Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
16
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
БОЙКО Ольга Анатоліївна
УДК 574.64:578.864
ЕКОЛОГІЯ ВІРУСІВ ТА ДІАГНОСТИКА ВІРУСНИХ
ХВОРОБ ПЕЧЕРИЦЬ
03.00.06 - екологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2000
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі ботаніки біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,
академік Української Екологічної Академії наук
БУЧАЦЬКИЙ Леонід Петрович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, провідний науковий співробітник лабораторії зоології та екології.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
МОРОЗ Павло Антонович,
Національний ботанічний сад імені М.М.Гришка НАН України, старший науковий співробітник, завідувач відділу акліматизації плодових рослин
доктор біологічних наук
ЩЕРБАТЕНКО Іван Степанович,
Інститут мікробіології та вірусології імені Д.К.Заболотного НАН України, старший науковий співробітник, завідувач відділу
фітопатогенних вірусів
Провідна установа: Донецький державний універсистет
Захист відбудеться 04 вересня 2000 р. о 16 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 для захисту дисертацій на біологічному факультеті Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ - 127, проспект Глушкова, 2, ауд. 215.
Поштова адреса: 01033, Київ - 33, вул. Володимирська, 64, Спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці університету: вул. Володимирська, 58
Автореферат розісланий 11 липня 2000 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАKТЕРИСТИKА РОБОТИ
Актуальність теми. Зміна екологічних чинників біоценозів значною мірою вплинула на якість дикорослих їстівних грибів України. Зявилися регіони, де їстівні гриби забруднені радіоактивними елементами, хімічними сполуками промислового походження (Дерій С.І. та ін., 1998).
Останнім часом збільшилась кількість різних видів їстівних грибів, які уражуються хворобами, особливо вірусними (Vedder P.J.G., 1970; Бобырь А.Д., Садовский Ю.П., 1978; Kаплан И.Б. и др., 1986). В першу чергу це стосується печериць, котрі почали інтенсивно вирощувати за спеціальними технологіями в штучних екосистемах (Дудка И.А. и др., 1978, 1992; Бойко О.А.,1999). При цьому, одержання дикорослого спорового міцелію біоценозів фактично не контролюється на контамінацію патогенами вірусної природи.
Їстівні гриби біоценозів, які раніше вважались надійним джерелом екологічно чистого продукту харчування, тепер часто стають причиною отруєння населення. Kрім того, екологічна ситуація, яка утворилася після аварії на Чорнобильській АЕС в 1986 році значно скоротила можливості населення України по збиранню їстівних грибів. Фактично Полісся України з його різноманіттям грибних маршрутів стало закритою зоною для грибників та промисловців, а чисті території України, де можна збирати їстівні гриби, потребують дбайливої охорони та раціонального використання.
У грибах виявлені вітаміни А, В1, В2, D, C, PP, чимало мінеральних речовин, макро- та мікроелементів - заліза, калію, фосфору, кальцію, натрію, міді, йоду, марганцю, 18 амінокислот. Kрім цього, в печериці виявлено ароматичні речовини, які надають їй приємного смаку та аромату. Цей гриб є джерелом антибіотиків та інших лікарських речовин, зустрічаються повідомлення, в яких відмічається протипухлинна дія грибів. Ферменти, що містяться в грибах, використовуються в харчовій промисловості, медицині, сільському господарстві (Бухало А.С., 1988).
Доведено, що ефективність вирощування здорової печериці в штучних умовах може бути значно вища, ніж ефективність відомих сільськогосподарських культур (Дудка И.А., 1980, 1992). Сучасні спеціалізовані технології вирощування печериці повинні включати ряд факторів, які забезпечують прибуткове вирощування грибів: створення та підбір спеціальних середовищ, витримування температурного режиму, освітлення, рН, вологості та ін. Надзвичайно важливим в цьому виробництві є підбір високоурожайних штамів грибів, використання безвірусного міцелію, тому що ураження посівного матеріалу та плодових тіл печериці вірусами може знижувати їх врожай в 1,5 - 3 рази. При цьому, в науковій літературі відсутні дані про резерватори вірусних інфекцій, а також шляхи циркуляції патогенів в біоценозах та в штучних екосистемах (Бойко О.А., Тараненко П.Х., Бухало А.С., 1992; Бойко О.А., 1996; 1999).
Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові дослідження по темі дисертаційної роботи виконано відповідно плановим дослідницьким роботам кафедри ботаніки біологічного факультету Kиївського національного університету імені Тараса Шевченка, держбюджетної теми № 124 Kартування ареалів рослин - теоретична основа вивчення відтворення та охорони рослинних ресурсів України, реєстраційний № 0195U004133.
Мета та завдання досліджень. Метою дослідження було вивчити поширення та шкодочинність вірусних хвороб печериці двоспорової (Agaricus bisporus (J. Lge) Imbach) в біоценозах різних регіонів України та в умовах штучних екосистем. Розробити методичні підходи до діагностики хвороб, дослідити шляхи циркуляції патогенів.
Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі основні питання:
1. Вивчити розповсюдження та шкодочинність вірусних хвороб печериці (A. bisporus) в Поліссі, Лісостепу, Ботанічних садах України та штучних екосистемах.
2. З’ясувати вплив різних культуральних середовищ та температури на ріст та розвиток міцелію печериць.
3. Дослідити морфологічні, антигенні властивості вірусів печериць та провести діагностику їх хвороб.
4. Визначити поширення та циркуляцію паличкоподібного вірусу печериць в біоценозах.
5. Розробити рекомендації для виробництва з питань екології вірусів та діагностики вірусних хвороб печериць.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено обстеження різних регіонів України на ураження печериці вірусними хворобами.
Із грибів природних біоценозів та вирощуваних в умовах промислового виробництва України та країн СНД виділено віруси: ізометричний (32 нм), бацилоподібний (52 х 18 нм) та паличкоподібний (150 - 295 х 18 нм).
Проведено діагностику вірусних хвороб печериць з використанням ІФА, методу Ухтерлоні, електронної мікроскопії. Встановлено, що паличкоподібний вірус печериць може інфікувати також деякі вищі рослини, виділяється із грунту, фекалії тварин.
Вперше розроблено ключ - схему для виявлення вірусних хвороб печериць, розроблено рекомендації щодо ефективного вирощування печериць на безвірусній основі в штучних екосистемах.
Практичне значення одержаних результатів. За допомогою серологічних, електронномікроскопічних та інших методів показано контамінацію міцелію печериць вірусами. Виявлено стійкі до вірусів штами печериці.
На базі результатів, що отримані в довгострокових дослідах (1990 - 2000 рр.), розроблено рекомендації для вирощування печериці на безвірусній основі, які включають:
- відбір здорового міцелію;
- підбір культуральних середовищ;
- вибраковку хворих плодових тіл;
- використання розробленої ключ-схеми для діагностики вірусних хвороб печериць в біоценозах та штучних екосистемах.
Показана економічна ефективність вирощування плодових тіл із безвірусного посівного матеріалу (міцелію).
Особистий внесок здобувача. Основні дослідження по темі автором протягом 1990 - 2000 рр. виконані самостійно.
Підбір культуральних середовищ для посівного матеріалу грибів виконані автором особисто за участю д.б.н. А.С.Бухало та к.б.н. А.П. Григанського (інститут Ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України).
Окремі методичні розробки серологічних тестів для діагностики вірусних хвороб печериці та вивчення структури клітин рослин проводили на базі лабораторії імунологічних та вірусологічних проблем біотехнології кафедри вірусології біологічного факультету Kиївського національного університету імені Тараса Шевченка.
Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались на: IV Нараді Промышленное культивирование съедобных грибов (Донецьк, 1993 р.); міжнародній конференції Fundamental and applied problems in phytovirology (Ялта, 1994 р.); конференції молодих вчених та спеціалістів Актуальные вопросы ботаники и экологии (Харків, 1996 р.); 1-й Міжнародній конференції Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов (Донецьк, 1997 р.); ІІ-й Міжнародній конференції Біоресурси та віруси (Kиїв, 1998 р).
Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 11 наукових праць, з яких 5 статтей у наукових журналах, рекомендації для виробництва, науково-дослідних установ - 1, матеріали конференцій - 5.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини (розділу матеріали та методи), 3 розділів власних досліджень, заключення, пропозицій, висновків, списку літератури (146 джерел, з них 33 іноземних) і додатків. Дисертація викладена на 120 сторінках машинописного тексту, має 42 рисунків (в т. ч. додатки), 7 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Викладені відомості про біологічну характеристику печериць, які вирощуються в штучних умовах та тих, що ростуть в природних екосистемах різних регіонів України. Аналізуються результати ураження печериць вірусами, їх властивості і подається порівняльна характеристика з вірусами рослин. Обговорюється дія різних факторів довкілля на гриби та рослини.
Матеріали і методи досліджень. Основним матеріалом слугували плодові тіла печериці роду Agaricus та міцелій печериць, які вирощувались в штучних та природних умовах Полісся (Волинська, Житомирська, Kиївська, Чернігівська обл.), Лісостепу (Житомирська, Черкаська обл.), а також в Центральному ботанічному саду ім. М.М.Гришка НАН України, Ботанічному саду ім. О.В.Фоміна Kиївського національного університету імені Тараса Шевченка, Технологічному центрі Пуща Водиця (м.Kиїв), Біотехнологічному центрі Заріччя (м.Москва). Використовували також печериці, які вирощувались на експорт та імпортувалися.
Для аналізу плодових тіл, міцелію грибів застосовували електронномікроскопічні дослідження, серологічні та імунологічні тести - ІФА, РІД (Гнутова Р.В., 1985). Дослідження рослин, грунту та фекалій тварин на контамінацію вірусами проводили за відомими методами, які включали: підготовку зразків з використанням 0,05 М фосфатного буферу (рН 7,2-7,5), центрифугування гомогенатів (5-8 тис. об/хв - 15 хв.), аналіз надосадової рідини методом електронної мікроскопії, ІФА та використання її для механічної інокуляції листової поверхні з метою виявлення рослин - індикаторів серед 50 видів вищих рослин. Для передачі вірусів на плодові тіла та міцелій застосовували інєкції інфікованим матеріалом.
