в S кол-во РНК увеличивается, в G2 – максимум. В митозе синтез РНК прекращается.
G0 – фаза покоя. Клетки могут в неё выходить, потом опять возвращаться в клеточный цикл.(напр клетки печени при удалении части печени переходят в G1 и могут делиться)
Клеточный цикл регулируется сложной системой циклирующих белков, контролируют вхождение в каждую фазу цикла.
Полиплоидизация – увеличение числа хромосомных наборов. Эуплоидия – кратное n увеличение (разрушить колхицином мкт веретена => 4n хроматид, 4с ДНК.), анэуплоидия – некратное (не хватает 1 и т.п.) Способы появления: 1.блокада при переходе из G2 к митозу 2. остановки в профазе и метафазе (напр. всё то же веретено –К-митоз) - эндомитоз 3.нарушение цитотомии (многоядерные клетки печени, мочевого пузыря). 4. из профазы в G2 –антифаза, переход в предыдущую фазу. 5. из G2 в G1 – эндоредупликация (полиплоидизация без митоза). 6. слияние клеток (гибриды там всякие..)
(У нервных клеток моллюска тритониии – ядра 1мм, 2*105 гаплоидных наборов ДНК + клетки железы шелкопряда и желез пищевода аскариды ~ 100 000с.)
Политения: в S при репликации ДНК хромосомы не конденсируются, не расходятся. Вступают в следующий цикл репликации, снова удваиваются и не расходятся. Образуется многонитчатая, политенная структура хромосомы интерфазного ядра. (Не участвуют в митозе! Идет синтез ДНК и РНК!) (Видели их в слюнных железах дрозофилы).
Строение политенных хромосом: неоднородны по длине, есть диски, междисковые участки и пуфы. Диски – конденсированный хроматин, пуфы – места деконденсации и разрыхления, места синтеза РНК. (кольца Бальбиани – два самых крупных пуфа у двукылых)
Расположение хр в интерфазном ядре – не теряют целостности, только деконденсируются. Остаются участки констут. гетерохроматина. Теломерные зоны расположены полярно (направлены в одну сторону) и связаны с ядерной оболочкой. Центромеры – аналогично. => хромосомы в ядре повторяют анафазную ориентацию. Могут оставаться целиком конд. хромосомы (тельца Барра). Каждая хромосома образует правую спираль, в нескольких местах связана с ядерной оболочкой. Объемы плеч хромосом не пересекаются. (метод FISH).
4. Структура и химия ядра. Химия хроматина (хромосом);(1). ДНК, ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота. Длина одной молекулы у разных организмов от 0.5мм до 2см. Кол-во ДНК на ядро у различных организмов может отличаться в сотни раз. Количество ДНК не связано напрямую со сложностью устройства генома. Просто существуют
а) часто повторяющиеся последовательности от 10в3 до 10в6 раз
б) умеренно повторяющиеся 10во2, 10в3
в) уникальная последовательность менее 200 повторов.
О сложности организма говорит именно количество уникальных последовательностей.
Сателлитная или часто повторяющаяся фракция ДНК является транскрипционно неактивной. Она не участвует в синтезе белка, не связана с процессом синтеза никаких РНК (было выяснено методом молекулярной гибридизации) Было выяснено что большая часть высокоповторяющейся ДНК расположена в центромерной зоне.
У человека представлена тандемом мономеров по 170п.н., организованных в димеры и пентамеры. Комплексообразующая функция – к ней прикрепляются белки, участвующие в образовании кинетохора.
Также высокоповторяющаяся последовательность ДНК есть и в теломерных районах хромосом. У человека от 500 до 3000 повторов ТТAGGG. Эти участки ограничивают хромосому с краев и предотвращают её укорачивание.
Высокоповторяющиеся последовательности интерфазных хромосом связываются с ламинами, упорядочивая локализацию хромосом в объёме ядра. Есть умеренно повторяющиеся короткие последовательности, разбросанные по всему геному, их функция не ясна. Также часть истинных генов представлена таким типом ДНК.
Репликация. В отличие от бактерий эукариотам свойственна полирепликонность. Т.е. есть много (несколько сотен) точек старта и точек терминации репликации. Скорость движения вилки 1-3 тыс п.н./мин у млеков и 1тыс п.н./мин у растений. Что намного ниже, чем у бактерий (50тыс п.н./мин). Интересно что репликация в эмбриональный период идёт быстрее в несколько раз. Каждая хромосома имеет строго определенный специфический рисунок репликации. Зоны конститутивного гетерохроматина реплицируются в конце S периода. Последовательность репликации очень четко кореллирует с рисунком дифференциального окрашивания хромосом. Репликация идёт в две стороны от точки старта, это доказывается опытом с введением радиоактивного тимидина, а затем его удалением из среды. Етка радиоавтографическая постепенно ослабляется симметрично с обоих сторон от точки старта. Репликону соответствует петля хромосомы. Кластеры репликонов объединены в репликонные единицы, которые вместе с ферментами репликации образуют кластеросомы – зоны в интерфазном ядре, где идёт синтез ДНК.
(2). Белки хроматина Негистоновые белки - 20% от всех белков хроматина. Наиболее распространены и изучены белки HMG (4%от всех) (high mobility group) HMG-1 HMG-2 HMG-14 HMG17. Повышают активность хроматина, делая его более доступным для РНК-полимеразы. HMG-1 HMG-2 связываются с линкерами, а HMG-14 и HMG-17 с нуклеосомами. Легкоэкстрагируемые – те, что легко выделяются – HMG например.
Гистоны – 80% от всех белков хроматина. Взаимодействуют с ДНК за счет солевых и ионных связей. У эукариот всего 5-7 типов молекул гистонов. H1 лизинбогатый; H2A, H2B умеренно лизинбогатые; H3, H4 – умеренно аргининбогатые. H1 самый основный, т.е. в соляном р-ре легче всего отщепляется. Для гистонов характерно кластерное распределение основных амингокислот ( по краям Аргинин с лизином), а в центре другие, образующие 3-4 -спирали. Ацетилирование гистонов – повышение активности генов. Фосфорилирование – конденсация. Гистоны связываются с ДНК во время её репликациив S-периоде. По остановке синтеза ДНК останавливается синтез гистонов. Гистоны - очень стабильные соединения. (У беспов в эритроцитах H5, а не H1, как везде) Н3 и Н4 очень консервативны (у коровы и гороха почти одинаковые)
Обеспечивают первые два уровня компактизации ДНК. Характерны только для хроматина. Щелочные белки, высокое содержание лизина и аргинина. Связь ДНК с гистонами лабильна, их присоединение и отсоединение – обратимые процессы. Функциональная роль – ограничение активности генов, ингибиторы транскрипции.
Нуклеосомы пропускают РНК-полимеразу так: от нуклеосомы отсоединяются димеры Н2А и Н2В. РНК-полимераза проходит, димеры возвращаются обратно. Во время репликации образуются новые нуклеосомы со скоростью 2-3 в секунду. При этом гистоны из старых не смешиваются с гистонами из новых. Старые и новые нуклеосомы распределяются по дочерним ДНК случайным образом. Такая скорость образования нуклеосом возможна из-за наличия пула гистонов в матриксе. ДНК реплицируется 20нм/секунду. Гистон Н1 по большей части модифицирован (ацетилирован).
Уровни компактизации хроматина:
а) Нуклеосомный(10нм). 11 нм бусины на нити. Октамер гистонов( 2Н2А, 2Н2В, 2Н3, 2Н4 и Н1) образует коровую часть. (core – ядро), по поверхности которой расположена ДНК, 146 пар нуклеотидов (п.н.) образуя 1.75 оборота, остальные 54п.н. образуют линкер –участок, не связанный с белками сердцевины, который соединяет две соседние нуклеосомы. Нуклеосома оч. консервативна. Гистон H1 связывается с частью линкера (30п.н.) молекулярная масса 262000 Да. На гаплоидный геном человека (3*10в9) приходится (1.5*10в7) нуклеосом. Нуклеосома 11S.
Сердцевина всегда 146п.н. линкер от 8 до 114 п.н. Ограничивает взаимодействие с РНК-полимеразой. Понижает активность генов.
б) Нуклеомерный. Обеспечивается гистоном Н1 (он не ацетилирован) и наличием двухвалентных катионов. Уровень компактизации - в 40 раз. Образование сверхбусин – нуклеомеров, по 6-8 нуклеосом в каждой. Они уложены в спираль с нерегулярной длиной витка (суперспираль). ДНК недоступно для метилазы, очень сильно ограничено взаимодействие с РНК-полимеразой. Сильно понижает активность генов. Нуклеомер 45S.
В) Хромомерный – петлевые домены, состоящие из розетковидно упакованных 30 нм фибрилл. Размер хромомера – 100 нм. В одной розетке 15-80 петель, до 200тыс п.н. (в среднем 60 тыс п.н.) Коэффициент компактизации 600. Размер отдельных петлевых доменов совпадает со средним размером репликона, может представлять 1 ли 2 гена. В основании петли связаны негистоновыми белками ЯБМ, в их составе ферменты репликации и транскрипции. Участки ДНК, оказывающиеся в центре называются MAR (matrix attachment region) или SAR (scaffold attachment region) Негистоновый остов интерфазного ядра – скэффолд.
(3). Ядерный белковый матрикс Впервые выделе в 1960х. Сначала обработка 2М NaCl, а затем ДНКазой. Хроматин растворяется полностью, остается ядерная оболочка, нуклеонемы(белок и РНК) ядрышки. Была высказана гипотеза, что хроматин прикреплен к этим нитям как ершик для чистки.
В 1970х стали использовать неионные детергенты, такие как Тритон Х100, растворяющие ядерную оболочку. Последовательная обработка растворами солей с малой, затем с большой ионной силой, а затем тритоном и нуклеазами приводила к тому, что оставался преимущественно белковый остов, который назвали матриксом. Он на 88-98% состоит из белка, 0.1 – 1.2% ДНК 0.1-1.2% РНК и 0.5-7% фосфолипидов.
Три основных компонента:
1) Ламина - тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В её состав входят также комплексы ядерных пор PCL. К ней тесно прилегает слой переферического хроматина. Велика её структурная роль. Она поддерживает морфологическую целостность ядра. Т.е. удаление ядерной оболочки не вызовет распада или растворения ядра.
2) Внутриядерный остов или сеть – выявляется только после экстркции хроматина. Губчатая сеть в состав которой входят различные гранулы РНП природы.
3) Остаточное ядрышко – плотная структура, повторяющая ядрышко по форме, состоящая исз плотно уложенных фибрилл.
Степень выявления этих компонентов зависит от дисульфидных связей. Если препятствовать их образованию, введя иодацетамид, то ябм будет представлен только комплексом PCL, а если способствовать, то все три компонента будут отчетливо видны.
Всё это привело к выводу, что ЯБМ не жесткая, а динамическая структура. Она зависит не только от условий выделения, но и от природы нативных ядер. В Зрелых эритроцитах кур весь геном репрессирован, виден только PCL, а в эритроците 5дневного куриного эмбриона видны все 3 компонента.
Белок представлен ламинами А, В и С. Ламины А и С похожи, а ламин В – липопротеид, связанный с ядерной оболочкой. Он не отсоединяется от неё даже во время митоза. По своему аминокислотному составу ламины близки к промежуточнм филаментам – виментинам и кератинам. Также помимо ламинов есть и другие белк, по своему составу совпадающие с белками, организующими петлевую укладку ДНК (образующими осевые структуры, скэффолд)
ДНК в составе ЯБМ. Менее 1% от всей ДНК ядра. Существуют в прочных ДНК-белковых комплексах, устойчива к действию нуклеаз. На хромосому приходится 2-3 длинных, сателлитных, по 10 тыс п.н. последовательностей, обеспечивающих прикрепление к ламине, отвечающих за локализацию хромосом в интерфазном ядре. Это необходимо не только для правильной сегрегации в будущем, но и для транскрипции и репликации. Вторая группа ДНК – последовательности по 120-140 п.н. с интервалами повторения – 50тыс п.н. лежащие в основании петель, ассоциированно с белками розеток хромомеров.(Это SAR или MAR последовательности)
В составе ЯБМ обнаружена ДНК-полимераза, топоизомераза-II, ДНК-лигаза, ДНК-праймаза и т.п. ЯБМ участвует в репликации. Петли ДНК как бы протягиваются через закрепленные в матриксе репликационные комплексы. Участки начала репликации совпадают с местами прикрепления ДНК к матриксу. Транскипционные комплексы также закреплены в ЯБМ, они содержат РНК-полимеразу II. Поведение белков при митозе изучено плохо. Ламины А и С переходят в цитоплазму, ламин В остается прикрепленным к оболочке. Известно что часть белков внутриядерного матрикса входит в состав матрикса митотических хромосом.
5. Ультраструктурная организация митотических хромосом Хромомерный – петлевые домены, состоящие из розетковидно упакованных 30 нм фибрилл. Размер хромомера – 100 нм. В одной розетке 15-80 петель, до 200тыс п.н. (в среднем 60 тыс п.н.) Коэффициент компактизации 600. Размер отдельных петлевых доменов совпадает со средним размером репликона, может представлять 1 ли 2 гена. В основании петли связаны негистоновыми белками ЯБМ, в их составе ферменты репликации и транскрипции. Участки ДНК, оказывающиеся в центре называются MAR (matrix attachment region) или SAR (scaffold attachment region) Негистоновый остов интерфазного ядра – скэффолд.
Хромонемный. Нитчатые структуры толщиной 0.1 – 0.2 мкм. Её можно проследить на начальной стадии конденсации хромосом в профазе митоза и во время деконденсации в поздней анафазе и ранней телофазе. Розетки хромомер, в виде стопочки, расположение розеток совпадают с рисунком G-бэндирования.
Модели строения хромосом:
а) Наиболее старая и ошибочная модель спутанных нитей
б) Соленоидная модель
в) Модель зигзага
г) Петлевая модель (наиболее распространена)
Высшие уровни компактизации хроматина.
в) Хромомерный
г) Хромонемный
д) Хромосомный компактизация в 10000 раз.
Нет представления, как хромомера уложена в хромонеме, и как хромонема образует хромосому.
6. Ядерная оболочка Ядерная оболочка – структура, ограничивающая периметр клеточного ядра. Обособляет процессы синтеза белка от процессов синтеза НК. Элементы оболочки – части ЯБМ. Состоит из двух мембран – внешней и внутренней, между которыми перинуклеарное пространство. Под внутренней мембраной ламина. Ещё центральнее пристеночный хроматин. Оболочка имеет многочисленные сложноустроенные поры.
Ламина – слой фибриллярный, иногда доходящий толщиной до 20нм под внутренней мембраной. Состоит из ламино А,В,С. Ламин С – липопротеид, который после образования модифицируется добавлением гидрофобной изопентильной группы на С конец. Он встраивается во внутреннюю мембрану. Ламина всё время перестраивается, она является динамичной структурой. По своей структуре ламины похожи на промежуточные филаменты (виментин, кератин) даже способны образовать нитчатые структуры толщиной 10нм. Также ламины прикрепляются к мембране посредством многочисленных интегральных белков (LBR, LAR эмерин и др.), ассоциированых с другими белками фиброзного слоя. Внешняя ядерная мембрана по своей структуре и отчасти функциям похожа на гранулярный ЭПР. На ней расположены рибосомы, она зачастую непосредственно переходит в сеть каналов ЭПР. У клеток, бедных ЭПР внешняя мембрана может представлять собой минимально необходимый объём ЭПР, который может участвовать в синтезе и белкового и липидного компонента мембран. Поверхность её неровная.
