Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
37
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА
ГРИНЕНКО Тетяна Вікторівна
УДК 577.151.4
РЕГУЛЯЦІЯ ФІБРИНОЛІЗУ НЕКАТАЛІТИЧНИМИ
ДІЛЯНКАМИ МОЛЕКУЛ ПЛАЗМІНОГЕНУ/ПЛАЗМІНУ
03.00.04 –біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Науковий консультант –доктор біологічних наук, професор
КУДІНОВ Станіслав Олександрович,
завідувач відділу хімії та біохімії ферментів
Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
КОЗЛОВ Едуард Андрійович,
старший науковий співробітник відділу
біохімічної генетики Інституту молекулярної біології
і генетики НАН України;
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
ЛІСНЯК Іван Олексійович,
провідний науковий співробітник відділу клітинної
фотобіології та фотомодуляції пухлинного росту
Інституту експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України;
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
ЛУГОВСЬКОЙ Едуард Віталійович,
головний науковий співробітник відділу молекулярної
імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна
НАН України.
Захист відбудеться 24 грудня 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої
вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України
(01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).
Автореферат розісланий 22 листопада 2007 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.
Актуальність проблеми. Дослідження складнопідпорядкованих багатокомпонентних ферментних систем організму, таких як зсідаюча та фібринолітична системи крові, є однією з важливих проблем сучасної біохімії.
Між системами зсідання крові та фібринолізу існує динамічна рівновага, порушення якої приводить до тромбоутворення або геморагій, наслідком чого є серцево-судинні захворювання різного ступеня складності. Вивчення багатьох механізмів, що забезпечують васкулярний кровоток, а в разі необхідності –зупинку кровотечі, є необхідною умовою розуміння закономірностей виникнення різних захворювань та розробки стратегії їх лікування.
Дослідження біохімічних механізмів функціонування цих систем має важливе теоретичне значення для вирішення проблем ензимології та білкової хімії, а саме: міжмолекулярного розпізнавання та комплексоутворення молекул, взаємозв’язку між структурою та функцією білка, селективності дії, багатофункціональності та регуляції активності ферментів.
Фібринолітична система забезпечує рідинний стан крові та розчинення фібринових згустків. До ії складу входять проферменти, ферменти, активатори, інгібітори та модуляторні білки. Ключовим ферментом є плазмін, який виконує фібринолітичну функцію. В плазмі крові він циркулює як неактивний попередник плазміноген.
Для плазмін(оген)у характерна мультидоменна структурна організація. В кринглових доменах, що розташовані в некаталітичній частині молекули, містяться специфічні центри міжбілкових взаємодій, які можуть відігравати важливу роль в функціонуванні та регуляції активності плазмін(оген)у.
Механізм селективності руйнування фібрину плазміном в плазмі крові, який обгрунтовано Wiman, Collen ще в 1978 р., і сьогодні є загальноприйнятим. Він базується на активації плазміногену на поверхні фібрину, дії плазміну в межах фібринового згустка та інгібуванні вільного плазміну б-антиплазміном.
Процес фібринолізу складається з послідовних етапів: взаємодії плазміногену та тканинного активатора з фібрином, активації плазміногену до плазміну на поверхні фібрину, гідролізу фібрину до розчинних фрагментів, інгібування плазміну, що вивільняється у кровоток, б-антиплазміном.
Фізіологічний фібриноліз контролюється численними взаємодіями між окремими компонентами фібринолітичної системи.
Вирішальне значення білок-білкових взаємодій для фібринолітичного процесу ставить важливу в теоретичному і практичному плані проблему визначення функціональної ролі окремих структур білкових молекул фібринолітичної системи, насамперед плазміногену/плазміну, в механізмах комплексоутворення і регуляції багатостадійного процесу фібринолізу.
Плазмін, крім своєї основної функції –гідролізу фібрину, приймає участь у багатьох фізіологічних та патологічних процесах в організмі: міграції клітин, диференціації та ремоделюванні тканин, інвазії та метастазуванні. Багатофункціональність плазміну потребує з’ясування молекулярних механізмів, що регулюють його активність при взаємодії з іншими білками.
Незважаючи на досягнуті успіхи у вивченні механізму фібринолізу, залишаються не з’ясованими важливі питання щодо експонування та ролі комплементарних центрів взаємодії плазміногену/плазміну з фібриногеном/ фібрином під час гідролізу, залежність таких взаємодій від конформації молекул, участі певних ділянок зв’язування молекул плазміногену/плазміну на окремих етапах фібринолітичного процесу, зміни активності плазміну та можливості контактної активації плазміногену в комплексі з іншими білками. Вирішення цих питань є необхідною умовою розуміння як механізмів регуляції фібринолізу, так і загальних принципів регуляції активності протеолітичних ферментів на рівні білок-білкових взаємодій. Визначення ділянок молекул, що є важливими для їх функціонування, відкриває можливості активно впливати на опосередковані ними процеси.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділах хімії та біохімії ферментів і структури та функції білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України по ДНТП „Біохімія тварин і людини”(шифр 2.28.4) за бюджетними темами: „Дослідження білок-білкових взаємодій компонентів фібринолітичної системи” (1983-1987 рр.), ДР № 01830064150; „Дослідження молекулярного механізму дії та регуляції фібринолітичної системи” (1988-1992 рр.), ДР № 01880076299; „Вивчення механізму регуляції фібринолітичного процесу на етапі утворення фрагментів молекул та їх комплексів” (1993-1996 рр.), ДР № 01930012959; „Вивчення структурної організації та функції тромбоцитарного інтегрину GPIIbIIIa та інших білків системи гемостазу” (1995-1997 рр.), ДР № 0195U002946; „Вивчення механізму активації ключових проферментів системи фібринолізу та гемостазу активаторами непрямої дії” (1998-2000 рр.), ДР № 0198U00345; „Вивчення молекулярних механізмів регуляції активації проферментів систем зсідання крові та фібринолізу в нормі та при патології” (2001-2003 рр.), ДР № 0101U000103; „Вивчення механізму активації плазміногену низькомолекулярною стрептокіназою та ролі фібрину у забезпеченні цього процесу” (2002-2004 рр.), ДР № 0102U000626 і „Вивчення механізмів регуляції та взаємодії компонентів системи зсідання крові та фібринолізу з судинно-тромбоцитарною ланкою системи гемостазу” (2004-2008 рр.), ДР № 0104U003276. У всіх зазначених темах здобувач приймав участь як відповідальний виконавець.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з’ясування механізмів регуляції фібринолітичного процесу на рівні білок-білкових взаємодій за участі некаталітичних ділянок молекули плазміногену/плазміну.
Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні задачі:
– дослідити взаємодію плазміногену з фібриногеном, фібрином та їх фрагментами, визначити доменну локалізацію плазміноген-зв’язувальних ділянкок на молекулі фібриногену/фібрину;
– визначити роль ліганд-зв’язувальних ділянок плазміногену/плазміну в регуляції швидкості гідролізу фібриногену/фібрину, активації плазміногену та інгібуванні плазміну;
– з’ясувати можливість контактної активації нативної форми плазміногену в комплексі з фрагментом Е фібриногену;
–визначити регуляторну дію б-антиплазміну у фібринолізі;
–з’ясувати механізм зміни активності плазміну в комплексі з активаторами непрямої дії;
Об’єкт дослідження. Фібринолітична система плазми крові та процес фібринолізу.
Предмет дослідження. Молекулярні механізми комплексоутворення білків фібринолітичної системи в регуляції процесу фібринолізу.
Наукова новизна отриманих результатів. В результаті проведених досліджень визначено функціональну роль некаталітичних ділянок певних доменів молекули плазміногену/плазміну на всіх етапах процесу фібринолізу. Установлено, що вони забезпечують взаємодію плазміногену/плазміну з фібриногеном/фібрином, визначають швидкість процесів руйнування фібринового згустка плазміном, активації плазміногену та інгібування плазміну.
Вперше визначено доменну локалізацію та відповідність центрів комплексоутворення молекул плазміногену/плазміну та фібриногену/ фібрину.
Вперше обгрунтовано та доведено, що швидкість гідролізу фібрину плазміном визначається послідовністю взаємодій молекул ферменту та субстрату за участі комплементарних центрів. Ключовими етапами гідролізу є полімеризація фібрину, що забезпечує ініціацію процесу, та початкові стадії, на яких відбувається підвищення швидкості гідролізу.
Під час полімеризації в D доменах молекул фібрину експонуються центри взаємодії з кринглом 5 плазміногену. Глу-плазміноген, зв’язуючись з ними, переходить у частково відкриту конформацію, що обумовлює його активацію тканинним активатором і початок гідролізу.
На стадії розщеплення С-доменів фібрину на них утворюються нові центри взаємодії з кринглом 4. Глу-плазміноген, зв’язуючись з ними, переходить у повністю відкриту конформацію, що забезпечує його взаємодію кринглом 1-3 з відповідними центрами молекул фібрину тієї самої або суміжних протофібрил. При цьому новоутворені центри вивільняються для наступних молекул. В такий спосіб в місцях первинного зв’язування плазміногену на фібрині за утворення обмеженої кількості нових центрів відбувається підвищення локальної концентрації плазміногену, що приводить до збільшення швидкості його активації та швидкості гідролізу фібрину.
Сформульовано положення, що взаємодія ділянок зв’язування різної спорідненості молекул плазміну з відповідними центрами молекул субстрату забезпечує переміщення ферменту по DDE-тріадам протофібрил та орієнтацію активного центра на гідроліз неупорядкованих ділянок в суперспіралізованій міждоменній частині молекул фібрину, внаслідок чого розщеплення протофібрил є строго спрямованим процесом.
Вперше показано існування неферментативного шляху активації Глу-плазміногену Е-фрагментом фібриногену. Плазмін в комплексі з Е-фрагментом інгібується б-антиплазміном, тому наслідком активації може бути зменшення локальної концентрації потенційно активного плазміногену в кров’яному згустку.
Установлено багатоцентрову взаємодію б-антиплазміну з лізин-зв’язувальними ділянками кринглових доменів та протеїназним доменом плазміну, що забезпечує ефективність дії інгібітора. Вперше доведено, що б-антиплазмін є регулятором фібринолітичного процесу, він контролює швидкість гідролізу полімерного фібрину на стадії активації плазміногену тканинним активатором.
Вперше показано, що лізин-зв’язувальні ділянки кринглових доменів плазміногену приймають участь у всіх етапах активації плазміногену стрептокіназою: утворенні еквімолярного комплексу, формуванні активного центра, взаємодії активаторного комплексу з субстратним плазміногеном.
Обґрунтовано, що в основі регуляції функціональної активності плазміногену/плазміну за участі ліганд-зв’язувальних ділянок кринглових доменів лежать тонкі структурні відмінності між окремими центрами зв’язування, багатоцентровість взаємодій, злагоджена одночасна дія декількох центрів зв’язування, конформаційна мінливість молекули та можливість переключення внутрішньомолекулярних взаємодій на міжмолекулярні.
Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати щодо конкретизації ділянок молекул плазміногену та фібрину, які мають провідне значення для активації фібринолітичної системи та руйнування згустків фібрину, є передумовою пошуку нових підходів для регуляції процесу фібринолізу та інших процесів, пов’язаних з перетворенням плазміногену на плазмін.
Виявлені особливості низькомолекулярної стрептокінази, а саме: ефективність активації асоційованого з фібрином плазміногену, низька активаторна активність у розчині та відсутність протекторної дії за інгібування плазміну -антиплазіном, що поясняють фібрин-селективну дію низькомолекулярної стрептокінази, можуть бути теоретичним обґрунтуванням для розробки нового ефективного тромболітичного препарату направленої дії на основі стрептокінази.
Запропоновано способи кількісного визначення в плазмі крові основних компонентів фібринолітичної системи: плазміногену, тканинного активатора плазміногену, б-антиплазміну, а також антистрептокіназних антитіл, що базуються на використанні фізіологічного субстрату плазміну –фібрину і можуть бути використані в медичній практиці для характеристики загального фібринолітичного потенціалу, контролю за ефективністю тромболітичної терапії, визначення функціонально активних білків та виявлення низькомолекулярних похідних плазміногену/плазміну.
Запропоновано афіннохроматографічний метод виділення б-антиплазміну, який запатентовано.