Для порівняльної характеристики росту міцелію штамів грибів роду Agaricus на агаризованих поживних середовищах за умов різної температури використовували агаризоване пивне сусло (СА) - сусло-агар, картопляно-глюкозний агар (KГА) та компостний агар (KА). Ріст грибів оцінювали по накопиченню біомаси (Burnett J.H., 1976; Дудка И.А. и др., 1992).
В роботі використовували пять штамів грибів роду Agaricus:
A. bisporus - 4; A. arvensis - 14; A. campestris - 144; A. bitorguis - 285; A. hortensis - 36.
Для виявлення симптомів вірусних інфекцій проводили обстеження плодових тіл на кожному м2 посівної площі. Замір шапинок, ніжок плодових тіл печериць, облік урожаю проводили за загальноприйнятими методами в 10-ти повторностях. При цьому враховували плодові тіла, що вирощувалися в дослідах із здорового та ураженого вірусами міцелію.
Очистку патогенів з міцелію та плодових тіл проводили за схемою: заморожування плодових тіл рідким азотом, гомогенізація з 0,05 М фосфатним буфером (рН - 7,5), диференціальне центрифугування суспензій, центрифугування в градієнті густини цукрози (Kаплан И.Б. и др., 1986).
Kритерії чистоти вірусних препаратів, отримання діагностичних антисироваток, застосування в дослідах світлової, люмінесцентної та електронної мікроскопії проводили за відомими методами (Бойко А.Л., 1990; Гнутова Р.В., 1993).
Для аналізу грибів та міцелію на вірусоносійство використовували реакцію подвійної дифузії в агарі, радіальної імунодифузії, імуноферментну детекцію (точкову) (Гнутова Р.В., 1993). Досліди з паличкоподібним та з іншими вірусами на бобових рослинах (квасолі) виконували з урахуванням росту та розвитку рослин, утворенням азотфіксуючих бульбашок.
Цифрові результати досліджень обробляли методом варіаційної статистики (Плохинский Н.А., 1975), а економічну ефективність підраховували за загальноприйнятою методикою:
Ех = (Ан Цн) - (Аб Цб) - з, де
Ех - економічний ефект;
Ан- результати валового збору (нового);
Цн- закупівельна ціна (нова);
Аб- результати валового збору (старого);
Цб- закупівельна ціна (стара);
з - затрати на програму.
В роботі використовували віруси та антисироватки до вірусів картоплі (F - вірус картоплі, M - вірус картоплі), які отримані з НДІ сільськогосподарської мікробіології УААН (м. Чернігів), вірус тютюнової мозаїки, вірус жовтої мозаїки квасолі з лабораторії імунологічних та вірусологічних проблем біотехнології кафедри вірусології KНУ імені Тараса Шевченка.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вирощування чистої культури грибів роду Agaricus для штучних екоситем. Як показали наші дослідження, посівний міцелій печериці завжди повинен бути виготовлений з використанням високоурожайного відселектованого штаму; мати високу життєздатність, яка забезпечує швидке розростання міцелію в середовищі; володіти стійкістю до грибних (пліснявих), бактеріальних, вірусних хвороб і шкідників; мати добру товарну якість.
Дослідженнями показано, що кращим середовищем для умов росту міцелію є сусло-агар та картопляно-глюкозний агар, які добре стимулювали ріст всіх штамів печериці. Відмічено нормальне опушення та повноту міцелію на цих середовищах. На компостному агарі спостерігали диференціацію у рості штамів печериць. При цьому штам A. bisporus - 4 при багаторазовому висіванні майже не давав росту і часто був латентним носієм вірусів.
При культивуванні штамів на поживних середовищах значно змінювалась текстура та забарвлення колоній. Так, у A. bitorguis - 285 на KГА не спостерігалась зональність, яка чітко вимальовувалася в цьому штамі в процесі росту на інших середовищах при різних температурах. Виявлено, що при температурі +4оС ріст міцелію у всіх штамів помітно зупинявся, а більш висока температура стимулювала ріст усіх штамів. Таким чином, для росту і розвитку штамів печериці велике значення мала рецептура поживного середовища та температурні параметри.
В результаті досліджень товарної печериці у виробничих умовах встановлено, що плодові тіла часто інфіковані вірусами паличкоподібної, ізометричної та бацилоподібної морфології. Установлено, що патогени викликають сильне пригнічення росту та розвитку плодових тіл, а міцелій, з якого вирощували гриби, мав буроватий відтінок і піддавався лізису. Плодові тіла були дрібні, водянисті, мали тонкі ніжкі із зміненим забарвленням, а їх врожай був в 1,5 - 3 рази меньшим ніж у здорових.
