Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ
ім. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО
ТОВКАЧ ФЕДІР ІВАНОВИЧ
УДК 578.262.8:579.842.24
ЛІЗОГЕНІЯ І БАКТЕРІОФАГИ ERWINIA CAROTOVORA
03.00.06 - вірусологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня доктора
біологічних наук
КИЇВ - 2002
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у відділі вірусів мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Менджул Михайло Іванович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, завідувач відділу вірусів водоростей
доктор біологічних наук, професор, академік УААН Бойко Анатолій Леонідович, Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, завідувач кафедри вірусології
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Швед Анатолій Давидович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу молекулярної вірусології
Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб
ім. Л.В.Громашевського АМН України.
Захист відбудеться “”грудня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м.Київ, вул. Заболотного, 154.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154.
Автореферат розісланий 4 листопада 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник Пуріш Л.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Сутність явища лізогенії полягає в структурно-фізіологічній взаємодії між помірним бактеріофагом і бактерією-господарем. За певних обставин геном бактеріофага стає складовою частиною бактеріального геному і успадковується бактерією як профаг. Лізогенія притаманна всім бактеріям і виражає найвищий ступінь пристосування паразита до умов оточуючого середовища. Лізогенний стан є унікальним в кожному конкретному випадку і детально досліджений лише для небагатьох бактеріально-фагових систем. Стан профага потенційно небезпечний не тільки для бактерії-носія. Помірні бактеріофаги переносять генетичні детермінанти патогенності і зумовлюють вірулентність бактерій. З іншого боку, вони суттєво впливають на біотехнологічні процеси, викликаючи непередбачуваний фаголізис продуцентів важливих мікробних продуктів. Отже, дослідження конкретних лізогенних систем є актуальним як в теоретичному, так і в практичному аспектах.
Пошук і дослідження нових бактеріофагів мають не менше значення, ніж вивчення лізогенії. Фаги –найпростіші живі істоти, про походження яких невідомо до цього часу, а концепція “виду”для них не сформульована остаточно. Бактеріофаги завжди виступають як прості модельні об'єкти молекулярної біології і мають велике практичне значення, як неперевершені інструменти в молекулярно-генетичних дослідженнях бактерій.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках НДР відділу вірусів мікроорганізмів за темами: “Структурно-функціональний аналіз генів та генетичних модулів помірних фагів Erwinia carotovora, 01.9.10_057062 (виконавець); “Вивчити вплив епісом на патогенні властивості пектолітичних ервіній з метою прогнозування та попередження хвороб сільськогосподарських рослин”, 0196U003718 (керівник); “Природні популяції мікроорганізмів, що включають пектолітичні ервінії: взаємовідношення членів популяції –бактерій, бактеріофагів, бактеріоцинів і плазмід”, 0195U027808 (керівник); “Полілізогенія і помірні бактеріофаги пектолітичних фітопатогенних ервіній”, 0195U027809 (виконавець); “Т7–подібні бактеріофаги у бактерій роду Ервінія: властивості та використання”, 0197U015460 (керівник).
Мета і задачі дослідження. Проблема, яка вирішувалася в ході виконання роботи –явище лізогенії у практично важливих фітопатогенних пектолітичних бактерій Erwinia carotovora, збудників м'якої гнилі рослин.
Мета роботи –виявити і визначити природу лізогенного стану та дослідити бактеріофаги E.carotovora, а також встановити зв'зок між лізогенією, бактеріоциногенністю і позахромосомними факторами (плазмідами) у цих бактерій.
Для досягнення мети передбачалося розв'язати наступні задачі:
- дослідити поширення та вивчити загальні властивості бактеріоциногенності у E.carotovora;
- визначити тип лізогенії та її взаємозв'язок з бактеріоциногенністю E.carotovora;
- знайти та охарактеризувати життєздатні бактеріофаги і встановити причини підвищеної стійкості пектолітичних ервіній до літичної дії фагів;
- провести порівняльне вивчення близькоспоріднених помірних ервініафагів 49 і 59;
- дослідити позахромосомні фактори і розглянути їх відношення до лізогенного стану E.carotovora;
- визначити вплив лізогенії, бактеріоциногенності і плазмід на популяційну дисоціацію штамів пектолітичних ервіній;
- розглянути можливість застосування бактеріофагів, бактеріоцинів та плазмід у дослідженнях молекулярної генетики фітопатогенних ервіній.
Об'єктом дослідження були фітопатогенні пектолітичні бактерії E.carotovora та таксономічно близькі до них аміловороподібні фітопатогени E.horticola.
Предмет дослідження: SOS-індуковані клітинні фактори –помірні бактеріофаги та бактеріоцини (каротоворіцини); вірулентні бактеріофаги; внутріклітинні позахромосомні фактори (плазміди).
Наукова новизна одержаних результатів. Результати роботи суттєво доповнюють наукові уявлення про лізогенію як невід'ємну рису бактеріального світу й унікальне явище для кожного виду бактерій.
В роботі вперше виявлена дефектна полілізогенія, біологічним проявом якої є бактеріоциногенність пектолітичних фітопатогенних бактерій E.carotovora. Дефектна полілізогенія - видова ознака цих бактерій. В межах одного і того ж штаму дефектний лізогенний стан пектолітичних ервіній є множинним і визначається кількома різними неповними бактеріофагами. Експресія генів дефектних профагів цих бактерій призводить не до утворення цілісної фагової частки, а до синтезу окремих її компонентів –головки, хвостового відростка і базальної пластинки. Хвостові відростки дефектних фагів (макромолекулярні бактеріоцини) E.carotovora виступають основними кілерними факторами щодо споріднених бактерій.
Встановлено, що бактеріоциногенність E.carotovora визначається бактеріоцинами двох видів –макромолекулярними каротоворіцинами (MCTV) і коліцинподібними каротоворіцинами (CCTV). На основі взаємопов'язаних показників лізисної активності та бактеріоциночутливості штамів-носіїв проведена класифікація MCTV E.carotovora. Запропоновано оригінальний метод виявлення макромолекулярних каротоворіцинів (біологічно активних дефектних бактеріофагів) необмеженої кількості штамів пектолітичних ервіній. Суть методу полягає в застосуванні набору бактеріальних мутантів, стійких до дії налідіксової кислоти, як бактеріоциночутливих індикаторів. Показано, що хвостові відростки дефектних бактеріофагів –зручна модельна система для вивчення самозбирання елементарних біологічних структур in vitro. Її використання привело до відкриття центрів самоорганізації (полімеризації) нових надмолекулярних структур вірусної природи.
Вперше було знайдено новий життєздатний помірний бактеріофаг ZF40, який здатний обумовлювати справжню лізогенію у E.carotovora. З його допомогою у пектолітичних ервіній виявлено три основні причини фагостійкості: обмеження розвитку фагів на рівні адсорбції, заборону внутріклітинного розвитку системою рестрикції клітини-господаря і обмеження за рахунок розповсюдження гомоімунних помірних бактеріофагів у E.carotovora.
Результати одержані при порівнянні двох помірних ервініафагів 49 і 59 підтвердили їх рекомбінаційне походження і дали можливість наблизитись до розуміння справжньої лізогенії у бактерій роду Erwinia.
Вперше отримані достовірні дані стосовно плазмідного складу E.carotovora. Показано, що біля 30% штамів цих бактерій несуть позахромосомні ДНК різного розміру. Ці елементи пектолітичних ервіній не беруть участі у формуванні стійкості до антибіотиків і не мають генетичних детермінант для синтезу хвостових відростків дефектних бактеріофагів та коліцинподібних каротоворіцинів.
Вперше встановлено, що при тривалому зберіганні штамів, особливо підвиду atroseptica, відбувається популяційна дисоціація E.carotovora. При цьому спостерігається множинна зміна фенотипу, яка стосується антибіотикостійкості та росту клітин на певних селекційних середовищах. Зрідка дисоціація стосується зміни синтезу CCTV. Показано, що гетерогенність популяції не обумовлена втратою криптичних плазмід і, скоріше за все, пов'язана із перебудовою бактеріального геному E.carotovora.
В процесі пошуків вперше виявлено новий вірулентний фаг F44, який здатний репродукуватися в клітинах різних представників родів Erwinia і Pseudomonas, а також - в E.coli. Важливим є те, що фаг F44 може інфікувати пектолітичні фітопатогенні ервінії з певними порушеннями в синтезі ліпополісахариду (ЛПС) зовнішньої клітинної оболонки. Вперше здійснено застосування оригінальної модельної системи фаг F44 –E.horticola, яке привело до вивчення позаклітинної супресії у ервіній.
В роботі вперше показано, що рецепторами для фагів і каротоворіцинів є ЛПС клітинної оболонки. Для адсорбції частинок фага ZF40 і хвостових відростків дефектних фагів рецептором виступає О–ланцюг ЛПС, тоді як місця прикріплення вірулентних фагів F44 і Т7 розміщені у коровій частині молекули (R –ЛПС).
Науково-практичне значення результатів, приведених у дисертації. В результаті проведеної роботи створено підґрунтя для вивчення молекулярної генетики важливих фітопатогенних бактерій із застосуванням їх власних генетичних елементів –бактеріофагів, бактеріоцинів і плазмід. Наступний етап досліджень E.carotovora може включати вирішення проблеми впливу лізогенії і помірних бактеріофагів різної природи на патогенний процес. З наукової точки зору перспективним є вирішення проблеми функціональної та структурної організації часток дефектних бактеріофагів E.carotovora. Виявлені нами центри самоорганізації нових надмолекулярних утворів MCTV можуть мати самостійне наукове значення для вирішення проблеми самозбирання елементарних біологічних структур in vitro. Біологічно активні хвостові відростки дефектних бактеріофагів можуть служити важливими інструментами для біоконтролю фітопатогенів в оточуючому середовищі. Запропонована в роботі загальна схема бактеріоцинотипування поряд з визначенням пектолітичної активності може бути рекомендована для ідентифікації E.carotovora з метою попередження хвороб сільськогосподарських рослин та виробничих втрат рослинної продукції.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу сплановано і виконано автором особисто. Здобувач –одноосібний автор центрального положення дисертації про те, що бактеріоциногенність E.carotovora є біологічним проявом її дефектних помірних бактеріофагів (дефектної лізогенії). Ідеї, гіпотези і наукові положення, а також теоретична розробка нових методичних положень повністю належить здобувачу. Дослідження в рамках планових та грантових НДІ проводились за керівництва та особистою участю здобувача. Отримані результати обговорено та опубліковано в спільних роботах. Автор висловлює подяку за плідне співробітництво соїм колегам: кандидатам біологічних наук Ю.А.Григоряну, В.І.Рубану, Т.Ю.Горб, М.С.Муквичу, С.М.Мороз, О.О.Дідик, М.В.Яговдик, С.К.Воцелко, А.О.Бондарчук; інженерам Т.В.Шевченко та І.І.Ромасю; студенту А.Ф.Товкачу. Автор висловлює вдячність за постійну увагу і зацікавленість до роботи, а також за участь у дослідженнях бактеріофагів і бактеріоцинів д.б.н., професорам Р.І.Гвоздяку та В.В.Данилейченку. Автор щиро вдячний К.П.Гущі, С.І.Бардакову і Н.І.Шевченко за кваліфіковану технічну допомогу. Автор глибоко вшановує пам'ять д.б.н., професора Я.Г.Кішко, який започаткував вивчення лізогенії і бактеріофагії на Україні і був ініціатором цих досліджень.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на: IV з'їзді Українського мікробіологічного товариства (м. Донецьк, 1984 р.); Всесоюзному Симпозіумі, присвяченому 60-річчю Тбіліського НДСВС (м.Тбілісі, 1984 р.); Х конгресі мікробіологічного товариства Угорщини (м.Сегед, 1987 р.); XII Міжнародній конференції по електронній мікроскопії (м.Дрезден, 1988 р.); Міжнародному конгресі “Молекулярна організація біологічних структур”(м. Москва, 1989 р.); Республіканській конференції “Фітонциди. Бактеріальні хвороби рослин”(м. Львів, 1990 р.); Всесоюзній конференції “Мікробіологічні і біотехнологічні основи інтенсифікації рослинництва і кормовиробництва”(м. Алма-Ата, 1990), Міжнародній конференції “Мікробіологія і біотехнологія XXI століття”(м. Мінськ, 2002 р.)
Публікації. За темою дисертації опубліковано 35 наукових праць, в тому числі 23 статті у фахових виданнях. Пошукач –автор 10 особистих публікацій в центральних фахових журналах.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, основної частини, яка включає 5 розділів власних досліджень і розділ “Об'єкти, матеріали і методи досліджень”, та висновків. Роботу викладено на 297 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 45 таблицями і 50 рисунками. Список використаних джерел містить 316 найменувань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
РОЗДІЛ 1. ЛІЗОГЕНІЯ І БАКТЕРІОЦИНОГЕННІСТЬ БАКТЕРІЙ (ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ)
Огляд літератури складається з двох підрозділів, які містять сучасну інформацію про лізогенію і віруси бактерій. У підрозділі “Бактеріальні віруси”розглянуто розповсюдження, класифікацію, спорідненість, походження та еволюцію бактеріофагів. Підвищену увагу приділено способам реалізації фагових генетичних програм (стратегія фагового геному), особливостям лізогенних систем та лізогенній фаговій конверсії. Другий підрозділ огляду стосується дефектної лізогенії і бактеріоциногенності у бактерій. На основі аналізу літературних джерел показано актуальність теми дисертаційної роботи та обгрунтовано доцільність проведення досліджень лізогенії і бактеріофагів важливих фітопатогенних бактерій E.carotovora.
РОЗДІЛ 2. ОБ'ЄКТИ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
В роботі використано 104 штами фітопатогенних пектолітичних бактерій E.carotovora і 7 штамів аміловороподібних бактерій E.horticola. Для різнопланових дослідів застосовані лабораторні штами ентеробактерій, псевдомонад, ксантомонад та агробактерій. Фаги ентеробактерій Е105, T2L, T4D, Т4amH11, Т7М, цII, P22, MS2, TuIIb, Ox2, л(papa), лCI857S7 і P1ctsCMr виступали як допоміжні об'єкти при вивченні лізогенії E.carotovora.
В роботі прийняті наступні позначення. Для штамів: E.carotovora підвидів . “carotovora”і “atroseptica”, а також E.aroideae - ECA, EAT і EAR, відповідно. Назви “макромолекулярний каротоворіцин”і “коліцинподібний каротоворіцин”позначені нами як “MCTV”і “CCTV”, відповідно. Для штамоспецифічних макромолекулярних каротоворіцинів вжито термін, який включає назву роду (E –Erwinia), підвиду (ca –carotovora, at –atroseptica, sp –підвид невідомий), а також номер штаму. Якщо вид MCTV ідентифіковано як бактеріоцин типу фагового хвостового відростка (хвостовий відросток дефектного бактеріофага), застосовано позначення TLCA (for tail-like carotovoricins).
Клітини E.carotovora культивували в повноцінних рідких середовищах LB, №1 і мінімальному середовищі А, або А з 1% пектином. Температура росту для E.carotovora, Erwinia spp., Pseudomonas spp., Xanthomonas spp. і Agrobacterіum spp. (LB-середовище) складала 25оС. Клітини Escherichia coli вирощували добу в середовищі LB при 37оС. Бактеріальні мутанти, лізогени та дисоціанти клонували не менше 2-х разів на відповідному агаризованому середовищі - LB, №1, АП і МПА. Фенотипові ознаки перевіряли в процесі отримання чистих ліній бактерій та їх мутантних форм.
Бактеріофаги титрували методом двошарового агару. Чисті лінії фагів одержували з окремих негативних колоній. Кожна лінія була результатом не менше ніж 5 пасажів фага на чутливому штамі.