Внутренняя мембрана – не содержит рибосом, связана с ламиной, и через неё (ламину) заякоривает хроматин.
Ядерная пора – сложно устроенный канал в ядерной оболочке. Диметр его около 100 нм. На снимках, сделанных ЭМ видно, чот это сложноорганизованная структура. Совокупность подобных мембранных перфораций называется комплексом пор. Пор намного меньше в местах, где к оболочке крепится хроматин, ядрышковые организаторы теломерные участки. ЯПК состоит более чем из 1000 белков, причем из 50-100 разных видов белков. Его молекулярная масса – 125000кДа. Белки ЯПК называются нуклеопорины. Переферия ЯПК представлена 8 глобулами. В центре «пробка» «транспортер» или центральная гранула. В сторону цитоплазмы фибриллярные выросты есть, а в сторону ядра они образуют «корзинку» Весь ЯПК закрепляется интегральными гликопротеидами GP210 и РОМ 121. По сложности организации и функциональной значимости поровый комплекс можно отнести к органеллам. Размеры пор стандартны для всех эукариот. Их число зависит от синтетической активности клетки. Чем она выше, тем пор больше. В ооците лягушки на 1 мкм приходится 51 пора, а в культуре ткани человека около 11,24/мкм. Количество пор в клетке меняется в течение жизненного цикла. Макромолекулярный ансамбль ЯПК способен к самосборке и встраиванию в мембраны.
Через ядерную пору транспорт веществ идёт в обе стороны. Частицы, массой менее 5кДа проходят беспрепятственно, белки с массой 40кДа проникают в ядро за полчаса, а 60кДа не проникают вовсе. Транспорт ведётся как по, так и против градиента концентрации, например в ядро, через каждую пору транспортируется по 100-500 гистонов за минуту. В то же время через пору могут проходить белки и макромолекулярные комплексы, с массой, сильно превышающей 60кДа. Из ядра в цитоплазму выходят фрагменты РНП, с массами около 250кДа. Это показывает, что поровый комплекс – не просто механическое сито, ограничивающее транспорт в зависимости от размеров молекул. Существуют специальные механизмы, по которым в-ва проходят через пору. Оказалось, что белки, транспортируемые в ядро имеют NLS (nuclear localization sequences) последовательность, такие последовательности свойственны для кариофильных белков, синтезируемых на рибосомах в цитоплазме и затем направляемых в ядро. От белка нуклеоплазмина отрезали С-концевые участки, содержащие NLS, после этого сам белок попасть в ядро не мог, а крупные гранулы декстрана, ассоциированные с NLS фрагментами проникали в ядро. NLS белок проходит в ядро в несколько этапов. NLS связывается с импоритнами альфа и бета локализованными в цитоплазме. Новый комплекс подходит к поре и закрепляется на цитоплазматических филаментах, после чего проходит через пору. Центральная гранула, предположительно белковые алаин и глицин содержащие фил-ты. После прохода через канал импортин бета связывается с RAN белком, исходный комплекс распадается, импортин альфа покидает ядро также как и бета, только в связи с RAN-GDP. Импортин альфа связывается с карго, а бета связывается с порой.
Экспорт осуществляется схожим образом. Есть NES (nuclear export sequences) её содержат белки экспортируемого РНП. Экспортин 1 связывается с карго и с RAN-GTP, комплекс проходит через канал, создаваемый транспортером в цитоплазму, где диссоциирует. Экспортин и RAN после гидролиза GTP возвращаются в ядро. Во время транспорта япк контролирует не только белковый компонент. Ядерные поры узнают и не экспортируют коротки (100нукл) последовательности Т-РНК, если в них есть хоть одна замена. иРНК, содержащее интронные участки не транспортируется. Мало изучен вопрос о транспорте в цитоплазму крупных РНП комплексов, таких как субъединицы рибосом, информосомы, мяРНП, вероятно в ходе прохождения поры они меняют конформацию. Есть гипотеза, что в зоне ЯПК происходит «переодевание» иРНК.
В большей части живых организмов ядерная оболочка разрушается при митозе и снова возникает после деления клеток. В профазе оболочка теряет связь с хромосомами, в ней появляются разрывы, она приобретает вид цистерн, Ядерные поры начинают исчезать. ЯПК массой 120кДа разбирается на кусочки по 1кДа. Начинается этот процесс с фосфорилирования cdc2/циклин В-киназой ряда нуклеопоринов. Образовавшиеся цистерны, вероятно, сливаются с вакуолями ЭПР, или оттесняются микротрубочками к периферии. В конце анафазы мембранные пузырьки гранулярного ЭПР первыми начинают контактировать с поверхностью хромосом. Сначала контактов немного, потом их число растет. Деконденсирующиеся хромосомы начинают отгораживаться образовывающейся мембраной. Интересно, что ядерные поры появляются ещё до того, как ядерная оболочка сомкнется. В образовании поры участвует интегральные белки gp 210 и РОМ 121, которые потом и будут закреплять ЯПК на мембранах. Филаменты образуются в последнюю очередь. Необходимым условием для реконструкции яд. оболочки является деконденсация хромосом. Интересно, что ламины А,В,С также необходимы для нормальной сборки оболочки. Ламины деполимеризуются до олигомеров одновременно с конденсацией хроматина.
7. Морфология транскрипции Типы РНК: информационная m, рибосомная r, транспортная t, малая ядерная sn (сплайсинг – удаление интронов и сшивание), малая ядрышковая sno (процессирование – модификация синтезированной рРНК), микро mi (блокирует трансляцию иРНК), малая интерферирующая si (взаимодействует с иРНК, вызывая её деградацию) и др. <…>
Длина: иРНК от 500 до 3000 нуклеотидов, малая ядерная – 90-400 нуклеотидов, тРНК – 74-95 нукл
Скорость: рРНК – 20-30нуклеотидов/с
РНК-полимераза -I: 5.8S, 18S, 28S RNA
-II: sno, sn, mi, si, m RNA
-III: t, 5S, часть sn RNA
иРНК образуются при участии РНК полимеразы-II, начинающей синтез со стартовой точки транскрапционной единицы (промотор) и кончающей его в точке терминации. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции (обычно там один ген). В пределах каждого транскриптона копируется только одна из двух нитей ДНК, которая называется значащей или матричной. Образуется одна молекула РНК. – первично синтезированная или гетерогенная ядерная РНК (гяРНК).
(Экзоны – участки ДНК, обладающие кодирующей информацией и входят в состав иРНК; интроны содержат последовательности, не входящие в иРНК.) гяРНК содержит и экзоны и интроны. Впоследствии происходит сплайсинг -> гяРНК укорачивается (длина гена белка сильно больше длины его иРНК). Сплайсинг идёт с помощью белковых комплексов – сплайсосом (=5-7 snRNP = 5-7*(snRNA + ~7 молекул белка)), которые садятся между интронами и экзонами, разывают это место и сшивают концы экзонов. Обозначения snRNP – Uk, где 1<=k<=12. гяРНК наматывается на белковые глобулы – информомеры. При переходе через ядерную пору они снимаются, а в цитоплазме иРНК одеваются новыми белками (неактивная форма) или связываются с белками, необходимыми для трансляции.
(2). Транскрипты интерфазных ядер Неядрышковые продукты транскрипции:
Перихроматиновые гранулы – диаметр 45нм, окружены светлым ореолом (избирательное контрастирование солями урана), встречаются по периферии конденс хроматина, встречаются в пуфах. Предположение, что это – комплексы из информомер (иРНП) или прерихроматиновые фибриллы – гяРНК.
Интерхроматиновые гранулы – 20-25нм, группируются между участками хроматина. В них обнаружили сплайсосомы.
Пуфы – место синтеза РНК на хромосомах. (на 4 хромосоме chironomus(мотыль) – два постоянных пуфа – кольца Бальбиани) Они содержат большое кол-во гранул рибоуклеопротеидной природы(50-60нм). Содержат иРНК, располагаются вдоль осевых элементов. Оказалось, что это 75S РНК, не подвергающаяся процессингу и служащая матрицей для синтеза огромных молекул секреторных белков.
(3). Транскрипция рибосомных РНК Ядрышко – обнаружено в 1774г., является наиболее плотной структурой клетки из-за большого (70-80) процента белков. Ядрышко – вместилище генов рибосом и местом транскрипции и процессинга рРНК.
Рибосомные гены – (у человека) 100-ни и 1000-и идентичных умеренно повторяющихся посл-тей в геноме. (Даже у бактерий их 6-7). Гены расположены в зонах ядрышковых организаторов (во вторичных перетяжках), собраны в кластеры – кроме 5S. Гены 5S тоже множественны – 2000 шт.
Рибосомный ген состоит из спейсера и транскрипционной единицы (28, 18, 5.8S рРНК + вставки = 45S РНК). Nts-промотор-tse-18S-tsi-5.8S-tsi-28S (nts – нетранскрибируемый, tsi-интроны). 5S синтезируется на др хромосомах, не в зонах ядрышковых организаторов (обычно в теломерных областях), при участии другой РНК-полимеразы. Скорость транскрипции 45S – 5-10 минут. На каждом гене одновременно идет синтез 50-100 молекул РНК (ёлочки). Длина транскрипта короче гена, тк он связывается с белками -> 80S. Около 50% белков большой единицы и 30% малой. Затем – процессинг – расщепление пре-рРНК на фрагменты и частичная деградация участков РНК при участии эндо- и экзонуклеаз. -> прерибосомные частицы 60 и 40S. 60S связывается с 5Sрнк, все выходят в цитоплазму, 40S связывается с иРНК, потом с 60S и дружно начинают трансляцию.
Структура ядрышек: по периферии – ДНК (в околоядрышковом хроматине), внутри – РНК, структура неоднородная.
Гранулярный компонент – по периферии, но бывает, что расположен в ядрышке равномерно. Иногда образуются нитчатые структуры – нуклеолонемы, которые также неоднородны по строению – содержат множество гранул и фибрилл.
Фибриллярные центры – участки скопления фибрилл с низкой электронной плотностью, окруженные плотным фибриллярным компонентом (соответственно с высокой плотностью).
+околоядрышковый хроматин и белковый сетчатый матрикс
(метод регрессивного окрашивания нуклеиновых кислот – ионы уранила на срезах вымываются легче с ДНК -> рнк ярче) => все компоненты ядрышка содержат РНК.
Н3-уридин => 45S пре-РНК синтезируется в ПФК, а прерибосомные частицы – в ГК. В ФЦ – ДНК, ответственная за синтез рРНК.
Но число ФЦ может быть больше числа ЯО, хотя состав один и тот же. Чем выше транскрипционная активность ядрышка, тем больше число мелких связанных друг с другом фибриллярных центров, окруженных ПФК. При полной активации (амплифицированные ядрышки растущих ооцитов) – только ПФК, при полной инактивации (митотические хромосомы)– только ФЦ, окруженный конденсированным хроматином..
Типы ядрышек: ретикулярный (нуклеолонемное строение, обилие гранул и ПФК), компактный (больше ФЦ) – для клеток с высоким уровнем синтеза РНК, кольцевидные (ФЦ, окруженный РНП-фибриллами и гранулами) – низкий уровень транскрипции, остаточные (маленькие, окружены конд. хроматином, почти не видны) – в клетках, потерявших способность к синтезу рРНК(эпителий), сегрегированные – обработанные хим вещ-вами, прекращающими синтез рРНК, вызывающими обособление компонентов ядрышка друг от друга.
Белки ядрышек: белки рибосом, белки для транскрипции, белки для процессинга (РНК-полимераза1, факторы транскрипции, топоизомеразы, фосфатазы, нуклеазы итп).
Полимераза – по краям ФЦ.
Фибрилларин – белок, специфический для ядрышек. Есть в ПФК, где осуществляет процессинг пре-рРНК вместе с U3 и snRNA.
С23 или нуклеолин в ПФК, и ФЦ, и ЯО митотических хромосом. Функции не ясны.
В23 или гуклеофозин – в ПФК, ГК, считается, что участвует в биогенезе рибосом и транспорте пре-рибосом.
Неканонические ф-ии: процессинг snRNA, tRNA. Как-то связанос продукцией иРНК?? Никто не знает.
В интерфазе – перед митозом – исчезновение ядрышка – теряет плотность, ядрышковый материал растекается между хромосомами (локализуется в ЯО). Метафаза, анафаза – их нет. В конце телофазы – первые признаки. Некоторые компоненты ядрышка во время митоза уходят в цитоплазму (РНП-частицы), другие связываются с пов-тью хромосом, образуя основу периферического хромосомного материала. Фибриллярно-гранулярный материал, синтезированный до митоза, который переносится хромосомами в дочерние клетки (пре-рРНК и snRNA.) + негистоновые белки из ядерного интерфазного остова. В ЯО переносятся рнк-полимераза1, топоизомераза1, фактор инициации транскрипции UBF и др. Возможно, это всё для форсированного начала синтеза и созревания рибосом в новых ядрах.
8. Мейоз- образование половых клеток. “Зародышевый путь”, соматические и герминативные клетки Мейоз – деление, при котором происходит уменьшение числа хромосом, переход клеток из диплоидного состояния в гаплоидное, это способ специализации клеток, образование половых клеток. Мейоз занимает два клеточных цикла, во втором отсутствует синтез ДНК.
<…>
Профаза 1 мейотического деления: самая продолжительная – от суток до неск лет. Состоит из – лептотены, зиготены, пахитены (самая длинная), диплотены, диакинеза. Происходит кроссинговер, идет синтез РНК и ДНК. (у человека профаза ооцитов – с 3 внутриутробн. месяца до 50 лет, сперматоцитов 1 порядка – 24 дня.)
Лептотена – стадия тонких нитей – хромосомы очень тонкие, в 10-100 раз длиннее митотических. Хромосомы удвоены, но их сложно различить. На нитях – «бусинки» - сгустки хроматина, которые характерны для каждой хромосомы -> составляются карты. Начинает образовываться синаптонемный комплекс.
Зиготена – гомологичные хромосомы сближаются, их связывает синаптонемный комплекс -> бивалент. Идёт коньюгация, синтезируется 0.3% ДНК клетки = z-ДНК – линейные ДНК, с уникальными посл-тями нуклеотидов. Служат для узнавания соответственных участков хромосом(?) до синаптонемного комплекса. Ск – трёхслойный (160-240нм) –два боковых тяжа и осевой элемент. Каждый боковой эл-т связан с петлями 2-х сестринских хроматид одного гомолога.
Пахитена – стадия толстых нитей. Полная коньюгация гомологов -> каждая нить – 4 хроматиды. Идёт кроссинговер – взаимный обмен идентичными участками хромосом. (в диплотене останутся хиазмы – в местах кроссинговера.) синтез 1% ДНК для репарации после кроссинговера. Возможно, принимает в этом участие рекомбинационный узелок – белковый комплекс в син. комплексе, в местах кроссинговера. + амплификация рДНК, появление дополнительных ядрышек.