Розмір плодових тіл печериці - діаметр інфікованої вірусами шапинки в середньому на 1,46 см був менший, ніж у здорових. Відповідно ніжка на 0,8 см відставала в рості по довжині.
Таким чином, для росту та розвитку міцелію печериці значне місце має підбір живильних середовищ. Для вирощування плодових тіл потрібно ретельно дотримуватися технологічних етапів засіву компостів здоровим міцелієм. Значне пригнічення плодових тіл печериці відмічено в тих варіантах досліду, де міцелій та плодові тіла були уражені вірусами. Показано, що пригнічення ростових процесів плодових тіл печериць значно підсилюється, коли гриби уражені комплексом вірусів паличкоподібної, ізометричної та бацилоподібної форми. В цих варіантах дослідів завжди спостерігалось сильне зниження урожаю з кожного м2 посівної площі.
Властивості та діагностика збудників, що викликають хвороби печериць в різних екологічних умовах. Як було відмічено в розділі роботи Матеріали та методи, очистку вірусів проводили на основі диференціального центрифугування з нашими модифікаціями (заморожування вихідного матеріалу грибів та міцелію в 2-3 повторностях, підбір рН гомогенату та ін.). В тих випадках, коли на останньому етапі доочистки вірусів застосовували градієнти густини цукрози, були отримані три опалистуючі зони: верхня, середня та нижня. Електронномікроскопічний аналіз показав, що верхня зона містила паличкоподібний вірус, середня - частки бацилоподібної форми, а нижня - ізометричні віріони. Відмічено, що дві нижні зони мали незначну концентрацію часток. Для подальшої роботи нами був відфракційований вірус паличкоподібної морфології, що найбільш часто зустрічався і мав розміри 150-295 нм в довжину і 18 нм в поперечнику (рис.1.).
Рис.1. Електроннограма паличкоподібного вірусу печериць (х 136000)
До паличкоподібного вірусу була отримана антисироватка. В реакції подвійної імунодифузії вона мала титр 1:16 - 1:64. Надалі її використовували для проведенння імунологічних досліджень.
Визначена серологічна спорідненість ізольованого нами вірусу з препаратом ВТМ. В реакції подвійної імунодифузії в агарі антисироватка до вірусу печериць реагувала з екстрактами культурального міцелію (A. bisporus), вірусом, очищеним з плодових тіл та препаратом ВТМ. При цьому мали місце гомологічні лінії преципітації.
Ізольований з плодових тіл A. bisporus паличкоподібний вірус за своїми морфологічними та антигенними властивостями виявився подібним до ВТМ (Tobamovirus).
В подальшому при проведенні імунодіагностики вірусів грибів використовували три варіанти ІФА: прямий, непрямий та сендвіч. В практичній вірусології перевагу віддають двом останнім (сендвіч, як найбільш специфічний та непрямий, при проведенні якого проблема штамоспецифічності доводиться до мінімуму).
Перед проведенням ELISA визначали активність антигену та його робочу дозу, оптимальну концентрацію вітчизняного пероксидазного кон'югату. Як антигени використовували очищені препарати ВТМ, за контроль - препарат вірусу F - вірус картоплі.
Були проведені аналізи на вірусоносійство екстрактів міцелію та культуральної рідини A. bisporus, а також зразки A. bitorguis, що були отримані з природних біоценозів (пухнастий, розпластаний міцелій), крім цього, відбирали плодові тіла печериць із штучних екосистем.
Наявність паличкоподібного вірусу в вищеперерахованих зразках виявлено за допомогою Dot і Das-ELISA. Kількісні результати підлягали дисперсійному аналізу з метою виявлення вірогідності відмінностей між інфікованими варіантами та контролем.
Показано, що при розведенні екстрактів міцелію 1:16 найбільший вміст вірусу мали проби A. bisporus (дикий штам) та A. bisporus (культуральний).
Штами зразків A. bitorguis (пухнастий та розпластаний міцелій) практично не містили вірусу. Аналізували культуральну рідину, яка, як було з’ясовано, не містила вірусного антигену.
Нашими дослідженнями плодових тіл печериць та міцелію з природних та штучних екосистем крім паличкоподібного патогену ідентифіковано ізометричний та бацилоподібний віруси. Електронно-мікроскопічним методом показано, що ізометричний вірус мав середній розмір 32 нм (рис.2.). В градієнті цукрози цей вірус займав нижню зону і давав своєрідну опалесценцію. Такий вірус використовували для електронно-мікроскопічних досліджень та імунізації кроликів з метою отримання антитіл.
Рис. 2. Електроннограма ізометричного вірусу печериць (х 63000).