Для індукції каротоворіцинів добову культуру (2 –х109 кл/мл) розводили в 20 разів у середовищі А, вирощували ще 3 год без аерації і додавали відповідний індуктор - мітоміцин С (МС), або налідіксову кислоту (НК). Кінцеві концентрації МС і НК складали 1 і 20 мкг/мл, відповідно. Лізати обробляли хлороформом, освітлювали центрифугуванням і зберігали при 4оС. Концентрацію бактеріоцинів виражали в плямоутворюючих одиницях на мл (ПУО/мл), або визначали за процентом клітин, які виживали після лізису каротоворіцинами (летальна доза –LD37%). Одиниця летальної дози відповідала кілерній активності MCTV - Aе.
В роботі запропоновано принципово новий підхід для вивчення бактеріоциногенності у E.carotovora. Як і у випадку бактеріофагів, каротоворіцини досліджували методом двошарового агару. Нижній шар містив 1,2%-ний агар LB, а верхній –м'який агар (0,5%), НК і клітини індикатора Nalr (чашки НКК). Досліди проводили за такою схемою. Налідіксову кислоту (20 мкг/мл) і суспензію клітин Nalr–мутанта додавали до м'якого разплавленого агару. Суміш ретельно перемішували і нашаровували на чашку з нижнім агаром. Клітини ервіній висівали за 2-3 доби до проведення досліду на звичайні LB-чашки. Бактерії переносили з матричних чашок на чашки НКК голковими реплікаторами. Використовували також рідкі суспензії клітин тестованих штамів. Суспензії (5х108 - 4х109 клітин/мл) або їх розведення об'ємами по 3 - 5 мкл наносили на чашки НКК і інкубували при 25 оС. Результати дослідів ураховували через 18 –год.
Частки дефектних фагів E.carotovora концентрували й очищали дворазовим ультрацентрифугуванням (ротор SW28, Spinco L8-70, 24000 об/хв, 80 хв) і зберігали в 1 мл буферу SТ (10 мМ NaCl, 50 мМ Трис-НСl, рН 7,5).
Вивчення біологічних властивостей лізогенії і бактеріофагів проводили з використанням стандартних методів (Миллер, 1976). Коло бактерій-господарів для фагів встановлювали з використанням максимально можливого набору бактеріальних штамів.
Бактеріофаги 49, 59, Е105, F44, ZF40, Т2, Т4, цII, Т7, Ох2, ТuIIb і MS2 отримували методом зливного лізису в концентраціях 1–х1011 БУО/мл. Помірні коліфаги л і Р1 виділяли методом термоіндукції.
Фагові частки концентрували центрифугуванням (26000 об/хв, ротор SW-28, 60 хв). Віріони очищали з допомогою ступінчатого й ізопікнічного центрифугування в хлористому цезії. Для фага ZF40, крім очищення в ступінчатому градієнті (1,4 і 1,6 г/см3, ротор SW-55, 40000 об/хв, 5 год), використовували дворазове диференційне центрифугування, метод освітлення лізатів (Девис с соавт., 1984) та гельфільтрацію на колонці з сефарозою 2В (8х200 мм). Частки фага ZF40 зберігали в буферах STM (50 мм NaCl, 50 мМ Трис-НСl, рН 7,5, 20 мМ MgSO4,) або STMG (STM + 100 мкг/мл желатини).
При електронномікроскопічних дослідженнях за стандарт розміру приймали довжину відростка бактеріофага Т4D - 113 нм (Ackermann, Krisch 1997).
Вивчення поліпептидного складу високоочищених фагових хвостових відростків і цілісних віріонів проводили за (Laemli, Favre, 1973).
Для виділення фагової ДНК послідовно змішували: 600 мкл очищеної фагової суспензії, 50 мкл 20%-ного розчину ДСН, 50 мкл пронази В (3 мг/мл) і 50 мкл 250 мМ Na2EDTA. Суміш інкубували 10 хв при 60 оС, додавали 200 мкл 5 М NaCl і здійснювали депротеїнізацію фенолом. ДНК осаджували 80%-ним етанолом. Суміш для рестрикції ДНК включала 5 мкл зразку, 2 мкл відповідного 10-ти кратного буферу для рестрикції, 1 - 2 мкл ендонуклеази (від 1 до 4 одиниць активності) й 11 - 12 мкл Н2О. Рестрикційні фрагменти розділяли в 0,5 - 1%-них гелях агарози. Для визначення відносної молекулярної маси використовували HindIII -фрагменти ДНК фага л (лCI857S7).
Виділення плазмідих ДНК E.carotovora проводили за методом Kado, Liu (1981). Суспензію бактеріальних клітин об'ємом 1,5 мл осаджували в мікроцентрифузі. Осад ресуспендували в 100 мкл буфера Е (40 мМ Тріс-ацетат, рН 7,9, 2 мМ Na2ЕДТА), а потім змішували з двома об'ємами лізисного розчину (50 мМ Трис-НCl, pH 12,6, 3% ДСН). Препарати прогрівали протягом 30 - 60 хв у водяному ультратермостаті при температурі 55оС і обробляли сумішшю кислого фенолу та хлороформу (1:1 за об'ємом). Після центрифугування лізатів водну фазу обережно відбирали пластмасовою піпеткою з розширеним кінцем. Для електрофорезу плазмідної ДНК використовували 0,7 - 1,0%-ні агарозні гелі. Розмір ДНК визначали за сумою рестрикційних фрагментів або з застосуванням референсних плазмід: pTi-C58(119 мД), F(63 мД), RP4(36 мД), RSF1010(5,7 мД) і pUC18 (1,75 мД).
Штами E.coli і S.typhimurium з плазмідами трьох груп несумісності (N, J і P) використовували як донори в транскон'югаційних дослідах. Для їх контрселекції застосовували тверде середовище АП з відповідним антибіотиком. Інкубаційні суміші містили рівні пропорції донора і реципієнта (штами E. carotovora). Після контакту (4 год, при 25оС) суміш висівали на селективні чашки. Фаг Т7 і MCTV використовували для додаткової ідентифікації донорних і реципієнтних штамів.
Мутанти E.carotovora, стійкі до налідіксової кислоти (Nalr), були отримані за (Милером, 1976). Для спонтанних мутантів ЕСА 62А, стійких до MCTV (тип RC), визначали здатність підтримувати розвиток фагів F44, Т7 і ZF40, а також чутливість до різних бактеріоцинів. Ауксотрофи His- одержували мутагенезом E.horticola 450 2-амінопурин нітратом та гідроксиламіном. Для тестування супресорних мутантів використовували дикий штам E.horticola 450 (su-- фенотип), E. coli gA120 (su-), HB 101 (supF44/su2+) та дикий тип фагу F44 з його amber-мутантами.
Популяційна дисоціація була досліджена у штамів ЕСА і ЕАТ, які зберігалися 16 років без пересівів. Ці штами E. carotovora розсівали до окремих колоній на LB-агарі, на лактозних агарах МС і ЕМВ.
Лізогенні варіанти чутливих штамів для фагів 49, 59, ZF40 і F44 одержували із вторинного росту культур в негативних фагових колоніях. Лізогени перевіряли на чутливість до гомологічного фага і на його спонтанний вихід. Clear-мутанти фага 49 одержували мутагенезом 1М гідроксиламіном (Девис с соавт., 1984).
Виділення ліпополісахарида (ЛПС) із клітинної стінки E.horticola 450 проводили після одержання L-мембран, які обробляли проназою В (200 мкг/мл) при 60 °С протягом 10 хв і депротеїнізували фенолом рН 8,1 (DePamphilis, Adler, 1971). Очищені препарати ЛПС були отримані методом ізопікнічного центрифугування в градієнті хлористого цезію. Для виділення ЛПС із клітин E.carotovora застосовували класичний фенольний метод (Westphal, Jann, 1965), або використовували обробку клітин Na2ЕDТА. В останньому випадку препарати ЛПС обробляли ДНК-азою І та РНК-азою. Далі їх очищали градієнтним центрифугуванням у CsCl. Стадія кінцевої очистки препаратів ЛПС з допомогою обробки фенолом була альтернативою градієнтному центрифугуванню. Чистоту одержаних препаратів ЛПС оцінювали методом спектрофотометрії в області 180-300 нм. Препарати ЛПС зберігали при 4оС. Для визначення моносахаридного сладу, проводили гідроліз ЛПС 2н трифтороцтовою кислотою протягом 5 год при 100оС, гідролізати ацетилювали (Захарова, Косенко, 1982), ацетати поліолів розділяли методом газорідинної хроматографії.
РОЗДІЛ 3.
БАКТЕРІОЦИНОГЕННІСТЬ E.CAROTOVORA
SOS-індуковані фактори E. carotovorа - бактеріоцини та бактеріофаги - були одержані під дією традиційних індукторів - мітоміцину С і налідіксової кислоти. Максимальний рівень індукції виявлено в логифмічній клітин стадії росту клітин при кінцевих концентраціях МС і НК - 1 та 20 мкг/мл, відповідно. В лізатах клітин виявлено два види бактеріоцинів. Термостійкі, коліциноподібні каротоворіцини (CCTV) утворювали на бактеріальних газонах широкі зони просвітлення. Чутливі штами для CCTV виявлено серед A.tumefaciens, E.herbicola, E.chrysanthemi, Klebsiella spp. i E.carotovora. Другий вид бактеріоцинів E.carotovora, макромолекулярні каротоворіцини (MCTV), ідентифіковано за здатністю осаджуватися при ультрацентрифугуванні. Індукція тільки одного штаму із 52 досліджених (Erwinia sp. ZM-1) призвела до виходу життєздатного помірного бактеріофага ZF40.
За формою і розміром зон лізису MCTV розділено на два типи, а за лізисною активністю (процент лізованих штамів) - на шість груп. Найбільш активні із них (група I) лізують від 62 до 73% штамів E. carotovora, тоді як бактеріоцини із групи VI здатні вбивати лише окремі штами або взагалі не проявляють автивності. До гетероімунних груп ІІІ і IV входять каротоворіцини, які не відрізняються за характером лізисної активності і вбивають до 29% чутливих штамів. В групу V включено дисперсний набір бактеріоцинів.
Фітопатогенні бактерії родів Pseudomonas, Xanthomonas і Agrobacterium, а також епіфітні бактерії E. herbicola нечутливі до лізисної дії макромолекулярних каротоворіцинів. Високоактивні MCTV із групи І і ІІ ефективно вражають штами E.coli K12 і В. Отже, MCTV не виступають факторами конкурентної взаємодії в межах бактеріальної асоціації, яка заселяє вражену рослину. Чутливість деяких ентеробактерій до MCTV вказує на їх тісну спорідненість з E.carotovora.
Бактеріоциногенність E.carotovora було проаналізовано за двома кількісними показниками: чутливістю штаму до MCTV (S) і лізисною активністю власного бактеріоцина (L). Це дозволило розділити досліджувані штами на два головні бактеріоцинотипи (БТ). Бактеріоцинотип з низькою чутливістю (S=0 –%) включає 28 штамів, а БТ з чутливістю в межах 40-67% налічує 24 штами. Серед 52 штамів E. carotovora не зустрічається жодного, бактеріоциночутливість якого знаходилась би в межах 27-40%. Кореляційний зв'язок між бактеріоциночутливістю і лізисною активністю каротоворіцинів виражається співвідношенням: S = 78 - L. Тобто, із збільшенням лізисної активності MCTV зменшується бактеріоциночутливість батьківського штаму, що дає підставу розглядати макромолекулярні бактеріоцини як множинні фактори E. carotovora. Ця гіпотеза отримала підтвердження при дослідженні чутливості бактеріальних мутантів, стійких до лізисної дії 14 різних каротоворіцинів. Було, зокрема, встановлено, що високоактивний препарат MCTV Еса35А гетерогенний і складається із різних за активністю каротоворіцинів. Виявлено бактеріальні R-мутанти, які остаточно не втрачають чутливості до даного бактеріоцина.
Для виявлення каротоворіцинів у роботі вперше застосовано бактеріальні індикатори, стійкі до дії налідіксової кислоти. Інформація, отримана за допомогою цього методичного прийому, значно розширила уявлення про бактеріоциногенність E. carotovora. Застосування десяти різних мутантів, стійких до НК (мутанти RN-типу), дало можливість встановити широке розповсюдження MCTV у пектолітичних ервіній. Серед 104 перевірених штамів E.carotovora 88% (91штам) містять біологічно активні MCTV. На бактеріоциногенність ервіній не впливає місце знаходження (країна і географічний регіон), рослина-господар і вік штаму. Це вказує на сталість (консервативність) генетичних детермінант MCTV. Отже, наявність макромолекулярних каротоворіцинів можна розглядати як видову ознаку E. carotovora. Вивчення каротоворіцинів з допомогою різних індикаторів Nalr показало певну автономність (“егоїстичність”) генетичних детермінант макромолекулярних каротоворіцинів. Допускається, що вони могли набуватися різними штамами в процесі горизонтальної передачі генів. Не виключено також, що генетичні детермінанти MCTV залишаються сталими при зміні окремих характеристик штамів при адаптації Е.carotovora до умов оточуючого середовища.
Для вивчення ліпополісахариду (ЛПС) зовнішньої клітинної оболонки, як рецептора для макромолекулярних каротоворіцинів, використовували штам ЕСА 48П та два бактеріоцини –Еса13А і Еса42А. Встановлено, що MCTV здатні адсорбуватися на молекулах ЛПС, одержаних екстракцією клітин E.carotovora Na2ЕДТА з наступною ферментною та фенольною обробкою. В конкурентних дослідах було показано, що летальна доза LD37% при наявності ЛПС складає 14 од., тоді як без ЛПС її значення дорівнює 33 од. Отже, молекули ЛПС конкурують з нативними рецепторними структурами бактеріальної клітини і дійсно є рецептором для MCTV. Додаткове підтвердження цього одержано на підставі порівняння швидкостей адсорбції каротоворіцинів на нативних клітинах і ЛПС. Адсорбція на нативних клітинах - швидкоплинний процес. За перші 2 хв адсорбується більшість часток MCTV. Наступна інкубації (від 2 до 60 хв) характеризується повільним насиченням адсорбції. Швидкість адсорбції каротоворіцину Еса13А на клітинах ЕСА 48П перевищує таку на ЛПС більше, ніж в 200 разів. Отже, очищені молекули виступають як малоефективні рецептори макромолекулярних каротоворіцинів, порівняно з молекулами ЛПС в складі клітинної оболонки. Висловлено припущення, що в складі зовнішньої клітинної мембрани молекули ЛПС знаходяться в особливій структурній конформації, яка залежить від найближчого оточення іншими компонентами. Оцінка кореляційного зв'язку між вмістом цукрів у коровій частині і в О-ланцюгу ЛПС штамів з їх бактеріоциночутливістю підтвердила, що рецептором для MCTV виступає О-ланцюг ЛПС E.carotovora. Визначено, що до складу рецепторних сайтів можуть входити такі моносахариди: фукоза, ксилоза, ліпофільні моносахариди Х1 й Х2 і, ймовірно, маноза. Враховуючи те, що ЛПС E.carotovora subsp. carotovora відіграє важливу роль в патогенності цих бактерій (Pirhonen and Palva 1988; Perombelon, 1992), MCTV можуть бути використані для одержання стійких мутантів зі зміненою вірулентністю.
В роботі започатковано вивчення взаємозв'язку між бактеріоциногенністю і патогенністю пектолітичних ервіній. Патогенний процес з участю E.carotovora супроводжується утворенням комплексу екстрацелюлярних ферментів, які причетні до деструкції серединної пластинки рослинної тканини (Barras et al. 1994). Типи ферментів та форми біохімічних реакцій, які вони здійснюють, різноманітні. Зважаючи на це, можлива оцінка патогенності кожного окремого штаму на основі конкретного типу ферментативної реакції. Для оцінки патогенності часто використовується якісний облік пектолітичної активності (Slade, Tiffin, 1984). Її кількісне визначення було розроблено при виконанні цієї роботи. Встановлено, що у більшості штамів ЕСА швидкість утворення зон розрідження поліпектату натрію постійна і визначається реакцією першого порядку. Аналіз розподілу пектолітичної активності 52 штамів пектолітичних ервіній показав природну дискретність цієї ознаки. Це вказує на множинність генетичних детермінант, які визначають пектолітичну активність.