Диплотена – стадия двойных нитей. Отталкивание гомологов друг от друга, но остаются соединенными сестринские хр. Видны хиазмы – места перекреста и сцепления хромосом. Конденсация хромосом -> хорошо видны. Происходит активация транскрипции иРНК, хр приобретают вид «ламповых щеток».
Диакинез – уменьшение числа хиазм, укорочение бивалентов, их расхождение. Хр теряют связь с ядерной оболочкой.
В анафазе 1 деления расходятся гомологичные хромосомы, а не хроматиды. -> редукция числа аллелей.
Второе мейотическое деление: короткая интерфаза без синтеза ДНК, расхождение сестринских хроматид -> редукция числа хромосом. Получилось 4 гаплоидных клетки. При мейозе сперматогониев – 4 сперматицита, которые дифференцируются в сперматозоиды. При мейозе оогоний возникает зрелая яйцеклетка и три мелких направительных тельца (образуются при делениях).
9. Мембранные компоненты клетки. Мембрана – тонкая липопротеидная пленка, состоящая из двойного слоя липидных молекул, в который включены молекулы белка. Липиды 25-60%, белки 40-75%. Часто углеводы 2-10%.
У липидов гидрофобный (неполярный) хвост и гидрофильная (полярная, заряж +, - или нейтр) голова. Толщина около 7.5 нм. Мембраны всегда замкнуты на себя. Поверхностное натяжение мембраны клетки ниже, чем искусственного бислоя. Причина в наличии в первом случае белков. Ф-ии мембраны: ограничительная, поддержание отличий внутр состава от внешнего, транспортная, рецепторная, адгезия.
Разнообразие липидов: глицерофосфатиды (глицеролипиды, фосфолипиды) — сложные эфиры глицерина с 2 жирными к-тами и фосфорной кислотой (она м.б. Связана с холином, серином, инозитом, этаноламином). Сфингомиелины (вместо глицерина аминоспирт сфингозин) и холестерин. => непроницаемый барьер для любых заряженных молекул, т.е. преграда для свободной диффузии.
Белки вкраплены в билипидный слой. Связаны либо ионными связями с липидными головками, либо гидрофильно-фобными взаимодействиями со слоем. (Периферические(чтобы их выделить, достаточно сменить ионное окружение) / интегральные(чтобы выделить, нужно разрушить бислой) (интегральные б. - замораживание-скалывание через центральную липидную зону) Бывают трансмембранные – пересекающие бислой (та часть, что в бислое – гидрофобна).
Пример переферического белка – спектрины альфа и бета, образует тетрамеры и сеть из них, сними взаимодействует актин в местах привязки к белку 4.1.
Молекулы липидов движутся со скоростью 2мкм/с (диффузия), могут вращаться вокруг оси, переходить из слоя в слой. Для изучения движения белков используют лектины, которые связываются с олигосахаридами белков мембраны. + можно пометить флюор. (антитела против лектинов) – белки распределены равномерно, могут собираться вместе («колпачок» над аппаратом гольджи) -> эндоцитоз, обновление белков мембраны.
Асимметричность мембран: 80% сфингомиелина, 75% фосфатидилхолина, и 20% фосфатидилэтаноламина - на наружной стороне. На внутренней - весь фосфатидилсерин и 80% фосфатидилэтаноламина. (для ЭПР наружн пов-ть та, что внутрь полости) Интегральные белки асиметричны! N концы белков обычно наружу (из-за синтеза). Гликолипиды есть только снаружи. Углеводы обычно снаружи. Появление фосфатидилсерина снаружи = апоптоз.
Холестерин – тоже амфипатическая молекула, ограничивает латер подвижность белков, увеличивает жесткость мембраны. Факторы, ограничивающие латер. Подвижность – вз-я белок-клетка, клетка-клетка, клетка-мембрана, вз-е с эл-тами цитоскелета, с кнеклеточным матриксом. Также ограничивается образованием самособирающихся ансамблей белков.
Белки выделяют детергентами. Ионные вз-т с гтдрофильными концами. Неионные (Х100, TWIN) с гидрофобными концами. Методом детергентов создаются перфорации в мембране.
Со стороны цитоплазмы мембраны через примембранные белки связаны с цитоскелетом => прочность и подвижность мембран. Белки-спектрины – образуют жесткую подмембранную сеть. +образование межклеточных контактов (десмосомы, адгезивный контакт итп). Внешняя ядерная мембрана связана с промежуточными филаментами, фиксирующими её в цитоплазме. Передвижение вакуолей – мкт и мкф.
Рост – за счет встраивания пузырьков в мембрану, образующихся в гэр, который является источником всех мембран, кроме мембран митохондрий и пластид. ГрЭПР -> Гольджи -> лизосомы/плазм мембрана/секреторные вакуоли.
10. Плазматическая мембрана Плазматическая мембрана клетки – осуществляет основные функции а) барьерную б) транспортную в) рецепторную г) сигнальную д) адгезивную
Состоит из липидов, белков и полисахаридов (гликопротеины, протеогликаны, гликолипиды)
Искусственные мембраны имеют поверхностное натяжение в 5-10 раз выше чемЮ природные. Также они абсолютно непроиницаемы для любых заряженных частиц.
Но через них свобожно проходят незаряженные частицы массой менее 60Да. Это обусловлено отсутствием в них белков. Это свойство используется для адресной доставки лекарств в клетки (образуются липосомы, которые сохраняют целостность до попадания в клетку)
Мембрана как механическй и диффузионный барьер. Проницаемостьь мембраны:
Свободно диффундируют не заряженные частицы, массой менее 60Да
Глицерол, О2, этанол, СО2, Н2О – легко проходят
Глюкоза, Н+, Nа+, Са2+, Сl-, аминокислоты – не проходят.
Выделяют 2 типа транспорта:
А) Пассивный – по электрохимическому градиенту или по градиенту концентрации. Транспорт через канальные белки и белки-переносчики.
Б) Активный транспорт – т.е. транспорт против градиента. Осуществляется белками-переносчиками и с затратой энергии. Выделяют: Унипорт– транспорт в одно напр-е и только одного вар-та молекул. ( напр. Са-помпа- активный унипорт). Антипорт – одновременный транспорт двух разных частиц в разные стороны. Симпорт – одновременный транспорт двух разных частиц в одну сторону. Анти-, Сим- и Уни- - только напр-я транспорта. Могут быть и активными и пассивными.
М.б. такой варинт симпорта, когда одна частица по градиенту, а другая против – парный транспорт. М.б. транспорт за счет энергии АТФ. М.б. светоэнергетический транспорт.
(K+ выводится из клетки через канальные белки).
Иногда в-во может проходить через клетку (глюкоза через эпителий)
Интересно организован Nа-Са антипорт в кардиомицитах. Идёт без использования доплнительной Э. 3Na закачивается в клетку, из неё выкачивается Са. 3Na снова выбрасывается, и закачивается 2K.
С-мы активного транспорта с использованием Энергии.
1. Помпы P-класса.
Есть в плазматической мембране грибов, растений ,бактерий ( Н+ помпа), в плазматической мембране высших эукариот ( Nа/K помпа), в апикальной плазматической мембране в клетках желудка млеков (Н+/K+), в плазматических мембранах всех эукариот (Са2+ помпа), в саркоплазматическом ретикулуме, в мышцах (Са2+)
2. F класс
Во внутренней мембране митохондрии, в мембране тилакоида в хлоропласте, в плазмат. Мембране бактерий
3.V класс
Вакуоли у растений и грибов, эндосомы и лизосомы животных, в плазмат. мембране клеток, вырабатывающих у животных кислоту (остеокластах)
4. АВС класс
В мембранах бактерий (тр-т кислот, сахаров, белков), в ЭПР млеков (белки связанные с антигенами ННС1 и ННС2), в плазматической мембране млеков (тр-т жироподобных в-в и фосфолипидов)
Идёт через ионные каналы. Есть 3 состояния этих каналов, открытое активное, открытое неактивное и закрытое. Открываться они могут по принципу потенциал-зависимости, лиганд-зависимости или же просто механически. Na/R помпа закачивает 2K и выкидывает 3Na, затрачивая при этом 1АТФ. Примерно 80% АТФ клетки тратится на поддержание гомеостаза.
Межклеточный транспорт и контакты.
Свойство клеток образовывать соединения, слипаться – называется адгезией. В этом участвуют различные белки, часто образующие целые ансамбли, связывающие клетки. За агрегацию однородных клеток отвечают трансмембраные гликопротеиды. Непосредственно за адгезию отвечают САМ белки (cell adhesion molecules), некоторые из них связывают клетки за счет межмолекулярных вз-й, некоторые образуюют спец. Контакты. Соединения бывают гомофильными (САМ белки клеток одинаковые) и гетерофильные (САМ – разные) Имеется несколько классов САМ белков: кадгерины, иммуноглобулинподобные N-САМ (адгезия нервных клеток), селектины, интегрины.
Кадгерины – интегральные фибриллярные белки, образуют гомодимеры. Некоторые связаны с Са2+, что придает жесткость. Всего около 40 видов. Е,Р,N –кадгерины –
(Е-эпителий, Р-плацента, N-нервы и мышцы)
N-CAM – некоторые участвуют в соединении синапсов и адгезии клеток иммунной с-мы.
Селектины – интегральные белки пл. мембр. Участвуют в связывании кровяных пластинок, лейкоцитов и адгезии эндотелиальных клеток.
Интегрины – гетеродимеры с альфа и бета цепями. В основном, связь клеток с субстратом.
На поверхности всех клеток позвоночных располагаются белги MHC – главного комплекса гистосовместимости. Это интегральные белки гликопротеины, гетеродмеры. Каждый индивидуум имеет свой набор белков МНС. Если комплекс МНС изменен, такая клетка будет уничтожена Т-лимфоцитом. Он выделит белки перфорины, которые создадут каналы в мембране клетки и она погибнет.
Запирающее или плотное соединение – характерно для однослойных эпителиев. Внешние слои сближены максимально, местами сливаются. Точки соприкосновения мембран – глобулы окклудина и клаудина. Особенно характерно для железистых и кишечных эпителиев. В кишечных образуют сплошную полоску, опоясывающую клетку, её часть, смотрящую в просвет кишечника. – т.н. замыкающая пластинка. Эта область контакта плохо проницаема для макромолекул и ионов и жидкостей. Т.е .она изолирует организм от внешней среды. Гидроокись лантана не проникает. (видно в ЭМ).
Заякоривающие, сцепляющие соединения
Соединяют не только плазматические мембраны клеток, но и связываются с эл-ми цитоскелета. Два типа белков а) трансмембранные линкерные – уч-ют в межклет. Соед. Или соединении с матриксом. б) Внутриклеточные белки, соединяют цитоскелет с мембранными эл-ми контакта. Две группы контактов:
1) межклеточные точечные сцепляющие контакты, сцепляющие ленты, фокальные контакты – связаны с актиновыми МФ
2) Десмосомы и полудесмомсомы – связаны ПФ.
Сцепляющие ленты – в однослойных эпителиях – опоясывает весь периметр клетки. Чаще лежит ниже плотного соединения. Плазматические мембраны раздвинуты на расстояние 25-30 нм. Между ними зона повышенной плотности – место вз-я трансмембранных гликопротеинов. Эти белки – Е-кадгерины. С цитоплазматической стороны тоже уплотнение ,к которому идут актиновые МФ. МФ крепятся к мембране посредством альфа актинина, катенина и винкулина. Значение - сокращение актиновых филаментов может вызвать изменение формы пласта, например сворачивание в трубочку + механическое удерживание.
Фокальные контакты
Встречаются у многих клеток в т.ч. у фибробластов. Построение похоже на построение лент, но расположены в виде небольших участков – бляшек. С МФ связаны винкулином. Значение – организация механизмов передвижения и закрепление на субстрате.
Десмосомы
Такие же бляшки, с кадгерина – десмоглеинами. Только с цитоплазматической стороны
Лежит белок десмоплакин, с которым связаны ПФ. Значение - В Кардиомиоцитах десминовые фибриллы (ПФ), в эндотелии сосудов виментиновые ПФ.
Полудесмосомы
Сходны по строению с десмосомой, только организуют соединение клетки с межклеточными структурами, а не с другими клетками. Вместо кадгеринов - интегрины.
Значение полудесмосом и десмосом сугубо механическое. Но именно они связывают кардиомиоциты, что позволяет им сокращаться, сохраняя единую структуру.
Все типы сцепляющих контактов, в отличие от плотного не играют никакой роли в ограничении диффузии.
Щелевые контакты
Комуникационные соединения клеток. Их долго не могли отличить от плотных ( выглядят также почти), заметили, когда гидроокись лантана прошла через такой «плотный», а на самом деле щелевой контакт. На сколах мембран щелевых контактов гексангонально расположены коннексоны – в зоне щелевого контакта от 10-20 до нескольких тысяч коннексонов. Частица диаметром 7-8нм с каналом, диаметром 2нм. Коннексон состоит из 6 субъединиц коннектина – белка 30кДа. Одному коннексону на одной плазмат. мембране точно противостоит другой на второй мембране – они образуют канал. Это прямые межклеточнеые каналы – свободная диффузия ионов и низкомолекулярных в-в. Между такими клетками с щелевым контактом идёт ток. Через канал могут проходить в-ва диаметром не более 1.5 нм (у насекомых не более 2кДа) и массой не более 1.5кДа. Ни белки, ни НК через коннексоны не проходят. Значение - Все клетки миокарда связаны щелевыми контактами( быстрая передача нервного импульса, без медиатора) т.е. обеспечивают одновременное сокращение (не только сердца, но и напр. стенок матки) Через щелевой контакт идёт обмен гомонами, метаболитами. Начиная с 8клеточной стадии у позвоночных бол-во клеток связаны щелевыми контактами. Целостность зависит от концентрации ионов Са2+, если она слишком большая контакты закрываются, и открываются лишь когда концентрация Са2+ придёт в норму.
Везикулярный перенос. Эндо, экзо и трансцитоз.
Эндоцитоз – захват в-в клеткой
Экзоцитоз - вывод в-в из клетки
Эндоцитоз условно делят на фаго - (захват частиц) и пиноцитоз (захват р-ра)
Эндоцитоз бывает неспецифический и специфический. Неспецифический м.б. связан с рецепторами ,м.б. не связан, специфический связан всегда.
Основное значение эндоцитоза – получение строительных блоков за счет внутриклеточного переваривания.
В результате неспецифического эндоцитоза м.б. поглощена чуждая клетке частица (краситель, сажа и т.п.)
При рецептор-независимом поглощении просто образуется первичная эндосома, которая потом сливается с лизосомой.
1.Часто неспецифический эндоцитоз сопровождается первоначальной сорбцией захватываемого материала гликокаликсом плазмалеммы. Гликокаликс из-за кислых групп полисахаридов имеет отрицательный заряд и хорошо связывается с + заряженными группами белков.