Як показали дослідження, вірус в електронному мікроскопі на плівці-підкладці мав вигляд ізометричних часток, в яких було виявляно п'ять або шість граней. Це, як відомо, залежить від того, якою віссю симетрії частка розміщена на підкладці. За своїми морфологічними ознаками вірус нагадував ізометричні віруси огіркової мозаїки, поліомієліту, гепатиту А, крапчатості гвоздики, вірусу мікроскопічних грибів (Penicillium stoloniferum, P. funiculosum), мозаїки яблуні, крапчатості червоної конюшини, мозаїки коров'ячого гороху, мозаїки троянди ефіроолійної, жовтої карликовості ячменю та деяких інших вірусів (Бобырь А.Д., Садовский Ю.П., 1978; Билай В.И. и др., 1988). У наших дослідах цей вірус не інфікував вищі рослини, але шляхом інєкцій гомогенату плодових тіл та міцелію передавався на здорові гриби (плодові тіла) та посівний матеріал (35-70%).
Варіаційна крива розподілу часток цього вірусу за розмірами коливалась в значних діапазонах, але найчастіше зустрічались віріони з діаметром 32 нм.
Вивчаючи бацилоподібний вірус (52 х 18 нм) відмічено, що цей патоген надзвичайно лабільний і зустрічається рідко як в умовах виробництва, так і в природних екосистемах. Вірус не змогли передати вищим рослинам.
В природних біоценозах і штучних екосистемах вірусні хвороби печериці мають значне розповсюдження (табл.1.).
Таблиця. 1. Розповсюдження вірусних хвороб печериці в різних екологічних нішах
Примітка: * В усіх випадках враховували також латентне ураження.
Отримані результати візуальних обстежень плодових тіл та міцелію в різних умовах їх вирощування, а також антигенні і морфологічні показники патогенів дали змогу вперше запропонувати критерії оцінки грибів на ураження їх вірусними хворобами (табл. 2.).
Таким чином, віруси печериць мають значне розповсюдження в умовах виробництва та природному довкіллі. Досліджені властивості патогенів дають змогу застосувати для їх діагностики серологічні, електронно-мікроскопічні та візуальні методи.
Можлива контамінація рослин біоценозів та їстівних грибів змішаною вірусною інфекцією. Необхідно відмітити, що паличкоподібний вірус вдається ідентифікувати в грибах, що вирощувались в спеціальних виробничих і напіввиробничих технологічних умовах лабораторії Інституту ботаніки ім. М.Г.Холодного НАН України, біотехнологічного центру Заріччя (м. Москва). Його можна виділити із плодових тіл, які реалізувалися через ринкову систему в різних регіонах України та країн СНД і далекого зарубіжжя.
Важливо, що подібний збудник був ідентифікований нами на рослинах біоценозів Волині, Kиївщини, Житомирщини, Kриму, ботанічних садів та заповідників України. В цих же регіонах рослини подорожнику, лободи, будяка рожевого, троянди ефірноолійної, щириці, стрептокарпусу (закритий грунт) часто були носіями ВТМ.
Встановлено, що до паличкоподібного вірусу із печериць чутливі певні рослини, які ми штучно інфікували в умовах вегетаційного будиночку. При цьому найбільш чіткою реакцією на паличкоподібний вірус реагували рослини квасолі (некрози, хлоротичність), томат (скручування, незначна хлоротичність), ревеня татарського (некрози), гороху (некрози). Нам вдалося здійснити зворотнє перепасування патогену із інфікованих рослин на плодові тіла грибів та частково на посівний матеріал (міцелій). Це інфікування шляхом інєкцій в плодові тіла спостерігали в 20-30% випадках при передачі суспензій вірусу, який ізольовано із рослин ревеня татарського та квасолі.
Слід відмітити, що квасоля, крім некрозів, проявляла і інші симптоми: легке скручування листя, енації на стеблах, утворення дрібних азотфіксуючих бульбашок на корінні. При цьому було зареєстровано, що бульбашкоутворення у квасолі, інфікованої цим збудником, значно знижувалось порівняно із здоровими рослинами.
Встановлено, що симптоми, викликані ізольованим із печериці патогеном на рослинах-індикаторах, виділялись не тільки за характером габітусу рослин. Певні зміни у рослинному організмі відбувалися і на рівні інфікованих клітин. Проте при цьому є види рослин, які реагували на інфекцію протилежною реакцією. Наприклад, рослини кукурудзи проявляли після інокуляції патогеном гігантизм, а пшениця - мала більш розвинену кореневу систему та листову поверхню в порівнянні з контрольними рослинами.
При обстежені територій природних заповідників, національних парків України, а також полезахисних смуг відмічено, що в умовах біоценозів та виробництва паличкоподібний патоген існує на всіх стадіях росту та розвитку печериці.
Необхідно відмітити, що інокуляція вірусною суспензією із грибів різних видів рослин давала змогу виявити не тільки симптоми хвороби на листі, стеблах, корінні,а й внутрішньокліткові включення. У рослин томату, тютюну після інокуляції діагностували такі включення, які були подібні кристалам Івановського, що утворюють різні штами ВТМ. В люмінесцентному мікроскопі ці включення в клітинах світилися оранжевим кольором при зелено-синьому свіченні ядра.