Фаги і бактеріоцини широко застосовуються в типуванні бактерій (Ackermann, Gershman, 1992; Gratia, 1989), але про використання цих простих методів у випадку E.carotovora невідомо. Спроби фаготипування штамів ервініафагами 49, 59 і Е105 виявились невдалими, оскільки ці віруси не репродукуються в клітинах пектолітичних ервіній. Зауваження деяких авторів з приводу неможливості бактеріоцинотипування і використання його як таксономічного критерію для E.carotovora (Slade,Tiffin 1984), на наш погляд, є невиправданим. По-перше, утворення MCTV цими бактеріями є стабільною генетичною ознакою, по-друге, переважна більшість каротоворіцинів суттєво не втрачає активності протягом 1-2-річного зберігання при 4оС. Для бактеріоцинотипування було застосовано набір із тих макромолекулярних каротоворіцинів, значення L у яких складає від 32% - 77%. Було встановлено, що переважну більшість штамів E. carotovora subsp. carotovora можа віднести до 4 типів –І, ІІ, ІІІ і ІV. Бактеріоцинотипи від V до ІХ включають невелику дисперсну групу штамів ЕСА, які мають низьку чутливість до застосованих бактеріоцинів. Між бактеріоцинотипами E. carotovora та вищеописаними природними класами пектолітичної активності будь-якого взаємозв'язку не виявлено. В той же час, у групі штамів із середнім значенням параметру А відмічена позитивна кореляції між лізисною та пектолітичною активностю штамів-носіїв MCTV. Тому бактеріоцини в природних популяцій ервіній можуть відігравати особливу роль. Вони можуть впливати на патогенність цих бактерій опосередковано. Таким чином, на підставі одержаних результатів можна зробити висновок про існування природних класів пектолітичної активності серед Е.carotovora, які в основному співпадають з патотипами даних бактерій. Стабільна ознака бактеріоциногенності забезпечує надійну видову та штамову ідентифікацію в цій групі мікроорганізмів. Між лізисною активністю бактеріоцинів та пектолітичною активністю існує позитивна кореляція, яка відображує важливу роль каротоворіцинів в екології ервіній.
Вивчення бактеріоциногенності E.carotovora дозволило зробити кілька важливих теоретичних висновків. Генетичні детермінанти бактеріоцинів у цих бактерій експресуються при включенні бактеріальної SOS-системи, але в цих умовах помірні життєздатні бактеріофаги не утворюються. Так як каротоворіцини синтезуються у великій кількості при лізогенній індукції, то одержання життєздатних помірних ервініофагів традиційними способами може бути проблематичним. Можливо, з цієї причини нам не вдалося виявити інших бактеріофагів, окрім фага ZF40. Майже 100%-на наявність MCTV вказує на те, що бактеріоциногенність є видовою ознакою фітопатогенних пектолітичних ервіній. Незважаючи на те, що у пектолітичних ервіній одночасно зустрічаються два типи каротоворіцинів, основний прояв кілерної активності відбувається за рахунок MCTV. Коліцинподібні бактеріоцини менш активні щодо штамів E.carotovora.
РОЗДІЛ 4. ДЕФЕКТНА ЛІЗОГЕНІЯ E.CAROTOVORA
Бактеріальний світ характеризується двома основними типами лізогенії (Campbell, 1994; Прозоров, 1996). При справжній або “істинній”лізогенії профаги помірних бактеріофагів повною мірою реалізують як вегетативний, так і лізогенний шлях розвитоку. За наявності генетичених дефектів, профаги не здатні утворювати повноцінних нащадків. Серед пеповних фагових продуктів бактеріальної клітини часто спостерігають фагові хвостові відростки. Особлива увага до цієї складової частини віріону зумовлена її кілерною активністю. При цьому інколи не приймаються до уваги інші компоненти фагової частки, що не дає змоги скласти повне уявлення про дефектну лізогенію. Наявність дефектної лізогенії у E. carotovora вивчали з використанням 11 штамів різного походження. В спонтанних і індукованих лізатах клітин цих штамів з допомогою електронної мікроскопії постійно виявляли макромолекулярні компоненти фагових часток: хвостові відростки, головки і базальні пластинки. В очищених препаратах було знайдено кілька видів фагоподібних структур: нормальні хвостові відростки (NT), відростки із скороченим футляром (CS), окремі стержні відростка (TT), головки різних розмірів (РН) і окремі базальні пластинки (BP). Відносний вміст цих часток у клітинах E. carotovora наведено в табл. 1. Отримані дані свідчать про те, що утворення зазначених компонентів фагових часток при SOS-індукції відбувається в усіх досліджених штамах. В мітоміцинових лізатах клітин спостерігається більше часток типу фагових хвостових відростків, ніж в НК-лізатах. В останніх переважають компоненти типу базальних пластинок. Вміст фагових головок не залежить від роду індуктора і складає від 1 до 4 % (за виключенням штаму ЕСА 35А –%). Частка нормальних (нескорочених) відростків незначна –від 3 до 11%. Майже в усіх лізатах E.carotovora виявляються порожні футляри різної довжини. На відміну від нормальних
Таблиця 1
Процентний вміст компонентів фагових часток в індукованих лізатах E.carotovora.
Компоненти фагових часток Штам/індуктор1
ECA J2 ECA 62A ECA 35A ECA Ec153
НК МС НК МС МС
Фагові хвостові відростки2 10
Нормальні відростки
Скорочені футляри
Окремі стержні
Порожні футляри
Базальні пластинки
Фагові головки
Кількість всіх часток3 179
Примітка. 1 –НК, МС –налідіксова кислота і мітоміцин С, відповідно. 2 –загальна кількість хвостових відростків в лізаті, отримана як сума нормальних відростків, відростків зі скороченим футляром і окремих стержнів відростків. 3 –кількість часток на окремому електронномікроскопічному полі.
відростків, структури СS-типу мають виражену тенденцію до руйнування. При обчисленнях довжини (L) та ширини (W) скорочених футлярів каротоворіцинів були отримані значні середньоквадратичні відхилення (уn), які у випадку L складали від 4 до 6%, а для W –від 5 до 9%. Ці результати, а також спостереження СS-часток з різним розташуванням структурних субодиниць, вказують на неоднотипність фагових хвостових відростків у клітинах одного і того ж штаму. Статистичний аналіз виявив від одного до трьох модальних об'ємів (Vm) скорочених футлярів в індукованих лізатах ервіній. На основі значень Vm було встановлено розміри скорочених футлярів відповідних типів. Для кожного штаму E.carotovora притаманно не менше двох типів нормальних фагових хвостових відростків (табл.2). Їх довжина знаходиться в межах 128 –нм, а ширина складає 15 –нм. Довжина жорстких стержнів відростків, які зустрічаються як окремі ТТ-структури, або в складі скорочених футлярів, співпадає з довжиною нормального відростка. Електронномікроскопічне вивчення адсорбції і кілерної дії нормальних відростків на чутливі клітини підтвердило, що ці частки є макромолекулярними каротоворіцинами типу фагових хвостових відростків (TLCA). Вони вбивають клітини E.carotovora “ззовні”. Частки TLCA можуть мати значну морфолого-структурну різноманітність. Наприклад, для штама ЕСА J2 характерно три типи відростків. До особливостей оного із них (ТLCA 44-1) слід віднести наявність поблизу вершини специфічного утвору (структура ANS –аномальна частина футляра). Структура ANS (19,5 х 18,2 нм) ТLCA 44-1 скорочується першою і, пересуваючись по стержню, може стимулювати його наступне скорочення.
Таблиця 2
Розміри хвостових відростків (нм), виявлених в індукованих лізатах 11 штамів E.carotovora.
Штам Назва Нормальний відросток Відросток з скороченим футляром
Футляр Стержень
L W L W L
ECA 35A TLCA 12-1 - - ,0 ,8 ,0
TLCA 12-2 - - ,9 ,4 ,0
TLCA 12-3 - - ,1 ,4 -
ECA J2 TLCA 44-1 ,0 ,1 - ,0 ,2
TLCA 44-2 ,6 ,4 ,4 ,0 ,0
TLCA 44-3 ,6 ,0 ,4 ,2 ,0
ECA 62A TLCA 5-1 ,5 ,1 - - ,7
TLCA 5-2 ,5 ,2 ,3 ,0 ,4
TLCA 5-3 - - - - ,5
ECA Ec153 TLCA 29-1 ,8 ,9 ,4 ,3 ,0
TLCA 29-2 ,2 ,3 ,3 ,0 ,5
ECA 48A TLCA 25-1 ,0 ,4 ,5 ,1 ,0
TLCA 25-2 - - ,8 ,8 -
EAR 3A TLCA 11-1 ,0 ,8 ,0 ,0 -
TLCA 11-2 ,0 ,6 ,5 ,0 -
ESP ZM-1 TLCA 40-1 ,0 - - - -
TLCA 40-2 - - ,8 ,4 -
EAR g48 TLCA 2-1 - - ,3 ,5 -
TLCA 2-2 - - ,6 ,4 -
ECA 59A TLCA 55-1 - - ,3 ,8 -
TLCA 55-2 - - ,4 ,2 -
ECA 4A TLCA 36-1 - - ,4 ,7 -
TLCA 36-2 - - ,0 ,3 -
ECA M2-4* TLCA 50-1 - - ,9 ,3 -
Примітка. “-“означає, що частки не виявлені в очищених суспензіях, або дослідження не проводились. * - виміряно 10 часток
Три типи структур, схожі на фагові головки, було виявлено в індукованих лізатах ЕСА 35А (табл. 3). Деякі із них мали виражену полярність, яка характеризує портальні вершини капсиду. Переважна кількість головок цього штаму, ймовірно, заповнена нуклеїновою кислотою невідомої природи і походження. В лізатах штаму ЕСА Ес153 було виявлено два типи РН-структур. Один із них представлено незаповненими головками діаметром 66,2 нм, другий –мініголовками з діаметром 18,7 нм, яким властиве приєднання до нормальних відростків TLCA 29-1 і TLCA 29-2. Було виявлено аналогичні мініголовки, які прикріплено тонкими нитками до аномально довгих хвостових відростків (417 нм). Для штаму ЕСА 62А характерні незаповнені головки еліпсоїдної форми (середній діаметр - 92 нм), які інколи асоційовані з нормальними відростками TLCA 5-1. В жодному випадку не спостерігали головок, приєднаних до відростка зі скороченим футляром, а також жодної нормальної фагової частки.
Таблиця 3
Головки і базальні пластинки дефектних фагів деяких штамів E.carotovora
Штам Діаметр головки (нм) Діаметр базальної пластинки (нм)
Тип 1 Тип 2 Тип 3 Тип 4
ECA 35A - ,4 ,0 ,2 -
ECA J2 - ,0 ,0 - ,7
ECA Ec153 ,7 - ,2 - ,6
ECA 62A - - - ,0 ,5
ECA 48A - - - - ,0
ECA 4A - - - - ,0
Примітка. “-“–означає, що результатів отримати не вдалося.
Діаметр часток типу базальних пластинок складає 39,7 –нм (табл. 3). Базальні пластинки не завжди виявляються в складі структур NT, дистальні кінці яких мають короткі кінцеві нитки. Детально проаналізовано базальні пластинки, знайдені в клітинах ECA J2 (BPJ). Виявлено 4 конформаційних стани BPJ. У вільному стані вони набувають такі форми: “велосипедного колеса”, неупорядкованих “клубків”і симетричних округлих “клубків”з добре вираженою центральною частиною. Дві останні конформації BPJ можуть переходити в структуру, яка має більше, ніж шість попарно розміщених жорстких ниток довжиною 56 –нм. Середній діаметр BPJ всіх конформацій складає 39,8 нм (уdn = 4 нм) і співпадає з модальним діаметром –,7 нм (уdn = 1 нм).
Поряд з частками дефектних помірних бактеріофагів, які утворюються при SOS-індукції клітин E.carotovora, були виявлені незвичні структури –порожні футляри і поліфутляри. Їх кількість збільшувалась з подовженням часу зберігання концентрованих суспензій часток при 4 –оС. Так як утворення нових структур свідчить про елементарну самоорганізацію каротоворіцинів in vitro, це явище було вивчено більш ретельно.
Тривалі спотереження дозволили виявити два види спонтанного руйнування скорочених футлярів (CS-структур) хвостових відростків штамів ЕСА. Найчастіше футляри руйнувалися вздовж осі відростка. Такому руйнуванню передувала стадія “набухання”. В результаті поздовжніх розривів футляри перетворювались в плоскі сітчаті структури, які, в свою чергу, формували великі скупчення. Агрегати зруйнованих футлярів мали сферичну форму, а їх діаметр складав 100 - 300 нм. Показано, що утворення порожніх футлярів (ES) і поліфутлярів (EPS) каротоворіцинів типу фагових хвостових відростків штамів ЕСА відбувається одночасно з руйнуванням скорочених футлярів, а відносна кількість порожніх футлярів і поліфутлярів збільшується з часом. Порожні футляри, як правило, відрізнялись від структур CS за довжиною. Довжина порожніх поліфутлярів у 2–разів перевищувала довжину скороченого футляра. Всі поліфутляри були поділені на частини тонкими перегородками. Різна довжина мономерних одиниць поліфутлярів вказує на незвичний механізм їх утворення, який відмінний від механізму полімеризації “голова до хвоста”окремих скорочених футлярів.
Порожні футляри і поліфутляри, на відміну від скорочених футлярів відростка, полярні структури. Один їх кінець округлий і замкнутий (“голова”), інший - відкритий (“хвіст”). Деякі із cтруктур ES побудовані як кулевидні утвори (структури RES). Ідентифіковано 2 типи структур RES, які відповідають двом типам порожніх футлярів TLCA 29-1 і TLCA 29-2 штаму ЕСА Ес153. В обох випадках довжина кулевидних футлярів менша за довжину структур ES і складає 38 –нм. Аналогічні результати отримані при аналізі кулевидних футлярів TLCA 25-1 (штам ЕСА 48 А). Довжина RES цього бактеріоцина складає від 38 до 50 нм. Ширина їх хвостової частини становить 24 нм і на 11% перевищує ширину відповідних порожніх футлярів. Доказ того, що кулевидні порожні футляри є попередниками сформованих порожніх футлярів, отримано при виявленні центрів збирання (кристалізації) кулевидних футлярів каротоворіцинів TLCA 29-1 і TLCA 29-2. Центри кристалізації мали обриси правильних дисків з середнім діаметром 26 нм. В тривимірному просторі вони складаються з двох супротивних напівсфер, менша з яких входить у більшу. Запропонована гіпотетична модель самозбирання структур ES каротоворіцинів TLCA 29-1 і TLCA 29-2. Перший етап самоорганізації порожніх футлярів розпочинається в центрах самозбирання (кристалізації), які містять концентрований білковий матеріал високої густини. На другому етапі відбувається синтез (ріст) хвостової частини кулевидного порожнього футляра, який супроводжується зміною тонкої структурної організації центрів кристалізації. Оночасно з цим відбувається закономірне зменшення щільності центрів кристалізації. Форма центрів стає близькою до форми подовженого еліпсоїда. Зміна просторової організації центрів, ймовірно, обумовлена виходом синтезованих структур в оточуюче середовище. На третьому етапі структура набуває форми кулевидного порожнього футляра. Оформлення завершених порожніх футлярів, ймовірно, протікає за межами центрів кристалізації, де ширина їх хвостової частини зменшується, а укладка субодиниць стає більш щільною і близькою до субодиничної побудови скорочених футлярів.