Отримані автором результати досліджень використано в курсі лекцій з дисципліни „Функціональні властивості білків” навчальної програми кафедри біохімії, філіал –біотехнологія біологічного факультету Київського університету ім. Тараса Шевченка.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота –завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1983-2007 рр. Дисертантом особисто обгрунтовано основну проблему та завдання роботи, розроблено методологію експериментальних досліджень, проведено пошук та аналіз даних літератури. Самостійно синтезовано афінні сорбенти, одержано всі необхідні для дослідження білки та їх фрагменти. Більшість досліджень, результати яких представлено в експериментальній частині роботи, виконані автором особисто. Дослідження взаємодії плазміногену з фрагментами фібриногену проведено за співучасті з інж. В.Г. Третяченко. Вивчення швидкості гідролізу фібриногену плазміном та фібрину плазміногеном, активованим тканинним активатором, виконано разом з інж. Е.М. Золотарьовою та пров. інж. О.В. Скоморовською. Вивчення впливу б-антиплазміну на активацію плазміногену тканинним активатором та взаємодію інгібітора з фрагментами фібриногену проведено за співпраці з м.н.с. М.Б. Задорожньою. Кінетику активації плазміногену та його похідних стрептокіназою досліджено за співучасті з м.н.с. Л.І. Соколовською. Дослідження протекторної дії стрептокінази та розробку способу визначення антистрептокіназних антитіл в плазмі крові проведено у співпраці з н.с. О.І. Юсовою. Основні теоретичні положення, що виносяться на захист, висунуто та обгрунтовано дисертантом особисто.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень дисертації були представлені на науковому семінарі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (2005 р.), V Українському біохімічному з’їзді (Івано-Франківськ, 1987 р.), VІ Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1992 р.), VІІІ Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002 р.), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 р.), ІV Всесоюзному симпозіумі „Инженерная энзимология” (Київ, 1983 р.), ІІІ симпозіумі „Химия протеолитических ферментов” (Москва, 1993 р.), IV симпозіумі СРСР-Італія „Макромолекулы в функционирующей клетке” (Київ, 1984 р.), XVth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Єрусалим, Ізраїль, 1995 р.), XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (Хамамацу, Японія, 2000 р.), міжнародному симпозіумі „Гемостаз –проблеми та перспективи” (Київ, 2002 р.), second Product biotechnology meeting (Курасао, Антильські острови, Нідерланди, 2003 р.), першій Українській конференції „Тромбози в клінічній практиці: профілактика, діагностика, лікування” (Київ, 2004), науково-практичній конференції „Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (Чернівці, 2005 р.), 18th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis (Сан-Дієго, США, 2006 р.), XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Женева, Швейцарія, 2007 р.).
Публікації. За результатами дисертаційної роботи опубліковано 45 друкованих праць, в тому числі 31 стаття, з яких 26 у наукових фахових виданнях, 1 патент та 13 тез у збірках наукових конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, основної частини, що включає огляд літератури, експериментальну частину (2 розділи), заключення, висновків, списку використаних літературних джерел (508 найменувань). Роботу викладено на 307 сторінках друкованого тексту, проілюстровано 94 рисунками, 14 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено сучасні дані про структурну організацію та функціональні властивості основних компонентів фібринолітичної системи, а саме: плазміногену, плазміну; ендогенних та екзогенних активаторів –тканинного активатора, урокінази та стрептокінази; інгібітора плазміну –б-антиплазміну. Особливої уваги приділено структурі, специфічності та функціональній ролі ліганд-зв’язувальних ділянок кринглових доменів плазміногену, конформаційним перебудовам молекули проферменту. Узагальнено дані про роль фібрину у фібринолітичному процесі, білок-білкові взаємодії в механізмах ініціації та регуляції фібринолізу.
Матеріали та методи досліджень. Glu-плазміноген та Ліз-плазміноген виділяли відповідно з плазми крові донорів і фракції ІІІ,3 по Кону шляхом афінної хроматографії на лізин-сефарозі 4В (Deutch, Mertz, 1970).
Фрагменти плазміногену –крингл 1-3, крингл 4 і міні-плазміноген одержували з еластазного (Sottrup-Jensen et al., 1978), тоді як мікро-плазміноген –з плазмінового (Shi, Wu, 1988) гідролізатів Ліз-плазміногену.
Плазмін, міні- та мікро-плазмін одержували за активації Глу-плазміногену, міні- та мікро-плазміногену урокіназою, що була іммобілізована на сефарозі 4В (Norman et al., 1985).
Фібриноген виділяли з оксалатної плазми крові бика шляхом фракційного висолювання сульфатом натрію (Варецька та ін., 1961).
ДезААВВ фібрин одержували, обробляючи фібриноген тромбіном (Pozdnjakova et al., 1979) та розчиняючи утворені фібринові згустки в 0,02 М оцтовій кислоті. Для інактивації фактора XIIIа та видалення плазміногену процедуру проводили за присутності пара-хлормеркурійбензоату натрію (п-ХМБ) та 6-аміногексанової кислоти (6-АГК).
Фрагменти фібриногену, DH- та Е-фрагменти отримували з плазмінового гідролізату фібриногену на КМ-сефадексі G-50 (Белицер, 1972). DL-фрагмент –пепсиновим гідролізом DH-фрагмента (Medved, 1988 ). DLа-фрагмент –плазміновим гідролізом фібриногену в присутності фізіологічної концентрації іонів кальцію (Medved, 1986). D-D –з плазмінового гідролізату стабілізованого фактором ХІІІа фібрину шляхом гель-фільтрації на сефакрилі S-300 з послідуючою доочисткою на КМ-сефадексі G-50 (Белицер и др. 1986).
б-Антиплазмін одержували з виснаженої на плазміноген та гістидин-збагачений білок плазми крові донорів на кринглі 1-3 (форма ІІ)-сефарозі.
Стрептокіназу (Kabikinase, Швеція) очищали від альбуміну на цибакрон-сефарозі CL-6B (Castellino et al., 1976).
Фрагмент стрептокінази з молекулярною масою 36 кДа виділяли препаративним електрофорезом з б-хімотрипсинового гідролізату стрептокінази (Корольчук, 2000).
Моноклональне антитіло IV-1c до Глу-плазміногену людини виділяли з супернатантів гібридомних клітин, одержаних у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, на плазміноген-сефарозі.
Антистрептокіназні антитіла одержували із сироватки крові людей, які пройшли курс лікування стрептокіназою, на протеїн-А сефарозі з подальшою доочисткою на стрептокіназ-сефарозі.
Протеолітичну активність плазміну і потенційну –плазміногену визначали казеїнолітичним методом (Robbins, Summaria, 1979) та за кількістю аміногруп, що вивільняються протягом гідролізу казеїну (Кастрикіна та ін., 1981).
Амідазну активність плазміну визначали з використанням хромогенного субстрату S2251 (H-D-Val-L-Leu-L-Lys-p-нітроаніліну гідрохлорид) за методом виробника (Kabi Diagnostica).
Фібриногенолітичну активність плазміну визначали за кількістю продуктів гідролізу фібриногену, що втрачали здатність утворювати фібриновий згусток.
Гідроліз фібрину визначали турбідиметричним методом (Bouvier, 1975) та методом фібринових пластин (Haverkate, 1975).
Швидкість гідролізу І-фібриногену визначали за кількістю утворених фрагментів, вимірюючи радіактивінсть відповідних їм електрофоретичних зон.
Інгібіторну активність б-2-антиплазміну визначали за здатністю гальмувати амідолітичну активність плазміну.
Кінетику інгібування плазміну та його похідних б-антиплазміном, активацію Glu-плазміногену тканинним активатором та стрептокіназою вивчали з використанням специфічного хромогенного субстрату плазміну S2251.
Взаємодію білків досліджували декількома способами: зв’язування Глу- та Ліз-плазміногену з фібриногеном та його фрагментами, іммобілізованими на сефарозі 4В, –методом рівноважної афінної сорбції; плазміногену з фібрином, –визначаючи кількість білка, що специфічно зв’язується з фібриновим згустком під час його утворення; мічених біотином б-антиплазміну з плазміном, тканинним активатором плазміногену, фрагментами плазміногену та фібриногену/фібрину, а також стрептокінази з плазміном і фрагментами плазміногену та плазміногену з фібриновими плівками, утвореними з desAABB мономерного фібрину, –з використанням принципу імуноферментного аналізу та авідин-біотинової реакції.
Вестерн-блот аналіз плазмін-стрептокіназного комплексу здійснювали згідно із стандартним протоколом (Burnett, 1981).
Фермент-зв’язаний імуносорбційний аналіз (ELISA) використовували для визначення титру антистрептокіназних антитіл в сироватці крові людини та спорідненості одержаних антитіл до стрептокінази.
Мічення білків І та біотином відповідно здійснювали із застосуванням хлораміну-Т (McConahey, 1980) та сукцинімідобіотину (Gilting et al., 1987).
Іммобілізацію білків проводили на сефарозі 4В після її активації бромціаном (March, 1974).
Хімічну модифікацію гуанідинових та аміногруп груп залишків аргініну та лізину в білках проводили за допомогою циклогександіону (Trexler, 1982) та малеїнового ангідриду (Butler, 1969) відповідно.
Електрофорез у поліакриламідному гелі проводили за присутності ДС-Na для перевірки гомогенності отриманих білків (Laemli, 1970) та в системі сечовина/оцтова кислота за низьких значень рН –для визначення форми одержаного плазміногену (Panyim, Chalkley, 1969).
Математичну обробку результатів досліджень виконували за допомогою пакету ORIGIN 6.1. До роботи включено результати експериментів, допустима похибка яких не перевищувала 6 відсотків (р < 0,06). Криві, що представлені на рисунках, є типовими для серії повторних дослідів (щонайменше три в кожній серії).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Комплексоутворення Глу- і Ліз-форм плазміногену з фібриногеном/
фібрином. Нативною формою плазміногену, який циркулює у крові, є Глу-плазміноген, що містить глутамінову кислоту на N-кінці. Молекула складається з N-кінцевого пептиду, п’яти кринглових доменів та серин-протеїназного домену, в якому в процесі активації до плазміну формується активний центр. В кринглових доменах розташовані ліганд-зв’язувальні ділянки. Тонкі структурні відмінності, що існують між ними, обумовлюють різну спорідненість і специфічність окремих ділянок до низькомолекулярних лігандів –лізину та аргініну і їх аналогів, а також високоспецифічне розпізнавання різних макромолекул. Внутрішньомолекулярні взаємодії N-кінцевого пептиду з п’ятим кринглом та третього крингла з четвертим забезпечують закриту конформацію Глу-плазміногену у розчині.
Під час досліджень використано: нативний Глу- або частково гідролізований Ліз-плазміноген, у якого відсутній N-кінцевий пептид, як форми проферменту, що різняться за конформацією та здатністю до міжбілкових взаємодій; окремі фрагменти плазміногену з різним набором кринглових доменів –крингли 1-3, крингл 4, міні-плазміноген, що складається з серин-протеїназного домену та крингла 5, і мікро плазміноген, у якого відсутні всі кринглові домени; низькомолекулярні ліганди –аналог лізину 6-аміногексанову кислоту (6-АГК) та аргінін для блокування певних ділянок зв’язування. З використанням одержаних високоочищених білків: різних форм плазміногену, плазміну, фібриногену, фібрин-мономеру, тромбіну, тканинного активатора плазміногену, стрептокінази, -антиплазміну, ізольованих фрагментів цих білків розроблено системи, що моделюють певні стадії процесу фібринолізу за фізіологічних умов.
Взаємодія плазміногену з фібрином, по перше, є необхідною умовою активації проферменту і послідуючого лізису фібринового згустка, по-друге, визначає вибірковість руйнування фібрину плазміном in vivo. Зважаючи на суперечливість даних щодо взаємодії різних форм плазміногену з фібрин(оген)ом і кількості сорбованого білка та обмежені відомості про участь в цьому процесі окремих ліганд-зв’язувальних ділянок проферменту та локалізацію комплементарних центрів взаємодії з плазміногеном в молекулах фібриногену/фібрину, проведено детальне дослідження комплексоутворення Глу- і Ліз-форм плазміногену з фібриногеном, фібрин-мономером, полімерним фібрином, фрагментами фібриногену, що утворюються в процесі гідролізу, а також вплив обмеженого протеолізу фібрин(оген)у плазміном на зміну конформації та властивості обох форм проферменту.
Взаємодія Глу- та Ліз-плазміногену з фібриноген-сефарозою, фібрин-мономер-сефарозою та полімерним фібрином. Показано, що за еквімолярного співвідношення взаємодіючих білків Ліз-плазміноген специфічно сорбується на фібриноген-сефарозі, фібрин-мономер-сефарозі та полімерному фібрині в однаковій кількості –,5 молей на 1 моль білка. В усіх випадках специфічно сорбований білок елююється 0,1 М 6-АГК. Кd комплексу Ліз-плазміногену з фібриноген-сефарозою дорівнює 5,6 мкМ, один центр зв’язування плазміногену припадає на одну молекулу фібриногену. З усіх фрагментів плазміногену ізольований крингл 1-3 зв’язується з фібриноген-сефарозою, а розчинний фібриноген –з іммобілізованим кринглом 1-3. Отримані дані свідчать, що молекула фібриногену містить центр взаємодії з плазміногеном, комплементарний ділянкам зв’язування кринглів 1-3. Очевидно, цей центр зберігається при відщепленні фібринопептидів А і В та експонований в фібрин-мономерних одиницях полімерного фібрину.
На відміну від Ліз-плазміногену, Глу-плазміноген не зв’язується з фібриноген- або фібрин-мономер-сефарозою за використаних співвідношень 0,5-3,0 моля проферменту на 1 моль іммобілізованого білка. Це пояснюється закритою конформацією нативної форми проферменту та недоступністю ділянок зв’язування кринглів 1-3 для взаємодії з фібриногеном. Тому в кров’яному руслі Глу-плазміноген та фібриноген, незважаючи на їх високу концентрацію, циркулюють незалежно один від одного і утворення комплексу між ними не відбувається.