2. Изменяется форма клеточной поверхности, образуются ямки(в кишечном эндотелии) или рафлы(выросты)(у фагоцитов и фибробластов).
3.Идёт процесс слияния мембран в строго определенном участке – окаймленной ямке. На этих участках мембрана покрыта тонким 20 нм слоем, состоящим в основном из белка клатрина, асооциированного с рядом дополнит. белков. Эти ямки есть почти у всех клеток животных, занимают 2% площади мембраны. Три молекулы клатрина вместе с тремя молекулами низкомолекулярного белка образуют трискелион. Трискелионы на внутренней поверхности ямок образуют сеть, состоящюу из 5- и 6-угольников. Клатриновый слой покрывает всю площадь отделяющихся вакуолей – окаймленных пузырьков. Клатрин относится к группе одевающих белков (СОР-coated proteins) Белки этой группы покрывают всю площадь отделяющегося пузырька, делая его окаймленным.
Также в отделении участвуют и белки динамины, которые полимеризуются в области шейки отделяющегося пузырька. Мембраны окаймленных ямок содержат сравнительно мало холестерина, что способствует снижению их жесткости.
4. После отделения пузырёк устремляется внутрь цитоплазмы, клатриновый слой распадается, диссоциирует. Мембрана пузырька приобретает обычный вид. После этого эндосомы начинают сливаться друг с другом. Функция СОРов, возможно, - вз-е с цитоскелетом и препятствие слишком раннему слиянию эндосом.
Интенсивность неспецифичного пиноцитоза чрезвычайно высока. Клетка эпителия тонкого кишечника образует до 1000 пиносом в секунду, макрофаг до 125 в минуту. Размер пиносом 60-130нм. У макрофагов и-за постоянного пинцитоза мембрана полностью обновляется за 30 минут. У фибробласта – за 2 часа. От эндосомы могут отщепляться маленькие вакуоли, которые будут снова сливаться с плазмалеммой. Вся мембрана проходит рециклизацию плазмалемма-эндосома-вакуоль-плазмалемма.
Специфический Эндоцитоз.
Поглощаются лишь молекулы, для связи с которыми на мембране есть специфическиие рецепторы. Эти молекулы часто называют лигандами. Пример – поглощение холестерина клетками. Он поглощается в виде ЛНП (липопротеид низкой плотности), связываясь со специфическими рецепторами на мембранах различных клеток.
Весь специфический эндоцитоз идёт по одному мех-му – ассациация с рецептором, перемещение в окаймленную ямку, интернализация (окружение мембраной). Рецепторы накапливаются в области клатриновой ямки. Затем вместе с лигандами интернализируются. А затем в виде вакуоли отщепляются от эндосомы и возвращаются на мембрану, происходит их рециклизация. А эндосома сливается с лизосомой, образуя эндолизосому, где лиганд и переваривается (в случае ЛНП гидролизуется до холестерина) Среда в эндосомах более кислая, чем в окружающей среде – в их мембранах АТФзависимые протонные насосы. Кроме того кислая среда лучше подходит для активации лизосомных ферментов.
Иногда идёт не эндоцитоз, а трансцитоз, тогда образовавшаяся эндосома не будет сливаться с лизосомой а просто перейдет в другую область клетки, где снова сольются с мембраной, выделив содержимое наружу. Ещё один пример трансцитоза – перенос антител. Антитела матери могут передаваться детенышу. Тогда комплекс рецептор-антитело останется в лизосоме без изменений.Фагоцитоз – тот же эндоцитоз, только макрочастиц. У нас к нему способны макрофаги и нейтрофилы.
Выведение в-в из клетки – Экзоцитоз.
Это процесс, обратный эндоцитозу. С помощью экзоцитоза идёт рециклизация мембран и рецепторов в ходе эндоцитоза. Клетки могут выделять и низко и высокомолекулярные соединения. Экзоцитоз чаще всего осуществляется в ответ на сигнал извне (нервный импульс, воздействие гормона, медиатора и др.) Иногда экзоцитоз идёт посотянно (секреция коллагена и фибронектина фибробластами). Часть эл-тов гликокаликса выделяется клеткой по мех-му экзоцитоза. Благодаря экзоцитозу животные организовали внеклеточное пищеварение – выделение пищеварительных ферментов из клеток идёт по тому же мех-му экзоцитоза (напр. ферменты в области тонкого кишечника, экзогидролазы)
Рецепторная роль
В роли рецепторов клетки могут выступать белки мембраны или эл-ты гликокаликса.
Например, прослежен мех-м работы гормона глюкагона.
Гормон связывается со специфическим рецептором на мембране. Рецептор, связанный с гормоном, активирует белок из цитоплазматической части мембраны – аденилатциклазу. Этот белок синтезирует цАМФ из АТФ. ЦАМФ активирует протеинкиназу А, которая активирует каскад ферментов, в конечном счете расщепляющих гликоген до глюкозы. Инсулин же действует наоборот, он стимулирует отложение глюкозы в виде гликогена.
Такая аденилатциклазная с-ма может усиливать сигнал в тысячи раз, за счет синтеза множества молекул цАМФ.
В плазматической мембране светочувствительных клеток животных находится родопсин, который преобразует световой сигнал в химический, что приводит к запуску электрического импульса.
11. Строение и химический состав рибосом, биосинтез белка в гиалоплазме. Рибосома – элементарная органоид синтеза любых белков клетки. За клеточный цикл их образуется 1*107. Основная масса рибосом – рРНК + множество молекул белков. Рибосома диссоциирует на 2 субъединицы: прокариотическая 70S=50S+30S, эукариотическая 80S=60S+40S. В составе малой субъединицы – одна рРНК, в составе большой – у прокариот 2, а у эукариот 3. РРНК прокариот: 16S + 23S, 5S, эукариот: 18S + 28S, 5S, 5.8S. Сборка может происходить спонтанно если последовательно добавлять к РНК белки.
Образование рРНК: синтезируется 45S РНК, в результате процессинга – 28, 18 и 5.8S. 5S РНК синтезируется независимо и не связана с ядрышковым организатором.
Начало синтеза всех белков – в гиалоплазме (кроме 13 митохондриальных белков). Трансляция: инициаторная аминок-та садится на цепь -> взаимодействие с иРНК, присоединяется большая субъединица. Пептидил-трансфераза – фермент «переброски», рост цепи. Трансляция идет до стоп-кодона (УАА, УАГ, УГА). В конце – гидролиз, отсоединение пептидной цепи, конец трансляции.
12. Вакуолярная система (1). Эндоплазматический ретикулум гранулярный. Эндоплазматический ретикулум – сеть из вакуолей и канальцев, ограниченных тонкими мембранами. Со стороны гиалоплазмы покрыты рибосомами – работающими, прикрепленными к мембране большой субъединицей. Скопление грЭПР – эргастроплазма. Характерна для клеток, активно синтезирующих белки, например, клетки поджел железы. Кол-во рибосом на мембране связано с активностью. Эти рибосомы участвуют в синтезе экспортируемых белков.
Котрансляционный транспорт растворимых белков: В гиалоплазме иРНК связывается с риобосомой и начинается синтез. Синтезируется сигнальная посл-ть из 16-30 аминок-т. Эта посл-ть узнается SRP-частицей и связывается с ней. (частица состоит из 7S рнк и 6 полипептидных цепей). SRP связывается с рибосомой, синтез останавливается. Далее SRP связывается со своим рецептором на пов-ти ЭПР. Рибосома взаимодействует с белковым канальным комплексом – транслаконом. SRP отделяется. Синтезированный пептид входит в канал, возобновляется синтез -> белок оказывается внутри ЭПР. Сигнальная посл-ть отщепляется ферментом. Рибосома отделяется от транслакона и диссоциирует. Канал закрывается. +тут же происходит гликозилирование, образование дисульфидных связей, сворачивание.
Синтез нерастворимых(мембранных) белков: всё то же самое, только в цепи синтезирующегося белка существует несколько стоп-последовательностей. В области стоп-сигнала белок остается связанным с мембраной, но синтез не прекращается. Эти белки также проходят первичное гликозилирование. (связываются с олигосахаридным комплексом, содержащим 2 N-ацетилгликозамина, 9 манноз и 3 глюкозы)
Синтез мембран: в ЭПР происходит синтез и сборка липидов мембран, в том числе фосфолипиды и холестерол. Ферменты, участвующие в синтезе встроены в мембрану со стороны гиалоплазмы, синтез происходит там же – липиды встраиваются снаружи, на внутренний слой переходят с помощью переносчиков фосфолипидов.
ЭПР синтезирует все белки и липиды всех клеточных мембран!
Дистальные участки гранулярного ЭПР (ближе к Гольджи) теряют рибосомы и образуют мембранные выступы, от которых отпочковываются мелкие вакуоли, содержащие синтезированные белки. Эта зона называется ERGIC или ЭПР-АГ-промежуточный компартмент. Отщепляющиеся вакуоли покрыты белковым слоем, похожим на клатрин (COP-II). Затем онитеряют оболочку, сливаются друг с другом и транспортируются по мкт к цис-зоне АГ. Адресность определяется белками SNARE (рецептор белков, участвующий в прикреплении и слиянии мембран). После деполимеризации СОР2 на пов-ти вакуоли открываются интегральные мембранные белки V-SNARE. Эти белки специфичны для каждого типа вакуолей. Они связываются с T-SNARE и SNAP25 других мембран. В этих местах и происходит слияние мембран.
(2) Аппарат Гольджи Открыт К. Гольджи в 1898. Есть во всех эукариотических клетках. Обычно рядом с ядром. Отдельная стопка цистерн – диктиосома. Диаметр цистерны 1мкм, толщина переменная, на концах – ампулы. В стопке 5-10 цистерн. + множество вакуолей, особенно по периферии. Различают цис- и транс- участки. Транс обычно обращена к пов-ти, цис – к ядру. В транс-сети АГ – разделение и сортировка секретируемых продуктов. АГ участвует в сегрегации и накоплении продуктов синтеза, участвует в их созревании, хим перестройках (в основном – перестройка олигосахаридных компонентов). +синтез полисахаридов. +выведение секретов за пределы клетки.
Белки, синтезированные в грЭПР после первичного гликозилирования попадают в цис-зону АГ. Там начинается вторичная модификация олигосахаридных цепей и их сортировка -> олигосахариды для лизосом фосфорилируются, а остальные подвергаются сложным превращениям далее.
В средней части диктиосом – вторичное гликозилирование секреторных белков (-манноза, +N-ацетилглюкозамин). В транс-участке - (+галактоза, + сиаловые к-ты,).
+в Аг синтез полисахаридных цепей и гликопротеидов, и сульфатирование глюкозаминогликанов и некоторых белков.
Через АГ идут три потока: гидролитические ферменты для лизосом, постоянно выделяемые секреторные белки и белки, которые выделяются из клетки после спец сигнала. В цис- и средней частях идут вместе, только разные модификации. Сортировка – в транс. Для лизосомных: на мембранах АГ есть М-6-Ф- рецептор, узнающий маннозные группировки лизосомных ферментов и связывающийся с ними, эти рецепторы образуют кластеры, на месте которых позже отшнуровывается вакуоль и переносит их к эндосомам. Оторвавшись от транс-сети вакуоли быстро теряют клатриновое окаймление, после слияния, при рН 6, ферменты отделяются от рецепторов и начинают работать, а участки мембран с рецепторами возвращаются в АГ.
+существует поток вакуолей от транс к цис, и от цис к ЭПР. В этих случаях они одеты белками СОР I-комплекса. Считается, что так возвращаются ферменты вторичного гликозилирования и рецепторные белки.
(3) Лизосомы Лизосомы (0.2-0.4мкм) необходимы для переноса гидролитических ферментов, необходимых для внутриклеточного расщепления полимеров. Лизосомы образуются за счет ЭПР и аппарата гольджи.
Внутри – кислые гидролазы, расщепляющие белки, нуклеиновые к-ты, полисахариды и липиды. Всего – 40 ферментов: протеиназы, нуклеазы, фосфорилазы итд, оптимум действия которых – при рН 5 (в мембранах есть протонная помпа, зависимая от АТФ). Ферменты проявляют активность только если вызывается повреждение лизосом, либо при воздействии осмотического шока или детергентов. Почему не переваривают себя? Возможно, из-за олигосахаридного покрытия мембраны. В мембраны встроены белки-переносчики для транспорта в гиалоплазму продуктов гидролиза.
Встречаются лизосомы с очень разным содержанием -> выделяют 4 типа. Первичные лизосомы – мелкие пузырьки 100нм, заполненные бесструктурным вещ-вом, содержащим набор гидролаз. Некоторые – с клатриновой оболочкой. В дальнейшем первичные лизосомы сливаются с эндосомами, образуя вторичную лизосому = внутриклеточная пищеварительная вакуоль -> начинается расщепление содержимого. Лизосомы могут сливаться друг с другом.
Телолизосомы или остаточные тельца – с непереваренными остатками, они более уплотненные. В них же откладываются пигментные вещ-ва.
Аутолизосомы(аутофагосомы) – вторичные лизосомы, переваривающие части клеточных органелл.
Лизосомные патологии: «болезни накопления» - отсутствие (генная мутация) у больных отдельных ферментов лизосом. Например, нет а-гликозидаза -> накапливается гликоген в лизосомах (болезнь Помпе).
+могут играть активную роль при гибели клеток.
(4) Гладкий эндоплазматический ретикулум. Гладкий ЭПР – часть мембранной вакуолярной системы. Сеть ветвящихся канальцев. В отличие от ГрЭПР нет рибосом на мембранах. Диаметр – 50-100нм. Гранулярный эпр может переходить в гладкий. Здесь образуются и отделяются транспортные пузырьки, переносящие белки и липиды к аппарату Гольджи. Гладкий образуется из гранулярного. В гладком ЭПР – ресинтез новых триглицеридов из поступивших в клетку предшественников с образованием липидов и липопротеидов. В нём же – основные ферменты синтеза стероидов (клетки надпочечников). ГлЭПР много в клетках сальных желез и клетках семенников, синтезирующих стероидные гормоны. + он участвует в метаболизме углеводов (рядом откладывается гликоген).
При действии ядов клетки печени теряют характерную базофилию цитоплазмы, в них падает содержание РНК, появляются оксифильные зоны в местах глЭПР, тк там происходят процессы деградации различных вредных веществ. Цитохром Р-450 – один из окислительных ферментов, участвует в присоединении гидроксильной группе к потенциально опасным водонерастворимым углеводородам и др опасным вещ-вам. После этого другие ферменты добавляют к этим группам отрицательно заряженные молекулы (сульфат, например), вредные молекулы становятся растворимыми и могут выводиться вместе с мочой.
В поперечно-полосатых мышцах глЭПР окружает каждую миофибриллу, выполняет функцию депонирования ионов кальция. (в присутствии АТФ способен активно поглощать эти ионы, что приводит к расслаблению мышечного волокна)
13. Митохондрии – двумембранные органеллы синтеза АТФ. Есть межмембранное пространство и матрикс. Внутренняя мембрана образует складки для увеличения площади. Митохондрии могут двигаться, сливаться друг с другом. (если что - окраска по Альтману или флуорохром родамин). Толщина 0.5мкм, длина 7-60мкм. Для определения длины и формы нужна трехмерная реконструкция. (много митохондрий в ооцитах, в сперматозоидах – одна большая вокруг оси жгутика). Локализуются там, где есть потребность в АТФ.