Центри кристалізації порожніх футлярів, аналогічні центрам TLCA 29-1 і TLCA 29-2, зустрічаються також у препаратах бактеріоцинів інших штамів E.carotovora. Так, у річній суспензії часток TLCA 11-2 (штам EAR 3A) нараховується до 20% центрів. Вони мають середній діаметр 48,5 нм і містять синтезовані структури ES округлої і кулевидної форми. В препаратах TLCA 36-1 (штам ЕСА 4А) виявлено два типи центрів самозбирання: центри першого типу мали діаметр 29,5 нм, другого –біля 60 нм. Центри кристалізації діаметром від 53,2 до 65,7 нм було знайдено в річних суспензіях каротоворіцина TLCA 25-1 (штам ЕСА 48А). Утворення порожніх поліфутлярів також відбувається в центрах кристалізації. Прямі спостереження показали, що в центрах самоорганізації спочатку синтезуються окремі кулевидні порожні футляри, які з'єднуються з відкритою хвостовою ділянкою частково синтезованого поліфутляра. Після чергового етапу полімеризації поліфутляр просувається по радіусу центра і виходить у вільний простір. Отже, полімеризація порожніх поліфутлярів - складний ступінчатий процес.
Оригінальний характер самоорганізації порожніх поліфутлярів було виявлено після руйнування часток каротоворіцинів штаму ЕСА 62А. Нові надмолекулярні структури TLCA 5-1 і ТLCA 5-2 утворювались через сіткові утвори необмеженої довжини. В центральній області сіток розміщені потовщені S-подібні утвори шириною від 19 до 25 нм. Через півроку від початку формування сіткових агрегатів відмічали появу дуже довгих порожніх поліфутлярів. Розміщення поліфутлярів на площині відповідало конфігурації сіткових структур. Структури EPS-типу обох каротоворіцинів складаються із окремих мономерних ділянок –порожніх футлярів з перегородками. Порожні поліфутляри походять від двох вихідних типів скорочених футлярів бактеріоцинів TLCA 5-1 і TLCA 5-2. В жодному із випадків не виявлено поліфутлярів змішаного типу. Крім довгих поліфутлярів в суспензіях каротоворіцинів штаму ЕСА 62А виявлено нові структури округлої і ламповидної форми з гнучкою оболонкою (структури LS). Їх діаметр складає від 33 до 117 нм. Структури LS-типу не мають відношення до заповнених головок фагового походження і фагових “тіней”. Показана структурна спорідненість скорочених футлярів, порожніх поліфутлярів і часток LS-типу TLCA 5-1 й TLCA 5-2. Допускається, що довгі порожні поліфутляри і ламповидні структури - продукти самоорганізації in vitro, основним вихідним матеріалом для якої служать зруйновані скорочені футляри відростків каротоворіцинів.
Наявність різних часток типу фагових хвостових відростків, головок і базальних пластинок, а також характеристичне самоутворення нових надмолекулярних структур після спонтанного руйнування скорочених хвостових відростків указують на множинність дефектної лізогенії E.carotovora. Доказ цього важливого положення було отримано при аналізі сумарного препарату MCTV із штаму Erwinia sp. 78-3 (Ep78-3). Іонообмінна хроматографія дозволила виявити три біологічно активні фракції (I, II і III). За даними спектрофотометрії кількісне співвідношення між фракціями склало 60, 12 і 28 %, відповідно. Після додаткового седиментаційного очищення у фракціях I і III було виявлено виключно білковий матеріал з однаковими максимумами поглинання при 275,8 нм. Доведено, що фракції I, II і III - мінімальні біологічно активні структури каротоворіцинів TLCA 86-1, TLCA 86-2 і TLCA 86-3 штаму ESP 78-3. Аналіз поліпептидів TLCA 86-1 і TLCA 86-3 в системі ДСН-ПААГ виявив наступі закономірності. Хвостові відростки обох каротоворіцинів складаються з однакових мажорних поліпептидів з молекулярними масами 72,4, 55,0 і 40,3 кД, які входять до складу футляра, стержня і базальної пластинки. Ймовірно, що структурний білок футляра складає 55 кД. До яких компонентів хвостового відростка відносяться мажорні білки ср4 (72,4 кД) і ср9 (40,3 кД), поки що невідомо. На різницю між TLCA 86-1 і TLCA 86-3 вказують деякі неспівпадаючі поліпептиди (сpб, cpв, cpг, cpу і cpе). Відмінність між цими каротворіцинами було виявлено також при визначенні кілерної активності матеріалу окремих хроматографічних фракцій щодо E.coli CR63 і BE і E.carotovora 66А. Різниця в питомій кілерній активності TLCA 86-1 і TLCA 86-3 щодо штамів E.coli була виявлена при 37оС. Вона вища у випадку TLCA 86-3. Каротоворіцин TLCA 86-2 класифіковано як такий, що має родову специфічність і нормально лізує лише індикаторний штамм ЕСА 66А. Отже, прямий біохімічний та біологічний доказ множинності каротоворіцинів повною мірою підтверджує положення про природне існування E.carotovora як дефектно-полілізогенної системи.
РОЗДІЛ 5. СПРАВЖНЯ ЛІЗОГЕНІЯ ERWINIA CAROTOVORA. ПОМІРНІ ТА ВІРУЛЕНТНІ БАКТЕРІОФАГИ
На цей час у E.carotovora, на відміну від інших бактерій, явище бактеріофагії досліджено недостатньо (Perombelon 1992; Chatterjje, Starr 1980). Опис бактеріофагів цих практично значимих фітопатогенів носить спорадичний характер (Toth et al., 1993; Toth et al., 1997). Причини обмеженого розповсюдження ервініафагів порівняно з іншими фагами, поки що невідомі (Perombelon 1992; Chatterjje, Starr 1980). Фагостійкість E.carotovora вивчали із застосуванням помірного бактеріофага ZF40, який було виявлено при дослідженні бактеріоциногенності (розділ 3). На газоні клітин ЕСА 62А фаг утворює два типи колоній - дрібні (м-бляшки) і великі (к-бляшки). Ця гетерогенність не стосується внутріклітинного обмеження репродукції фага, а також не пов'язана з геномними змінами. Її причина була встановлена з допомогою бактеріальних мутантів, стійких до лізису каротоворіцинами (мутанти RC). RC-мутанти було віднесено до трьох видів. На більшості із них ефективність висіву фага помітно не змінювалась, тоді як на кількох мутантах вона мала нульове значення. Тільки на газонах клітин двох мутантів, отриманих селективними MCTV EcaEс153 (мутант RC5297) і EcaМ2-4 (мутант RC5501), бактеріофаг утворює к-бляшки з непрозорим центром. Однією із причин фагостійкості у E.carotovora може бути блокування бактеріофага ZF40 на рівні адсорбції. Різноманітність мутантів, стійких до бактеріоцинів (не менше 5 різних типів), а також підвищена чутливість до дезоксихолату натрію вказувають на зміни в структурі О-ланцюга ліпополісахариду (ЛПС) зовнішньої клітинної оболонки. Це підтверджується тим, що деякі RC-мутанти здатні підтримувати розвиток фага Т7 E.coli з рецепторним сайтом в R-ЛПС ентеробактерій (Beumer et al., 1984). На клітинах батьківського штаму ЕСА 62А, а також на клітинах мутантів з незначними змінами в структурі ЛПС фаг Т7 не адсорбується через відсутность прямого фізичного контакту зі своїм рецептором. З іншого боку, для фага ZF40 рецептором є S-ЛПС і він здатний прикріплюватися до клітин, які мають цей тип ліпополісахарида. Аналогічне явище описано при взаємодії фагів Т7 і Р22 з клітинами S. typhimurium (Brunovskis, Burns, 1973). Отже, нормальний адсорбційний процес для фага ZF40 можливий лише за наявності проміжного типу S-ЛПС, який входить до складу клітинної оболонки мутантів RC5297 і RC5501 E.carotovora 62А. Далі мутант RC5297 використовували як універсальний індикатор для вивчення фага ZF40.
Два варіанти фага ZF40, одержані на ЕСА 62А і RC5297 (фаги ZF40 і ZF40/5297, відповідно), використовували для вивчення кола його господарів серед штамів пектолітичних ервіній. Більше ніж 13 штамів, із 52 досліджених, чутливі до фага ZF40. На основі ефективності висіву штами Е.carotovora були розділені на 6 груп. Для двох штамів ЕСА M2-4 и 33A, а також для штама ЕАТ 37A ефективність висіву фага склала 10-4 - 10-5, тоді як на штамах 15A, 43A, 53A, 61A, 74A, j15, j22, J2 і g125 вона була ще нижчою –-7 - 10-9. Для фагочутливих штамів властиве формування гетерогенної фагової популяції, але на клітинах штамів ЕСА M2-4, 33A і ЕАТ 37A фаг після кількох пересівів утворює бляшки однакового розміру.
Внутріклітинну рестрикцію у E.carotovora досліджували у 4 штамів ЕСА: 62A, RC5297, M2-4 и 33A. Фаги, оодержані на M2-4 и 33A позначали як ZF40/M2-4* і ZF40/33А*, відповідно. Рестрикційний аналіз ДНК ендонуклеазою HpaI показав, що ці фаги гомологічні один одному, а також ідентичні вихідному фагу ZF40/5297. Отже, розвиток фага в клітинах штамів ЕСА M2-4 і 33A обмежується внутріклітинно. Аналогічно іншим ентеробактеріям (Krыger, Bickle, 1983), у E.carotovora внутріклітинна рестрикція тісно пов'язана з протилежним процесом - модифікацією фагової ДНК. Це справедливо і в нашому випадку: фаги ZF40/M2-4* и ZF40/33А* відновлюють вихідну ефективність висіву через 4 –пасажів на відповідних штамах. Системи рестрикції-модифікації (R-M) співпадають для штамів Е.carotovora subsp.carotovora M2-4 і 33A, тоді як така система у штама ЕСА 62А - інша. Можливо, що унікальні системи R-M мають штами ЕАТ 37A, ЕСА 61А і ЕСА J2. Для інших фагочутливих ервіній обмеження развитку фага ZF40 дуже значне, що можна пояснити накладанням двох ефектів –блокуванням адсорбції фагових часток на клітинах і дією внутріклітинної рестрикції.
Імунітет до гомологічних вірусів і наявність спонтанних мутантів сlear-типу - ті особливості ZF40, які дозволяють віднести його до категорії помірних бактеріофагів. Лізогени отримані на основі вихідного фага ZF40-к ведуть себе як класичні і мають рівень спонтанної індукції в середньому рівний 2х105 БОЕ/мл. Доля лізогенів класичного типу (тип I) штамів ЕСА M2-4 і 33A, що несуть модифіковані варіанти фагів ZF40/M2-4* і ZF40/33А*, складає лише 16 –%. У двох інших типів (біля 80% для обох штамів) рівень індукції або незначний, або вона не проявляється. На відміну від лізогенів типу III, лізогени першого типу малочутливі до суперінфекції гомологічним фагом. Лізогени другого типу нечутливі до суперінфікуючого гомологічного бактеріофага. Показники суперінфекції отриманих в роботі лізогенів і природних штамів E.carotovora фагами ZF40 і ZF40/M2-4* часто співпадають. Останнє свідчить про фагостійкість ервіній на рівні імунної відповіді лізогенної клітини, а також про широке розповсюдження гомоіммунних помірних бактеріофагів у цих бактерій. Крім фага ZF40, додатково виявлено 5 помірних фагів –EF444, EF47, EF35, EF19 і EF36. Ці фаги не розмножувались у клітинах лізогенів, про які згадувалося вище, а штучні лізогени, які несли окремі профаги EF444, EF47, EF35, EF19 і EF36, не підтримували розвиток фагів ZF40, ZF40/M2-4* і ZF40/33А*. Як і очікувалось, з допомогою індикатора RC5297 виявляється більше помірних ервініафагів, ніж на вихідному фагочутливому штамі E.carotovora 62А.
Зважаюче на те, що помірний бактеріофаг ZF40 може бути корисним для вивчення справжньої лізогенії E.carotovora, а також молекулярної генетики цих важливих фітопатогенних бактерій, його вивчали більш ретельно. Встановлено, що частки фага ZF40 складаються з ізометричної головки, яка на площині виглядає як правильний шестикутник. В тривимірному просторі головка фага являє собою правильний ікосаедр, грані якого можна спостерігати тільки в нормальних частках. “Тіні”і нормальні частки фага мають конусовидний хвостовий відросток, який через конектор приєднаний до портальної вершини головки. Конектор відділений від футляра відростка тонкою шийкою. Футляр відростка здатний до скорочення. При спостереженні нормальних часток і “тіней” виявляються відростки з хвостовими нитками (фібрилами). В табл. 4 наведено розміри структурних компонентів нормальних часток і “тіней”фага ZF40. Будову хвостового відростка цього фага вивчали, порівнюючи її з такою відростка коліфага Т4. На відміну від футляра фага Т4, поперечне розміщення субодиниць футляра фага ZF40 виражене слабо і його субодиниці утворюють спіралі, які виглядають як диски з “нахилом”. Різниця в організації футлярів відростків фагів, мабуть, зумовлена меншою кількістю субодиниць, які входять до поперечних дисків футляра фага ZF40, а також їх більшим розміром. Футляр відростка фага ZF40 має форму зрізаного конуса; ця структура у фага Т4 - циліндрична. Конусність футляра відростка фага, ймовірно, формується за рахунок додаткових субодиниць в його основі (біля базальної пластинки) і зменшенням їх кількості біля вершини (поряд з шийкою відростка). Підтвердження цього було отримано при електронномікроскопічному аналізі часток фага ZF40, зруйнованих осмотичним шоком (5 М CsCl). Руйнування футлярів включало дві стадії - “набухання”та їх “сповзання”у вигляді покриваючої “шуби”із стержня. В кінцевому підсумку це приводило до утворення неправильних еліпсоїдних структур з полюсами різної ширини. Розміщення структурних субодиниць в еліпсоїдах часто дугоподібне. Отже, утворення еліпсоїдних структур пов'язане з руйнуванням футляра відростка фага вздовж однієї із спіралей “нахилених”дисків. Відросток фага ZF40 має хвостові нитки, довжина яких приблизно в 5 разів менша, ніж довжина фібрил відростка фага Т4 - 31,5 нм, а також базальну пластинку у формі зрізаного конуса.
Таблиця 4
Параметри віріона помірного бактеріофага ZF40 E. carotovora (нм)
Тип фагової частки Головка Відросток Футляр відростка ВР (ширина)
ДГ1 ДГ2 Довжина ДХ1 ДХ2
Нормальна 58,3 ,5 86,3 ,1 ,8 ,8
“Тіні” 49,2 ,2 86,2 ,5 ,7 ,6
Примітка. Для гексагональної проекції (вісь симетрії 3 порядку) відстань між протилежними вершинами (ДГ1) і протилежними сторонами (ДГ2). Ширина футляра визначена біля шийки віростка (ДХ1) і базальної пластинки (ДХ2).
Рестрикційний аналіз генома бактеріофага ZF40 проведено із застосуванням 7 ендонуклеаз рестрикції: BamHI, BglII, EcoRI, HindIII, HpaI, KpnI і PvuI. Ендонуклеази BglII і HindIII мають по одному сайтові рестрикції на ДНК фага, тоді як EcoRI, HpaI і PvuI утворюють більше, ніж 10 фрагментів. Середній розмір ДНК фага ZF40 за даними рестрикційного аналізу складає 45,8 тпн.