Разом з тим, Глу-плазміноген зв’язується з полімерним фібрином в кількості 0,05-0,065 молей на 1 моль фібрину, що майже на порядок нижче значень, отриманих для Ліз-плазміногену. Взаємодія Глу- і Ліз-плазміногену з фібрином характеризується різною чутливістю до 6-АГК. Кількість сорбованого Ліз-плазміногену зменшується на 50 % за концентрації 6-АГК 8 10-5 М, що насичує високоафінні ділянки зв’язування кринглів 1-3, тоді як Глу-плазміногену –в області мілімолярних концентрацій за насичення низькоафінних ділянок, розташованих в кринглах 4 або 5 проферменту (рис. 1). З’ясування участі окремих доменів Глу-плазміногену у взаємодії з фібрином показало, що за 10-50-разового молярного надлишку до проферменту ізольовані крингли 1-3 та 4 не впливають, тоді як міні-плазміноген більш ніж на 50 % знижує величину сорбції міченого біотином Глу-плазміногену на фібринових плівках (рис. 2).
Отже, в процесі полімеризації на фібрині експонуються центри взаємодії з плазміногеном, наймовірніше, комплементарні ділянці крингла 5. Вони забезпечують сорбцію нативної форми проферменту на фібрині. Оскільки крингл 5 контролює конформаційний стан Глу-плазміногену, профермент, зв’язуючись з фібрином, набуває конформації, яка забезпечує його активацію тканинним активатором і початок гідролізу.
На важливе значення крингла 5 у взаємодії нативної форми проферменту з фібрином та його активації вказують дані про те, що моноклональні антитіла до міні-плазміногену (Church, 1991) та тромбоспондин (Markus, 1996), який проявляє специфічну спорідненість до крингла 5, інгібують активацію Глу-плазміногену тканинним активатором на фібрині.
Виходячи з отриманих даних про кількість Глу-плазміногену, яка сорбується на фібрині, легко підрахувати, що на 20-30 фібрин-мономерних одиниць припадає один центр зв’язування Глу-плазміногену і тому за фізіологічної концентрації проферменту та фібриногену з фібриновим
згустком, який утворюється, зв’язується не більш ніж 1/10 кількості нативної форми плазміногену, що міститься в плазмі.
Взаємодія Глу- та Ліз-плазміногену з фрагментами фібриногену, які послідовно утворюються в процесі гідролізу плазміном. Складність процесу фібрин(оген)олізу передбачає експонування на різних його етапах нових центрів взаємодії з плазміногеном. На таку можливість вказують отримані нами дані про те, що внаслідок обмеженого протеолізу іммобілізованого на сефарозі фібриногену плазміном, за умов утворення Х-фрагмента, фібриноген набуває здатності взаємодіяти з Глу-плазміногеном, за більш глибокого гідролізу –до появи в розчині D-фрагмента, підвищується сорбційна емкість фібриноген-сефарози до Ліз-плазміногену.
Для визначення доменної локалізації плазміноген-зв’язувальних центрів молекул фібриногену/фібрину і виявлення етапів гідролізу, що приводять до експонування нових центрів, досліджували взаємодію Глу- і Ліз-плазміногену з фрагментами, що послідовно утворюються під час протеолізу фібриногену або непрошитого фібрину: Х, У, DH та Е.
Ліз-плазміноген специфічно зв’язується з переліченими фрагментами, іммобілізованими на BrCN-сефарозі, але в різній кількості і з різних афінних сорбентів елююється розчином 6-АГК або аргініну (рис. 3 А). Кількість Ліз-плазміногену, що сорбується на Х та Е-фрагментах, є однаковою і співпадає з величиною зв’язування на фібриногені. З цих сорбентів профермент повністю елююється 0,1 М 6-АГК. В найбільшій кількості профермент зв’язується з У-фрагмент-сефарозою і частково елююється 0,1 М 6-АГК, повна десорбція білка спостерігається за послідуючого використання 0,1 М аргініну. У-фрагмент складається з центрального Е- та одного з периферичних D-доменів. Ліз-плазміноген, сорбований на DH-фрагмент-сефарозі, стійкий до дії високих концентрацій 6-АГК і елююється 0,1 М аргініном. Взаємодія проферменту з DH-фрагментом має місце в присутності 0,1 М 6-АГК за умов насичення всіх ліганд-зв’язувальних ділянок кринглових доменів. В плазміногені тільки одна ділянка, що міститься в серин-протеїназному домені, проявляє вузьку специфічність до бічних радикалів аргініну в білках та лігандів з позитивно зарядженою гуанідиновою групою. Очевидно, саме вона відповідає за взаємодію Ліз-плазміногену з DH-фрагментом.
За подальшого протеолізу DH-фрагмента за певних умов плазміном або іншими гідролітичними ферментами відщеплюються С-кінцеві ділянки -ланцюга або -ланцюга і утворюються DL- та DLa-фрагменти відповідно, що супроводжується конформаційними змінами у просторовій орієнтації доменів, з яких складено D-фрагмент (Медведь, 1989).
Наші дослідження взаємодії Ліз-плазміногену з DL- та DLa-фрагментами виявили, що профермент зв’язується з кожним з цих сорбентів і, на відміну від DH-фрагменту, повністю елююється 6-АГК. Очевидно, в результаті структурних перебудов, які мають місце при переході DH-фрагмента до низькомолекулярних фрагментів, експонуються або з’являються центри взаємодії з плазміногеном відповідні одній з лізин-зв’язувальних ділянок. На можливість локалізації центра в суперспіралізованій області DH-фрагмента вказують існуючі дані про те, що Ліз-плазміноген та крингл 1-3 зв’язуються з високою спорідненістю з ізольованим фрагментом, що відповідає цій області (Lezhen, 1986).
Отримані результати про взаємодію Ліз-плазміногену з фібриногеном та його фрагментами свідчать, що в фібриногені центри зв’язування плазміногену локалізовано в центральному Е та периферічних D доменах. Розташовані в D доменах центри є скритими, вони експонуються під час гідролізу фібриногену –при утворенні У-фрагмента та низькомолекулярних D-фрагментів.
Дані дослідженнь комплексоутворення Глу-плазміногену з іммобілізованими фрагментами фібриногену представлені на рис. 3 Б. Як зазначалось вище, внаслідок закритої конформації нативна форма плазміногену не взаємодіє з фібриногеном. Разом з тим, Глу-плазміноген специфічно зв’язується з ранніми та пізніми продуктами гідролізу фібриногену –Х- та Е-фрагментами в однаковій кількості, величина якої близька до кількості сорбованого на цих фрагментах Ліз-плазміногену. Дані концентраційної залежності сорбованого Глу-плазміногену від нанесеного на колонку з Е-фрагмент-сефарозою, представлені в координатах Скетчарда, показали, що подібно до Ліз-плазміногену, взаємодія відбувається за участі двох типів центрів Глу-плазміногену –з високою та низькою спорідненістю до Е-фрагменту, з Кd відповідно 1,8∙10-6 та 7,5∙10-5 М. Близькі значеннями Кd свідчать, що комплексоутворення обох форм проферменту з Е-фрагментом відбувається за участі однакових ділянок зв’язування. Отримані дані показали, що при взаємодії Глу-плазміногену з фрагментами, які утворюються в процесі гідролізу фібриногену, його конформація може змінюватись на Ліз-плазміноген подібну.
Глу-плазміноген, на відміну від Ліз-плазміногену, не взаємодіє з DH-фрагментом і зв’язується з DL-фрагментом в невеликій кількості –,04-0,05 молей на моль фрагмента з низькою спорідненістю, Кd дорівнює 20 мкМ. Відсутність взаємодії Глу-плазміногену з DH-фрагментом можна пояснити тим, що в молекулі Глу-плазміногену, структура якого має форму кільця спіралі, N-кінцева ділянка поліпептидного ланцюга, що містить перші три кринглові домени, перекриває частину поверхні серин-протеїназного домену, в якій, очевидно, розташована ліганд-зв’язувальна ділянка, що забезпечує взаємодію Ліз-плазміногену.
Кількісні параметри взаємодії Глу-плазміногену з DL-фрагментом відрізняються від таких Ліз-плазміногену і подібні до значень, що характеризують взаємодію Глу-плазміногену з фібрином. Для того щоб з’ясувати, яка з низькоафінних ділянок плазміногену здатна взаємодіяти з DL-фрагментом, досліджували зв’язування з ним крингла 4 та міні-плазміногену. Крингл 4 не взаємодіє, тоді як міні-плазміноген специфічно зв’язується з DL-фрагментом, сорбований білок не чутливий до дії низьких концентрацій 6-АГК, але може бути елюйований з колонки розчином 0,1 М 6-АГК або 0,1 М аргініну. Отримані дані показують, що взаємодія Глу-плазміногену з DL-фрагментом, як і з фібрином, може відбуватись за участі ліганд-зв’язувальної ділянки п’ятого крингла.
Дослідження процесу активації плазміногену тканинним активатором на фібрині та фрагментах бромціанового розщеплення фібриногену дозволили установити, що послідовність 148-160 А-ланцюга, яка входить до суперспіральної частини D-фрагмента, відповідає за взаємодію з плазміногеном (Nieuwenhuizen, 2001). З використанням моноклональних антитіл доведено, що ця послідовність є закритою в молекулі фібриногену та DH-фрагменті, але експонована на фібрині (Schielen, 1991). Її експонування відбувається під час полімеризації фібрину на стадії латеральної асоціації протофібрил (Yang, 2000) або за фрагментації DH-фрагмента (Yakovlev, 2000).
Послідовність Аб 148-160 має незвичайне розміщення заряджених амінокислотних залишків:
148 160
Ліз-Арг-Лей-Глу- Вал-Асп-Лей-Асп-Лей-Ліз-Лей-Арг-Сер
+ + 0 – – – + 0 + 0 ,
де від’ємні та нейтральні амінокислоти чередуються між собою і розміщені між двома наборами позитивно заряджених амінокислот. Наявність в ній ділянки, до складу якої входять Асп 155, Ліз 157 та Арг 159, дозволяє пояснити взаємодію Глу- та Ліз-плазміногену з DL-фрагментом за участі різних ліганд-зв’язувальних ділянок. Бічні радикали лізину або аргініну можуть відповідати за взаємодію з АН- (або аргініл-) зв’язувальною ділянкою крингла 5, тоді як карбоксильна група аспарагінової кислоти та аміно- або гуанідинова група лізину або аргініну можуть утворювати електростатичну пару, яка відповідає за взаємодію з лізин-зв’язувальною ділянкою кринглів 1-3.
На підставі наведених літературних даних та отриманих нами результатів про відсутність взаємодії між Глу-плазміногеном і фібриногеном, здатність нативної форми проферменту зв’язуватись з полімерним фібрином, малу і майже однакову кількість Глу-плазміногену, що сорбується на один моль фібрину та DL-фрагмента, інгібування комплексоутворення Глу-плазміногену з фібрином міні-плазміногеном та можливість останнього взаємодіяти з DL-фрагментом зроблено висновок, що первинний центр зв’язування Глу-плазміногену, який формується при переході розчинного фібриногену до полімерного фібрину, локалізовано в області D-домену.
Для з’ясування механізму, що спричинює на початкових стадіях гідролізу фібрину до значного збільшення кількості зв’язуваного з ним Глу-плазміногену, було проведено порівняльне дослідження взаємодії обох форм проферменту з частково гідролізованим фібрином, що утворювали з фібриногену, який попередньо обробляли плазміном. Умови обробки добирали таким чином, щоб під час гідролізу в молекулах фібриногену мало місце розщеплення лише бС доменів. Ступінь гідролізу визначали за кількістю продуктів деградації фібриногену, що залишались у розчині після утворення фібрину. Дані електрофорезу показали, що в отриманих препаратах desAABB фібрину з’являються Х-фрагменти, кількість яких збільшується з підвищенням концентрації плазміну. В усіх випадках зберігається твердо-фазна структура фібринових згустків.
Показано, що кількість сорбованого на частково гідролізованому фібрині Ліз-плазміногену є такою ж, як і на вихідному (рис. 4), і не залежить від ступеня гідролізу (рис. 5). Отже, поява С-кінцевих лізинів на початкових стадіях гідролізу фібрину не приводить до збільшення сорбції Ліз-плазміногену.
Тоді як зв’язування Глу-плазміногену з фібрином залежить від структурної цілістності складових молекул. За еквімолярного співвідношення взаємодіючих білків кількість сорбованого Глу-плазміногену на моль фібрину збільшується з 0,05 на вихідному до 0,5 молей на частково гідролізованому фібрині і досягає величини, характерної для Ліз-плазміногену (рис. 4). Для розуміння досліджуваного механізму важливе значення має виявлена експоненційна залежність кількості Глу-плазміногену, сорбованого на фібрині, від ступеня його гідролізу. Збільшення в декілька разів сорбції білка спостерігається за 0,35 % ступеня гідролізу. Максимальна кількість Глу-плазміногену зв’язується з фібрином за відщеплення 1-2 % молекулярної маси вихідного фібриногену і за умов експерименту далі не змінюється (рис. 5). Зважаючи на те, що бС-домени складають 25 % молекулярної маси фібриногену, можна стверджувати, що відсутність невеликих С-кінцевих пептидів в б-ланцюгах окремих фібрин-мономерних одиниць полімерного фібрину є достатньою умовою збільшення до максимального рівня кількості сорбованого на ньому Глу-плазміногену.