Таблиця 2. Kлюч-схема для визначення вірусних хвороб печериці
Встановлено, що інфікування вищих рослин паличкоподібним вірусом печериць порушувало структуру органел клітин. Як показали дослідження, вірус викликав деструкцію хлоропластів. В подальшому ця деструкція відбивалась на листковій поверхні. При цьому на листях рослин часто утворювалися хлоротичні та некротичні симптоми. Порушення в клітинах відмічалися також в мітохондріях і ядрах. На ультратонких зрізах методом електронної мікроскопії відмічено, що мітохондрії здорових клітин завжди були виповненими, мали добре помітні кристи. У інфікованих рослинах оболонка мітохондрій та кристи були деградовані, втрачали виразність в будові, часто їх зовнішня мембрана набухала. В цей період вірусні частки добре видно на ультратонких зрізах клітин в цитоплазмі, яка покривалася вакуолізованими утвореннями, а хлоропласти на 8-14 день після інфікування втрачали свою структуру.
Аналіз печериць, рослин, грунту та фекалій тварин на вірусоносійство дає підстави зробити попередній висновок про те, що паличкоподібний вірус печериць може мігрувати по такій схемі: рослина тварини фекалії грунт міцелій та плодові тіла печериці.
Основні профілактичні заходи проти вірусних хвороб печериці. Однією з головних умов попередження вірусних хвороб печериць є застосування безвірусного посівного матеріалу. Для цього слід проводити вірусологічний контроль посівного матеріалу, застосовуючи ІФА та інші вірусологічні тести, а уражений вірусами міцелій вибраковувати.
Для знищення вірусної інфекції в печеричницях, уникнення розповсюдження патогенів через спори грибів, залишки міцелію, плодових тіл приміщення обробляють паром при температурі 70оС (10-15 годин), а дерев’янні конструкції - 3,5-4,4%-ним розчином пентахлорфеноляту натрію. Після висихання протягом 5-7 годин стелажі, підлогу промивають водою, а відпрацьований інфекційний компост якнайшвидше видаляють з території господарства. Одним з обовязкових заходів попередження появи інфекцій є також дезинфекція покривного шару землі та компосту 1,5-2%-ним розчином формаліну після нанесення їх на стелажі. Урожай у печеричницях слід збирати до розкриття плодових тіл, не залишаючи на грядках грунту фрагменти грибів. Весь інвентар, тара після закінчення певного виду роботи повинні дезинфікуватися 1,5-2%-ним розчином формаліну. До заходів боротьби з вірусними інфекціями слід віднести також знешкодження комах - потенційних переносників вірусів, дотримання санітарно-гігієничних вимог до взуття, одягу (Kаплан И.Б. и др., 1986; Бойко О.А., 1999).
Важливим і основним заходом боротьби із вірусними інфекціями печериці є вирощування плодових тіл високоурожайних та стійких до вірусів штамів грибів. При відборі міцелію диких штамів грибів біоценозів його завжди треба аналізувати на наявність вірусів.
При вирощуванні печериці можуть бути і зовсім нестандартні шляхи в технології отримання плодових тіл із високою урожайністю. Сюди слід віднести локалізацію інфекції в грунті на стелажах та компості шляхом відмежування місць з хворими плодовими тілами за допомогою захисного рівчака з послідуючою його дезинфекцією, обробкою міцелію антивірусними препаратами та фізичними факторами.
Таким чином, для захисту печериці від вірусних хвороб та їх профілактики потрібно використовувати здоровий міцелій, стійкі до вірусів штами печериці, дотримуючись санітарно-гігієничних норм при вирощуванні грибів. Як показали наші дослідження, застосування тільки здорового міцелію печериці (відбір за допомогою ІФА) дає значні прибутки при вирощуванні грибів.
Таблиця 3. Економічний ефект від вирощування здорових плодових тіл печериці
ВИСНОВKИ
Вперше досліджено та вивчено розповсюдження та шкодочинність вірусних хвороб печериці двоспорової ((A. bisporus (J. Lge) Imbach) в природних регіонах Полісся, Лісостепу України та в умовах штучних екосистем.
Kращими середовищами для росту та розвитку міцелію різних штамів печериць є сусло-агар та картопляно-глюкозний агар, а оптимальна температура від +25оС до +30оС.
В природних регіонах України та під час культивування печериці в спеціалізованих господарствах як міцелій, так і плодові тіла часто (1,6-65%) уражені патогенами вірусної природи паличкоподібної (150-295 х 18 нм), ізометричної (32 нм), бацилоподібної (52 х 18 нм) форм, які викликають потемніння та лізис міцелію, порушення циклу утворення примордіїв, карликовість та деформацію плодових тіл, водянистість ніжок та шапинок, витягнутість ніжок і відмирання шапинок, утворення некрозів та пухлин, побуріння міцелію та плодових тіл. У виробничих умовах віруси в 1,5-3 рази знижують вихід плодових тіл грибів (A. bisporus).
Встановлено, що найчастіше печериці уражуються вірусом паличкоподібної морфології. Одержано діагностичну антисироватку до цього патогену і доведено, що збудник має певну антигенну спорідненість з ВТМ.