При гідролізі фагової ДНК було виявлено додаткові фрагменти з низькою молярною концентрацією. Ці субмолярні фрагменти зникали при нагріванні інкубаційної суміші протягом 2 хв при 80оС. Доведено, що субмолярні фрагменти - продукти гідролізу відкритої кільцевої форми ДНК фага ZF40, утвореної при спонтанному з'єднанні комплементарних однониткових виступів –липких кінців. За допомогою фізичного картування рестрикційних сайтів ДНК фага для ендонуклеаз BamHI, BglII, HindIII і KpnI було визначено розміщення BamHI-фрагментів, яке має такий порядок розташування фрагментів: CBDA. За рахунок липких кінців бактеріофаг ZF40 використовує cos-механізм при реплікації ДНК і, подібно іншим помірним фагам, володіє генетичною системою інтеграції і вирізання профага (Campbell, 1994).
Фаг ZF40 віднесено до бактеріофагів морфотипу А1 родини Myoviridae. Проведено його порівняння з іншими подібними фагами - цKP E.carotovora; Y64 E.herbicola ; Mu1, P278 і P2 E.coli і Spy-3 Bacillus polymyxa. За розміром головки, розміром геному, а також за структурною організацією скороченого футляра фаг ZF40 близький до фага Spy-3. В літературі поки що не описано фагів ентеробактерій, подібних фагу ZF40 (Ackermann et al., 1997). З цієї причини помірний бактеріофаг ZF40 може розглядатися як новий вид фагів бактерій родини Enterobacteriaceae.
Вважається, що походження близькоспоріднених бактеріофагів пов'язане з горизонтальним переносом генів чи генетичних модулів (Botstein, 1980; Lucchini et al., 1999). Джерелом останніх виступають дефектні профаги або життєздатні фаги, які приймають участь в рекомбінаційних обмінах (Hendrix et al., 1999). Раніше у бактерій роду Erwinia було виявлено два споріднені бактеріофаги –фаги 49 і 59 (Товкач, 1987). Ці помірні фаги утворюються при титруванні мітоміцин-С-індукованих лізатів E.carotovora 268 на деяких штамах E.horticolа. Вони типові представники родини Syphoviridae (морфотип B1). Для того, щоб наблизитись до розуміння справжньої лізогенії у бактерій роду Erwinia, проводили порівняння молекулярно-біологічної організації бактеріофагів 49 і 59.
Серед 100 різних ентеробактерій, фаги 49 і 59 викликають літичну і лізогенну реакцію тільки 5 штамів E.horticolа. Вони відрізняються за параметрами одиночного циклу розмноження в клітинах штамів 450 і 60. Період лізису для фага 49 складає 90 хв. Він в три рази триваліший, ніж для фага 59. Бактеріофаги 49 і 59 - гетероімунні і жодин з них не інфікує лізогени, які несуть гомологічний бактеріофаг, але нормально розвиваються в лізогенних клітинах, які містять відповідний гетерологічний профаг. Подвійні лізогени не спроможні підтримувати розвиток фагів 49 і 59 як окремо, так і при спільному зараженні. С-мутанти помірного фага 49 віднесено до двох незалежних груп, тоді як кількість цистронів в області імунітету фага 59 досягає 4. Поки що невідоме відношення генів СI до формування імунності лізогенів, так як обидва фаги здатні формувати імунітет на рівні фагових прикріпних рецепторів (лізогенна конверсія). Лізогенна конверсія може доповнити дію фагових імунних репресорів. Хоч існує певна ідентичність генів с-області, встановлення і підтримання лізогенного стану в обох фагів істотно відрізняються. Зокрема, частота лізогенізації E. horticola 450 на порядок вища для фага 49, ніж для фага 59. Отримано ряд фактів, які вказують на формування цими фагами іншого типу лізогенії, ніж класичний (фаг лямбда).
Вивчення структурних білків показало, що віріони фагів 49 і 59 містять однакові мажорні поліпептиди ФП8, ФП9 і ФП13 - 32, 26 і 11 кД, відповідно. Крім трьох (49,5, 47,9 і 8,2 кД), інші поліпептиди також співпадають за вмістом і молекулярною масою. Поряд з даними імунної електронної мікроскопії (Товкач, 1987) співпадаючий поліпептидний склад cвідчить про гомологічність структурних білків віріонів фагів 49 і 59. Три мінорні поліпептиди ФП4, ФП5 і ФП15, які відсутні в частках фага 59, можуть характеризувати базальну пластинку (ВР) фага 49, яка складається з трьох (або шести) коротких фібрил. Завдяки цій структурі фаг 49, на відміну від фага 59, може адсорбуватись на клітинах E. horticola 43I і 43II, а також долати імунітет на рівні прикріпних рецепторів у лізогенів E. horticola 450 (59) і 60 (59). Унікальна базальна пластинка фага 49 змінює фізичні властивості його часток у порівнянні з фагом 59. Фаг 49 високочутливий до дії температури й інактивується в розчині 5М CsCl. Фаг 59 дуже стійкий до впливу зазначених факторів. Суттєве зниження плавучої густини віріонів фага 49 у градієнті CsCl пов'язане з модифікацією фагового відростка. Це підтверджують і дані електронної мікроскопії. Допускається, що модифікація може стосуватися зміни структурної конфігурації відростка при приєднанні іншої базальної пластинки, або його структура суттєво змінюється за рахунок включення додаткового білка (чи білків). В будь-якому з цих випадків можна чекати, що структура часток фага 49 порушується при дестабілізації не тільки базальної пластинки, але і хвостового відростка. Отримані дані дозволили прийти до висновку про рекомбінаційне походження фагів 49 і 59. Віріон фага 49 можна уявити як такий фага 59, до капсиду якого приєднаний частково змінений хвостовий відросток з нестабільною (іншою, ніж у фага 59) базальною пластинкою. ВР може походити від іншого фага (чи криптичного профага).
Віріонні ДНК фагів 49 і 59 - лінійні двониткові молекули без липких кінців. За даними електронної мікроскопії і рестрикційного аналізу розмір ДНК фага 59 складає 47,9 тпн. Фаг 59 містить циклічно пермутований геном з кінцевим надлишком (2,2%) і може бути віднесений до групи pac-фагів (Товкач, 1987). Пермутація характерна також і для генома фага 49 - 47,8 тпн. Але тут вона має дискретний характер, що дозволяє допустити наявність значної вставки в геномі 49. За даними рестрикційного аналізу, при збиранні часток фага 49 за pac-механізмом упаковки віріонної ДНК може утворюватися до 4-х дискретних наборів (headfulls). Вставка змінює не тільки характер пермутації, але й загальний вміст ГЦ-пар у віріонній ДНК. Для ГЦ-вмісту ДНК фага 49 отримано значення 57,1%, що значо вище, ніж для фага 59 –%. Таким чином, споріднені фаги 49 і 59 могли виникнути в процесі складних рекомбінаційних подій у спільному господарі. Не виключено, що геном фага 49 має мозаїчну структуру, яка утворена значною частиною ДНК-послідовностей генома фага 59 і генома іншого, поки що невідомого, профага(фага)-попередника.
При вивченні природи клітинних рецепторів для помірних фагів 49 і 59 переслідували перспективну мету –дослідити фагову лізогенну конверсію, яка обумовлюється цими фагами, та фагом Е105. Як зазначалося вище, суть явища конверсії полягає в неспроможності адсорбувати гомологічний бактеріофаг лізогенними клітинами. Встановлено, що фаги 49 і 59 не прикріплюються до L-мембран E. horticola 450. В той же час адсорбційну здатність виявляє ЛПС-компонент, отриманий фенольною депротеїнізацією L-мембран. Інкубація ЛПС протягом 3-5 год з фагами 49 і 59 знижує їх титр на 1,5-2 порядки. Високоочищені молекули ЛПС у воді утворюють міцелярні структури різного розміру та конфігурації. Міцели набувають таких форм: кулястих структур (30 нм) і видовжених еліпсоїдів. Товщина бішару для обох видів міцел однакова і складає в середньому 17,5 нм. Дослідження кінетики адсорбції фага 59 на клітинах E. horticola 450 і на очищеному ЛПС показало, що на відміну від адсорбції на нативних клітинах, адсорбція на ЛПС проходить у два етапи. Це можна пояснити неоднорідністю рецепторного сайта на ЛПС (структурно-конформаційною невідповідністю нативному сайту), або відсутністю додаткових хімічних компонентів, які втрачаються в процесі очистки рецептора. Адсорбційна активність для фагів 49 і 59 на очищених молекулах ЛПС майже однакова. Таким чином, рецепторні сайти для цих фагів локалізовані на одній і тій же молекулі ЛПС, хоча їх хімічний склад може відрізнятися. Цікаво, що ліпополісахарид клітин E.horticola 450 здатний ефективно інактивувати фаг Т2 E.coli. Цей фаг, а також фаг Т4 адсорбуються також на клітинах E. horticola 450. Таким чином, в процесі вищенаведених досліджень встановлено, що рецептором для фагів 49 і 59 є ліпополісахарид L-мембрани клітинної оболонки E. horticola 450. У високоочищеному вигляді рецептор проявляє значну адсорбційну активність стосовно досліджуваних фагів, хоча і є “неповним”, порівняно з рецептором нативних клітин E. horticola 450.
В роботі показано, що бактеріофаги T2, T4 і Р1 E.coli здатні взаємодіяти з невеликою кількістю штамів Е.carotovora, які входять до бактеріоцинотипу 1. Але продуктивного розвитку фагів при цьому не відбувається. Пошук інших фагів, які б розмножувалися в клітинах пектолітичних фітопатогенних ервіній (ЦЙЙ, л, Пx2, TuIIb і P22) не мав успіху. Фаг F44, який несподівано було виявлено при взаємодії Т-парних фагів з клітинами E.horticola, ефективно розмножувався в клітинах бактерій родів Erwinia i Pseudomonas та лабораторних штамах E.coli, включаючи і ті з них, які несуть статевий фактор F. Фаг F44 віднесено до поліфагів. На бактеріальних газонах він утворює негативні колонії великого розміру, що важливо для генетичних досліджень. Фаг F44 є типовим представником родини Podoviridae. Його капсид складається з ізометричної ікосаедричної головки діаметром 46,8 нм та короткого конусовидного відростка довжиною 14 нм. Фаг F44 значно менший, ніж ервініафаг Е105 (діаметр головки - 54 нм) та фаг Т7 (діаметр головки –нм). ДНК бактеріофага F44 стійка до гідролізу ендонуклеазами. Поряд з повною відсутністю, сайти для деяких із рестриктаз у фаговій ДНК частково, або повністю модифіковані. Так, наприклад, сайти для PstI частково модифіковані, коли бактеріофаг був одержаний на E.herbicola 60, чи на E.coli C600. Якщо ж фаг репродукується на E.coli BE або L1+, то його ДНК стає чутливою до дії PstI. Вивчення рестрикції свідчать про відсутність спеціального фагового механізму захисту від обмеження розвитку цього фага з боку бактерії-господаря.
За даними рестрикції розмір геному бактеріофага F44 складає 39,2 тпн. За розміром капсиду, а також за розміром геному, бактеріофаг F44 один із найменших бактеріальних вірусів, знайдених у ервіній. Він вірулентний і не утворює стабільної лізогенної асоціації з чутливими бактеріями.
Полівалентність фага F44 дозволила застосувати його для отримання бактеріальних позагенних супресорих мутантів. Питання про позагенну супресію у бактерій роду Erwinia вивчено лише частково (Schonejans et al., 1987), тоді як використання супресорів у E.coli i S.typhimurium відіграло значну роль в дослідженні молекулярної генетики цих бактерій і їх бактеріофагів (Стент, Кэлиндар, 1981). Робота проводилася в два етапи. Спершу одержували ауксотрофні бактеріальні мутанти з допомогою транзиційого мутагенезу. Окремі мутанти перевіряли на точковість мутації і на фенотипове виліковування аміноглікозидними антибіотиками. Коли ці тести були позитивними, відбирали спонтанні ревертанти, які виникали за рахунок супресії. Другий етап включав перевірку ревертантів на позагенну супресію набором мутантів фага F44 amber-типу. Останні можна отримати користуючись здантістю фага F44 репродукуватися в клітинах E.coli gA120 (su-) i HB101 (supE44/su2+). Перевірка ефективності висіву amber-мутантів фагу F44 на різних su- - i su+ -штамах показала, що у E.horticola може існувати не менше двох класів позагенних супресорів, а ефективність супресії досягає 50%. Далі були одержані nonsense-мутанти помірного бактеріофага 59 з використанням як непермісивного господаря –E. horticola 450 так і пермісивного –E. horticola 450 His+1-5 (su+). Це створює передумови для наступного генетичного картування ервініафага 59. Отже, використання фагa F44 як тест-системи для пошуку позагенних супресорів у E.horticola поки що єдиний спосіб для цього виду бактерій.
Таким чином, поширення життєздатних фагів, які б могли формувати справжню лізогенію у E.carotovora обмежене. Це справедливо також і для вірулентних бактеріофагів. Така ситуація багато в чому незрозуміла. Фагостійкість у E.carotovora пов'язана з обмеженням розвитку фагів на рівні адсорбції і забороною їх внутріклітинного розвитку рестрикційною системою господаря. Вона існує також на рівні гомоімунності. Дефектна полілізогенія у пектолітичних ервіній може утворювати надстійкость до гомологічних і гетерологічних фагів.
Помірні фаги 49 і 59 утворюють справжню лізогенію у аміловороподібних бактерій E.horticola. Ця фаго-клітинна система унікальна в наступному. Фаги 49 і 59 мають пермутовану віріонну ДНК і гомологічні геноми. Їх ДНК упакована в капсиди, які побудовані з однакових структурних білків, але їх віріони відрізняються будовою базальної пластинки. За рахунок лізогенної конверсії ервініафаги утворюють надстійку систему, яка забороняє адсорбцію гомологічних фагів на лізогенізованих клітинах. Походження обох фагів, скоріше за все, є результатом рекомбінаційної взаємодії генетичних модулів у системі лізогенних штамів E.horticola, більш детальне вивчення якої може наблизити до розуміння явища справжньої лізогенії у фітопатогенних ервіній.
Нові життєздатні бактеріофаги, виявлені в ході виконання роботи, можуть бути з успіхом використані для вивчення молекулярної генетики ервіній.
РОЗДІЛ 6. ПЛАЗМІДИ E. CAROTOVORA
Для виділення плазмід E.carotovora використовували метод Kado, Liu (1981), який грунтується на обробці бактеріальних клітин 1,5% ДСН з наступною необоротньою денатурацією хромосомної ДНК і ренатурацією кільцевої плазмідної ДНК. В ході експериментів встановлено, що плазміди ервіній мають підвищену ампліфікацію в мінімальному середовищі з 1%-ним пектином. Плазмідні ДНК із клітин, які вирощували в цьому середовищі, не мали домішок хромосомної ДНК, РНК і білків. Ці препарати були використані для гідролізу ендонуклеазами рестрикції. Застосування рестриктаз дозволило встановити молекулярну масу ДНК деяких порівняно невеликих плазмід ервіній. Для визначення розміру великих плазмід і плазмід, які зустрічаються разом з іншими в одному і тому ж штамі-носії, як маркерні були використані загальновідомі плазміди pTi-C58, F, RP4, RSF1010 і pUC18.