Зв’язування Глу-плазміногену з частково гідролізованим фібрином супроводжується зміною властивостей проферменту. Сорбція білка на такому фібрині, на відміну від нативного, пригнічується 6-АГК за концентрацій, що насичують високоафінні ліганд-зв’язувальні ділянки. Фрагмент плазміногену крингл 1-3 за 50-разового надлишку до Глу-плазміногену на 60 % інгібує сорбцію проферменту на частково гідролізованому фібрині, тоді як в разі нативного фібрину його вплив був відсутнім. Отже, за часткового гідролізу до взаємодії з фібрином залучаються високоафінні ділянки перших трьох кринглових доменів Глу-плазміногену, що свідчить про зміну його конформації.
Таким чином, можна зробити висновок, що на початкових етапах гідролізу фібриногену/фібрину при розщепленні А-ланцюга в молекулі з’являється новий центр взаємодії з плазміногеном, який контролює конформаційний стан проферменту. Зважаючи на появу С-кінцевих залишків лізину за гідролізу пептидних зв’язків плазміном, які найбільше відповідають лігандній специфічності ділянці крингла 4, і те, що цей крингл регулює конформаційні переходи молекули плазміногену, можна припустити, що новий центр, електростатичною складовою якого є заряджені групи С-кінцевого лізину, комплементарний ділянці, розташованій в четвертому крингловому домені плазміногену.
Висловлене припущення підтвердується наступними дослідженнями функціональних властивостей ізольованого крингла 4, які показали, що він не зв’язується з іммобілізованими Е- та D-фрагментами фібриногену, незважаючи не те, що лізин є С-кінцевим амінокислотним залишком -ланцюга в складі D-фрагмента та кожного з трьох ланцюгів обох субодиниць в складі Е-фрагмента. Крингл 4, як і Глу-плазміноген, не проявляє спорідненості до фібриноген-сефарози. Після пропускання через колонку з фібриноген-сефарозою розчину Ліз-плазміногену з слідовою спонтанною активністю або тканинного активатора крингл 4 і Глу-плазміноген набувають здатності специфічно зв’язуватись з афінним сорбентом. Поясненням цього є часткове ферментативне розщеплення іммобілізованого фібриногену плазміном, який міститься в слідовій кількості у розчині Ліз-плазміногену або утворюється за активації домішок плазміногену в препаратах фібриногену. Отже, нові центри взаємодії з плазміногеном, що з’являються на початкових стадіях гідролізу фібрин(оген)у, містяться в С-доменах і комплементарні ліганд-зв’язувальній ділянці крингла 4. Основна роль їх полягає в зміні конформації плазміногену.
В результаті проведених порівняльних досліджень взаємодії Глу- та Ліз-плазміногену з фібриногеном, його фрагментами та нативним і частково гідролізованим фібрином обґрунтовано положення про послідовність взаємодій, доменну локалізацію та етапи експонування комплементарних центрів розпізнавання молекул плазміногену/плазміну та фібриногену/фібрину в процесі полімеризації та на початкових стадіях гідролізу:
- молекула фібриногену в центральній частині –Е-домені містить експонований центр взаємодії з плазміногеном, комплементарний ліганд-зв’язувальним ділянкам перших трьох кринглових доменів молекули проферменту. Внаслідок закритої конформації Глу-плазміногену і недоступності ділянок перших трьох кринглових доменів для міжбілкових взаємодій нативна форма плазміногену та фібриноген у кров’яному руслі циркулюють незалежно один від одного;
- під час формування фібрилярної структури фібринового згустка в молекулах фібрину в області D-доменів експонуються центри взаємодії з Глу-плазміногеном, які комплементарні ліганд-зв’язувальній ділянці п’ятого крингла;
- взаємодія Глу-плазміногену з цими центрами за участі п’ятого кринглового домену обумовлює дисоціацію внутрішньомолекулярного зв’язку між п’ятим кринглом та N-кінцевим пептидом Глу-плазміногену, внаслідок чого профермент переходить у частково відкриту конформаційну форму, що забезпечує його активацію тканинним активатором до плазміну і початок гідролізу;
- на ранніх стадіях гідролізу фібрин(оген)у, за розщеплення С-доменів, на них утворюються або експонуються нові центри взаємодії з плазміногеном, які комплементарні ліганд-зв’язувальній ділянці четвертого крингла;
- взаємодія Глу-плазміногену з новоутвореними в молекулах фібрину центрами за участі ділянки четвертого кринглового домену обумовлює дисоціацію внутрішньомолекулярного зв’язку між третім та четверим кринглами, внаслідок чого профермент переходить у повністю відкриту просторово витягнуту конформаційну форму, що забезпечує його подальшу взаємодію за участі ділянок перших трьох кринглових доменів з комплементарними їм центрами, що існують в молекулах фібрину і локалізовані в домені Е, а можливо, і D або в зоні D-D контактів.
На основі отриманих експериментальних даних сформульовано механізм, який на ранніх стадіях гідролізу фібрину плазміном забезпечує збільшення локальної концентрації плазміногену на фібриновому згустку. Він полягає в тому, що на стадії розщеплення -ланцюгів окремих молекул фібрину з’являються нові центри зв’язування плазміногену, комплементарні низькоафінній ділянці крингла 4. Зміна конформації плазміногену, що відбувається внаслідок взаємодії з цим центром, дозволяє йому зв’язуватись високоафінною ділянкою крингла 1-3 з відповідними центрами інших молекул фібрину, що знаходяться на доступній для проферменту відстані. Плазміноген, переміщуючись на центри, комплементарні кринглу 1-3, вивільняє тим самим центр взаємодії з кринглом 4 для наступних молекул. В такий спосіб за обмеженої кількості новоутворених центрів відбувається багаторазове збільшення кількості зв’язаного з фібриновим згустком плазміногену.
Білок-білкові взаємодії в регуляції швидкості гідролізу фібрин(оген)у. Фібрин –фізіологічний субстрат плазміну одночасно є стимулятором фібринолізу. Якщо експонування центрів зв’язування плазміногену і тканинного активатора під час полімеризації фібрину забезпечує активацію проферменту та ініціює процес фібринолізу, то утворення нових центрів взаємодії з плазміногеном, що має місце на початкових стадіях цього процесу, можливо, регулює його швидкість.
Наступні дослідження були спрямовані на вирішення питання, чи впливає зміна властивостей плазміногену, що має місце за розщеплення С-кінцевих ділянок -ланцюгів молекул фібрину, на швидкість руйнування фібринового згустка.
Гідроліз нативного та частково гідролізованого desAABB фібрину Глу- або Ліз-плазміногеном, активованим тканинним активатором, досліджували з використанням турбідиметричного методу, вимірюючи зміну оптичної густини середовища при 350 нм під час утворення та розчинення полімерного фібрину. Отримані криві відображають динаміку змін в структурі згустка і дозволяють визначити ряд параметрів для кількісної характеристики фібринолітичного процесу. Швидкість гідролізу фібрину визначали за величиною t Ѕ, яка відповідає проміжку часу, що є необхідним для зменшення максимальної величини оптичної густини середовища на 50 %. Вимірювання часу від початку полімеризації до повного розчинення фібринового згустка дозволяє визначити кількість розчинних продуктів і розрахувати швидкість реакції плазмінолізу. Проміжок часу між досягненням максимальної величини оптичної густини середовища та початком її зменшення, який відповідає горизонтальному відрізку кривої, характеризує процес активації.
Показано, що швидкість руйнування полімерного фібрину залежить від концентрації кожної з форм проферменту та тканинного активатора. Проте, в усіх випадках гідроліз desААВВ фібрину відбувається вдвічі швидше за використання Ліз-плазміногену, ніж нативної форми проферменту. Порівняння кінетичних кривих гідролізу фібрину за активації Глу- та Ліз-плазміногену виявило запізнення в часі початку гідролізу при використанні Глу-плазміногену, що проявляється подовженим горизонтальним відрізком кривої. Після досягнення часу напівлізису (t Ѕ) швидкість гідролізу стає однаковою, про що свідчить тангенс кута нахилу нисхідного відрізка кривих (рис. 6). Тобто, різниця в швидкості руйнування полімерного фібрину між Глу- та Ліз-плазміногеном має місце на початкових стадіях гідролізу і залежить від швидкості активації.
Форма кривих гідролізу частково деградованого desAABB фібрину плазміном за активації Глу-плазміногену змінюється, у порівнянні з нативним фібрином, і стає подібною до таких при використанні Ліз-плазміногену, що можна пояснити зміною конформації Глу-плазміногену на Ліз-плазміноген подібну. Показано, що на частково деградованому desAABB фібрині за всіх досліджуваних концентрацій Глу-плазміногену збільшується в декілька разів як швидкість активації, так і швидкість гідролізу (рис. 7). Підвищення швидкості гідролізу спостерігається при відщепленні 1-3 % молекулярної маси фібриногену, з якого отримували препарати частково гідролізованого desAABB фібрину.
За даними залежності швидкості гідролізу нативного та частково деградованого фібрину плазміном за різних концентрацій субстрату були розраховані константи Міхаеліса, значення яких становить 7,0 та 3,3 10-7 М відповідно. Збільшення спорідненості плазміну до частково гідролізованого фібрину дозволяє припустити участь у протеолізі додаткової ділянки зв’язування ферменту.
Таким чином, установлено, що на стадії розщеплення -ланцюгів молекул фібрину має місце збільшення швидкості активації Глу-плазміногену та швидкості гідролізу полімерного фібрину. Причиною збільшення є зміна конформації плазміногену та залучення до взаємодії додаткових ділянок зв’язування ферменту. Зроблено висновок, що стадія утворення Х-фрагментів є ключовою в регуляції швидкості руйнування фібринового згустка фібринолітичною системою.
Надалі з’ясовували роль кринглових доменів в регуляції швидкості гідролізу фібриногену/фібрину плазміном. Для характеристики ранніх етапів І фібриноген гідролізували плазміном і вимірювали зміну в часі радіоактивності електрофоретичних зон, що відповідають сумарній фракції фібриногену та Х-фрагментів. Порівняння швидкості гідролізу плазміном, міні- та мікро-плазміном за різних концентрацій 6-АГК та аргініну дало можливість визначити участь ліганд-зв’язувальних ділянок окремих доменів ферменту на ранніх стадіях протеолізу (рис. 8, табл. 1).
Плазмін гідролізує фібриноген з найвищою швидкістю, її приймали за 100 %. У порівнянні з ним активність міні- та мікро-плазміну, у яких відсутні К 1-4 або всі кринглові домени відповідно, складає 30 та 20 %. 6-АГК в залежності від концентрації пригнічує швидкість гідролізу досліджуваної фракції плазміном та міні-плазміном до рівня мікро-плазміну і не впливає на активність останнього. В присутності 10 мМ аргініну активність плазміну знижується приблизно на 50 %. За такої концентрації аргініну, згідно з константами дисоціації для окремих кринглів, має місце насичення ділянок кринглів 1-3 та 5, тоді як ділянка крингла 4 залишається вільною. Отримані дані про те, що за блокування всіх ліганд-зв’язувальних ділянок активність плазміну знижується на 80 %, тоді як ділянок кринглів 1-3 та 5 –на 50 %, свідчать про важливе значення ділянки крингла 4 в регуляції швидкості початкових етапів гідролізу фібриногену плазміном.
Дослідження динаміки утворення та розщеплення Х-фрагментів, показало, що 10 мМ аргінін майже не впливає на швидкість розщеплення Х-фрагментів, тоді як в присутності 10 мМ 6-АГК вони накопичуються в реакційному середовищі і подальше їх руйнування потребує тривалого часу. Зроблено припущення, що найбільшого значення четвертий крингл набуває в процесі гідролізу фібриногену на стадії розщеплення Х-фрагментів.
Ефективність розчинення полімерного фібрину плазміном також значною мірою визначається крингловими доменами молекули ферменту. 6-АГК майже повністю пригнічує швидкість гідролізу фібринового згустка плазміном за концентрацій, які не впливають на активний центр, проте насичують його низькоафінні ліганд-зв’язувальні ділянки. Фрагменти плазміногену крингли 1-3 та 4, які можуть конкурувати за місця зв’язування плазміну на фібрині, ефективно впливають на процес гідролізу за спільної дії. Швидкість розчинення полімерного фібрину плазміном за 5-разового молярного надлишку кожного з фрагментів –кринглів 4 та 1-3 змінюється на 5 та 25 % відповідно, тоді як за одночасної присутності їх в інкубаційному середовищі швидкість реакції знижується більш ніж на 70 % (рис. 9).
Таким чином, доведено, що швидкість ранніх етапів гідролізу фібриногену, як і швидкість руйнування фібринового згустка плазміном контролюються крингловими доменами молекули ферменту. Отримані результати дозволяють припустити, що взаємодія некаталітичних ділянок молекули плазміну з відповідними центрами молекули субстрату орієнтує активний центр ферменту на гідроліз певних пептидних зв’язків, внаслідок чого розщеплення фібриногену/фібрину є строго спрямованим процесом.
Згідно сучасним уявленням, полімерний фібрин розщеплюється плазміном на великі надмолекулярні блоки, які складаються з фрагментів фібрил. Ефективність такого шляху визначається тим, що гідроліз відбувається лише в певних місцях фібрил у напрямку, перпендикулярному їх довжині. З погляду на отримані нами дані, можна висловити думку, що такими місцями є центри первинного зв’язування Глу-плазміногену на фібрині. На них відбувається активація проферменту, а на початкових етапах гідролізу –збільшення локальної концентрації плазміногену і швидкості його активації. Участь ділянок зв’язування різної спорідненості молекули плазміну у взаємодії з фібрином забезпечує його переміщення по DDE-трідам протофібрил, а орієнтація активного центра –гідроліз плазміном неупорядкованих ділянок в суперспіралізованій міждоменній частині молекул.