Ультраструктура: наружняя гладкая мембрана – 7нм, межмембр пространство – 10-20нм, внутренняя мембрана с впячиваниями (кристами), расстояния между мембранами в кристе – 10-20нм. Матрикс имеет тонкозернистое гомогенное строение. В нём – молекулы ДНК и митохондриальные рибосомы. Крупные плотные гранулы в матриксе – отложения солей кальция и магния.
Функции: синтез АТФ, происходящий в результате окисления органических субстратов и фосфорилирования АДФ. Начальные этапы окисления (гликолиз) проходят в гиалоплазме: тратится 2 АТФ, получается 4 -> +2. В митохондриях – цикл Кребса. <…>
Хондриом – совокупность всех митохондрий в клетке. Вместо отдельных митохондрий может быть одна большая разветвленная – образующая митохондриальный ретикулум (сеть). Смысл сети в том, что она эквипотенциальна.(опыт – снимали напряжение в одном участке – там пропадала окраска (краситель накапливался только при синтезе АТФ)). На уровне z-дисков в мышцах митохондрии образуют саркоплазматический ретикулум.
Между митохондриями может быть ММК – межмембранное пространство и мембраны в этой области имеют повышенную электронную плотность. ММК – энергетическое объединение митохондрий друг с другом. (нужно для синхронной работы, например, в мышцах; много ммк есть в клетках сердца)
Днк в митохондриях – циклическая, без гистонов. Идет синтез и,р,тРНК, на рибосомах идет синтез митохондриальных белков.
14. Цитоскелет - Цитоскелет – белковые фибриллярные неветвящиеся полимеры. Обеспечивают 3 основные функции – опорно-каркасную, транспортную и двигательную.
Перемещение в пространстве (амебиодное) происходит благодаря способности основного белка микрофиламентов актина и основного белка микротрубочек тубулина к полимеризации и деполимеризации, что, при связи этих белков с мембраной может вызвать образование псевдоподий или филоподий, которые могут закрепиться на субстрате и участвовать в движении клетки.
Второй способ движения – жгутиковый – принципиальное отличие в том, что теперь микрофиламенты и микротрубочки – лишь направляющие, по которым перемещаются специальные белки моторы. Эти белки могут связывать с мембранными или фибриллярными компонентами клетки и тем самым участвовать в их перемещении.
Компоненты цитоскелета:
Промежуточные филаменты. Толщина 8-10 нм. Локализованы главным образом в околоядерной зоне и в пучках фибрилл, отходящих к периферии клетки. Есть во всех клетках животных, особенно много в эпидермисе, мышцах, нейронах. У растений ПФ нет. Есть разные типы ПФ. а) Кератины – кислые и нейтральные. Образуют и гетреполимеры этих двух подтипов. В эпителиях до 20 форм кератина, в волосах и ногтях ещё 10 других. Масса 40-70кДа
б) Второй тип включает в себя 4 вида белков. Масса 45-53кДа. Виментин (эндотелий, мезенхима, клетки крови)
Десмин (гладкая и поперечнополосатая мускулатура) Глиальный белок (астроциты и шванновские клетки) Периферин (периферические и центральные нейроны)
в) Белки нейрофиламентов (аксоны) Масса 60-130кДа.
г) Нестин – белок ПФ.
д) Белки ламины. Имеют ядерную локализацию.
Некоторые белки могут образовывать сополимеры – виментин с десмином или с глиальными белками.
Все белки ПФ имеют из 130 АК в центральной части фибриллярной молекулы, обладающей альфа спиральным строением. Концевые участки различны по длине, набору а.о. и не имеют спирального строения. Наличие спирального участка позволяет молекуле образовывать двойную спираль – палочковидный димер около 48нм длиной. Сливаясь димеры образуют тетрамер, который, полимеризуясь, образует протофиламент. ПФ состоит из 8 протофиламентов. Белки ламины полимеризуются иначе – обоазуют димеры с головками на одном конце и полимеризуются, создавая решетку, которая легко разрушается при фосфорилировании. ПФ самый устойчивые эл-ты цитоскелета. Разрушаются только в рез-те денатурации. Пф выполняют только скелетно-опорную функцию. В эпидермисе связываются с десмосомами – образуют плотную сеть. Десмин входит в состав Z диска. Ингибиторов полимеризации ПФ не найдено, поэтому неизвестен процесс сборки-разборки. Возможно, также, как и ламины. Топографически повторяют расположение микротрубочек в клетке. При разрушении МТ образуют кольца вокруг ядра. Начинают восстанавливаться от клеточного центра.
Микрофиламенты. Есть во всех эукариотических клетках. Особенно много в мышечных клетках. Входят в состав микроворсинок. Основной белок – актин. У млеков 6 актинов, 1 скелетная мускулатура, 1 сердечная, 1гладка, 1 гладкая и сосуды, 2 немышечных (везде)
Отличаются концевыми участками – меняется скорость полимеризации.
В мономере G-актин масса 42кДа. Полимеризация – фибрилла 6-8 нм, полярная. При определенной концентрации G-актин самопроизвольно полимеризуется. «+» конец микрофиламента быстро связывается с G-актином и поэтому растет быстрее «-» конца. Если концентрация мала, то F-актин деполимеризуется. Будет устанавливаться равновесие. МФ очень динамичные структуры. На + конец садятся мономеры, содержащие АТФ, по мере роста АТФ => АДФ. АТФ- содержащие связаны прочнее, чем АДФ-содержащие. Стабилизируется система специальными белками. А) Тропомиозин – придает жесткость филаментам. БиВ) Филамин и альфа актинин – образуют поперечные скрепки между нитями F-актина. Г) Фимбрин – связывает филаменты в пучки и т.д. Белок ADF кофилин – фактор деполимеризации, заставляет мономер повернуться немного, что ослабляет его связь с соседним мономером. Белок гельзолин режет Актиновый филамент. Латрункулин (в-во из губок) препятствует полимеризации. Характерен тредмиллинг – иллюзия дв-я за счет сборки/разборки. В регуляции организации актина участвуют белки RHO–G-белки RAC1,2,3,белки, CDC42 - белок. Активность Scar регулир RAC, а активность WASp - CDC42.
WASp/Scar N-концом соединяются с гегуляторами, а С-концом с Arp2/3. Когда Arp2/3 т.о. активироваН, он способен провзаимодействовать с белком филамента, но только с активированным. Для активации актина (мономера) необходим профилин. Для удлинения филамента служит формин. (про рост ламеллоподии это всё)
Есть белки, взаимодействующие с концами МФ, предотвращая их разборку.
Особое – белки Миозинового типа. Вместе с актином образуют комплекс, способный сокращаться. Минимум две функции – сокращение (вз-е с моторами) и скелетная (за счет полимеризации и деполимеризации). МФ образуют кортикальный слой (по всему периметру клетки под мембраной) В этом слое есть белок филамин, который сшивает пересекающиеся филаменты, придавая стр-ре жесткость.. Arp2/3 садится на минус конец растущей цепи, препятствует деполимеризации. Благодаря такой работе WASp/Scar образуется филоподия. Ламеллоподия образуется иначе Arp2/3, связавшись с WASp/Scar пришивает МФ к уже готовому МФ и растет от него к мембране под углом 70градусов, веерообразно.
Миозины – один из компонентов МФ. Весь актомиозиновый комплекс – АТФаза. Миозины – транслокаторы. Осуществляют перемещение как самих клеток, так и их внутренних компонентов. У всех миозинов есть голова (моторная) – АТФазная активность комплекса, шейка, связанная снесколькими белками-регуляторами и хвост, характерный для каждого типа миозина. 3 основных типа: Миозин II и Миозин V – димеры, хвост альфа спиральный, образует сверхспиральный палочковидный участок. Миозин I – мономер Две молекулы миозина I могут образовывать биполярную толстую фибриллу, участвующую в мышечном сокращении, при сокращении внутриклеточных МФ и при делении. Миозины IиV участвуют во внутриклеточно транспорте. За одну АТФ головка миозина смещается на 5-25нм. Миозин I участвует в движении микроворсинок (тонкие и длинные 0.1 х 1мкм выросты) на каждой клетке кишечного эпителий несколько тысяч микроворсинок. Жесткость актинового пучка внутра МКВ обеспечивается фимбрином и фасцином(поперечные связки) Снизу пучок вплетен в примембранный белок спектрин. МФ здесь – каркас. Также здесть есть миозин I, МКВ могут укорачиваться и удлинняться. Миозин I обеспечивает транспорт везикул внутри клеток человека, за исключение мозга, где работает миозин V. Наиболее распространен миозин II. (фибробласт, подвижный край) При остановке фибробласта и образовании стресс фибрилл стягивает субстрат, закрепившись фокально.
В образование актомиозинового кольца при делении также уч-ет миозин II и др. мышечн. белки. Цитохалазин – ингибитор полимеризации актина ( напр, для создания двуядерной клетки)
Скелетные мышцы состоят из симпластов (рез-т слияния мышечных клеток) Скелетные и сердечная мышцы исчерчены:
Тёмные полосы – А-анизотропные диски. Светлые – I-изотропные диски. I диск пересекается полоской Z. Единица строения и функции – саркомер. Его величина в расслабл. Состоянии 1.8-2.8мкм постоянна для вида животных. Это Z диск, тонкие нити актина, толстые миозина II, снова актин и снова Z диск и т.д. Z диск состоит из альфа актинина и десмина. Толстые нити – Миозин II. Миозин II (масса 500кДа) состоит из шести цепей – двух длинных (тяжелые), спирально обвивающихся друг одна другой и 4х коротких (лёгкие), которые связываются с глобулярными головками тяжелых цепей. Тяжелые обладают АТФазной активностью, способны образовывать актомиозиновый комплекс. Толщина нитей т.к. в каждой 300 таких молекул. Миозин лежит хвост к хвосту, поэтому все головки с краев. Миозиновые нити связаны с Z диском белками титинами. Расположены нити так, что каждая миозиновая окружена 6ю актиновыми. Саркомер укорачивается на 20%. В гладкой мускулатуре такого порядка нет, там просто масса актиновых волокон среди которых раскидан миозин, агрегмрованный по 15-20штук.
Микротрубочки
Нормальная микротрубочка состоит из 13 элементов, иногда 11, 15,14.
Толщина 25нм. Состоит из Тубулина. Толщина стенки – 5нм. Также есть плюс и минус концы. Сборка идёт быстро на +, и медленно на -. Иногда на + идёт и сборка и разборка – динамическая нестабильность. При недостатке тубулина разборка может идти и с обоих концов. Разборке МТ способствует понижение температуры и наличие ионов Са2+. Тубулин состоит из альфа и бета субъединиц. Обе они связаны с ГТФ. Но гидролиз её идёт только на бета субъед. Молекулы тубулина связаны так, что бета субъед одного белка связана с альфа субъед.другого. следовательно вся МТ полярна. В-во прекращающее полимеризацию МТ – колхицин. Во время митоза ведёт к К-митозу и полиплоидии. Также действуют колцемид и нокодозол. Стабилизатор, способствующий полимеризации – таксол. В составе МТ есть МАР белки (microtubule associated proteins) – они тоже стабилизаторы, поддерживающие полимеризацию. Среднее время полужизни МТ – 5 мин. В составе веретена деления время жизни 15-20сек. Связь с ГТФассоц прочнее чем с ГДФ ассоц. Поэтому если есть ГТФ-колпачок, то скорость роста возрастает. Некоторые МТ остаются стабильными (10-20%) связаны с МАР или модифицирован тубулин. Ацетилирование лизина, как и удаление тирозина в МТ сильно стабилизирует МТ. МТ не способны к сокращению, но являются об.к-ттами ресничек и жгутиков. В целом роль МТ сводится к 2м функциям – скелетная и двигательная. Образуют «скелет» клетки – при их удалении клетки сложной формы приобретают форму шара. МТ обязательны для экзоцитоза, дв-я митохондрий и т.п. Большая часть клеточного траспорта на МТ. Есть моторные белки кинезины – «+» ориентированные и динеины – «-» ориентированные.
Используется для этого энергия АТФ.
Процесс начала роста МТ или нуклеация происходит в четко ограниченных участках клетки – в ЦОМТах. В зонах ЦОМТ закладываются МТ минус концами к ЦОМТ, минус концы заблокированы белками, предотвращающими ненужную деполимеризацию. В животных клетках в качестве ЦОМТа – клеточный центр, содержащий центриоли. Ядерная зона также м.б. ЦОМТ, как и хромосомы в митозе. МТ много в аксонах нейронов. По МТ идёт транспорт крупных объектов напр. Меланина у рыб в меланофорах или транспорт в-вв в аксоне. МТ поддерживают структуру АГ.
Моторные белки. Ретро и антероградный транспорт в аксоне. Антеро 400мм/сутки антеро 200-300мм/сутки. Кинезин (+) масса 300кДа. 2тяжелые и неск-ко легких цепей. Тяжелая цепь, головка, связывающаяся с МТ. АТФазная активность. Лёгкая цепь – связывается с мембранами. Кинезин всегда двигает пузырьки к + концу за счет энергии АТФ. Некоторые кинезины связываются с грузами специфически, напр. переносят только митохондрии. Кинезины участвуют в расхождении хромосом. Динеин (-) ретроградный. Содержит 2 тяжелые и неск-ко лёгких и промежуточных цепей. Цитозольный(тр-т вакуолей, хромосом и т.д.) и аксонемный(реснички и жгутики). Та же энергия АТФ.
От периферии к центру движ. эндоцитозные вакуоли, и вакуоли ЭПР и АГ (рециклизация) и др. И от центра к периферии – вакуоли ЭПР, лизосомы, секреторные вакуоли и др.
Клеточный центр. Центросомы и центриоли.
Клеточный центр зачастую является ЦОМТом, он может содержать, а может и не содержать центриоли.
Центросомы были открыты Флеммингом в 1875г. Центросомы характерны и обязательны для клеток животных. Могут содержать центриоли, обычно парные (диплосома) окруженные светлым пространством (собств. центросома) от которой радиально отходят тонкие фибриллы (центросфера).
В эпителиальных клетках центросомы определяют полярность клетки. В полиморфных лейкоцитах (нейтрофилах) лежат в подкововидном впячивании ядра. Наиболее часто в состав центросомы, кроме матрикса входят центриоли. Основу строения центриоли составляют расположенные по окружности 9 триплетов микротрубочек, образующие цилиндр 150нм диаметром и длиной 300-500нм. (есть центриоли длиной и в несколько микрон)
Первая микротрубочка триплета А-МТ 13 субъединиц, 5 нм толщиной. 2я и 3я (ВиС) МТ из 11 эл-тов. Триплет расположен под углом 40градусов. От А-МТ отходят выросты «ручки» одна (внешн) к С-МТ, одна (внутренн) к центру цилиндра. Обычно центриоли 2, они образуют диплосому. Относительно друг друга под 90градусов. Выделяют материнскую и дочернюю центриоли. Проксимальный конец дочерней как бы «смотрит» на поверхность материнской. На дистальном конце материнской располагаются придатки 9шт (аморфный материал), их нет на дочерней. Ими материнская центриоль крепится к мембране. От материнской центриоли отходят субдистальные придатки, они же сателлиты. В центральной части центриоли есть втулка.дочерняя центриоль почти не принимает участие в инициации и организации сборки. На проксимальном конце дочерней центриоли есть»колесо со спицами» в опухолевых и в материнской, но в норм. клетках только в дочерней. В клетках не менее 7 в-тов тубулина. Альфа, бета, дельта и эпсилан преобладает. Гамма только для инициации. Центросомные белки: центрин, гамма тубулин, перицентрин, центросомин, центрактин – конститутивные т.е. всегда есть. Есть белки-визитёры – POPA prophase originating polar antigen. Есть только во время митоза.