Показано, що плазміди широко розповсюджені у E.carotovora. Біля 30% штамів цих бактерій несуть позахромосомні ДНК різного розміру –від 2,5 до 129 тпн. Плазміди частіше зустрічаються у E.carotovora subsp. atroseptica (в 4 із 6 штамів), ніж у E.carotovora subsp. carotovora (12 із 46 штамів). Причому у випадку підвиду atroseptica не спостерігається множинного вмісту плазмід. Кожний окремий штам цих бактерій містить індивідуальну позахромосомну ДНК. По одній плазмідній ДНК мають також штами ЕСА M2-4, 48A, B566, 52A і J2, тоді як у інших представників subsp. carotovora виявлено кілька різних плазмідних ДНК. Так, штами ECA13A і ECA35A несуть по 5 і 4 індивідуальних плазмід, відповідно. Клітини 5-ти інших штамів (33A, C366, 69A, 66A і 55A) мають по 2 плазміди. В клітинах штамів ECA C366 і 33A поряд з невеликими плазмідами (4,3 і 5,3 тпн) виявлені плазміди розміром 129 тпн. Плазміди абсолютно однакового розміру (129 тпн) присутні у штамів ервіній різного походження - ECA (13А, 33А і 366) і ЕАТ g217. У двох штамів E.carotovora subsp. atroseptica 39A і g152, які також різні за походженням, показано наявність двох близьких за розміром плазмід (pAT 33 і pAT 58) - 19 тпн. Рестрикційний аналіз ДНК цих порівняно невеликих плазмід показав їх неідентичність. Однак, три плазміди pCA 25, pCA 19-1 і pCA 47 із штамів ЕСА 48A, 55A і B566, крім однакового розміру ДНК (9,8 тпн), гомологічними за послідовністю і кількістю рестрикційних сайтів. Найменша плазміда (2,5 тпн) була виявлена в клітинах штаму ЕСА J2.
Обробка клітин мітоміцином С і акридін оранжевим не призводила до втрати плазмід. Спроби видалити плазміди, вирощуючи штами при температурах, які значно перевищують оптимальні для E.carotovora, були невдалими. Крім того всі плазміди ервіній стабільно успадковувались клітинами при частих пересівах культур на середовищі LB. При пересівах штама ЕСА 13А на середовищі АП втрачається нетипова плазміда (pCA 6-2, 48 тпн). Відсутність цієї плазміди призводить до збільшення синтезу макромолекулярного каротоворіцина Еса13А при індукції мітоміцином С. В одному із безплазмідних варіантів ЕСА 13А (клон 6/15) утворюється в 2–рази більше біологічно активного МCTV, ніж у батьківському штамі. Для інших штамів E.carotovora зв'язку між позахромосомними ДНК і лізисною активністю каротоворіцинів (групою MCTV) не виявлено. Плазмідний склад фітопатогенів не корелює з їх пектолітичною активністю. У плазмідних і безплазмідних штамів не вдалося знайти помітної різниці між такими ознаками як стійкість до антибіотиків, стійкість до дії СCTV і MCTV, здатність до росту на поліпектаті натрію і пектині та патогенність. Виявилося також, що криптичні плазміди не мають відношення до формування стійкості до антибіотиків і, в цьому зв'язку, не можуть розглядатися як R-плазміди (R-фактори) E.carotovora.
У процесі тривалої роботи з E.carotovora ми спостерігали популяційну гетерогенність штамів. При зберіганні колекційних штамів суттєва доля популяції (від 18 до 94% в залежності від штаму) Е.carotovora subsp. atroseptica змінює фенотип. Для штаму ЕАТ 39А ця зміна є множинною і стосується зменшення швидкості росту і забарвлення бактеріальних колоній на ЕМВ-агарі, втрату клітинами стійкості до олеандоміцину і еритроміцину і набуття ними чутливості до дії власних каротоворіцинів –фенотип PoeOmsErsBnsAu. Три інших штами цього підвиду ( ЕАТ 36, g125 і g217) утворюють тільки один тип дисоціантів (фенотип Poe). Їх Poe-варіанти не змінюють сприйнятливості до МСТV і коліфагів, а також до власних ССТV. Перевірка штамів ЕСА показала, що представники цього підвиду пектолітичних ервіній не утворюють Poe-дисоціантів з помітною частотою. Так як поява Рое-фенотипу може зумовлюватися коливаннями навколишньої температури, були проведені відповідні модельні експерименти. Клітини ЕСА і ЕАТ спочатку вирощували при супраоптимальних температурах (31°С для ЕАТ і 37 °С для ЕСА), а потім при 27 °С. Підрахунок Рое-дисоціантів проводили після 1 - 3 циклічних вирощувань клітин при супраоптимальній і оптимальній температурах росту. Було встановлено, що в 4-х штамів ЕАТ поява Рое-дисоціантів відбувається з частотою біля 3 % (після третього циклу). У штамів ЕСА утворення аналогічних фенотипів, крім штама ЕСА J2 (3 %), спостерігається значно рідше (менше 1 %). При цьому множинних дисоціантів серед штамів ЕАТ не спостерігали. Штам ЕСА J2 давав два типи стабільних клонів - з одиничним Poe-фенотипом і клони з потрійним фенотипом PoeАрsOms. При цьому він не змінював чутливості до МСТV, коліфагів і власних ССТV. Отже, гетерогенність штамів E.carotovora виникає як певна популяційна реакція клітин на тривалу дію підвищеної температури. Множинна зміна фенотипу в дисоціантів, можливо, має плейотропну природу (наприклад, стійкість до олеандоміцину й еритроміцину). Досліди показали, що плазмідний склад дисоціантів, у порівнянні з батьківськими штамами, залишається незмінним. Стабільне і незворотнє успадкування означених фенотипів свідчить про істотні зміни в бактеріальній хромосомі, тому ці зміни не можуть розглядатися як точкові мутації. Прояв Рое-фенотипу однаковий як для E.carotovora subsp. atroseptica, так і для E. carotovora subsp. carotovora.
Як було зазначено вище, бактерії роду Erwinia підвиду “carotovora”синтезують різноманітні пектинлітичні і пектолітичні ферменти, кількість яких корелює зі ступенем їх патогенності і є однією із таксономічних ознак цих бактерій. Цю особливість було використано при вивченні транскон'югативного перенесення чужорідних плазмід в клітини пектолітичних ервіній. Вперше для контроселекції клітин донора (E.coli та S.thyphimurium) застосовано селективне середовище з пектином. Додавання до нього відповідного антибіотика дозволяє відбирати лише транскон'югантні клони. Додаткова мета зазначених досліджень - визначення впливу власних плазмід та бактеріоцинів на горизонтальне перенесення чужорідних плазмід в клітини ервіній. При перенесенні плазміди RP4 (група несумістності Р1) в клітини 10-ти різних штамів (9 із яких –плазмідовмістні) показано, що придбання стійкості до ампіциліну штамами E.carotovora має низьку частоту. Частота переносу маркера Apr (стійкість до ампіциліну) для штама ЕСА 35А більше ніж на порядок перевищує частоти для решти штамів і складає 1х10-5 на клітину донора. Аутентична плазмідна ДНК RP4 виявляється тільки в даному штамі та штамі 39А E.carotovora subsp. atroseptica. Низькі частоти переносу ознаки Apr (в средньому 3х10-6 на донорну клітину) і відсутність плазмідної ДНК у більшості транскон'югантів поки що не мають пояснень. Частотні характеристики переносу стійкості до антибіотиків з допомогою плазміди RP4 в різні штами ервіній, одержані нами, добре узгоджуються з такими, що встановлені при вивченні сприйнятливості цими бактеріями плазмід групи несумісності Р (Cho et al., 1975). В подальшому вивчали передачу плазмід R391 і pKM101 в штами E.carotovora з допомогою описаного вище підходу. В результаті досліджень було встановлено, що частоти переносу ознаки Kmr плазмідою R391 в клітини 10-ти штамів E.carotovora є більш низькими, ніж одержані при використанні плазміди RP4 для тих же штамів. Вони знаходились в межах 1 х 10-8 –х 10-6 на клітину донора. Вивчення плазмідного вмісту у більшості штамів транскон'югантів E.carotovora свідчить, що плазміда R391, аналогічно плазміді RP4, не виявляється як незалежна екстрахромосома. Відсутність екстрахромосомальної стадії у R391 в клітинах інших штамів можа пояснити великою ймовірністю інтеграції плазміди в бактеріальну хромосому. При вивченні передачі стійкості до ампіциліну плазмідою рКМ101 в 5 штамах E.carotovora були встановлені вищі частотні характеристики, ніж для плазмід RP4 і R391. Наявність екстрахромосоми рКМ101 в клітинах штамів ECA J2 і ECA 66A проявляється через збільшення частоти передачі Apr при схрещуванні донора та реципієнтів, що аналогічно для випадку RP4 –штам ЕСА 35А. Як аутентична, екстрахромосома рКМ101 виявляється також в штамі ЕАТ 39А. При цьому виявити аналогічну форму рКМ101 в клітинах штамів ЕСА Ес153 і 62А не вдалося. Аналіз частотних характеристик передачі стійкості до антибіотиків у штами E.carotovora з допомогою плазмід RP4, R391 і pKM101 показує, що наявність власних криптичних плазмід не впливає на транскон'югаційний процес. Кореляції між частотою перенесення чужерідних плазмід і лізисною активністю MCTV знайдено не було. У випадку транскон'юганта ЕСА 55А Kmr відбувається виключення двох резидентних гомологічних плазмідних ДНК рСА 19-1 і рСА 19-2, які, ймовірно, можуть бути віднесені до групи несумісності J. Виключення інших резидентних плазмід E.carotovora при переносі плазмід R391, RP4 і pKM101 не виявлено.
Таким чином, власні критичні плазміди зустрічаються доволі часто у пектолітичних фітопатогенних ервіній. Вони не відповідають за прояв антибіотикостійкісті, не мають генетичних структур для синтезу MCTV і CCTV. Популяційна гетерогенність не пов'язана зі зміною плазмідного складу штамів E.carotovora. Запропонований нами підхід для транскон'югативного перенесення плазмід у перспективі дозволить вивчити властивості і встановити екологічне значення даних екстрахромосом. Слід також відмітити очевидну паралель між дефектними фагами і деякими криптичними плазмідами E.carotovora: обидва види генетичних елементів є множинними факторами цих бактерій. Даний феномен множинності доповнюється багатофакторністю патогенності фітопатогенних пектолітичних ервіній, зокрема наявністю кількох ізоферментів пектатліаз ( Barras et al., 1994).
РОЗДІЛ 7. ВЗАЄМОЗВ'ЯЗОК МІЖ БАКТЕРІОЦИНАМИ, БАКТЕРІОФАГАМИ І ПЛАЗМІДАМИ E.CAROTOVORA (УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ)
Згідно літературних даних штами E.carotovora несуть два види бактеріоцинів –коліцинподібні бактеріоцини (CCTV) і макромолекулярні бактеріоцини типу фагових відростків (MCTV) (Лысак с соавт., 1978; Itoh et al., 1978). Екологічна роль MCTV і CCTV невідома, хоч подібні фактори у бактерій беруть участь у міжвидовому і міжштамовому антагонізмі (Прозоров, 1996). В роботі вперше показано, що CCTV виступають кілерами для віддалених родів бактерій і можуть вбивати фітопатогенні агробактерії, псевдомонади і Klebsiella spp. Серед ервіній вони обумовлюють лізис штамів E.chrysanthemi і E.herbicola. Всі ці бактерії можуть бути членами мікробної асоціації, яка заселяє рослину чи рослинний матеріал. Дослідження CCTV показують, що цей вид бактеріоцинів, на відміну від подібних бактеріоцинів ентеробактерій (Пагсли, Оудега, 1990), не має прямого відношення до криптичних плазмід E.carotovora. Ці фактори у пектолітичних ервіній, ймовірно, кодуються генами, які локалізовані в межах бактеріальної хромосоми. Аналогічні генетичні детермінанти виявлено у бактерій роду Pseudomonas. Вони кодують коліцинподібні піоцини типу S (Sano, 1993). При вивченні популяційної дисоціації штамів виявлено, що один і той же штам E.carotovora може нести кілька генетичних детермінант CCTV.
Макромолекулярні бактеріоцини E.carotovora - високоспецифічні кілерні агенти. Вони лізують близькоспоріднені штами фітопатогенних ервіній та штами близьких до них ентеробактерій - E.coli. Вузька специфічність MCTV аналогічна фаговій. Відомо, що майже всі бактеріофаги мають обмежене коло бактерій- господарів (Hendrix et al., 1999). На фагову природу MCTV вказують характерні зони лізису, що утворюються при їх дії на чутливі бактеріальні клітини. Важливим є те, що MCTV, окрім E.carotovora, можуть вбивати інші бактерії родини Enterobacteriaceae, які відносяться до важливих патогенів людини та тварин. Фаготерапія в теперішній час розглядається, як важливий напрямок медицини (Крылов, 2001) і MCTV, специфічні щодо коліформ, могли б бути використані для біоконтролю цих патогенів в оточуючому середовищі та в хворих пацієнтів.
Рецепторами для MCTV виступають молекули ліпополісахариду (ЛПС) зовнішньої клітинної оболонки E.carotovora subsp. carotovora. Скоріше за все, O-ланцюг ЛПС містить рецепторні ділянки для часток каротоворіцинів. Ця складова частина ЛПС-молекул містить і рецепторні ділянки для помірного бактеріофага ZF40 E.carotovora. У бактерій роду Erwinia наявність ЛПС-рецепторів можна розглядати як певну закономірність. Помірні ервініафаги 49 і 59, а також чужорідний фаг Т2 адсорбуються до високоочищених молекул ЛПС E.horticola 450. Дані, одержані при вивченні кола господарів для вірулентного фага F44, та розширення кола індикаторів серед RC –мутантів E.carotovora вказують на R-ЛПС, як на рецептор цього фага та коліфага Т7. Відомо, що всі складові частини ЛПС можуть виступати рецепторами для бактеріофагів і макромолекулярних бактеріоцинів (Beumer et al., 1984) Ті з них, які прикріплюються до S-ЛПС, вважаються вузькоспецифічними щодо бактерій-господарів. В цьому аспекті MCTV можна розглядати як особливі фактори конкурентних взаємовідносин у системі пектолітичних ервіній, що пояснює відсутність прояву кілерної дії на інші фітопатогенні бактерії.
Для пошуку макромолекулярних бактеріоцинів E.carotovora в роботі запропоновано принципово новий підхід. Суть методу полягає у визначенні бактеріоциногенністі безпосередньо на газоні бактеріальних мутантів, стійких до дії налідіксової кислоти. Дія НК викликає індукцію MCTV, які утворюють зони лізису на газоні. Метод застосовано щодо 104 штамів E.carotovora різного походження. Вперше показано, що 88 % штамів цих важливих фітопатогенів несуть MCTV, які відрізняються між собою за морфологією зон лізису бактеріального газону, його характером та іншими біологічними ознаками. Встановлено незалежність персистенції бактеріоцинів E.carotovora від місця знаходження штамів-носіїв та від рослини-господаря.
Результати вивчення лізогенного стану показують, що у фітопатогенних пектолітичних бактерій E.carotovora бактеріоциногенність і дефектна лізогенія поєднані між собою. Основні кілерні фактори цих бактерій є продуктами збирання дефектних помірних фагів при SOS-індукції лізогенних клітин. При індукції мітоміцином С і налідіксовою кислотою, окрім хвостових відростків, клітини утворюють й інші частинки фагової природи –головки та базальні пластинки. Кількісне співвідношення фагоподібних часток (компонентів фагових часток) в індукованих лізатах дефектно-лізогенних ервіній залежить від роду індуктора. При індукції НК штами E.carotovora дають від 63 до 85% часток типу фагових базальних пластинок. Причина цього явища невідома, але встановлений факт може бути корисним при наступному вивченні дефектних фагів пектолітичних ервіній.