Активація плазміногену нативною та низькомолекулярною (36кДа) стрептокіназою. Ефекторні властивості фібрину. Участь плазміноген/ плазмінової системи у багатьох фізіологічних та патологічних процесах в організмі обумовлює інтерес до вивчення механізмів, які забезпечують та регулюють активацію плазміногену.
Наразі відомо ферментативний та неферментативний шляхи активації плазміногену. Фізіологічні активатори –тканинний та урокіназа каталізують гідроліз пептидного зв’язку Арг561-Вал562 в плазміногені, перетворюючи його на дволанцюговий плазмін. Неферментативна активація здійснюється стрептокіназою –екзогенним білком бактеріального походження. Стрептокіназа в комплексі з плазміногеном шляхом конформаційних перебудов індукує в проферменті утворення активного центра.
Вивчення стрептокінази як активатора плазміногену викликає особливий інтерес у зв’язку з широким застосуванням ії в тромболітичній терапії, унікальними властивостями та можливістю існування в організмі подібного механізму перетворення плазміногену на плазмін.
Отримані дані щодо кристалічної структури комплексу стрептокінази з мікро-плазміном (Wang, 1998) та результати клінічних досліджень, які показали, що за тромболітичною ефективністю стрептокіназа майже не поступається рекомбінантному тканинному активатору (GUSTO, 1993), надали нового імпульсу всебічному дослідженню цього білка. Проте, роль кринглових доменів плазміногену в механізмі активації стрептокіназою залишається до кінця не з’ясованою. Відомості щодо N- і С-кінцевих ділянок активатора у взаємодії з плазміногеном та формуванні активного центра є суперечливими. Отримано рекомбінантну стрептокіназу, у якої, на відміну від нативної, відсутні 59 N-кінцевих амінокислотних залишків. Активність її, яка набагато менша за таку стрептокінази, повністю відновлюється в присутності фібрину. В плазмі вона стимулює фібриноліз за мінімального фібриногенолізу (Reed, 1999), але причини такої дії стрептокінази залишються не з’ясованими.
Тому ми вивчали роль ліганд-зв’язувальних ділянок кринглових доменів молекули плазміногену та N- і С-кінцевих ділянок стрептокінази в процесі активації, а також ефекторні властивості фібрину щодо активації плазміногену стрептокіназою.
Молекулярний механізм активації плазміногену стрептокіназою може бути представлено загальною схемою:
На першій стадії реакції стрептокіназа утворює з плазміногеном еквімолярний комплекс, на другій –викликає конформаційні перебудови в серин-протеїназному домені проферменту з формуванням активного центра і появою ферментативної активності. На наступній стадії активаторний комплекс ферментативним шляхом розщеплює в плазміногені активаційний пептидний зв’язок з утворенням плазмін-стрептокіназного комплексу або за каталітичної кількості стрептокінази –вільного плазміну.
Активацію плазміногену стрептокіназою вивчали, використовуючи специфічний хромогенний субстрат плазміну S2251. Швидкість активації визначали за швидкістю вивільнення п-нітроаніліну, поглинання якого реєстрували на спектрофотометрі при 410 нм.
Дослідження кінетики активації Глу-, Ліз-, міні- та мікро-плазміногену каталітичною кількістю стрептокінази показало, що швидкість активації залежить від наявності в молекулі проферменту кринглових доменів. Про участь розташованих в них лізин-зв’язувальних ділянок свідчить пригнічення швидкості активації Глу-, Ліз- і міні-плазміногену 6-АГК у межах концентрацій 10-5 –-2 М, а також нативної форми плазміногену ізольованими кринглами 1-3 та 4.
Якщо комплекс активатора з Глу-плазміногеном утворювали в присутності 6-АГК, то його амідолітична активність зменшується в залежності від концентрації 6-АГК. В той же час 6-АГК практично не впливає на амідолітичну активність попередньо сформованих комплексів.
Комплекс стрептокінази з плазміногеном або плазміном, попередньо інкубований протягом декількох годин, взаємодіє з лізин-сефарозою. Наявність стрептокінази або її фрагментів в білкових фракціях, які елююювали 6-АГК, доведено вестерн-блотом з використанням відповідних антитіл. Отже, показано, що в комплексі плазмін(оген)–стрептокіназа після формування активного центра лізин-зв’язувальні ділянки кринглових доменів вивільняються. Комплементарні їм центри в молекулі стрептокінази можуть взаємодіяти з лізин-зв’язувальними ділянками субстратної молекули плазміногену. Підтвердженням цього є зменшення на 40 та 60 % відповідно активації Глу- та Ліз-плазміногену еквімолярним комплексом плазмін-стрептокіназа в присутності 6-АГК.
Отримані результати дозволили дійти висновку, що лізин-зв’язувальні ділянки проферменту регулюють всі стадії процесу активації стрептокіназою: утворення еквімолярного комплексу з активатором, індукцію каталітичної активності плазміногену та взаємодію активаторного комплексу з субстратним плазміногеном.
Для з’ясування ролі залишків лізину на С-кінці та в складі поліпептидного ланцюга молекули стрептокінази, що можуть приймати участь у взаємодії з плазміногеном, проводили хімічну модифікацію NH-груп стрептокінази тринітробензолсульфокислотою або обробляли її карбоксипептидазою. Відщеплення С-кінцевого лізину стрептокінази зменшує швидкість активації нею Глу-плазміногену в 3 рази, тоді як хімічна модифікація –більш ніж у 100 разів. Отримані дані свідчать про важливу роль залишків лізину і, можливо, N-кінцевого ізолейцину стрептокінази в процесі активації.
Існують різні точки зору відносно механізму формування активного центра в плазміногені у комплексі з стрептокіназою. Згідно одної з них, N-кінцевий ізолейцин стрептокінази утворює соляний місток з залишком Асп 740 плазміногену, що розташований поруч з Сер 741 каталітичної тріади (Wang,1999; Perry, 2000). Така взаємодія є пусковим механізмом формування активного центра та Sсубцентра. Згідно другої, -домен стрептокінази зв’язується з серин-протеїназним доменом плазміногену поблизу консервативного залишку Ліз 698, що викликає конформаційні зміни цієї ділянки молекули, внаслідок яких утворюється необхідний іонний зв’язок між Ліз 698 та Асп740 (Wang, Lin, 1998).
Обмежений хімотрипсиновий гідроліз стрептокінази дозволяє одержати ряд фрагментів, які зберігають спорідненість до плазміногену. З метою визначення функціональної ролі окремих ділянок молекули стрептокінази досліджували активаторні властивості фрагменту з молекулярною масою 36 кДа, у якого відсутні 7 та 4 кДа N- та С-кінцеві пептиди відповідно. Індукція каталітичної активності Глу-плазміногену за еквімолярної кількості 36 кДа стрептокінази починається лише через годину від початку інкубації за високої 200 нМ концентрації кожного з білків. Швидкість реакції уповільнюється більш ніж на два порядки порівняно з нативною стрептокіназою. Наведені результати добре узгоджуються з даними літератури про низьку активаторну активність рекомбінантної стрептокінази, у якої відсутні 59 N-кінцевих амінокислотних залишків, і свідчать про важливу роль N-кінцевої ділянки стрептокінази в процесі активації плазміногену.
Вивчення кінетики активації Глу-, Ліз- та міні-плазміногену 36 кДа стрептокіназою за 50 нМ концентрації реагуючих білків виявило, що індукція каталітичної активності Глу-плазміногену була відсутня протягом всього часу спостережень, тоді як Ліз- і міні-плазміногену починалась відповідно через 30 і 10 хв від початку реакції (рис. 10). Швидкість активації міні-плазміногену на порядок перевищує таку Ліз-плазміногену (табл. 2). Отримані результати свідчать, що N-кінцева ділянка стрептокінази відповідає за кон-формаційні зміни проферменту, які контролюють доступність центрів зв’язування стрептокінази в протеїназному домені, що є необхідними для формування активного центра. Дослідження впливу фібрину на активацію різних форм плазміногену 36 кДа фрагментом стрептокінази показало, що за присутності desAABB фібрину активація Глу-плазміногену починається після 20-30 хв лаг-періоду і відбувається з високою швидкістю (рис. 10).
Фібрин на порядок прискорює швидкість активації Ліз-плазміногену і практично не впливає на активацію міні-плазміногену низькомолекулярною стрептокіназою (табл. 2). Ці дані дозволяють дійти висновку, що певна ділянка молекули фібрину виконує функцію N-кінцевого пептиду стрептокінази, індукуючи в проферменті конформаційні зміни, які необхідні для швидкого утворення активаторного комплексу плазміногену з 36 кДа фрагментом стрептокінази.
На відміну від нативної, низькомолекулярна стрептокіназа не впливає на швидкість реакції плазміну з -антиплазміном –амідолітична активність ферменту повністю інгібується -антиплазміном в присутності еквімолярної кількості 36 кДа фрагмента стрептокінази.
Таким чином, показано, що низькомолекулярна стрептокіназа є ефективним активатором плазміногену, асоційованого з фібрином. Низька швидкість активації нею плазміногену у розчині та відсутність протекторної дії за інгібування плазміну -антиплазіном дозволяють пояснити вибірковість руйнування фібрину та відсутність фібриногенолізу за активації плазміногену плазми низькомолекулярною стрептокіназою.
Порівняльна характеристика активації Глу-плазміногену Е-фрагментом фібриногену, стрептокіназою та моноклональним антитілом IV-1c. До непрямих активаторів плазміногену, крім стрептокінази, належить антиплазміногенове моноклональне антитіло IV-1c, властивості і механізм дії якого досить детально вивчені (Макогоненко, 2000). При вивченні взаємодії Глу-плазміногену з Е-фрагментом фібриногену нами виявлено, що в комплексі з ним профермент змінює конформацію і з часом перетворюється на Ліз-плазміноген, що вказує на потенційні активаторні властивості Е-фрагмента.
Представляло інтерес більш детально дослідити активацію плазміногену Е-фрагментом і порівняти її з характерними особливостями механізму активації плазміногену стрептокіназою та моноклональним антитілом IV-1c, що є важливим для визначення існування в організмі неферментативної активації плазміногену та вивчення механізмів регуляції фібринолітичного процесу продуктами гідролізу фібриногену/фібрину.
Характерними ознаками неферментативної активації плазміногену є:
- утворення стійкого комплексу між проферментом та активатором;
- двоцентрова взаємодія;
- зміна конформації проферменту;
- індукція каталітичної активності;
- перетворення плазміногену на плазмін в складі комплексу;
- активація комплексом субстратного плазміногену;
- залежність активаторної активності комплексу від часу його існування.
Ймовірність домішок будь-якої протеолітичної або активаторної активності в препаратах Глу-плазміногену та Е-фрагмента виключали системою контролей з гідролізу фібрину або S 2251 та попередньою обробкою інгібіторами п-НФГБ та ДФФ.
Дослідження комплексоутворення Глу-плазміногену з Е-фрагментом показало, що за надлишку проферменту з 1 молем фрагмента можливе зв’язування 2 молей плазміногену. Взаємодія забезпечується високо- та низькоафінними ділянками зв’язування проферменту, розташованими в кринглах 1-3 та 5. Значення констант дисоціації комплексу Глу-плазміногену з Е-фрагментом співпадає з такими для Ліз-плазміногену, що свідчить про зміну конформації нативної форми проферменту.
Здатність Е-фрагмента формувати активний центр та індукувати каталітичну активність в Глу-плазміногені доведено вивільненням п-нітроаніліну з субстрату S-2251 під час його інкубації з еквімолярною сумішшю Глу-плазміногену та Е-фрагмента. За присутності ДФФ вивільнення п-нітроаніліну не спостерігається.
Електрофоретичні дослідження суміші, яку попередньо інкубували при 37 оС, виявили перетворення з часом нативної форми проферменту в частково гідролізовану, а за умов відновлення дисульфідних зв’язків в білках –утворення плазміну. З використанням методу фібринових пластин показано, що комплекс проявляє фібринолітичну активність, величина якої становить приблизно 30 % відповідної кількості плазміну. Збільшення зон лізису фібринових пластин за надлишку плазміногену свідчить про активаторну активність комплексу. Дослідження динаміки вивільнення п-нітроаніліну від часу попередньої інкубації комплексу виявило, що його активаторна активність досягає максимальної величини через 30 хв після утворення і з часом поступово зменшується, можливо, внаслідок протеолізу Е-фрагмента плазміном або автолізу останнього.
Таким чином, установлено, що Е-фрагмент спричинює в Глу-плазміногені структурні зміни, внаслідок яких в протеїназному домені проферменту формується активний центр. Проведені дослідження дозволяють віднести Е-фрагмент до активаторів плазміногену непрямої дії та
припустити фізіологічне значення неферментативної активації плазміногену в присутності Е-фрагмента. Враховуючи кількість Глу-плазміногену, що зв’язується з фрагментом, та інгібування плазміну, який утворюється в складі комплексу, б-2-антиплазміном, представляється ймовірним, що Е-фрагмент буде впливати на фібринолітичний процес за механізмом від’ємного зворотнього зв’язку, зменшуючи локальну концентрацію потенційно активного плазміногену в кров’яному згустку. Зважаючи на можливість Е-фрагмента активувати протромбін (Платонова, 2002; 2006) та перетворювати Глу-плазміноген на Ліз-форму, яка має підсилюючий вплив на полімеризацію фібрину, можна припустити, що накопичення Е-фрагмента пов’язано з ризиком повторного тромбоутворення.