Центросомный цикл – на границе G1 и S фаз начинается удвоение центриолей образуется «колесо со спицами», образуется кольцо из синглетов МТ, затем дуплеты, затем триплеты. Формирование заканчивается к Митозу. Придатки у мат центриоли появл. К метафазе.
На всех стадиях митоза материнская центриоль окружена зоной тонких фибрилл – гало.
Функции центросомы – 1)Дупликация центриоли. 2) Заякоривание и Нуклеация МТ 3)Формирование ресничек и жгутиков 4) Ориентация Митотич веретена 5) Контроль клеточного цикла.
Мех-м образования Аксонемы. Сначала заклад базальное тельцо, идентичное центриоли, но к окончанию р-тия в основании уже стр-ра не похожая на центриоль. В своём основании аксонема имеет девять дублетов МТ. Кроме переферических в аксонеме расположено 2центр МТ. В дублетах А и В МТ. А-13эл-тов. В-11эл-тов. От А ручки к В соседнего дублета От А к центру спица, присоедин к центральной муфте головкой. В основании ресничек и жгутиков часто лежат исчерченные корешки – кинетодесмы- пучки 6нм фибрилл. Роль не известна. Не подверг. В-ю колхицина. За Дв-е отвечают ручки А-МТ в них динеины. Динеины двигают одну МТ относительно другой. Тогда ресничка изгибается.
Первичные реснички – не имеют 2х центр МТ, не способны к движению.
15. Митоз Клетки возникают в результате митоза Митоз идёт после репликации хромосом
Во время митоза хромосомы разделяются на две равные группы, после чего происходит разделение цитоплазмы
Выделяют 6 стадий митоза: Профаза, прометафаза, метефаза, анафаза, телофаза, цитокинез.
Ошибки в митозе ведут к серьёзным аномалиям, есть мех-мы, устраняющие эти ошибки
Цель митоза – равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками
Две цитоскелетные структуры участвуют в разделении хромосом и цитоплазмы. Это биполярное веретено деления из МТ и контрактильное кольцо из актиновых фил-тов.
Постоянными для всех типов митоза структурами являются веретено деления, кинетохоры и клеточные центры.
Классификация митозов: Плевромитоз (закрытый) у простейших - не происходит разрушения ядерной оболочки, образуются полярные тельца неопределенной морфологии, и два полуверетена, соединенные хромосомами.
Ортомитоз. Бывает открытый (обычный митоз), полузакрытый и закрытый.
При полузакрытом ядерная оболочка сохраняется в течение всего митоза, на всех участках за исключением полюсов. В качестве ЦОМТ здесь могут выступать массы гранулярного материала, иногда и центриоли. Характерно для микронуклеуса инфузорий.
Открытый ортомитоз характерен для клеток животных, некоторых простейших и высших растений. Есть два типа – астральный и анастральный. (либо наличие центриолей, либо отсутствие)
Центромеры бывают голоцентрическими, когда хромосома связывается по всей длине (некоторые насекомые, нематоды, некоторые растения) и моноцентрическими, которые в свою очередь могут быть точечными (у некоторых дрожжей), соедин. только с одной МТ и зональными, где к сложному кинетохору подходит пучок МТ.
Зональные центромеры состоят из многократно повторяющихся CENлокусов, обогащенных участками конститутивного гетерохроматина, содержащую сателлитную ДНК, связанную с кинетохором.
Кинетохор, структура, сходноустроенная у всех эукариот. Это белковая структура, расположенная в зоне центромера. Это трехслойные структуры. Внутренний плотный слой, примыкающий к телу хромосомы, средний рыхлый слой, и внешний плотный слой. В общей форме имеют вид пластинок, лежащих в центромере. (у некоторых растений форма полусферы) Кинетохоры – сложные комплексы, где кроме специфической ДНК участвует более 200 белков, в т.ч. и СЕNР белки. В участке центромера, под кинетохором, расположен участок гетерохроматина, обогащенный альфа сателлитной ДНК. Здесь же СENP-B, который связывается с альфа-ДНК, МСАК – кинезинподобный белок, а также когезины. Во внутреннем слое кинетохора выявлены белки CENP-A – вариант гистона Н3, который, вероятно, связывается сCDE II участком ДНК, CENP-G, связывающийся с белками ядерного матрикса и CENP-C – консервативный белок с неизвестной пока функцией.
В среднем рыхлом слое обнаружен белок 3F3/2, который регистрирует натяжение пучков МТ.
Во внешнем плотном слое белк,И осуществл. Контроль прикрепления МТ - SPC-24,25 и CENP-E, CENP-F – связывание МТ. Кроме того здесь есть белки динеины. Функциональная роль кинетохора – организация движения по МТ, регуляция разъелинения хромосом.
По одной из моделей строения центромера предложено, что в интерфазе на специфических участках ДНК расположены субъеденицы кинетохора ,содержащие все белки. По мере конденсации создаётся зона, обогащенная этими белковыми комплексами – кинетохор. Кинетохоры удваиваются в S периоде. Их белки присутствуют на хромосомах в течении всего жизненного цикла.
Подготовка генетического материала. В конденсации хромосом участвуют белки: конденсины (поступают в ядро до митоза, начинают работать при фосфорилировании), когезины (удерживают 2 нити(хроматиды) вместе до поздней профазы, там связь уже только в области центромерного участка, в анафазе и это соединение разрушается), белки SMC-3, SMC-1, SCC-1, SA-1.
Образуется веретено деления, состоящее из тубулина и МАРов. (для работы моторных белков нужна АТФ, но не энергия АТФ)
Основные события стадий митоза и S-фазы: Интерфаза – Репликация ДНК, удвоение хромосом, связывание сестринских хроматид когезинами.
Профаза – идёт конденсация хроматина в ядре, образуются нитчатые структуры. Отдельные фибриллярные центры, сливаясь, образуют ядрышковые организаторы. Большая часть ядрышковых белков диссоциирует и либо свободно «плавает» в цитоплазме либо связывается с поверхностью хромосом. Образуются зрелые кинетохоры. В самом начале идёт повышение активности фосфорилаз, модифицирующих гистоны, особенно Н1, интерфазные МТ разбираются, строятся новые, более динамичные (время полужизни их 15 сек). Идёт фосфорилирование ламинов А,В,С. АиС свободно «болтаются» в цитоплазме, В остается связанным с мембранными пузырьками. Активированные центросомы начинают расходится друг от друга на некоторое расстояние. Это расхождение происходит из-за взаимодействия МТ, на концах которых находятся олигомеры, состоящие из двух кинезинподобных (хромокинезины) моторных белков. Их легкие цепи связываются с МТ (МТ в роли карго) Олигомер может связать как параллельные, так и антипараллельные МТ. Одновременно с разборкой интерфазных МТ идёт и дезорганизация ЭПР и АГ, они распадаются на отдельные диктиосомы.
Прометафаза – Завершается разрушение ЯО. Начинается двтжение и перемещение хромосом. В начале ,сразу после захвата МТ кинетохором происходит быстрое движении хромосомы по этой МТ в сторону её минус конца, это происходит за счёт наличия на кинетохоре динеинподобных моторных белков. Продолжается образование веретена, расхождение центросом к полюсам за счет хромокинезинов на межполюсных МТ. (т.н. конгрессия – они совершают поочередно дв-я то к одному ,то к другому полюсу) Оказываясь около полюса хромосома связывается с новыми МТ и в рез-те их полимеризации начинает своё движение к полюсу. Также к полюсу её толкают МТ, не связывающиеся с ней, а просто утыкаются в тело и плечи хромосом. Плюс к ней присоединяются МТ от другого полюса, она становится биориентированной. (???Также её толкает к центру и +ориентированные хромокинезины ,которые цепляют плечи хромосом в кач-ве карго???).
Начинается осцилляция (подрагивание) хромосом. Продолжается она и в метафазе и в анафазе, причем осциллируют как би-, так и моноориентированные хромосомы. По достижении определенного расстояния от полюса силы уравняются. Для движения хромосомы достаточно одной МТ
Метафаза – Число межполюсных МТ достигаерт максимума (это те, что антипараллельны и связываются между собой). Продолжается осцилляция. В клетках животных хромосомы располагаются так, что образуют «материнскую звезду» центромеры обращены к центру, а плечи к переферии. Заканчивается конгрессия, образуется метафазная пластинка. Все хромосомы до самого конца остаются связаны в центромерных участках. Идёт Flux (течение) тубулина. Этому подвержены лишь кинетохорные МТ. Одновременно идёт полимеризация на кинетохоре и деполимеризация на полюсе. Т.о. сменяется состав кинетохорных МТ. тот тубулин, что был около кинетохора двигается в сторону полюса.
Анафаза – начинается резко с разъединения всех хромосом сразу в центромерных участках. Это Cdc20 активирует APC/c комплекс, который активирует сепаразу, отрезая от неё секурин. Активная сепараза разрезает когезиновую связь в области центромера. Останавливается полимериация на кинетохоре, в рез-те чего хромосома подтягивается к полюсу.
Анафаза А – это разделение хромосом, их расхождение (при помощи динеина) и укорачивание кинетохорных МТ. Есть 2 модели прикрепления МТ к кинетохору. В области кинетохора идёт деполимеризация МТ со сдвигом (сдвиг из-за работы динеина)
Анафаза В – есть только в астральном типе митоза. Полюса начинают расталкиваться благодаря работе олигомеров кинезина на межполюсных МТ и удлинения этих МТ(собствено это и называют анафазой В). Также полюса растаскиваются благодаря динеину, связанномы с актином кортекса и прикрепившемуся к астральным МТ. Другие белки моторы препятствуют расталкиванию. Расхождение полюсов нужно для определения плоскости деления цитоплазмы.
По мере расхождения к полюсам хромосомы приобретаю V-образную форму, это происходит из-за столкновений плеч с МТ. Это также показывает, что именно за центромер хромосома тянется к полюсу.
Телофаза – начинается с остановки хромосом. Заканчивается началом реконструкции нового ядра и цитокинезом. Хромосомы, не меняя своей локализации начинают деконденсироваться и увеличиваться в объёме. В местах их контактов с мембранными пузырьками начинает строится новая ядерная оболочка. После замыкания оболочки начинается формирование ядрышек. В телофазе начинается и заканчивается процесс разборки МТ веретена. Он идёт от полюсов к экватору, где МТ сохраняются дольше (остаточное тельце) Одно из главных событий – цитокинез. Закладка контрактильного кольца происходит по экватору клетки, начинается она в поздней анафазе. Есть несколько гипотез об образовании контрактильного кольца. М.Б. по межполюсным МТ передается стимулир. Сигнал. (одна гипотеза), а м.б. что по астральным передается ингибирующий сигнал (вторая гипотеза) – ведь астральных МТ меньше всего в центре, значит там и будет образовано кольцо. Кольцо это состоит из МФ актина и коротких палочковидных молекул миозина II. После цитокинеза восстанавливаются ЭПР и АГ, начинается реконструкция интерфазного цитоскелета.
Была гипотеза «Search and capture» Она гласила, что те МТ, которые связаны с кинетохором стабильнее. В рез-те роста этой МТ кинетохор захватывает и МТ с другого полюса. Было посчитано, по этой модели время формирования веретена – 71чаС, а оно формируется за 10-15минут. Тогда модель подправили:
Хромосомы тоже участвуют в образовании веретена. Белок RAN-GTF – мощный центр нуклеации МТ. Он в основном локализован вблизи хромосом т.к. там есть RAN-GEF, который RAN-GDF=>RAN-GTF. В итоге от тела и плеч хромосом растут МТ. Эти МТ захватываются кинетохором т.к. их концы после нуклеации отсоедин от хромосомы, то кинетохор захватывает + концы. «–» конец такой МТ с динеином торчит в цитоплазму. При его вз-ии с «+» концом полюсной МТ динеин в качестве карго повезет МТ. (т.о. хромосома будет двигаться к полюсу). Веретено деления м.б. образовано вовсе без участия центриоли.
16. Регуляция клеточного цикла. контрольные точки регуляции клеточного цикла, ингибиторы CDK-циклиновых комплексов, р53. При получении гетерокарионов из интерфазных и митотических клеток в ядрах от интерфазных клеток начиналась конденсация хромосом или ПКХ, разрушалась ядерная оболочка. Причем если ядро было из G1 фазы, хромосомы были однонитчатые.
G1+G2=нет влияния
S+G1=синтезДНК
S+G2=нет влияния
M+G1/G2/S=M(ПКХ)
=>вывод, что есть фактор, стимулирующий митоз (MPF), активный только во время митоза.
Ооцит после репликации ДНК и короткой G2 переходит в мейотическую профазу1, за время которой ооцит дорастает до размера икринки. При спаривании выделяющийся прогестерон стимулирует переход из профазы в 1мейотическое деление., затем после короткой интерфазы наступает 2мейотическое деление, которое останавливается на метафазе. При оплодотворении происходит второе деление, ядро яйца и ядро спермия сливаются и получается диплоидная зигота.
Если часть цитоплазмы из ооцита на стадии метафазы 2 мейотического деления инъецировать а цитоплазму не стимулированного прогестероном ооцита, то он вступит в 1, а потом 2 деление мейоза. => есть фактор, стимулирующий созревание яйцеклетки (ФСС), что то же самое, что MPF.
MPF- гетеродимерный комплекс, состоящий из циклина и протеинкиназы Cdk (фермент-фосфорилаза, модифицирующий белки, перенося фосфатную группу от АТФ на серин и треонин). Две части – каталитическая (Cdk) и регуляторная (циклин).
Циклин постоянно синтезируется в течение эмбрионального цикла и резко разрушается при вступлении в анафазу.
У дрожжей один и тот же Cdk отвечает за прохождение клеточного цикла, но на разных стадиях взаимодействует с разными циклинами, характерными для каждой стадии цикла.
Для млекопитающих (всего 9 циклинов и 7Cdk):
G1: Cdk4-cyclinD/ Cdk6-cyclinD
G1-S: Cdk2-cyclinE – регулирует вступление в S-фазу.