Клітини окремих штамів E.carotovora утворюють при індукції від двох до трьох типів фагових відростків, які відрізняються між собою не тільки за лінійними размірами, але й за морфолого-структурною організацією. Результати, які обґрунтовують множинну лізогенію E.carotovora, були отримані також при вивченні фагових головок. Для всіх штамів ервіній характерна наявність головок 4 типів, при цьому один із штамів (ЕСА 35А) містить три різні типи цих часток. Результати вказують на наявність у фітопатогенних пектолітичних ервіній дефектної полілізогенії і підтверджують множинність MCTV. Природа дефектів у профагових геномах E.carotovora, які приводять до формування тільки компонентів фагових віріонів, а не нормальних помірних бактеріофагів, невідома. Висловлено кілька припущень. Дефектність профагів ервіній пов'язана з порушенням синтезу конекторів фагових часток. У випадку профагів ервіній можливо мають місце дефекти при упакуванні ДНК. І, нарешті, компоненти фагових часток є продуктами окремих генетичних модулів дефектних профагів, які структурно і функціонально не зв'язані між собою і розміщені в різних місцях бактеріальної хромосоми. Головки дефектних помірних фагів пектолітичних ервіній близькі за формою до головок ізометричних фагів, що дозволяє припустити існування дефектних помірних фагів морфотипу А1 у цих бактерій. Бактеріофаг такої морфологічної організації (ZF40) дійсно було знайдено, але за размірами та за структурою скоротливого футляра хвостового відростка він суттєво відрізняється від дефектних фагів E.carotovora.
Розміри нормальних хвостових відростків дефектних помірних фагів 11-ти штамів E.carotovora складають від 128 до 192 нм і близькі до лінійних розмірів хвостових відростків інших штамів цих бактерій (Nguyen et al., 1999). Вони також співпадають з розмірами піоцинів R-типу (Kageyama et al., 1979) і макромолекулярними бактеріоцинами інших бактерій (Boemare et al., 1992). Отже, штами фітопатогенних пектолітичних ервіній зустрічаються в природі як дефектно-полілізогенні системи. Дефектна лізогенія пектолітичних ервіній тісно асоційована із бактеріоциногенністю, носіями якої виступають макромолекулярні каротоворіцини типу фагових хвостових відростків.
В роботі вперше започатковано вивчення процесу самозбирання in vitro таких надмолекулярних структур, як порожні футляри і поліфутляри, після руйнування скорочених футлярів хвостових відростків дефектних фагів E.carotovora. Виявлено центри самозбирання (кристалізації) порожніх футлярів і поліфутлярів каротоворіцинів, які являють собою двохкомпонентну систему. Центри самозбирання, ймовірно, складаються із молекул "затравки" і структурного білка скороченого футляра. Самоорганізація порожніх поліфутлярів каротоворицинов близька до процесу полімеризації за моделлю “риб'ячого хвоста”, яку запропоновано для самозбирання бактеріальних джгутиків (Асакура, 1982). Вона носить ступінчатий характер і призводить до утворення полярних порожніх поліфутлярів, які складаються з мономерних одиниць. Самозбирання порожніх футлярів і поліфутлярів каротоворіцинів - високоспецифічний процес. Кожному футляру і поліфутляру відповідає тільки певний тип скороченого футляра каротоворіцина того чи іншого виду. Структури змішаного типу не виявляються. Процес утворення in vitro нових надмолекулярних структур каротоворіцинів може бути зручною моделлю для вивчення самозбирання елементарних біологічних структур. Значну роль при цьому могли б відігравати центри самозбирання. Очевидно, що їх вивчення як самостійних структур могло б привести до визначення сил міжмолекулярної взаємодії і термодинамічних параметрів процесу самоорганізації.
Наявність справжньої лізогенії з участю помірного бактеріофага ZF40 у пектолітичних фітопатогенних бактерій E.carotovora у нашій роботі встановлена вперше для цих бактерій. Фаги 49, 59 і Е105, які раніше розглядалися як помірні фаги цих бактерій не лізують і не лізогенізують жодного штаму E.carotovora. З цієї причини їх можна розглядати як фаги аміловороподібних фітопатогенів E.horticola.
Основні причини фагостійкості загальновідомі (Krыger, Bickle, 1983) і включають обмеження розвитку фага з боку систем рестрикції-модифікації бактерії-господаря, а також обмеження через відсутність відповідних рецепторів і/або зменшену доступність фага до власного рецептора. Розвиток фага в клітині може заборонятися репресором гомоімунного профага. Як показано в роботі, всі зазначені причини фагостійкості можуть мати місце у E.carotovora. Хоч при дослідженні фагостійкості не було показано абортивного виключення власними плазмідами цих бактерій - фенотип Abi (Deng et al., 1997), деякі дані вказують на можливість існування у ервіній і цього феномену. В ході експериментів було встановлено, що три штами ервіній (ЕСА М2-4, 33А і J2), які фаг ZF40 вражує з низькою ефективністю при першому інфікуванні, несуть плазміди різного розміру.
ZF40 –класичний помірний бактеріофаг. Він здатний формувати правильні лізогени чутливих культур і спонтанно утворювати мутанти clear-типу. Геном фага ZF40 містить липкі кінці і має середній розмір (45,8 тпн), який близький до розміру геномів лямбдоїдних бактеріофагів (Campbell, 1994). Фаг, скоріше за все, використовує cos–стратегію реплікації ДНК. Механізм інтеграції його геному в ДНК бактерії-господаря близький до сайт-специфічної рекомбінації. Структурна організація фагового капсиду і, особливо, хвостового відростка є унікальною і досить складною. Порівнюючи структуру каротоворіцинів E.carotovora і відростка фага можна бачити, що власне цей компонент фагового капсиду є найбільш унікальним утвором як дефектних, так і життєздатних фагів E.carotovora.
Не дивлячись на те, що E.carotovora є занадто шкідливим фітопатогеном й інтенсивно вивчається в різних лабораторіях, кількість її бактеріофагів не нараховує і десяти (Perombelon, 1992). Ця унікальна ситуація не має пояснення. Відповідь на питання про поширення життєспроможних фагів E.carotovora може лежати у площині дефектно-полілізогенного стану цих важливих бактерій. На нашу думку, дефектна полізізогенія у пектолітичних ервіній може призводити до утворення надстійкості до гомологічних і гетерологічних фагів.
Згідно сучасній теорії модульної організації бактеріальних вірусів (Brussow et al., 1998), фагові геноми складаються із наборів (кластерів) генів, які відповідають за кодування структурно і функціонально споріднених білків. Генетичні модулі, які відповідають за синтез структурних білків віріона, включають три головні незалежні набори генів: білків капсида, хвостового відростка і базальної пластинки. Ці модулі були порівняні у споріднених помірних ервініафагів 49 і 59, які мають біля 50% гомології ДНК (Товкач, 1987). Показано, що фаги мають однакові модулі капсида і хвостового відростка. В ідентичні капсиди фагів 49 і 59 упаковується віріонна ДНК однакового розміру –,9 тпн. Навпаки, організація генних модулів базальної пластинки в обох фагів різна. Базальноі пластинки обох фагів відрізняються за морфолого-структурною організацією та поліпептидним складом. Вони мають спорідненість до різних рецепторних сайтів, розташованих на ЛПС клітинної оболонки спільного господаря –E. horticola 450. Наявність відмінних ВР змінює коло чутливих бактерій-господарів. Ці факти підтверджують положення про меншу сталість (консервативність) модулів базальних пластинок, особливо хвостових фібрил, порівняно з модулями фагових хвостових відростків (Sandmeier, 1994). Рестрикційний аналіз геномів фагів 49 і 59 показав, що обидва фаги мають циклічно пермутовану ДНК. Проте пермутація ДНК фага 49, на відміну від ДНК фага 59, - дискретна. Отже в геномі фага 49, у порівнянні з таким фага 59, наявна значна зміна нуклеотидної послідовності, що має відношення до рекомбінації. Певно, геном фага 49 є гібридним геномом, походження якого обумовлене рекомбінаційною взаємодією батьківського генома фага 59 і модульного набору генів невідомого партнера фагового чи профагового походження. Новий гібридний помірний фаг (фаг 49) включає модулі капсида і хвостового відростка, а також деяку частину генів с-області, які ведуть своє походження від батьківського фага 59. Дані, одержані при дослідженні L. lactis, показують, що нові фаги, аналогічні фагу 49, можуть виникати як відповідь на селективний тиск абортивної інфекції (Moineau et al., 1994). Висловлено допущення, що помірні фаги 49 і 59, насправді, належать до унікальної полілізогенної системи E.horticola і їх походження пов'язане з наявністю різних профагів в клітинах одного господаря.
В роботі охарактеризовано новий вірулентний бактеріофаг F44. Фаг F44 –полівалентний і здатний розмножуватися в клітинах багатьох представників бактерій роду Erwinia, лабораторних штамів E.coli і деяких псевдомонад. Важлива особливість цого фага - здатність лізувати деякі мутанти фітопатогенних пектолітичних ервіній, стійких до MCTV. При порівняльному вивченні виявлено дві суттєві відмінності між фагом F44 та фагом Т7 E.coli. Фаг F44 не має власної системи захисту від рестрикції з боку бактерії-господаря, аналогічної Orc –системі фага Т7 (Krыger, Schroeder, 1981). З іншого боку, на відміну від фага Т7, розвиток фага F44 не обмежується в клітинах штамів E.coli, які несуть статевий фактор F (Studier, 1979). Відсутність багатьох рестрикційних сайтів на ДНК фагів F44 і Т7 свідчить про їх контрселекційне видалення в процесі адаптації фагів до співіснування з господарем.
Подальший розвиток фундаментальних досліджень в галузі молекулярної генетики бактерій роду Erwinia і їх бактеріофагів неможливий без отримання банку відповідних бактеріальних і фагових мутантів. Для вивчення генетичної організації бактеріофагів, плазмід та бактерій необхідні супресорні мутанти. Так як фаг F44 фактично має властивості полівалентного бактеріофага, він може застосовуватися для вивчення позагенної супресії у E.horticola. При цьому стає можливою надійна селекція su+-мутантів не тільки в аміловороподібних ервіній, а також у E.carotovora (RC-мутанти) і таких важливих епіфітних бактерій як E.herbicola.
Дослідження E.carotovora subsp. carotovora і E.carotovora subsp. atroseptica показали, що 16 із 52 досліджених штамів несуть позахромосомні ДНК різного розміру –від 2,5 до 129 тпн. Виявлено дві закономірності, про які ще не було повідомлено для пектолітичних ервіній. Плазміди у E.carotovora subsp. atroseptica зустрічаються частіше, ніж у E.carotovora subsp. carotovora –проти 33%. На відміну від штамів ЕСА, плазмідовмістні штами ЕАТ несуть виключно поодинокі резидентні плазміди різних розмірів. В роботі не вдалось виявити тих ознак, за прояв яких відповідають плазмідні гени. Наявність резидентних плазмід може відігравати певну “стабілізуючу”роль в природних популяціях E.carotovora. Так, в одному з випадків –штам ЕСА 13А –показано, що втрата тільки однієї плазміди призводить до значного збільшення спонтанного виходу відповідних MCTV. Очевидно, що за рахунок збільшення долі лізованих клітин зменшується патогенний потенціал популяції. Незважаючи на те, що наші дослідження плазмід E.carotovora, а також створення методів для їх аналізу і використання носили переважно пошуковий характер, отримані результати дозволяють сподіватися на їх плідне використання при вивченні молекулярної генетики фітопатогенних пектолітичних ервіній.
Отже, результати, отримані при вивченні бактеріоциногенності (розділ 3), дефектної лізогенії (розділ 4), справжньої лізогенії (розділ 5) і плазмідного складу (розділ 6), створюють підґрунтя для цілісного розгляду “егоїстичних”факторів і їх ролі в екології важливих фітопатогенних бактерій E.carotovora. Вбачається, що тільки повне врахування цих автономних генетичних факторів може привести до цілісного розуміння стратегії вірулентності пектолітичних ервіній.
Таким чином, лізогенія у E.carotovora має два прояви. Дефектно-полілізогенний стан можна вважати переважаючим над справжньою лізогенією. Дефектна лізогенія даних фітопатогенів проявляється через лізисну дію фагових хвостових відростків на чутливі клітини споріднених бактерій. Екстрахромосомальні елементи не пов'язані з лізогенією і можуть розглядатися як незалежні генетичні елементи E.carotovora.
ВИСНОВКИ
1. При SOS-індукції клітин E.carotovora утворюється два види бактеріоцинів –коліциноподібні та макромолекулярні каротоворіцини. Бактеріоциногенність на рівні макромолекулярних каротоворіцинів відображає міжштамовий антагонізм у природних популяціях пектолітичних фітопатогенних ервіній.
2. Присутність макромолекулярних бактеріоцинів –стала видова ознака E.carotovora. Макромолекулярні каротоворіцини поширені серед штамів пектолітичних ервіній, які заселяють різноманітні рослини в різних країнах та різних географічних регіонах.
. Штами E. carotovora існують в природі як дефектно-полілізогенні системи, біологічним проявом яких є бактеріоциногенність. Носіями останньої виступають макромолекулярні каротоворіцини типу фагових хвостових відростків. При SOS- індукції клітини штамів E. carotovora різного походження утворюють три типи надмолекулярних структур фагової природи: базальні пластинки з середнім діаметром 47 нм, головки різної величини (19 –нм) і хвостові відростки, лінійні розміри яких складають 128 –х 13,4 –,6 нм. За кілерну активність щодо чутливих штамів відповідають лише скоротливі хвостові відростки дефектних фагів.
. Після спонтанного руйнування скоротливих хвостових відростків дефектних фагів E. carotovora in vitro відбувається самообумовлений синтез нових надмолекулярних структур –порожніх футлярів і поліфутлярів, які збираються в центрах самоорганізації. Центри самоорганізації (полімеризації) - унікальні структурно-функціональні утвори діаметром від 30 до 60 нм. Самоорганізація каротоворіцинів відноситься до морфопоезу низького порядку і відображає основні етапи самозбирання елементарних біологічних структур in vitro.
5. Бактеріофаг ZF40 здатний формувати справжню лізогенію у E.carotovora. Цей помірний фаг має геном з липкими кінцями, розмір якого становить 45,8 тпн. За морфолого-структурною організацією бактеріофаг віднесено до морфотипу А1, родини Mioviridae, порядку Сaudovirales; капсид фага ZF40 має діаметр 58,3 нм. Унікальна структурна організація скоротливого футляра відростка віріона, а також незначна довжина відростка (86,3 нм) дозволяють віднести цей фаг до нового виду ентеробактеріальних вірусів.
. Незвичайна природна стійкість E.carotovora до літичної дії екзогенних бактеріофагів лежить в площині дефектно-полілізогенного стану цих фітопатогенів. Її причини полягають в обмеженні розвитку фагів на рівні гомоімунних профагів, а також пов'язані з утрудненою адсорбцією фагових часток до поверхневих клітинних рецепторів. Крім цього, розвиток фагів обмежується дією різноманітних внутріклітинних систем рестрикції-модифікації.
. Рецепторами для макромолекулярних каротоворіцинів і помірного бактеріофага ZF40 виступає О-ланцюг ліпополісахариду (ЛПС) зовнішньої клітинної оболонки E.carotovora. У бактерій роду Erwinia молекули ЛПС мають рецепторні ділянки для фагів 49, 59 і F44, а також для коліфагів Т2 і Т4.
. Гетероімунні ервініафаги 49 і 59 –споріднені помірні бактеріофаги аміловороподібних фітопатогенних бактерій Erwinia horticola. Їх походження пов'язане з горизонтальним обміном генетичних модулів фагових геномів, які відповідають за синтез регуляторних і структурних білків віріона.
. Бактеріофаг F44, який відноситься до родини Podoviridae, здатний викликати продуктивну інфекцію у багатьох лабораторних штамів Escherichia coli, фітопатогенних бактерій E.carotovora, E.horticola, E.herbicola, E.chrysanthemi і деяких представників Pseudomonas spp. Полівалентність фага F44 дозволяє використовувати його як зручний генетичний інструмент для отримання відповідних мутантів у важливих фітопатогенних бактерій.