Некаталітичні ділянки молекули плазміну в інгібуванні б-антиплазміном. Роль б-антиплазміну у фібринолітичному процесі. На завершальному етапі фібринолітичного процесу плазмін, що вивільняється в кровоток, швидко і необоротно інгібується -антиплазміном. Механізм реакції досить добре вивчений, але участь в ньому окремих кринглових доменів плазміну остаточно не з’ясована, що залишає відкритим питання про здатність -антиплазміну ефективно інгібувати низькомолекулярні похідні плазміну, які можуть утворюватись в організмі (Lijnen, 2001; Narasaki, 2005).
Проведене нами дослідження кінетики інгібування б-антиплазміном амідолітичної активності плазміну, міні- та мікро-плазміну показало, що низькомолекулярні похідні плазміну також інгібуються б-антиплазміном, але повільніше. Значення константи швидкості комплексоутворення з інгібітором зменшується на порядок в послідовності: плазмін, міні- та мікро-плазмін. За умов насичення лізин-зв’язувальних ділянок плазміну та міні-плазміну 6-АГК швидкість інгібування їх б-антиплазміном зменшується до рівня мікро-плазміну (табл. 3).
З використанням міченого біотином інгібітора установлено, що він взаємодіє з фрагментами плазміногену: мікро-, міні-плазміногеном, кринглом 4 та з найвищою спорідненістю з кринглом 1-3. Величина зв’язування б-антиплазміну з міні-плазміногеном та плазміном, який попередньо інгібували ДФФ, в присутності 6-АГК знижується до рівня мікро-плазміногену.
Крингли 1-3, 4 та міні-плазміноген за 30-разового молярного надлишку практично не впливають на інгібування плазміну еквімолярною кількістю інгібітора.
Проведені дослідження показали, що: а) швидкість реакції плазміну з б-антиплазміном контролюється крингловими доменами; б) в протеїназному домені плазміногену/плазміну міститься відмінна від активного центра ділянка зв’язування інгібітора. Зроблено висновок, що ефективність дії б-антиплазміну забезпечується багатоцентровою взаємодією інгібітора з ферментом.
Основною функцією б-антиплазміну вважається нейтралізація вільного плазміну та захист білків плазми від неспецифічного протеолізу.
З метою визначення ролі інгібітора в фібринолітичному процесі були розроблені модельні системи гідролізу фібринових згустків, утворених в присутності різних компонентів фібринолітичної системи. Дослідження проводили в термостатованій кюветі спектрофотометру, реєструючи зміну оптичної густини середовища при 350 нм. Для запобігання змішування білків до початку реакції їх вносили в різні кутки кювети в мікролітрових кількостях. Полімеризацію des ААВВ фібрин-мономеру ініціювали додаванням буферу з нейтральним значенням рН. Виявлено, що фібрин швидко гідролізується за наявності в системі як плазміну, так і Глу-плазміногену та стрептокінази або тканинного активатора (рис. 11). За одночасної присутності -антиплазміну та плазміну фібриновий згусток не гідролізується. Інгібітор не впливає на швидкість гідролізу фібрину Глу-плазміногеном, активованим каталітичною кількістю стрептокінази, що пояснюється його низькою спорідненістю до проферменту. Плазміноген в присутності інгібітора зв’язується з фібрином і активується до плазміну. Разом з тим, в системі, що містить Глу-плазміноген і тканинний активатор, -антиплазмін майже повністю пригнічує гідроліз фібрину. Зважаючи на залежність активації проферменту тканинним активатором від фібрину і те, що плазмін, зв’язаний з фібрином, захищений від дії інгібітора, отриманий результат виявився несподіваним.
Подальші дослідження показали, що -антиплазмін практично не впливає на величину зв’язування тканинного активатора та плазміногену з фібрином, також як і амідолітичну активність активатора.
Разом з тим, в залежності від концентрації він пригнічує швидкість активації плазміногену тканинним активатором (рис. 12). Майже повне інгібування спостерігається за фізіологічної концентрації інгібітора при всіх досліджуваних концентраціях тканинного активатора.
Виявлено, що мічений біотином -антиплазмін зв’язується з тканинним активатором з Кd 78 нМ. Інгібітор сорбується на фібринових плівках, утворених з дезААВВ фібрину, та іммобілізованих фрагментах D та D-D і не взаємодіє з Е-фрагментом, тобто ділянки зв’язування інгібітора на фібрині розташовані в місцях локалізації активаторного комплексу. Це дозволяє зробити припущення, що інгібування -антиплазміном процесу активації може бути результатом стеричних перешкод для взаємодії плазміногену з тканинним активатором або зміни конформації активатора.
Таким чином, установлено, що -антиплазмін регулює швидкість гідролізу фібрину на стадії активації плазміногену тканинним активатором.
Механізм зміни активності плазміну в комплексі зі стрептокіназою.
Плазмін, крім фібринолітичної, виконує в організмі різноманітні регуляторні функції. Вибірково гідролізуючи в білках певні пептидні зв’язки, він активує металопротеїнази, фактори росту, клітинні рецептори. В зв’язку з багатофункціональністю та участю плазміну в широкому спектрі біологічних процесів, особливого значення набуває вивчення механізмів регуляції активності плазміну на рівні білок-білкових взаємодій.
Одним з відомих білків, які змінюють активність плазміну, є стрептокіназа. В комплексі з нею плазмін не інгібується -антиплазміном, майже втрачає здатність гідролізувати фібрин і стає ефективним активатором плазміногену.
Ми поставили на меті з’ясувати механізм регуляції активності плазміну по відношенню до високомолекулярних субстратів та інгібіторів в комплексі з стрептокіназою.
Оскільки взаємодія -антиплазміну і стрептокінази з плазмін(оген)ом є багатоцентровою і відбувається за участі як кринглових, так і протеїназного доменів ферменту, порівнювали зв’язування цих білків, що попередньо мітили біотином, з іммобілізованими фрагментами плазміногену.
Обидва білка в однаковій кількості і з однаковою спорідненістю (С дорівнює 60-80 нМ) зв’язуються з кринглом 1-3. Тоді як стрептокіназа проявляє більш високу спорідненість до міні-плазміногену (С –нМ), з яким зв’язується в основному в області протеїназного домену, оскільки на величину зв’язування слабо впливає 20 мМ аргінін, який блокує ділянку п’ятого крингла.
Стрептокіназа, в залежності від концентрації, інгібує зв’язування -антиплазміну з плазміном. Повне інгібування спостерігається за одночасної присутності стрептокінази та 6-АГК (рис. 13). За аналогічних умов - антиплазмін та 6-АГК слабо впливають на зв’язування стрептокінази з
плазміном. Зроблено висновок, що взаємодія -антиплазміну саме з протеїназним доменом блокується стрептокіназою. Послаблення впливу стрептокінази на взаємодію -антиплазміну з плазміном за інгібування ферменту ДФФ, вказує, що ділянки зв’язування стрептокінази розташовані поблизу або в контактній зоні активного центра.
Отримані результати добре узгоджуються з даними рентгеноструктурного аналізу комплексу мікро-плазмін–стрептокіназа, які показали, що область активного центра ферменту оточена розташованими на поверхні кластерами позитивно заряджених амінокислот, що беруть участь у взаємодії з стрептокіназою (Parry, 2000).
Дослідження просторової структури мікро-плазміну та активаторів плазміногену виявили, що поблизу активного центра плазміну розташована виступаюча назовні петля, яка має делецію з 6 амінокислотних залишків і є більш пологою порівняно з аналогічною структурою тканинного активатора та урокінази. Внаслідок цього плазмін гідролізує пептидні зв’язки, розташовані на витягнутих в просторі ділянках поліпептидного ланцюга, тоді як активатори –на ділянках, що мають “шпилькоподібну” структуру.
Результати експериментальних досліджень та аналіз літературних даних дозволили запропоновувати механізм регуляції активності плазміну в комплексі з стрептокіназою. Він полягає в тому, що частина молекули стрептокінази, що приєднується до протеїназного домену, виконує структурну роль відрізка поліпептидного ланцюга, де має місце делеція амінокислотних залишків. В такий спосіб стрептокіназа обмежує доступ в контактну зону активного центра плазміну просторово витягнутим субстратам та інгібіторам і залишає її відкритою для субстратів, які мають ділянки, структурно подібні до активаційної петлі плазміногену.
Відомо, що патологічні процеси в організмі супроводжуються порушеннями зсідаючої та фібринолітичної систем крові. В зв’язку з цим визначення основних компонентів обох систем буде сприяти попередженню розвитку патологічних станів, що ведуть до тромбоутворення або геморагій, а в разі їх розвитку –визначенню схем ефективного лікування.
Широке впровадження в клінічну практику тромболітичної терапії порушує питання про необхідність контролю за зміною концентрації та активності основних компонентів, що приймають участь в процесі розчинення тромбів.
Для визначення вмісту плазміногену в плазмі найчастіше використовують імуноферментний та амідолітичний методи. Перший дозволяє визначати кількість плазміногену та його фрагментів, але не дає уявлення про рівень функціонально активного білка. Амідолітичний метод з використанням синтетичного хромогенного субстрату дає завищення рівня функціонально активного плазміногену. За різних запальних процесів поява в плазмі нейтрофільної еластази та інших протеолітичних ферментів, приводить до розщеплення циркулюючого плазміногену на декілька проміжних форм та фрагментів. Відповідні форми плазміну зберігають гідролітичну активність до хромогенних пептидних субстратів, але різко зменшують здатність розпізнавати та гідролізувати фізіологічний субстрат фібрин. До того ж в амідолітичному методі для запобігання інактивації плазміну, що утворюється, б-антиплазміном активацію плазміногену проводять надлишковою кількістю стрептокінази. Тому весь плазмін буде находитись в комплексі з стрептокіназою, яка значно підвищує його амідолітичну активність.
За надмірної активації плазміногену рівень б-антиплазміну крові критично знижується, що передбачає можливість неконтрольованого протеолізу і ставить питання про необхідність визначення крнцентрації б-антиплазміну за різних патологій та при тромболітичній терапії стрептокіназою або тканинним активатором.
Концентрація тканинного активатора в крові є значно нижчою, порівняно з іншими протеазами, тому точне визначення її є методично складною задачею. Використання імуноферментних методів виявило збільшення концентрації активатора за ряду тромботичних ускладнень, що пояснюється накопиченням неактивного комплексу активатора з його специфічним інгібітором. В зв’язку з цим поряд з імуноферментними необхідно використання методів визначення функціонально активного тканинного активатора, який міг би з високою ефективністю перетворювати плазміноген до плазміну на поверхні фібринового згустка. Широкого застосування набув метод з використанням хромогенного субстрату плазміну та бромціанового фрагмента фібрину –FCB-2 в якості стимулятора. Ефекторні властивості цього фрагменту, порівняно з фібрином, є досить низькими, тому метод потребує використання високих концентрацій плазміногену. Отже, потреба у розробці способів визначення основних компонентів фібринолітичної системи з використанням специфічного фізіологічного субстрату –фібрину є нагальною практичною проблемою.
Для визначення концентрації плазміногену в плазмі крові нами розроблено спосіб, який базується на активації проферменту, адсорбованого на фібрині, каталітичною кількістю стрептокінази і гідролізі фібрину плазміном, що утворюється.
При розробці способу враховували отримані нами дані про кількість Глу-плазміногену, що зв’язується з фібрином; більш високу спорідненість нативної форми проферменту до фібрину, порівняно з стрептокіназою та б-антиплазміном; високу швидкість активації асоційованого з фібрином Глу-плазміногену стрептокіназою та відомий факт про недоступність плазміну, що утворюється на фібрині, дії б-антиплазміну.
Реакцію проводили в термостатованій кюветі спектрофотометра, в яку вносили зразки досліджуваної плазми, буферний розчин та стрептокіназу. Полімеризацію фібрину ініціювали додаванням аліквоти des ААВВ фібрин-мономеру, після чого зміну світлопропускання реєстрували при 350 нм. За часом, необхідним для зменшення максимальної величини мутності розчину на 50 %, визначали швидкість гідролізу фібрину і виражали як 1/tЅ. Вміст плазміногену визначали за калібрувальним графіком, побудованим з використанням стандартної плазми. Кількість плазміногену виражали в мкг/мл.
До переваг даного способу можна віднести: 1) використання desААВВ фібрину замість фібриногену, що дозволяє позбутися впливу фібриногену плазми та інгібіторів тромбіну на процес полімеризації фібрину; 2) визначення концентрації плазміногену безпосередньо в плазмі, що дозволяє скоротити час на отримання еуглобулінової фракції; 3) використання малої кількості плазми (10-30 мкл) та короткий час (3-10 хв), які витрачаються на одне випробування.
