Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Целью работы является определение последовательности и аннотация природной плазмиды E Coli , содержащую оперон микроцина Б.
Микроцин б- пептидный антибиотик, ингибирующий ДНК-гиразу(Этот фермент обеспечивает раскручивание суперспиралей ДНК, необходимое для ее репликации.) прокариот. Природный штамм E Coli, продуцирующий микроцин б , был выделен в конце 70х годов. В этом штамме была обнаружена плазмида длиной более 70 т. п .н ., содержащая микроциновый оперон(функциональная единица генома у прокариот, в состав которой входят цистроны (гены, единицы транскрипции), кодирующие совместно или последовательно работающие белки и объединенные под одним (или несколькими) промоторами.), состоящий из 7 генов (mcbABCDEFG). Для дальнейшего изучения именно этот оперон микроцина б и был клонирован в небольшой вектор (молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке.) , а исходная плазмида(небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы, но изредка плазмиды встречаются также у архей и эукариот.В природе плазмиды обычно содержат гены, повышающие устойчивость бактерии к неблагоприятным внешним факторам (в т. ч. устойчивость к антибиотикам), нередко они могут передаваться от одной бактерии к другой (иногда даже к бактерии другого вида) и, таким образом, служат средством горизонтального переноса генов.) была забыта. Биосинтез и механизм действия микроцина б изучены достаточно хорошо, чего нельзя сказать о его происхождении. Анализ последовательности позволит пролить свет как на происхождение самой плазмиды, так и микроцинового оперона.
Экспериментальная часть
Задача- отсеквенировать плазмиду Ps2 длиной более 70кб. Фрагменты( двумя наборами рестриктаз EcoRI-HindIII, EcoR1-BamHI-BgIII), лигировать с вектором pBlueScript ( по липким концам, так эффективнее) с образованием небольших плазмид.
Плазмиды нужно трансформировать в компетентные клетки(Бактерия, находящаяся в таком физиологическом состоянии, когда она может воспринимать экзогенные молекулы ДНК, т.е. быть рецепиентом ДНК при трансформации; К.к. широко используются в генной инженерии в качестве рецепиентов векторных плазмид ). Трансформированные клетки вырастали на чашке с ампициллином (pBlueScript несет ген устойчивости к ампициллину), при этом клетки, содержащие вставку в плазмиде были белого цвета, а клетки, не получившие вставки, были синими ( на чашке присутствовал IPTG – индуктор лак-оперона , и X-gal- аналог лактазы, который при расщеплении образует вещество синего цвета. Система работает из-за присутствия в векторе гена бета-галоктозидазы, который имел место для вставки фрагмента в середине гена)
Чтобы проверить наличие и длину вставки в колонии, ставили ПЦР с праймерами на концах вставки. Праймеры (искусственно синтезированные олигонуклеотиды, комплиментарные соответствующим участкам ДНК-мишени..)называются m13F и m13R. В случае,если вставка была длиннее 1000 нк, отПЦРеныый фрагмент очищали от примесей с помощью колонки с силикой. Таким образом было очищено около 50 пцр фрагментов различной длины. Эти фрагменты и были отправлены на сиквенс.
Другим способом получения сиквенсов со вставок было выделение целых плазмид из ночной культуры клеток ( ночная культура – это сколотая единичная белая колония, растворенная в жидкой питательной среде). За ночь клетки нарастают до миллиарда штук, таким образом, в каждой пробирке мы имеем миллиарды копий одинаковых плазмид со вставкой. Плазмиды из клеток выделяли с помощью колонки с силикой. Плазмиды, содержащие вставку, были отправлены на секвенирование. Итого- 40 пцр фрагментов и 40 плазмид, все пцр фрагменты были прочитаны с двух сторон, все плазмиды-только с одной( с forward стороны), всего 120 сиквенсов.
Биоинформатическая часть
Было получено 120 сэнгеровских сиквенсов
С помощью программы Chromas мы могли оценить качество сиквенса ( не смесь ли это – по пикам)
С помощью программы SeqMan были получены 23 контига средней длиной 1000 нк
С помощью программы Вlast ORFfinder были найдены открытые рамки считывания ( ORF open reading frame), которые были отбластованы ( blastp метод по умолчанию)
Все эти ORFs в следующие функциональные группы белков:
|
Предсказанные белки |
34.62% |
|
Другие белки |
26,92 % |
|
колицины |
13,46% |
|
Транспозоны |
11, 54% |
|
Микроцин б |
7,69 |
|
репликация |
5,77% |
Биоинформатическая часть 1 Illumina MiSeq секвенирование
На секвенирование нового была отправлена целая плазмида pS2.
Ее расщепили ультрозвуком на фрагменты длиной около 500 нк( нормальное распределение длин с максимумом в 500 нк), этот максимум вырезали из геля и очистили. Далее запустили прибор, который с двух сторон читал фрагменты. Весь процесс запуска и форматирования данных занял 48 часов
После чего с помощью программы CLC Genomics Databench данные с Illumina были собраны в несколько групп контигов:
|
count |
Average length |
Total bases |
|
|
Matched |
329683 |
250 |
82420750 |
|
Not matched |
36129 |
250 |
9032250 |
|
Contings |
9661 |
557 |
5385259 |
|
Reads in pairs |
300496 |
27646 |
|
|
Broken paired reads |
29187 |
250 |
Параметры, которые мы меняли – быстрая/медленная сборка и минимальная длина контига. После нескольких пробных сборок мы выбрали ту, из которой потом выбрали 6 контигов ( 5 , собравшихся с SeqMan в один контиг, и 1 – хромосомная ДНК, содержавшая 16S Ррнк)
Контиг прогнали в Blast ORF finder ,найденные ORFs классифицировали по белковым семействам.