S: Cdk2-cyclinA
G2: Cdk1-cyclinA/ Cdk1-cyclinB
Факторы роста (GF) – вещ-ва, побуждающие клетки к размножению (напр прогестерон). Бывают продуктами самих клеток (аутокринная стимуляция), соседних (паракринная) или клеток других органов (гормональная). Есть эпидермальный фр, фр нервов итп. Без него клетки переходят в G0. ФР связываются с рецепторами клеток, передают сигнал на систему каскада протеинкиназ, связанных с запуском клеточного цикла. Сначала активируются гены раннего ответа, белки которых индуцируют транскрипцию генов отложенного ответа, а также индуцируют синтез ряда циклинов и Cdk, которые отсутствовали в G0.
17. Клеточная смерть Причины клеточной гибели можно разделить на две категории: некроз и апоптоз (или программируемая клеточная смерть).
Некроз обычно связан с нарушением гомеостаза, нарушением проницаемости мембран -> необратимые изменения митохондрий. Ядра компактизируются (пикноз), хроматин распадается на мелкие массы (кариорексис), ядро растворяется (кариолизис). Клетка набухает за счет обводнения, цитоплазма закисляется, набухают и разрываются вакуолярные компоненты -> лизис клетки. Такой гибели подвергаются группы клеток, развивается воспалительная реакция.
ПКГ: апоптоз / аутофагия / программируемый некроз / альтернативные вар-ты (онкоз / пироптоз/каннибализм). Цель: убрать лишние, контроль численности, убрать поврежденные.
Апоптоз – гибель без химического или физического повреждения.Погибают клетки на всех стадиях онтогенеза (напр клетки эмбриона; хвост головастиков). Для начала апоптоза нужен сигнал (напр. фактор некроза опухоли - TNF) или отсутствие фактора (NGF – фактор роста нервов), также апоптоз может вызываться внешними факторами (радиация, токсины). Апоптоз вызывают необратимые повреждения ДНК, повреждения митохондрий, при которых цитохром с выходит в цитоплазму. Клетки теряют контакты, сморщиваются (сжимаются), происходит специфическая конденсация хроматина (полулунные части), ДНК режется на равные части (200 нукл. пар, потом до нуклеотидов), отделяются рибосомы от ГЭР, распад цитоскелета, активация каспаз, клетка и ядро фрагментируются на апоптические тельца, ограниченные плазматической мембраной, которые впоследствии фагоцитируются другими клетками. При апоптозе нарушается асимметрия плазм мембраны – на её пов-ти появляется фосфатидилсерин -> апоптотические клетки различаются макрофагами.
Аутофагия: отсутствие фрагментации, не деградирует ДНК до нуклеотидов, увеличивается число аутофагосом и уровень лизосомной активности, сохраняется цитоскелет(мкт), нет активности каспаз.
Программируемый некроз: нехватка АТФ -> не работают помпы, набухание, неспецифическая конденсация хроамтина, вакуолизация цитоплазмы, нарушение целостности мембраны, воспаление.
Клеточный каннибализм: клетка открепляется от матрикса с дальнейшей инвазией в другую клетку. Попавшая внутрь клетка «переваривается» своей соседкой.
Регулятором ПКС (каспазозависимый путь) у позвоночных является белок Bcl-2, который ингибирует адаптерный белок Apaf-1, стимулирующий каскад активации каспаз. Каспазы – протеиназы, расщепляющие белки по аспарагиновой к-те. Каспазы могут действовать на адгезионные структуры, ламины, цитоскелет, ферменты репарации ДНК, может расщеплять ДНК и т.п.
В присутствии трофических факторов белок Bad неактивен, в отсутствии он связывается с Bcl-2 и ингибирует его антиапоптозные св-ва. Активируется Bax, открывая путь ионам в митохондрию, из неё выходит цитохром с, который связывается с адаптерным белком Apaf-1, который активирует прокаспазу 9, которая запускает каскад других прокаспаз, в том числе каспазу 3 -> смерть клетки.
При необратимых повреждениях ДНК накапливается транскрипционный фактор р53, который не только ингибирует зависящую от циклина киназу и останавливает клеточный цикл в G1 или G2 фазе, но и активирует экспрессию гена bax, продукт которого запускает апоптоз.
|
Трансмембранный перенос |
|
На транспортной функции мембран остановимся подробнее. Следует разделять способы помолекулярного (поионного) и мультимолекулярного трансмембранного переноса. В первом случае молекулы (или ионы) вещества проходят через мембрану относительно независимо друг от друга, во втором — за один акт переноса перемещается сразу огромное число молекул (либо растворенных в среде, либо образующих нерастворимые частицы). 1.2.2.1. Способы помолекулярного трансмембранного переноса Данные способы транспорта используются только для низкомолекулярных веществ. Сюда относятся следующие три способа. а) Простая диффузия (рис. 2.10, а). Это самостоятельное проникновение веществ через мембрану по градиенту концентрации (с) — иначе говоря, из области с большей концентрацией в область с меньшей концентрацией. Так проходят небольшие нейтральные молекулы (Н2О, СО2, О2) и низкомолекулярные гидрофобные органические вещества (жирные кислоты, мочевина). б) Облегченная диффузия (рис. 2.10, б). Здесь вещество проходит через мембрану опять-таки по градиенту своей концентрации, но с помощью специального белка — транслоказы. Молекулы последней обычно пронизывают мембрану, образуя в ней транспортные каналы, и специфичны в отношении лишь определенного вещества (или группы сходных веществ). Примерами таких транслоказ являются ионные каналы — в частности К+-каналы, Nа+-каналы, анионные каналы и т. д. в) Активный транспорт (рис. 2.10, в). Наконец, в данном случае вещество переносится с помощью специальной транспортной системы (насоса) против градиента концентрации. Для этого требуется энергия; чаще всего ее источником служит распад АТФ. Самый известный пример подобных систем — Na+, K+-Hacoc (или Na+, K+-ATФaзa). |
Клеточный цикл — это период жизни клетки от одного деления до другого или от деления до смерти.
Клеточный цикл состоит из интерфазы (период вне деления) и самого клеточного деления.
Если клетка собирается когда-нибудь делиться, то интерфаза будет состоять из 3-х периодов. Сразу после выхода из митоза клетка вступает в пресинтетический или G1-период, далее переходит в синтетический или S-период и потом — в постсинтетический или G2-период. G2-периодом заканчивается интерфаза и после нее клетка вступает в следующий митоз.
Если клетка не планирует снова делиться, то она как бы выходит из клеточного цикла и вступает в период покоя, или G0-период. Если клетка, находящаяся в G0-периоде, снова захочет делиться, то она выходит из G0-периода и вступает в G1-период. Таким образом, если клетка находится в G1-периоде, то она обязательно рано или поздно будет делиться, не говоря уже о S- и G2-периодах, когда клетка в ближайшее время обязательно вступит в митоз.
G1-период может продолжаться от 2–4 ч до нескольких недель или даже месяцев. Продолжительность S-периода варьирует от 6 до 8 ч, а G2-периода — от нескольких часов до получаса. Длительность митоза — от 40 до 90 минут. Причем самой короткой фазой митоза можно считать анафазу. Она занимает всего несколько минут.
G1-период характеризуется высокой синтетической активностью, в течение которого клетка должна увеличить свой объем до размера материнской клетки, а значит, и количество органелл, различных веществ. Непонятно почему, но клетка прежде чем вступить в следующий митоз должна иметь размер равный материнской клетке. И пока этого не произойдет, клетка продолжает оставаться в G1-периоде. Видимо, единственным исключением из этого является дробление, при котором бластомеры делятся, не достигая размеров исходных клеток.
В конце G1-периода принято различать специальный момент, называемый R-точкой (точка рестрикции, R-пункт), после которого клетка обязательно в течение нескольких часов (обычно 1–2) вступает в S-период. Период времени между R-точкой и началом S-периода можно рассматривать в качестве подготовительного для перехода в S-период.
Самый главный процесс, который идет в S-периоде — это удвоение или редупликация ДНК. Все остальные реакции, происходящие в это время, направлены на обеспечение синтеза ДНК — синтез гистоновых белков, синтез ферментов, регулирующих и обеспечивающих синтез нуклеотидов и образование новых нитей ДНК.
Сущность G2-периода не совсем понятна в настоящее время, однако в этот период происходит образование веществ, необходимых для самого процесса митоза (белки микротрубочек веретена деления, АТФ).
Прохождение клетки по всем периодам клеточного цикла строго контролируется специальными регуляторными молеулами, которые обеспечивают: 1) прохождение клетки по определенному периоду клеточного цикла и 2) переход из одного периода в другой. Причем прохождение по каждому периоду, а также переход из одного периода в другой контролируется различными веществами. Одними из участников регуляторной системы являются циклин-зависимыми протеинкиназами (cdc). Именно они регулируют активность генов, ответственных за прохождение клетки по тому или иному периоду клеточного цикла. Имеется несколько их разновидностей, и все они присутствуют в клетке постоянно независимо от периода клеточного цикла. Но для работы циклин-зависимых протеинкиназ требуются специальные активаторы. Ими являются циклины. Циклины присутствуют в клетках не постоянно, а то появляются, то исчезают. Это обусловлено их синтезом и быстрым разрушением. Известно много типов циклинов. Синтез каждого циклина происходит в строго определенный период клеточного цикла. В один период образуются одни циклины, а в другой — другие (Табл.). Таким образом, система "циклины — циклин-зависимые протеинкиназы" управляет движением клетки по клеточному циклу.
Рибосома – не простой органоид. Это крупный внутриклеточный ансамбль макромолекул, который отвечает в клетке трансляцию – процесс биосинтеза полипептидных цепей на матрице информационной РНК. В состав рибосомы входит собственная, рибосомальная РНК (рРНК), а также белки.
Большинство рибосом локализованы в цитоплазме. Именно они придают цитоплазме «зернистость». Рибосомы, в отличии от мембранных органоидов, есть в клетках как прокариот, так и эукариот.
В клетке прокариот на рибосомы приходится до 30% в пересчете на сухую массу. В одной бактериальной клетке содержится около десяти тысяч рибосом. В клетках эукариотов доля рибосом в сухой массе клетки поменьше. Что касается количества рибосом, оно может быть очень различным в зависимости от типа ткани и белоксинтезирующей активности клетки.
В клетках эукариотов цитоплазматические рибосомы формируются в ядрышке. Митохондрии эукариотических клеток, пластиды растительных клеток также имеют рибосомы, в этих органоидах и образующиеся. Эти рибосомы отличаются от цитоплазматических.
О тонком строении ядрышка сведения были получены главным образом методом электронной микроскопии. Световая микроскопия давала ограниченный набор сведений о структуре ядрышка из-за их малого размера (1-5 мкм) и недостаточной разрешающей способности данного метода.
В ядрышке различают гранулярный компанент (гк) и фибриллярный компанент (фк).
Гранулярный компанент представляет собой
гранулы 15-20 нм, обычно расположенные на периферии ядрышка, хотя гк и фк могут быть распределены равномерно.
Фк и гк способны образовывать нитчатые структуры - нуклеолонемы - ядрышковые нити ~100-200 нм, которые могут образовывать отдельные сгущения.
Фибриллярный компанент - представляет собой тонкие (3-5 нм) фибриллы - диффузная часть ядрышек, в центре ядрышка – 1 или 3-5 отдельных зон: фибриллярные центры - частки скопления фибрилл с низкой е лотностью, окруженные зоной фибрилл высокой е плотности - плотный фибриллярный компонент
хроматин – примыкает или окружает ядрышко. 30нм фибриллы хроматина по периферии ядрышка могут заходить в лакуны, м-у нуклеолонемными участками.
белковый сетчатый матрикс –
Белки ядрышек
До 60% сухой массы выделенных ядрышек приходится на белки, число которых может составлять несколько сотен разных видов. Помимо белков ассоциированного с ядрышками хроматина в состав ядрышек входят белки рибосом и специфические ядрышковые белки, связанные с транскрипцией рибосомных генов, с процессингом 45S рРНК, такие как РНК-полимераза I, факторы транскрипции, топоизомеразы, метилазы, нуклеазы, протеинкиназы, фосфатазы. Часть ядрышковых белков имеет сродство к серебру (аргентофильные белки): РНК-полимераза I, фактор транскрипции UBF, нуклеолин (С-23), нуклеофозмин (ньюматрин, или В-23).
Аргентофилия характерна для белков, обогащенных сульфгидрильными, дисульфидными связями. Как уже указывалось, четкой аргентофилией обладают интерфазные ядрышки и зоны ядрышковых организаторов на митотических хромосомах.
Собственно ядрышковые белки расположены в специфических местах их активности. Так, РНК-полимераза I и фактор транскрипции рРНК UBF располагаются в фибриллярных центрах (ФЦ) и/или в плотном фибриллярном компоненте (ПФК).
Аргентофильным является также белок с молекулярной массой 195 кДа, представляющий собой большую субъединицу РНК-полимеразы I, участвующую в синтезе рРНК. Этот белок локализуется в зоне фибриллярных центров, по их периферии. На плоскостных препаратах ядрышек аргентофилией обладают участки над осевой частью «елочек», непосредственно над расположением гранул РНК-полимеразы I. Кроме того, с помощью иммуноморфологических методов РНК-полимераза I обнаруживается в зоне ядрышковых организаторов митотических хромосом. Это обстоятельство не противоречит данным о том, что во время митоза транскрипция полностью прекращается. Вероятно, что во время митоза гены, нагруженные неактивной РНК-полимеразой I, переносятся вместе с нею в области ядрышковых организаторов из одной клеточной генерации в другую.
Специфический для ядрышек белок фибрилларин (В-36, мол. масса 34 кДа) располагается в ПФК, где он осуществляет процессинг пре-рРНК в комплексе с другими РНП, в состав которых входит U3 мяРНК, необходимая для начального этапа процессинга 45S рРНК. Фибрилларин обнаруживается также в остаточных ядрышках — в «ядрышковом матриксе».
Белок С23 (110 кДа), или «нуклеолин», локализуется в зоне плотного фибриллярного компонента и в фибриллярных центрах ядрышек, но также и в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом. Следовательно, он обнаруживается как на транскрибируемых, так и на неактивных участках рибосомных генов. В препаратах распластанных ядрышек он выявляется над транскрипционными единицами («елочками»). Он обнаружен во фракциях, содержащих предшественники рибосом. Функции его до конца не ясны, хотя стало известно, что белок С23 может играть важную структурную роль в процессе транскрипции: своим N-концом, на котором находятся лизиновые группы, он связывается с ядрышковым хроматином, а С-концом — с транскрибируемым спейсером (tsi) на 45S рРНК. Обнаружено, что этот белок связывается не с ДНК транскрипционной единицы, а с ДНК, имеющей нуклеосомное строение (вероятно, со спейсерными участками).
Белок В-23 (нуклеофозин, мол. масса 37 кДа) с помощью иммуноцитохимических методов локализован в области ПФК и главным образом в зоне гранулярного компонента. Считается, что В-23 участвует в промежуточных и терминальных стадиях биогенеза рибосом и в транспорте пре-рибосом.
Строение и функции ядрышка
Ядрышко-округлое тельце, состоящее из р-РНК и рибосом. Основной функцией ядрышка является синтез рибосомных РНК и рибосом.