Для визначення б-антиплазміну плазми розроблено спосіб, який базується на гідролізі фібрину екзогенним плазміном, що залишається вільним після взаємодії з інгібіторами плазми. В кювету спектрофотометра вносили плазмін, зразки досліджуваної плазми та буферний розчин. Полімеризацію фібрину проводили як описано вище. За часом, необхідним для зменшення максимальної величини мутності розчину на 50 %, визначали швидкість гідролізу фібрину і виражали як tЅ. Вміст б-антиплазміну визначали за калібрувальним графіком, побудованим з використанням стандартної плазми з визначеним вмістом інгібітора. Кількість б-антиплазміну виражали в мкг/мл.
Спосіб визначення тканинного активатора представляє модифікацію стандартної процедури методу COASET t-PA (Chromogenix). Сутність її полягає у використанні desААВВ фібрину в якості стимулятора, що дозволяє вдвічі знизити кількість плазміногену та вдвічі скоротити час інкубації, а також визначати активність тканинного активатора безпосередньо у фібриновому згустку, що є необхідним в разі використання в клінічній практиці фібринового клею.
Застосування стрептокінази в тромболітичній терапіі потребує попереднього визначення рівня антистрептокіназних антитіл в плазмі крові, наявність яких знижує терапевтичну ефективність стрептокінази, а за повторного використання викликає алергійні реакції різної етіології. Нами розроблено простий у використнні спосіб визначення концентрації IgG проти стрептокінази у сироватці крові людини, що базується на інгібуванні ними активації плазміногену стрептокіназою і визначенні швидкості гідролізу фібрину плазміном.
Запропоновані способи можуть бути використані в медичній практиці для характеристики загального фібринолітичного потенціалу, контролю за ефективністю тромболітичної терапії, визначення концентрації функціонально активних білків та виявлення низькомолекулярних похідних плазміногену/плазміну.
ВИСНОВКИ
1. Функціонування фібринолітичної системи базується на високоспецифічних білок-білкових взаємодіях, вивчення яких важливе для з’ясування молекулярних механізмів регуляції фібринолізу та загальних принципів функціонування регуляторних протеїназ. Проведені дослідження визначили функціональну роль некаталітичних ділянок певних доменів молекули плазміногену/плазміну на всіх етапах процесу фібринолізу. Установлено, що вони забезпечують взаємодію плазміногену/плазміну з фібриногеном/фібрином, визначають швидкість процесів активації плазміногену, руйнування фібринового згустка плазміном, інгібування плазміну та зміну його активності.
2. Виявлено, що молекула фібриногену містить центри зв’язування плазміногену, які локалізовані в центральному домені Е та периферичних доменах D.Доведено, що в останніх плазміноген-зв’язувальні центри експонуються в процесі гідролізу молекули фібриногену. Показано, що Глу-плазміноген не взаємодіє з фібриногеном, що обумовлено його закритою конформацією, тоді як Ліз-плазміноген зв’язується з доменом Е фібриногену високоафінними ділянками кринглів 1-3.
3. Вперше вивчено взаємодію Glu-плазміногену з фрагментами фібриногену, що утворюються на всіх етапах його гідролізу, та розраховано константи дисоціації комплексів проферменту з Е- та D-фрагментами фібриногену.
4. Установлено, що під час полімеризації фібрину в D-доменах його молекул експонуються первинні центри зв’язування Глу-плазміногену, комплементарні низькоафінній ділянці крингла 5. Показано, що Ліз-плазміноген взаємодіє з фібрином як високо-, так і низькоафінними ділянками зв’язування в кількості, що на порядок перевищує таку Глу-плазміногену.
5. Показано, що на початкових стадіях гідролізу фібрину при розщепленні С-доменів в окремих молекулах фібрин-мономеру утворюються нові центри зв’язування плазміногену, комплементарні кринглу 4. Взаємодія з ними викликає конформаційні зміни в молекулі Глу-плазміногену, внаслідок чого ділянки кринглів 1-3 отримують можливість взаємодіяти з фібрином, що приводить до збільшення кількості сорбованого на фібриновому згустку проферменту.
6. Продемонстровано, що на стадії розщеплення С-доменів молекул фібрину швидкість активації Глу-плазміногену тканинним активатором та гідролізу полімерного фібрину збільшується. Таким чином, стадія утворення Х-фрагментів є ключовою в регуляції швидкості руйнування фібринового згустка фібринолітичною системою.
7. Вперше показано існування неферментативного шляху активації Глу-плазміногену за присутності Е фрагмента фібриногену. Останній викликає в проферменті структурні зміни, внаслідок яких в його протеїназному домені формується активний центр. Проведені дослідження дозволяють віднести Е-фрагмент до активаторів плазміногену непрямої дії.
8. Установлено, що кринглові домени контролюють швидкість процесу активації плазміногену стрептокіназою. Вперше показано, що лізин-зв’язувальні ділянки кринглових доменів беруть участь у всіх етапах процесу активації: утворення еквімолярного комплексу, формування активного центра, взаємодії активаторного комплексу з субстратним плазміногеном.
9. Запропоновано механізм регуляції активності плазміну в комплексі з стрептокіназою. Він полягає в тому, що частина молекули активатора, який приєднується до протеїназного домену, виконує структурну роль відрізка поліпептидного ланцюга, де має місце делеція амінокислотних залишків. В такий спосіб стрептокіназа обмежує доступ в контактну зону активного центра плазміну просторово витягнутим ділянкам субстратів та інгібіторів і залишає її відкритою для ділянок, структурно подібних до активаційної петлі плазміногену.
10. Вперше установлено, що б-антиплазмін є регулятором фібринолітичного процесу. Він контролює швидкість гідролізу полімерного фібрину на стадії активації плазміногену тканинним активатором.
11. Запропоновано способи кількісного визначення плазміногену, тканинного активатора плазміногену, б-антиплазміну та антистрептокіназних антитіл в плазмі крові людини.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г. Иммобилизация стрептокиназы на нерастворимых носителях и свойства иммобилизованного белка // Укр. биохим. журн. – 1983. – Т. 55, № 3. – С. 307–310.
. Кудинов С.А., Гриненко Т.В., Новохатний В.К., Макогоненко Е.М., Кастрикина Т.Ф. Некоторые структурные и функциональные аспекты молекулярного механизма фибринолиза // Вестник АН УССР. – 1984. – № 6. – С. 27–34.
. Веревка С.В., Кудинов С.А., Гриненко Т.В. Аргинил-связывающие участки плазминогена человека // Докл. АН УССР. – 1985. – Сер. Б, № 1. – С. 53–56.
. Кудинов С.А., Веревка С.В., Гриненко Т.В. Лигандная специфичность участков белок-белкового взаимодействия молекулы плазминогена человека // Стрептокиназа в регуляции свертывающей и противосвертывающей систем крови: Сб. науч. работ. –Минск, 1985. –С. 116–121.
. Кудинов С.А., Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Медведь Л.В. Локализация плазминоген-связывающих участков на молекуле фибриногена и его фрагментах // Докл. АН УССР. – 1986. – Сер. Б, № 4. –С. 70–.
6. Verevka S.V., Kudinov S.A., Grinenko T.V. Arginil-binding sites of human plasminogen // Thrombosis Research. –. –Vol. 41, № 5. –Р. 689–.
. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Кудинов С.А., Медведь Л.В. Плазминоген-связывающие центры молекулы фибриногена, фибрина и продуктов их протеолиза // Биохимия. – 1987. –Т. 52, № 10. –С. 1732–1738.
. Третьяченко В.Г., Гриненко Т.В., Кудинов С.А. Связывание К 1-3 и К 4 фрагментов плазминогена, содержащих лизин-связывающие участки, с фибриногеном и его фрагментами // Укр. биохим. журн. – 1988. – Т. 60, № 2.– С. 3–6.
. Скоморовская Е.В., Гриненко Т.В., Кудинов С.А., Третьяченко В.Г. Протеолитическая активность Глу-плазминогена при его взаимодействии с Е-фрагментом фибриногена // Докл. АН УССР. – 1988. – Сер. Б, № 10. –С. 75–78.
. Кудинов С.А., Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г. Изучение взаимодействия Глу- и Лиз-форм плазминогена с фибриногеном // Механизмы регуляции гемостаза на уровне молекулярных взаимодействий: Сб. науч. работ. –Свердловск. –1988. –С. 6–13.
. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А. Связывание Глу-плазминогена с фибриногеном и продуктами его протеолиза // Биохимия. – 1989. – Т. 54, № 2. – С. 213–220.
. Гриненко Т.В., Кудинов С.А. Межбелковые взаимодействия плазминогена и фибриногена/фибрина в процессе фибринолиза // Биохимия животных и человека. – Киев, Наукова думка. –1989. – Т. 13. – С. 46–55.
13. Скоморовская Е.В., Гриненко Т.В., Кудинов С.А., Золотарева Э.Н. Исследование протеолитической активности комплекса Глу-плазминогена с фрагментом Е фибриногена // Биохимия. – 1991. – Т. 56, № 3. – С. 458–466.
. Гриненко Т.В., Кудинов С.А. Характеристика центров комплексообразования между Глу- и Лиз-формами плазминогена и фибриногеном/фибрином // Биохимия животных и человека. –Киев, Наукова думка.–1991. – Т. 15. – С. 66–76.
15. Золотарева Э.Н., Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А. Влияние аргинина на гидролиз фибриногена плазмином и мини-плазмином // Укр. биохим. журн. –. –Т. 64, № 1. –С. 3–.
16. Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А., Золотарева Э.Н. Особенности взаимодействия Glu- и Lys-форм плзминогена с нативным и частично гидролизованным фибрином // Биохимия. –1992. –Т. 57, № 5.–С. 728–737.
. Золотарева Э.Н., Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Кудинов С.А. Влияние химической модификации остатков аргинина фибриногена и его Dн-фрагмента на скорость гидролиза этих белков плазмином // Укр. биохим. журн. – 1994. – Т. 66, № 2. – С. 79–84.
18. Метелицына И.П., Левицкая Г.В., Гриненко Т.В., Метелицына Т.И. Методы исследования системы фибринолиза и ее компонентов // Укр. биохим. журн. –. –Т. 69, № 5. –С. 33–.
. Макогоненко Є.М., Яковлев С.О., Сломінський О.Ю., Корольчук В.І., Гриненко Т.В., Соколовська Л.І., Дружина Н.М., Колесникова І.М., Чернишов В.І., Седерхольм-Вильямс С.А. Активація плазміногену антиплазміногеновим моноклональним антитілом IV-1с. Властивості та механізм реакції // Укр. біохім. журн. –. –Т. 72, № 4-5. –С. 99–.
. Гриненко Т.В., Макогоненко Є.М., Юсова О.І., Седерхольм-Вільямс С.А. Деградація стрептокінази та каталітичні властивості плазмін-стрептокіназного комплексу // Укр. біохім. журн. –. –Т. 74, № 3. –С. 50–.
. Гриненко Т.В., Макогоненко Е.М., Юсова Е.И., Скоморовская-Прокволит Е.В., Седерхольм-Вильямс С.А., Колесникова И.Н. Модифицирующее действие антиплазминогенового антитела IV-1с на каталитические свойства плазмина человека // Укр. биохим. журн. – 2002. – Т. 74, № 4. – С. 61–70.
22. Гриненко Т.В., Юсова О.І., Задорожна М.Б., Макогоненко Є.М. Особливості взаємодії б-2-антиплазміну з плазміногеном/плазміном // Укр. біохім. журн. –. –Т. 74, № 6. –С. 83–.
23. Соколовська А.С., Платонова Т.М., Гриненко Т.В., Чернишенко Т.М. Порівняльна характеристика методів визначення вмісту фібриногену в плазмі крові // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. –. –№ 3 –С. 82–.
24. Юсова Е.И., Гриненко Т.В., Волков Г.Л. Способ определения количества антистрептокиназных антител // Гематологія і переливання крові: Міжвід.зб. –Київ, 2002 –Т. 31 –С. 345–.
25. Соколовская Л.И., Макогоненко Е.М., Гриненко Т.В., Седерхольм-Вильямс С.А. Роль лизин-связывающих участков в активации плазминогена стрептокиназой // Укр. биохим. журн. – 2003. – Т. 75, № 2. – С. 25–32.
26. Гриненко Т.В. Альфа-2-антиплазмін інгібує процес активації плазміногена тканинним активатором на фібрині // Кровообіг та гемостаз ––№ 3. –С. 49–.
27. Юсова Е.И., Гриненко Т.В., Волков Г.Л. Влияние стрептокиназы на взаимодействие б-2-антиплазмина с различными участками молекулы плазмина // Укр. биохим. журн. –. –Т. 76, № 2. –С. 98–.
. Задорожна М.Б., Гриненко Т.В., Юсова О.І., Волков Г.Л. Зв’язування б-2-антиплазміну з фібриногеном/фібрином та їх фрагментами без участі фактора ХІІІ // Укр. біохім. журн. ––Т. 76, № 5. –С. 42–.
. Гриненко Т.В., Задорожна М.Б., Платонова Т.М., Волков Г.Л. Інгібуванняб-2-антиплазміном процесу активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині DDЕ-комплексі та DD-димері // Укр. біохім. журн. –. –Т. 77, № 5. –С. 45–.
. Гриненко Т.В., Задорожна М.Б., Юсова О.І. Регуляція б-2-антиплазміном процесу активації Glu-плазміногену тканинним активатором на фібрині // Укр. біохім. журн. –. –Т. 78, № 3 –С. 106–.