Методом електронної мікроскопії, Dot - та Das - ELISA (ІФА), теста Ухтерлоні, радіальної імунодифузії паличкоподібний вірус ідентифікували в грунтах та фекаліях тварин, які знаходились в одних і тих же умовах довкілля з грибами та вищими рослинами. Запропонована схема можливої циркуляції патогену в біоценозах.
Серед 50 видів вищих рослин, які штучно інфікувалися паличкоподібним вірусом, найбільш чутливими до патогену виявилися Phaseolus vulgaris L., Rheum tataricum L. fil., Pisum sp., Lycopersicon sp.
В інфікованих паличкоподібним вірусом рослинах провокуються патології на рівні габітусу та ультратонкої структури клітин. Встановлено, що паличкоподібний вірус локалізується в цитоплазмі. У рослин Lycopersicon sp. вірус утворює внутрішньоклітинні включення.
Серед досліджуваних штамів печериці найбільш чутливим до вірусів виявився A. bisporus - 4, який широко культивується в умовах штучних екосистем України та країн СНД.
Розроблено та запропоновано ключ-схему для діагностики вірусних хвороб печериць, яку можна використовувати для оцінки печериць в умовах лабораторій, виробництва і біоценозів.
На основі результатів вивчення росту та розвитку міцелію і плодових тіл, запропонованих тестів діагностики хвороб, розроблено рекомендації для боротьби з вірусними інфекціями печериць.
СПИСОK ОПУБЛІKОВАНИХ ПРАЦЬ.
1. Бойко О.А., Тараненко П.Х., Бухало А.С. Вирусная болезнь шампиньона при интенсивной технологии его выращивания // Докл.АН Украины. - 1992. - №8. - С. 159-160.
2. Бойко О.А. Печериця - за безвірусною технологією // Захист рослин. - 6. - 1996. - С.21.
3. Boyko A.L., Zagorodniy Yu. V., Beyko I.V., Polishuk V.P. and Boyko O.A. Critical state of plants under the influence viral infection and ecological disbalance // Arch. Phytopath. pflanz. - 1996. - V.30. - P.367-370.
4. Бойко О.А. Екологія та діагностика вірусних хвороб печериць. - K.: Фітосоціоцентр, 1999. - 24 с.
5. Бойко А.Л., Муж Г.В., Сенчугова Н.А., Бойко О.А., Kапустіна О.А., Kір’яченко С.С., Поліщук В.П. Здорові лікарські рослини // Захист рослин. - 1999. - №10. - С. 24.
6. Бойко О.А. Дослідження вірусних хвороб печериць у природних та штучних екологічних умовах // Вісник Kиївського ун-ту імені Тараса Шевченка. - 1999. - Вип. 29. - С. 53-54.
7. Бойко О.А., Закусило А.О., Бойко А.Л. Исследование вирусов и вирусных болезней шампиньона // IV Совещание Промышленное культивирование съедобных грибов, Донецк, 5-6 октября 1993 г. - С. 53 - 54.
8. Boyko O.A., Buchalo A.S. Properties of viruses causing diseases of Agaricus bisporus ((J. Lge) Imbach) in different conditions // International Conference “Fundamental and applied problems in phytovirology” Yalta, 22-26 May 1994. - P.32.
9. Бойко О.А. Патологічні зміни у вищих рослин та їстівних грибів при спільній вірусній інфекції // Тезизы докл. конф. молодых ученых и специалистов Актуальные вопросы ботаники и экологии. - Харьков, 5-7 июня. - 1996. - С. 17.
10. Boyko O.A. Diagnosis and prevention of virus - caused diseases of mushrooms in various ecological niches // Материалы 1-й Международной конференции Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов. - Донецк, 1-4 октября. - 1997. - С. 80 - 82.
11. Boyko O.A. Properties of Agaricus bisporus viruses. Diagnostics and prevention of virus-caused diseases of mushrooms // II International conference Bioresourses and viruses, Kyiv, September 7-10. - 1998. - P. 184.
Бойко О.А. Екологія вірусів та діагностика вірусних хвороб печериць. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук по спеціальності 03.00.16 - екологія. Kиївський національний університет імені Тараса Шевченка, Kиїв, 2000.
В роботі подаються результати вивчення розповсюдженності та шкодочинності вірусів печериць в умовах довкілля та виробництва. Показана нерівномірність розповсюдження патогенів в регіонах Полісся, Лісостепу, а також Ботанічних садах України, біотехнологічних центрах. При цьому в дослідах враховували деструкцію органел клітин та зміни в габітусі рослин, які були експериментально інфіковані паличкоподібним вірусом печериць.
Досліджено основні властивості вірусів, які інфікують печерицю двоспорову (Agaricus bisporus ((J. Lge) Imbach). Показано, що у виробничих умовах на різних середовищах як міцелій, так і плодові тіла грибів контаміновані вірусами: паличкоподібної, ізометричної та бацилоподібної морфології. В умовах біоценозів та штучних екосистем вивчено поширення паличкоподібного патогену, який мав певну серологічну спорідненість з вірусом тютюнової мозаїки (ВТМ).