Ядрышко - это плотная структура ядра (плотность ядрышки в 1,5 раза превышает плотность ядра), которая хорошо заметна в живом неокрашенных клеток. Форма ядрышек сферическая, размер 1-5 мкм. Ядрышко хорошо красится, особенно основными красителями. Это связано с наличием в нем большого количества РНК, концентрация которого здесь в два-восемь раз выше, чем в ядре, и в два-три раза превышает концентрацию в цитоплазме. Количество ядрышек обычно соответствует количеству хромосомных наборов. Поэтому в диплоидных клетках их бывает два в ядро.
Ядрышко - это не самостоятельная структура, а производное хромосом, содержащих так называемые ядрышковые организаторы, расположенные в зонах вторичных перетяжек. Последние представляют собой локусы хромосом с высокой концентрацией и активностью синтеза РНК в интерфазе. Ядрышко - это место образования рибосомных РНК и субъединиц рибосом. ДНК ядрышковых организаторов состоит из множественных копий генов рРНК: на каждом из них синтезируется предшественник рРНК, который в зоне ядрышка связывается с белком; так образуются субъединицы рибосом.
Субмикроскопическая строение ядрышка характеризуется наличием двух основных структур: гранул диаметром 15-20 нм и фибрилл толщиной 6-8 нм. Гранулярный компонент часто располагается в виде нити (нуклеолонемы) толщиной 0,2 мкм. Фибриллярный компонент ядрышка - это рибонуклеопротеинови тяжи, предшественники рибосом, а гранулы - субъединицы рибосом, которые созревают. Вокруг ядрышки находится компактная зона приядерцевого гетерохроматина. Конденсированный хроматин также размещен между петлями нуклеолонемы.
РЕПЛИКАЦИЯ (редупликация), процесс воспроизведения (синтеза) дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). При этом из одной молекулы ДНК в результате её удвоения образуются две молекулы – точные копии исходной ДНК (лат. «репликацио» – повторение). Биологический смысл репликации – сохранение и точная (неискажённая) передача генетической информации в ряду поколений клеток и организмов, а также при воспроизведении ДНК-содержащих структур (митохондрий, пластид, некоторых вирусов). Поэтому репликация всегда предшествует делению ядер у эукариотических клеток, делению клеток бактерий, размножению вирусов и т. п. (см.Митоз, Мейоз).
Репликация, так же как другие важнейшие молекулярно-генетические процессы – транскрипция и трансляция, основана на матричном принципе биосинтеза и комплементарном взаимодействии между молекулами. Перед началом синтеза специальный фермент расплетает цепи двойной спирали ДНК, они расходятся (не полностью), и на каждой цепи другой фермент находит точку начала синтеза. Затем на обеих цепях, как на матрицах, происходит синтез новых цепей, причём избирательное соединение нуклеотидов строящейся цепи с цепью старой осуществляется по принципу комплементарности азотистых оснований. Расплетание цепей родительской ДНК и репликация идут параллельно. После завершения синтеза каждая новая молекула ДНК состоит из одной старой, родительской, цепи и одной новой. Такой способ репликации получил название полуконсервативного. На разных этапах процесса участвуют большое число разных ферментов, а также белки, препятствующие, напр., запутыванию цепей ДНК. В зависимости от формы ДНК – кольцевой или линейной – способы репликации имеют свои особенности. Репликация может осуществляться одновременно на многих участках одной молекулы ДНК.
Две замечательные особенности характеризуют процесс репликации – высокая скорость и высокая точность. Так, вся молекула ДНК кишечной палочки (состоит из 4ґ106 пар нуклеотидов) реплицируется за 20 мин, т. е. в одну секунду образуется участок ДНК размером приблизительно в 3000 пар нуклеотидов. Такая скорость возможна только при чрезвычайно «согласованном» действии всего комплекса ферментов, ведущих репликацию. У эукариот скорость репликации ниже – 100–300 пар нуклеотидов в секунду. Высокую точность репликации, столь важную для сохранения специфичной для каждого биологического вида наследственной информации, обеспечивают комплементарное спаривание нуклеотидов (возможная ошибка – одно неправильное спаривание на 108 —109) и наличие ферментов, способных узнавать и исправлять (вырезать) ошибки репликации.
Репликацией называют также матричный биосинтез РНК на РНК (у некоторых, т. н. РНК-содержащих вирусов) и удвоение хромосом, которому предшествует репликация ДНК. См. также Дезоксирибонуклеиновые кислоты, Молекулярная биология.
Отличия прокариот и эукариот.
Все живые организмы на Земле делятся на две группы – надцарство прокариот и надцарство эукариот. К надцарству прокариот относятся царства бактерий (эубактерий), архебактерий и цианобактерий (цианей, синезеленых водорослей). К надцарству эукариот относятся царства растений, животных и грибов.
1) У прокариот нет ядра, а у эукариот есть.
2) У прокариот из органоидов имеются только рибосомы (мелкие, 70S), а у эукариот, кроме рибосом (крупных, 80S), имеется множество других органоидов: митохондрии, ЭПС, клеточный центр, и т.д.
3) Клетка прокариот гораздо меньше клетки эукариот: по диаметру в 10 раз, по объему – в 1000 раз.
1) У прокариот ДНК кольцевая, а у эукариот линейная
2) У прокариот ДНК голая, почти не соединена с белками, а у эукариот ДНК соединена с белками в соотношении 50/50, образуется хромосома
3) У прокариот ДНК лежит в специальной области цитоплазмы, которая называется нуклеоид, а у эукариот ДНК лежит в ядре.
Направленность.
Направленность (англ. directionality) (в молекулярной биологии) — ориентация одноцепочечной структуры в молекуле нуклеиновой кислоты.
Структура нуклеотида соединенного двумяфосфодиэфирными связями — по 3' и 5' атомам углерода сахара рибозы
Наименование атомов углерода в нуклеотидах (исходя из нумерации атомов углерода в молекуле сахара пентозы) дает начало двум концам — 5' и 3', (произносятся как пять штрих и три штрих, англ. five prime end, three prime end).
Относительные положения структурных аналогов цепочек нуклеиновых кислот, генов, транскрипционных факторов, полимераз, обычно называют согласно положению по направлению к или от 5' и 3' концов соответственно. Синтез нуклеиновых кислот возможен in vivo только в направлении от 5' к 3', так как ДНК- и РНК-полимеразы присоединяют новые остатки нуклеотидов только к 3' гидроксильной группе (-OH) с помощью фосфодиэфирной связи. Обычно запись последовательностей нуклеотидов ДНК и РНК осуществляется в направлении от 5' к 3'
Кладёшь хромосомный препарат на предметное стекло, заливаешь краской, накрываешь покровным, кладёшь под микроскоп, и - любуешься!!
Согласно современным представлениям, биологические мембраны образуют наружную оболочку всех животных клеток и формируют многочисленные внутриклеточные органеллы. Наиболее характерным структурным признаком является то, что мембраны всегда образуют замкнутые пространства, и такая микроструктурная организация мембран позволяет им выполнять важнейшие функции.
Строение и функции клеточных мембран.
1.Барьерная функция выражается в том, что мембрана при помощи соответствующих механизмов участвует в создании концентрационных градиентов, препятствуя свободной диффузии. При этом мембрана принимает участие в механизмах электрогенеза. К ним относятся механизмы создания потенциала покоя, генерация потенциала действия, механизмы распространения биоэлектрических импульсов по однородной и неоднородной возбудимым структурам.
2.Регуляторная функция клеточной мембраны заключается в тонкой регуляции внутриклеточного содержимого и внутриклеточных реакций за счет рецепции внеклеточных биологически активных веществ, что приводит к изменению активности ферментных систем мембраны и запуску механизмов вторичных «месенджеров» («посредников»).
3.Преобразование внешних стимулов неэлектрической природы в электрические сигналы (в рецепторах).
4.Высвобождение нейромедиаторов в синаптических окончаниях.
Современными методами электронной микроскопии была определена толщина клеточных мембран (6—12 нм). Химический анализ показал, что мембраны в основном состоят из липидов и белков, количество которых неодинаково у разных типов клеток. Сложность изучения молекулярных механизмов функционирования клеточных мембран обусловлена тем, что при выделении и очистке клеточных мембран нарушается их нормальное функционирование. В настоящее время можно говорить о нескольких видах моделей клеточной мембраны, среди которых наибольшее распространение получила жидкостно-мозаичная модель.
Согласно этой модели, мембрана представлена бислоем фосфолипидных молекул, ориентированных таким образом, что гидрофобные концы молекул находятся внутри бислоя, а гидрофильные на правлены в водную фазу (рис. 2.1). Такая структура идеально подходит для образования раздела двух фаз: вне- и внутриклеточной.
1) Внутриклеточный транспорт является направленным; транспорт от
эндоплазматического ретикулума через аппарат Гольджи к лизосомам,
эндосомам или клеточной поверхности называется антероградным ;
транспорт в обратном направлении - ретроградным .
Нарушение аксонного транспорта является широко распространенным явлением и ранним событием при многих нейродегенеративных заболеваниях. Целью данной работы стало изучение механизмов нарушения ретроградного аксонного транспорта в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга мыши после аппликации бета-амилоидного пептида (бетаАП) (25-35) на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва. Под общим наркозом мышам перерезали левый седалищный нерв в средней трети бедра, а затем на центральный отрезок нерва апплицировали раствор, в зависимости от экспериментальной группы животных, содержащий ретроградный флуоресцентный маркер Fluorogold (5%), либо бетаАП С25-35) (10 6 М), либо и то и другое. Через 24 ч после операции поясничный отдел спинного мозга процессиро-вали для морфометрического и иммуногистохимического анализа. В контроле количество Fluorogald-позитивных мотонейронов составило 1223,7±1Б2,7 (п = 7), тогда как при аппликации бетаАП (25-35) - 393,2±85,3 (п = 5, р < 0,01), что говорит о выраженном угнетении ретроградного аксонного транспорта. Окраска поликлональными антителами к каспазе-3 не выявила мотонейронов в состоянии апоптоза, в окраска моноклональными антителами к р4/7 (25-35) была отрицательна как на оперированной, так и на интактной стороне спинного мозга. Таким образом, выявленное нами угнетающее действие бетаАП (25-35) на ретроградный аксонный транспорт не связано с апоптотической гибелью нейронов или накоплением бетаАП (25-35) в теле нейрона, а, вероятно, обеспечивается внутриаксонными эффектами. Полученные данные имеют важное значение для понимания механизмов патогенеза болезни Альцгеймера. Внутриклеточный транспорт веществ и органелл является необходимым условием существования всех клеток млекопитающих, но наибольшую важность этот процесс имеет для нейронов. Это связано с наличием у нейронов отростков и их значительной длиной [длина аксона мотонейрона может составлять более 1 м). Выделяют антероградный и ретроградный аксонный транспорт, Антероградный транспорт обеспечивает доставку материалов из тела нейрона в различные компартменты аксона [натриевые каналы — преимущественно в перехваты Ранвье, синаптические белки — в окончание аксона, и др.), а ретроградный — в обратном направлении (интернализированные синаптические везикулы, сигнальные молекулы и т.д.). Установлено, что аксонный транспорт нарушается при большинстве распространенных нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероза, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и др.) . Чаще всего, такие нарушения связаны с накоплением патологических белковых агрегатов внутри аксонов, однако детальные механизмы дефектов аксонного транспорта при разных патологиях различны. Нарушения аксонного транспорта описаны на ранних стадиях заболевания у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера
ТРАНСКРИПЦИЯ, Транскрипция — синтез РНК с использованием ДНК в качестве матрицы. В результате возникает 3 типа РНК:
- матричная (мРНК);
- рибосомная (рРНК);
- транспортная (тРНК).
Процесс транскрипции требует больших затрат энергии в виде АТФ и осуществляется ферментом ДНК-зави-симой-РНК-полимеразой трех типов и рядом так называемых вспомогательных факторов. Одномоментно транскрибируется не вся молекула ДНК, а лишь отдельные ее отрезки. Они называются единицами транскрипции, или транскриптонами. По сути транскриптон — это и есть ген с точки зрения молекулярной биологии. Напомним, что промотор — участок ДНК длиной в несколько десятков нуклеотидов, куда присоединяется РНК-полимераза и откуда начинается транскрипция. Терминатор — участок ДНК, содержащий сигнал (последовательность) окончания транскрипции. Поскольку у бактерий оперонная организация генома, у них транскрибируются сразу несколько генов, объединенных одной функцией. У эукариот за один раз транскрибируется только один ген. Транскрипция, как и репликация ДНК, основана на способности азотистых оснований нуклеотидов к комплементарному связыванию. Аналогично репликации, при транскрипции полимераза (здесь уже РНК-полимераза) шаг за шагом подбирает и “сшивает” нуклеотиды комплементарные матричной последовательности. Отличительной особенностью транскрипции является то, что в РНК нет тимидина, его замещает уридин; соответственно при транскрипции аденозин молекулы ДНК спаривается с уридином синтезируемой РНК. На время транскрипции двойная цепь ДНК разрывается и синтез РНК осуществляется по одной цепи ДНК, которая называется кодирующей. Вторая цепь является некодирующей. Какая цепь будет кодирующей, определяется тем, на какой из них находится промотор. В процессе транскрипции образуется гибрид одноцепочечной ДНК с РНК, который существует короткое время и очень быстро распадается, при этом восстанавливается нативная двуцепочечность ДНК.
Цикл транскрипции состоит из трех стадий:
- инициации;
- элонгации;
- терминации.
Им предшествует узнавание промотора или подготовительная стадия, на которой РНК-полимераза узнает промотор и связывается с ним. Одновременно происходит локальное расплетение ДНК примерно на 10 пар нуклеотидов.
1 Инициация. На этой стадии происходит образование нескольких начальных звеньев РНК (так называемый синтез критической длины). До этого комплекс полимераза-ДНК не стабилен и способен распадаться.
2. Элонгация. Продолжается дальнейшее расплетение ДНК и синтез РНК по кодирующей цепи. Он, равно как и синтез ДНК, осуществляется в направлении 5- 3.
3. Терминация. Как только полимераза достигает терминатора, она немедленно отщепляется от ДНК, локальный гибрид ДНК-РНК разрушается и новосинтезированная РНК транспортируется из ядра в цитоплазму. На этом транскрипция заканчивается.
Созревание РНК
Все образовавшиеся РНК непосредственно после трансляции не способны, функционировать, так как они синтезируются в виде молекул-предшественников: пре-р, пре-т и пре-м РНК. Чтобы начать работать, пре-РНК должны подвергнутьсяпроцессингу (созреванию). Под процессингом понимают совокупность биохимических реакций, при которых пре-РНК укорачиваются, подвергаются химическим модификациям, в результате которых образуются зрелые РНК. Процессинг т- и рРНК осуществляется по одинаковому плану. В основном вырезаются лишние фрагменты с 3'- и 5'-концов и химически модифицируются азотистые основания.
Процессинг мРНК гораздо сложнее. Интересно, что мРНК прокариот (бактерий) процессингу не подвергаются вообще — это единственные РНК, способные работать сразу после синтеза. У эукариот Процессинг мРНК осуществляется многоступенчато и включает модификацию 3'- и 5'- концов, а также вырезание интронов. В последнем процессе участвует четвертый известный тип РНК — малая ядерная РНК (мяРНК). которая удерживает концы, экзонов при вырезании интронов.