. Не менше 30% природних штамів фітопатогенних пектолітичних ервіній (16 із 52 досліджених) несуть позахромосомну ДНК різного розміру –від 2,5 до 129 тпн. Криптичні плазміди зустрічаються частіше у E.carotovora subsp.atroseptica ніж у E.carotovora subsp. carotovora; в останніх відмічається множинний вміст плазмід. Плазміди не детермінують стійкості до антибіотиків, синтезу CCTV, MCTV і пектолітичних ферментів та не причетні до популяційної дисоціації E.carotovora.
СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Товкач Ф.И. Самосборка надмолекулярных структур in vitro после спонтанного разрушения каротоворицинов//Микробиология. - 2002.- Т.71, №4.- С. 467 –.
. Товкач Ф.И. Дефектная лизогения Еrwinia carotovora//Микробиология.- 2002.- Т.71, №3. - С. 359 –.
. Товкач Ф.И. Лизогенное состояние фитопатогенных бактерий Еrwinia carotovora//Доповіді НАН України. - 2002.- № 7. - С. 170 –.
4. Товкач Ф.И. Молекулярно-биологические свойства вирулентного бактериофага FE44//Доповіді НАН України. - 2002.- № 6. - С. 175 –.
5. Товкач Ф.И. Структурная организация частиц и рестрикционный анализ ДНК умеренного бактериофага ZF40 Еrwinia carotovora//Микробиология. - 2002. Т.71, №1. - С. 75 –.
6. Товкач Ф.И. Изучение фагоустойчивости с помощью умеренного бактериофага ZF40//Микробиология.- 2002.- Т.71, №1. - С. 82 –.
7. Товкач Ф.И. Выделение и предварительная характеристика криптических плазмид Еrwinia carotovora//Микробиология. - 2001.- Т.70, №6. - С. 804 –.
8. Товкач Ф.И. Биологические свойства и классификация бактериоцинов Erwinia carotovora//Микробиология. - 1998. - Т.67, № 6. - С. 767 –.
9. Товкач Ф.И. Соотношение между лизирующей активностью макромолекулярных каротоворицинов и бактериоциночувствительностью у Erwinia carotovora//Микробиология.- 1998. - Т. 66, № 6. - С. 775 –.
10. Товкач Ф.И. Новый вирулентный бактериофаг, репродуцирующийся в штаммах Erwinia horticola и Escherichia coli // Микробиол. журн. -1994. - Т. 56, №5. - С. 107.
11. Горб Т.Е., Товкач Ф.И. Способ горизонтальной передачи плазмид у Еrwinia carotovora//Микрбиол. журн. - 2002. - Т.64, №3. - С.20 – 26.
. Товкач Ф.И., Шевченко Т.В., Горб Т.Е., Муквич Н.С., Романюк Л.В. Сравнительное изучение умеренных ервиниофагов 49 и 59//Микрбиол. журн. - 2002. - Т.64, №2. - С. 65 –.
13. Товкач Ф.И., Товкач А.Ф., Мороз С.Н. Изучение популяционной диссоциации музейних культур Еrwinia carotovora// Микрбиол. журн. - 2002. - Т.64, №1. –С. 11 –.
. Товкач Ф.И., Мороз С.Н., Гвоздяк Р.И. Изучение адсорбционных рецепторов макромолекулярных бактериоцинов Erwinia carotovora subsp. сarotovora // Мікробіол. журн. - 2001. - Т. 63, № 1. - С. 23 –.
. Товкач Ф.І., Мороз С.М., Гвоздяк Р.І. Природа адсорбційних рецепторів для макромолекулярних каротовороцинів //Доповіді НАН України. -2001.- № 7. - С. 159 –.
. Товкач Ф.И., Горб Т.Е. Использование бактериофага F44 для поиска внегенных супрессоров у Erwinia horticola // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т.16, № 2. - С. 64 –.
17. Горб Т.Е., Товкач Ф.И. Типирование фитопатогенных штаммов Erwinia carotovora на основе пектолитической активности и чувствительности к бактериоцинам (каротоворицинам)//Микробиология. - 1997. - Т.66, № 6. - С.823–.
18. Яговдик М.В., Товкач Ф.И. Конструирование супрессорных штаммов Erwinia horticola 450 с целью получения амбер-мутантов фага 59//Микробиол. журн. - 1994. - Т.56, №5. - С.111.
19. Шевченко Т.В., Кишко Я.Г., Товкач Ф.И. Изучение термической инактивации умеренных бактериофагов 59 и 49 Erwinia carotovora//Микробиол. журн. - 1993. - Т.55, №2. - С. 58 –.
. Товкач Ф.И., Ромась И.И., Рубан В.И., Кишко Я.Г. Природа прикрепительных рецепторов умеренных фагов 49 и 59 Erwinia carotovora// Микробиол. журн. -1993.- Т.55, № 6.- С. 36 –.
21. Григорян Ю.А., Товкач Ф.И., Данилейченко В.В., Кишко Я.Г. Рестрикционная карта ДНК умеренного фага Е105 полилизогенной культуры Erwinia carotovora 268 //Мол. генет. микробиология и вирусология. - 1988. - №3.- С. 24 –.
22. Товкач Ф.И., Григорян Ю.А., Рубан В.И., Данилейченко В.В., Кишко Я.Г. Рестрикционная карта пермутированной ДНК умеренного бактериофага 59 Erwinia carotovora//Мол. генет. микробиология и вирусология. - 1988. - №1. - С. 20 –.
. Товкач Ф.І., Воцелко С.К., Бондарчук А.О. Визначення молекулярної ваги білкових фракцій ферментного препарату Bacillus mesentericus 316 M //Мікробіол журн. - 1977. - Т.39, № 4. - С. 504.
. Товкач Ф.И. Популяционная гетерогенность коллекционных штаммов Erwinia carotovora subsp.carotovora и ее связь с фаговой лизогенной конверсией// Материалы международной конференции”Микробиология и биотехнология XXI столетия“. –Минск, 2002. - С.103 –.
25. Товкач Ф.И., Григорян Ю.А., Рубан В.И., Кишко Я.Г. Фаг-фаговые взаимоотношения в лизогенной клетке эрвиний//Фитонциды. Бактериальные болезни растений, ч. II. - Киев-Львов, 1990. - С. 42.
26. Кишко Я.Г., Товкач Ф.И., Рубан В.И., Дидык О.А., Яговдик М.В. Молекулярно-генетические свойства умеренного бактериофага 59 Erwinia carotovora// Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства. - Алма-Ата, 1990. - С. 44.
. Товкач Ф.И., Шевченко Т.В. Получение и предварительная характеристика st-мутантов умеренного бактериофага 49//Там же. - С. 114.
28. Kishko Ya.G., Tovkach F.I., Ruban V.I., Danileichenko V.V. Structural study of Erwinia carotovora temperate phages//Molecular organization of biological structures.- Moscow. 1989. - P. 95.
29. Grigoryan Yu.A., Kishko Ya.G., Danileichenko V.V., Ruban V.I., Tovkach F.I. Structure of temperate bacteriophage E105 of Erwinia carotovora//Ibid. - P. 96.
30. Kishko Ya.G., Tovkach F.I., Grigoryan Yu.A., Ruban V.I., Danileichenko V.V. Electron microscopic study of the fine DNA-structure of Erwinia phage 59 and transposone-like element//12 Tagung Elektronmikroskopie. – Dresden, 1988. - P.201 –.
31. Kishko Ya.G., Grigoryan Yu.A., Tovkach F.I., Ruban V.I. Restriction maps of temperate phages 59 and E105//10th Congress of the Hungarian society of microbiology 26-29 Аugust 1987. - Szeged, 1987. - P. 21.
32. Кишко Я.Г., Рубан В.И., Товкач Ф.И., Григорян Ю.А., Данилейченко В.В. Особенности лизогенной индукции дефектно-полилизогенной культуры E. carotovora//Материалы VI съезда УМО. –Донецк: Наукова думка. 1984. Ч. 2. –С. 164.
. Товкач Ф.И., Григорян Ю.А., Данилейченко В.В. Полилизогения и умеренные фаги E. carotovora 268//Там же. - С. 170.
34. Товкач Ф.И., Рубан В.И., Кишко Я.Г. Рестрикционный анализ ДНК фага 59 Erwinia carotovora 268 // Материалы Всесоюзного симпозиума, посвященного 60-летию Тбилисского НИИВС. - Тбилиси, 1984. - С. 157 –.
. Кишко Я.Г., Рубан В.И., Григорян Ю.А., Товкач Ф.И. Особенности лизогении и вирус-вирусные взаимоотношения культуры Erwinia carotovora 268// Там же. - С. 47 –.
АНОТАЦІЯ
Товкач Ф.І. Лізогенія і бактеріофаги Erwinia carotovora. –Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 –вірусологія. –Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ, 2002.
В роботі визначено природу лізогенії, виявлено і досліджено помірні та вірулентні бактеріофаги важливих фітопатогенних бактерій Erwinia carotovora, збудників м'якої гнилі рослин.
Вперше доведено, що дефектна лізогенія –видова ознака E.carotovora. При експресії генів дефектних профагів ервіній не утворюється цілісних віріонів. SOS-індукція клітин супроводжується синтезом окремих компонентів фагових часток –головок, базальних пластинок і хвостових відростків. Лізогенія пектолітичних ервіній проявляється через бактеріоциногенність. Бактеріоцини типу фагових хвостових відростків (макромолекулярні каротоворіцини) виступають основними кілерними факторами щодо споріднених бактерій.
Встановлено, що помірний бактеріофаг ZF40 із родини Myoviridae (морфотип А1) обумовлює справжню лізогенію у E.carotovora. Порівняння двох помірних, гетероімунних ервініафагів 49 і 59 (морфотип В1) підтвердило їх рекомбінаційне походження при персистенції в клітинах спільного господаря. Полівалентність нового вірулентного бактеріофага F44 (морфотип С1) дозволяє використовувати його для одержання різних мутантів у фітопатогенних ервіній. Молекули ліпополісахариду клітинної оболонки ервіній виступають рецепторами як макромолекулярних каротоворіцинів, так і фагів. Фагостійкість у E.carotovora зумовлена обмеженням адсорбції, забороною розвитку фагів внутріклітинною системою рестрикції і обмеженням гетероімунними помірними фагами.
Встановлено, що 30% штамів E.carotovora несуть позахромосомну ДНК. Виявлені плазміди не визначають стійкості до антибіотиків, синтезу бактеріоцинів та пектолітичних ферментів, не причетні до популяційної дисоціації даних бактерій і віднесені до криптичних.
Ключові слова. Erwinia carotovora, дефектна і справжня лізогенія, полілізогенія, помірні і вірулентні бактеріофаги, бактеріоцини, плазміди.
АННОТАЦИЯ
Товкач Ф.И. Лизогения и бактериофаги Erwinia carotovora. –Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.06 –вирусология. –Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев, 2002.
В работе определена природа лизогении, обнаружены и исследованы умеренные и вирулентные бактериофаги важных фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora, вызывающих мягкую гниль у растений.
Впервые доказано, что дефектная полилизогения –видовой признак E.carotovora. Экспрессия генов дефектных профагов не приводит к образованию нормальных вирионов. При SOS-индукции клеток эрвиний образуется три типа надмолекулярных структур фагового происхождения –базальные пластинки со средним диаметром 47 нм, головки различного размера (19 –нм) и хвостовые отростки длиной от 128 до 192 нм. Бактериоцины типа фаговых хвостовых отростков (макромолекулярные каротоворицины - MCTV) –основные киллерные факторы E.carotovora, которые убивают родственные бактерии.
Изучены основные молекулярно-биологические свойства MCTV. Показано, что эти структуры могут служить модельной системой для изучения элементарной самосборки in vitro новых надмолекулярных структур –полых чехлов и поличехлов сократимых фаговых отростков.
Обнаружен новый умеренный бактериофаг ZF40 из семейства Myoviridae (морфотип A1), формирующий истинную лизогению у E.carotovora. Размер его генома составляет 45,8 тпн. Два других фага, 49 и 59 (семейство Syphoviridae, морфотип В1), имеют размер генома 47,9 тпн. ДНК этих фагов пермутированы и, в отличие от фага ZF40, не содержат когезивных концов. Бактериофаги 49 и 59 –гетероиммунные, близкородственные умеренные вирусы. Их геномы содержат совпадающие структурные модули вирионов, которые отличаются лишь строением базальных пластинок. Сравнительное изучение этих фагов подтверждает их рекомбинационное происхождение в пределах сложной полилизогенной системы эрвиний. Обнаружены существенные различия между фагом Т7 Escherichia coli и новым вирулентным бактериофагом F44 –семейство Podoviridae, морфотип С1, размер генома 39,2 тпн. В отличие от Т7, бактериофаг F44 не обладает специальной системой защиты от бактериальных рестриктаз и его развитие не ограничивается F-плазмидой. Поливалентность бактериофага F44 позволяет использовать его в качестве удобного генетического инструмента для получения важных мутантов у фитопатогенных ервиний.
Рецептором для хвостовых отростков дефектных бактериофагов и фага ZF40 служит О-цепь молекул клеточного липополисахарида (ЛПС) E.carotovora. Молекулы ЛПС содержат рецепторные участки для адсорбции фагов 49, 59 и F44, а также неродственных фагов Т2 и Т4 E.coli. Фагоустойчивость E.carotovora обусловлена ограничением адсорбции, запретом внутриклеточного развития фагов системой рестрикции бактерии-хозяина и ограничением со стороны гомоиммунных умеренных бактериофагов.
Показано, что 30% природных штаммов E.carotovora несут внехромосомную ДНК различного размера –от 2,5 до 129 тпн. Криптические плазмиды встречаются чаще у E.carotovora subsp. atroseptica, чем у E.carotovora subsp. carotovora. Плазмиды не определяют устойчивости к антибиотикам, синтез бактериоцинов и пектолитических ферментов, а также не участвуют в процессах популяционной диссоциации у эрвиний.
Ключевые слова. Erwinia carotovora, дефектная и правильная лизогения, полилизогения, умеренные и вирулентные бактериофаги, бактериоцины, плазмиды.
ABSTRACT
Tovkach F.I. Lysogeny and Bacteriophages for Erwinia carotovora. –Manuscript.
Doctoral degree thesis, speciality 03.00.06 –Virology. –Zabolotniy Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2002.
It was determined the lysogenic state for the phytopathogenic soft rot bacteria Erwinia carotovora; theirs temperate and virulent bacteriophages were detected.
At the first time proved that defective lysogeny is the innate property of E.carotovora, as species. The cells of these bacteria produce particular phage parts (baseplates, heads, and tails) but do not assemble them into fully functional phage particles. The lysogeny of pectolytic phytopathogenic bacteria is expressed by theirs bacteriocinogenicity. The phage-tail-like bacteriocins (the macromolecular carotovoricins) are the main killers for the related bacteria.
The temperate phage ZF40 proved to be a typical member of the Myoviridae family (morphotype A1). It establishes the true lysogeny in E.carotovora. Molecular-biological properties of two temperate heteroimmune phages 49 and 59 (morphotype B1) have been comparatively studied. It is supposed that phage 49 is the recombination (hybrid) derivate of phage 59 and unknown phage. The virulent bacteriophage F44 has polyvalent nature. It belongs to the Podoviridae family (morphotype C1). This phage can be the important genetic tool for receiving useful bacterial mutants in erwinias. The lypopolysaccharide molecules of erwinias contain a receptor sites for carotovoricins and bacteriophages ZF40, 49, 59, F44, T2, and T4. It was shown that, in E.carotovora, the phage-cell interaction can be substantially blocked at the states of adsorption, restriction-modification and phage immunity levels.
The cryptic plasmids of E.carotovora are not responsible for their resistance to antibiotics and not involved in the synthesis of macromolecular and colicin-like carotovoricins. The population dissociation of erwinias is not associated with the loss of residential plasmids by cells.
Key words. Erwinia carotovora, defective and true lysogeny, polylysogeny, temperate and virulent bacteriophages, bacteriocins, plasmids.