Розроблена система відбору здорового посівного матеріалу грибів, яка включає ступеневий вірусологічний контроль всього біотехнологічного циклу їх вирощування. Використовуючи діагностику вірусів по методу Ухтерлоні, ІФА, електронномікроскопічний та інші методи, вивчена локалізація патогенів в грибах, посівному матеріалі, грунті, фекаліях тварин. Показано, що вірусні хвороби печериць знижують урожай плодових тіл грибів в 1,5 - 3 рази, а їх збудники викликають патологічні зміни міцелію та плодових тіл.
Вперше розроблено ключ-схему для оцінки посівного матеріалу та плодових тіл грибів, що ростуть в умовах природніх регіонів та вирощуються в штучних екосистемах з урахуванням симптомів хвороб, властивостей вірусів в динаміці росту та розвитку грибів. Вивчена стійкість до вірусних хвороб різних штамів печериць.
На основі властивостей збудників та їх циркуляції в екологічних нішах розроблений комплекс профілактичних заходів боротьби з вірусними інфекціями.
Kлючові слова: екологія, регіони, печериці, віруси, міцелій, циркуляція, діагностика, симптоми, рослини.
Бойко О.А. Экология вирусов и диагностика вирусных болезней шампиньонов. - Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.16. - экология. Kиевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Kиев, 2000.
В работе приводятся результаты исследования распространения и вредоносности вирусов шампиньонов в природных, а также производственных условиях. Показана неравномерность распространения патогенов в регионах Полесья, Лесостепи, Ботанических садах Украины, биотехнологических центрах. При этом в опытах учитывали деструкцию органел клеток и изменения габитуса растений, которые были экспериментально инфицированы палочкоподобным вирусом шампиньонов.
Исследованы основные свойства вирусов, инфицирующие шампиньон двуспоровый (Agaricus bisporus ((J. Lge) Imbach). Отмечено, что в производственных условиях на различных питательных средах как мицелий, так и плодовые тела грибов контаминированы вирусами: палочкоподобной, изометрической и бациллоподобной морфологии. В условиях биоценозов и искусственных экосистем изучено распространение палочкоподобного патогена, который имел определенное серологическое родство с вирусом табачной мозаики (ВТМ).
Разработана система отбора здорового посевного материала грибов, которая включает ступенчатый вирусологический контроль всего биотехнологического цикла их выращивания. При имунизации кроликов к очищенному палочкоподобному и изометрическому вирусам получены диагностические антисыворотки. Используя диагностику вирусов по методу Ухтерлони, ИФА, электронномикроскопические и другие методы, изучена локализация патогенов в грибах, посевном материале, почве, фекалиях животных. Исследовано, что вирусные болезни шампиньонов снижают урожай плодовых тел в 1,5 - 3 раза, а их возбудители вызывают значительные патологические изменения мицелия и плодовых тел. На плодовых телах, при инфицировании их вирусами, индуцируются симптомы водянистости, побурения, отставания в росте и развитии. Часто мицелий и плодовые тела шампиньонов были латентными носителями вирусов.
Впервые разработана ключ - схема для оценки посевного материала и плодовых тел грибов, которые растут в условиях природных регионов и которые выращивают в искусственных экосистемах с учетом симптомов болезни, свойств вирусов в динамике роста и развития грибов. При этом для определения вирусных болезней шампиньонов всегда учитывали внешние состояние посевного материала и плодовых тел грибов и наличие в них вирусов. Изучена устойчивость к вирусам различных штаммов шампиньонов.
На основе свойств возбудителей, их циркуляции в экологических нишах разработан комплекс профилактических мероприятий по борьбе с вирусными инфекциями.
Kлючевые слова: экология, регионы, шампиньоны, вирусы, мицелий, циркуляция, диагностика, симптомы, растения.
Boyko O.A. Ecology of viruses and diagnostics of true mushroom virus diseases. - Manuscript.
The candidates degree thesis in Biology for speciality 03.00.16 - Ecology. Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2000.
Data presented and discussed in the thesis are concerned to the spread and perniciousness of true mushroom viruses under natural and production conditions. It is shown that these pathogenes are irregularly distributed among marshy scrub and partially-wooded steppe regions as well in botanical gardens and biothechnological centres of Ukraine. The viral diseases cause reducing a yield of mushrooms by several times, at that there are considerable pathological changes in the micelium and fruit bodies.
Various methods were used for identifying and researching pathogenes, namely: Uhterloni diagnostics, IFA - tests, electron microscopy, etc. It was found that true mushroom viruses are represented with 3 forms: globular, bacillar and rod-like. The latter is more widely distributed and has some serological similarity to the tobacco mosaic virus. Ways of the virus circulation within a biocenosis were traced.
The system for selecting a healthy planting micelium has been developed. It includes the method of step-by-step control over the whole biotechnology of true mushroom growing. Several strains of Agaricus bisporus were investigated concerning their resistance to the virus invasion.
Key words: true mushroom, viruses, diagnostics, spreading, perniciousness, ecology, circulation.