31. Гриненко Т.В., Юсова Е.И., Волков Г.Л. Вплив антистрептокіназних антитіл на активацію плазміногену стрептокіназою та комплексом плазмін-стрептокіназа // Лаб. діагностика. –. –Т. 2, № 40. –С. 60–.
32. Пат. UA 53146 C2. Спосіб виділення високоочищеного A-антиплазміну з плазми крові людини: Пат. UA 53146 C2 Гриненко Т.В., Макогоненко Є.М., Юсова О.І., Задорожна М.Б., Волков Г.Л.; Заявл. 22.03.2002; Опубл. 15.01.2003, Бюл. № 1.
33. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Веревка С.В. Влияние аминокапроновой кислоты и аргинина на взаимодействие плазминогена с фибрином и его фрагментами // IV Всесоюзный симпозиум „Инженерная энзимология”. – Киев, 1983. – С. 85.
34. Гриненко Т.В., Третьяченко В.Г., Кудинов С.А. Локализация плазминоген-связывающих участков на молекуле фибриногена и его фрагментах // IV симпозиум СССР-Италия „Макромолекулы в функционирующей клетке”. –Киев, 1984. –С. 43.
. Гриненко Т.В., Лежен Т.І. Структурно-функціональні аспекти міжбілкових взаїмодій плазміногену та фібриногену в системі фібринолізу // Тези V Українського біохімічного з’ізду – Івано-Франківськ, 1987. – С. 40.
36. Гриненко Т.В., Скоморовська О.В., Золотарьова Е.М. Вплив появи Х-фрагменту на фібрин-зв’язуючі властивості Глу-плазміногену // Тези VІ Українського біохімічного з’ізду. –Київ, 1992. –С. 90.
37. Гриненко Т.В., Скоморовская Е.В., Золотарева Э.Н., Кудинов С.А. Изучение комплексообразования различных форм плазминогена с фибрином // III симпозиум „Химия протеолитических ферментов”.– Москва, 1993. – С. 80.
38. Skomorovskaya E.V., Grinenko T.V., Platonova T.N. Interaction between Glu-plasminogen and Lys-plasminogen with Dн-dimer // Abstracts of XVth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, June 11-16, 1995, Jerusalem (Israel) / Thrombosis and Haemostasis. – 1995. – Vol. 73, № 6. –P. 1136.
39. Grinenko T., Slominski A., Makogonenko E., Skomorovskaya- Prokvolit E., Yusova E., Cederholm-Williams S. Catalytic properties of plasmin in complex with antiplasminogen monoclonal antibody IV-1c // Abstracts of XVth International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, June 25-29, 2000, Hamamatsu (Japan) / Fibrinolysis and Proteolysis –. –Vol. 14, № 1. –P. 70.
40. Гриненко Т.В., Семьошкіна Т.В. Швидкість гідролізу фібрину різними формами плазміногену, активованого стрептокіназою за присутності б-2-антиплазміну // Тези VIII Українського біохімічного з’їзду, 1-3 жовтня 2002, Чернівці / Укр.біохім.журн. – 2002. – Т.74, № 4Б (додаток 2) – С. 25-26.
1. Grinenko T., Volkov G., Gavriliuk O., Yusova O., Zadorozhnaya M. Triple affinity columns package for step high purificvation of the alpha-2-plasmin inhibitor and histidine-rich glycoprotein directly from human plasma // Abstracts of the second Product biotechnology meeting. – Curasao (Netherlands Antilles), 2003. – Р. 66.
42. Гриненко Т.В., Юсова О.І. Порівняння активаторних та протекторних властивостей нативної стрептокінази та її 36 кДа фрагмента // Матеріали науково-практичної конференції „Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії”, 18-20 2005, Чернівці / Буковинський медичний вісник –. –Т. 9, № 2. –C. 75-76.
3. Grinenko T., Yusova O. Activation of Glu-, Lys- and mini-plasminogen by equimolar quantities of streptokinase 36 kDa fragment and effect of fibrin on this process. // Abstracts of 18th International Congress on Fibrinolysis and Proteolysis, August 21-31, 2006, San Diego (USA) / J. Intern. Soc. Thrombosis and Haemostasis – 2006. – Vol. 4. –P. 191.
44. Гриненко Т.В. Міжбілкові взаємодії плазміногену/плазміну в регуляції фібринолізу // Матеріали ІХ Українського біохімічного з’їзду. –Харків, 2006. –С.16.
45. Grinenko T.V., Volkov G.L., Yusova E.I. Influence of the streptokinase 36 kDa fragment on the plasmin activity. // Abstracts of XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, July 6-12, 2007, Geneva (Switzerland) / J. Thromb. and Haemost. –. –Vol 5, Suppl. 2. –P-T-394.
АНОТАЦІЯ
Гриненко Т.В. Регуляція фібринолізу некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора білогічних наук за спеціальністю 03.00.04 –біохімія. –Інститут біохімії ім О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2007.
Робота присвячена вивченню механізмів регуляції фібринолітичного процесу. Досліджено взаємодію плазміногену/плазміну з фібриногеном/ фібрином, її роль в регуляції швидкості гідролізу фібрину.
Визначено відповідність центрів комплексоутворення окремих доменів молекул плазміногену/плазміну та фібриногену/фібрину. Установлено послідовність взаємодій молекул ферменту та субстрату за участі комплементарних центрів, яка визначає швидкість гідролізу фібрину. Визначено ключові стадії, які ініціюють процес гідролізу фібрину та регулюють його швидкість.
Показано появу нових плазміноген-зв’язувальних центрів на стадії фібрин(оген)олізу –утворення Х-фрагменту. Взаємодія з ними плазміногену змінює його конформацію на просторово витягнуту форму. Запропоновано механізм регуляції швидкості гідролізу фібринового згустка. Згідно з ним зміна конформації Глу-плазміногену забезпечує переміщення проферменту на центри, що існують в молекулах фібрину. В такий спосіб відбувається підвищення локальної концентрації плазміногену, збільшення швидкості його активації та швидкості гідролізу фібрину плазміном, що утворюється.
Установлено, що -антиплазмін контролює швидкість гідролізу фібрину, пригнічуючи активацію плазміногену тканинним активатором.
Установлено, що всі етапи процесу фібринолізу: білок-білкові взаємодії, активація, інгібування, гідроліз фібрину регулюються некаталітичними ділянками молекул плазміногену/плазміну. Обгрунтовано, що функціональна активність плазміногену/плазміну визначається структурними відмінностями центрів зв’язування кринглових доменів, злагодженою одночасною дією декількох центрів зв’язування, конформаційною мінливістю молекули та можливістю переключенням внутрішньомолекулярних взаємодій на міжмолекулярні.
Ключові слова: фібриноліз, плазміноген, плазмін, фібрин, б-антиплазмін, стрептокіназа, міжмолекулярні взаємодії, механізми регуляції.
АННОТАЦИЯ
Гриненко Т.В. Регуляция фибринолиза некаталитическими участками молекул плазминогена/плазмина. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора билогических наук по специальности 03.00.04 –биохимия. Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2007.
Работа посвящена изучению механизмов регуляции фибринолитического процесса на уровне белок-белковых взаимодействий, обусловленных некаталитическими участками молекул плазминогена/ плазмина.
Исследование взаимодействия Глу- и Лиз-плазминогена с фибриногеном и его фрагментами, нативным и частично гидролизованным фибрином позволило определить доменную локализацию центров комплексообразования молекул плазминогена/плазмина с фибриногеном/ фибрином. Установлено, что в Е домене фибрин(оген)а экспонирован центр связывания плазминогена, комплементарный участку крингла 1-3. Во время полимеризации фибрина в его D-доменах экспонируются центры, комплементарные участку крингла 5 плазминогена. На начальных стадиях гидролиза, при расщеплении С-концевых областей -цепей молекул фибрина, появляются новые центры, соответствующие участку крингла 4 плазминогена.
Показано, что на частично гидролизованном фибрине, по сравнению с нативным, количество адсорбированного Лиз-плазминогена не изменяется, тогда как таковое Глу-плазминогена увеличивается на порядок, повышается его сродство к фибрину, увеличиваются скорость активации тканевым активатором и скорость гидролиза фибрина.
На основании полученных данных предложен механизм регуляции скорости гидролиза фибринового сгустка, согласно которому при взаимодействии плазминогена кринглом 4 с центрами, образующимися на начальных стадиях гидролиза, конформация профермента меняется таким образом, что участки кринглов 1-3 могут взаимодействовать с комплементарными им центрами, которые существуют в молекулах фибрина. Плазминоген, перемещаясь на эти центры, открывает доступ к взаимодействию с фибрином следующим молекулам профермента. Таким образом, в местах первичного связывания плазминогена на фибрине при образовании ограниченного количества новых плазминоген-связывающих центров происходит увеличение локальной концентрации профермента, что приводит к увеличению скорости его активации и быстрому разрушению фибринового сгустка.
Обосновано положение, что стадия образования Х-фрагмента является ключевой в регуляции скорости разрушения фибринового сгустка фибринолитической системой. На этой стадии происходит увеличение количества связанного с фибрином Глу-плазминогена, его сродства к фибрину, скорости активации и скорости гидролиза.
Исследование роли крингловых доменов в выполнении плазмином гидролитической функции показало, что на ранних стадиях при появлении Х-фрагментов скорость гидролиза фибриногена плазмином в большей мере зависит от участка связывания крингла 5, тогда как с началом разрушения Х-фрагментов она определяется участками кринглов 1-3 и 4. Показано, что кринглы 1-3 и 4 снижают скорость гидролиза фибрина плазмином. Ингибирующий эффект этих фрагментов усиливается при одновременном присутствии их в реакционной среде. Синергизм действия свидетельствует о важном значении кринглов 1-3 и 4 в разрушении фибринового сгустка плазмином.
На основании результатов исследований предложена гипотеза, согласно которой взаимодействие некаталитических участков молекул плазмина с соответствующими центрами молекул субстрата обеспечивает перемещение фермента по DDE-триадам протофибрилл и ориентацию активного центра на гидролиз неупорядоченных областей в суперспирализованной междоменной части молекул фибрина, вследствие чего расщепление протофибрилл является строго направленным процессом.
Установлено, что -антиплазмин может быть регулятором фибринолитического процесса. Он контролирует скорость гидролиза фибрина, ингибируя активацию плазминогена тканевым активатором.
Показано существование неферментативного пути активации Глу- плазминогена в присутствии Е-фрагмента фибриногена. Е-фрагмент формирует в проферменте активный центр и индуцирует каталитическую активность. Комплекс плазминоген–Е-фрагмент проявляет небольшую, по сравнению с плазмином, фибринолитическую активность и активирует субстратный плазминоген. Е-фрагмент не защищает плазмин от ингибирования -антиплазмином. Полученные результаты свидетельствуют, что Е-фрагмент может влиять на фибринолитический процесс по механизму отрицательной обратной связи, уменьшая концентрацию потенциально активного плазминогена в кровяном сгустке.
В результате проведенных исследований определена регуляторная роль лиганд-связывающих участков различных доменов молекулы плазминогена/ плазмина на всех этапах фибринолитического процесса.
Предложены способы количественного определения основных компонентов фибринолитической системы с использованием фибрина в качестве субстрата.
Ключевые слова: фибринолиз, плазминоген, плазмин, фибрин, б-антиплазмин, стрептокиназа, межмолекулярные взаимодействия, механизмы регуляции.
SUMMARY
Grinenko T.V. Regulation of fibrinolysis by noncatalytic sites of plasminogen/plasmin molecule. –Manuscript.
Thesis for a scientific degree of doctor of biological sciences by speciality 03.00.04 –Biochemistry. –Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv, 2007.
The thesis describes the research of the mechanism of fibrinolysis regulation. It was investigated the plasminogen/plasmin interaction with fibrinogen/fibrin and the role of this interaction into regulation of fibrin hydrolysis rate.
It was determined the accordance of complex-formation centers from separate domains of plasminogen/plasmin and fibrinogen/fibrin molecules. It was declared, that the fibrin hydrolysis rate was determined by sequence of interactions between enzyme and substrate. It was postulated key stages initiated the process of fibrin hydrolysis and controls its rate.
The appearance of new plasminogen-binding sites on fibrino(geno)lytic stage of the X-fragment formation was showed. Plasminogen interacts with these sites and its conformation shall be changed at extended one. Mechanism of fibrin clot hydrolysis rate regulation was proposed. It based on data that plasminogen, after its conformation changing, can be transfered from one site to another within fibrin clot. This moving led to increasing of local concentration of proenzyme, its activation rate and rate of fibrin hydrolysis.
It was declared that б-antiplasmin served a regulation of fibrinolysis. It inhibited of plasminogen activation on fibrin by tissue activator and subsequent lysis of fibrin clot was inhibited as well.
It was concluded that all process of fibrinolysis –protein-protein interactions, activation, inhibition, fibrin hydrolysis –were regulated by noncatalytic sites of plasminogen/plasmin molecule. It was founded, that functional activity of plasminogen/plasmin was determined by structural differences of binding sites of kringles domains, multisites interactions, simultaneous act of several binding sites, conformational possibility of molecules and the possibility of molecules changes intra- on inter-molecular interactions.
Key words : fibrinolysis, plasminogen, plasmin, fibrin, б-antiplasmin, streptokinase, inter-molecular interactions, regulation mechanism.