Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО по ОБРАЗОВАНИю
Белгородский государственный университет
Медицинский факультет
Лабораторный практикум по биологической химии
учебные указания к проведению лабораторных работ
по биологической химии для студентов второго курса
медицинского факультета
по специальностям: 060101 - Лечебное дело и 060103 - Педиатрия
БЕЛГОРОД 2006г
«___»___________20 г.
Напечатаны по решению редакционно-издательского совета университета
Составители:
Е.А.Шенцева, кандидат биологических наук,
Л.Р.Закирова, кандидат биологических наук.
Предисловие
Настоящие методические указания к проведению лабораторных работ по биологической химии написано сотрудниками кафедры биохимии и фармакологии Белгородского государственного университета доцентом Е.А.Шенцевой и старшим преподавателем Л.Р.Закировой. Методические указания составлены в полном соответствии с программой курса биологической химии, рекомендованной для студентов медицинских ВУЗов (Москва, 2000г.)
Методические указания содержат описание лабораторных работ по курсу биологической химии, выполняемых студентами II курса медицинского факультета на лабораторно-практических занятиях. В каждой лабораторной работе излагается краткая информация по изучаемой теме, принцип метода, ход эксперимента, советы по оформлению результатов и контрольные вопросы для закрепления изученного материала. Методические указания призваны помочь студенту овладеть на лабораторно-практических занятиях современными методами экспериментальных исследований, закрепить теоретические знания, приобретенные на лекциях, анализировать полученные результаты.
В основу методических указаний положен многолетний опыт проведения курса биологической химии на лабораторно-практических занятиях на кафедре биохимии и фармакологии Белгородского государственного университета.
Сотрудники кафедры будут признательны всем, кто пожелает высказать свои замечания, полезные советы и пожелания относительно содержания методических указаний.
ОГЛАВЛЕНИЕ
|
[1] [2] Лабораторная работа №1 [2.1] Качественные цветные реакции на функциональные группы белков и аминокислот [3] Лабораторная работа №2 [3.1] Реакции осаждения белков [4] биохимия Сложных белков (протеинов) [5] Лабораторная работа №3 [5.1] Геминовая проба Тейхмана [6] Лабораторная работа №4 [6.1] Выделение казеиногена из молока и открытие в нем фосфата [7] Лабораторная работа №5 [7.1] Выделение муцина из слюны и открытие в нем углеводного компонента [8] биохимия ФЕРМЕНТов [9] Лабораторная работа №6 [9.1] Количественное определение активности амилазы (по Вольгемуту) [10] Лабораторная работа №7 [10.1] Специфичность действия амилазы слюны [11] Лабораторная работа №8 [11.1] Влияние температуры на активность α-амилазы слюны [12] Лабораторная работа №9 [12.1] Определение оптимума рН для действия α-амилазы слюны [13] Лабораторная работа №10 [13.1] Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы слюны [14] биохимия нуклеиновых кислот [15] Лабораторная работа №11 [15.1] Кислотный гидролиз нуклеопротеинов дрожжей и определение состава нуклеиновых кислот [16] Изучение реакций окисления [17] Лабораторная работа №12 [17.1] Открытие альдегиддегидрогеназы в молоке [18] Лабораторная работа №13 [18.1] Обнаружение каталазы крови [19] Лабораторная работа №14 [19.1] Открытие пероксидазы [20] Лабораторная работа №15 [20.1] Получение тирозиназы и окисление тирозина в присутствии кислорода [21] Обмен углеводов [22] Лабораторная работа №16 [22.1] Определение глюкозы в крови (набором реактивов «Глюкоза-ФКД») [23] Биохимия липидов [24] Лабораторная работа №17 [24.1] Эмульгирование триацилглицеридов желчными кислотами [25] Лабораторная работа №18 [25.1] Качественная реакция Петтенкоффера на желчные кислоты [26] Лабораторная работа №19 [26.1] Определение содержания β-липопротеинов (липопротеинов низкой плотности) в плазме крови [27] Лабораторная работа №20 [27.1] Качественные реакции на холестерол [28] биохимия белков [29] Лабораторная работа №21 [29.1] Качественный анализ желудочного сока [30] Лабораторная работа №22 [30.1] Определение активности аспартатаминотрансферазы( аланинаминотрансферазы) по методу Райтмана-Френкеля(набором реагентов) [31] Лабораторная работа №23 [31.1] Определение мочевины в крови по реакции с диацетилмонооксимом (набором реагентов) [32] биохимия гормонов [33] Лабораторная работа №24 [33.1] Качественная реакция на адреналин [34] Лабораторная работа №25 [34.1] Обнаружение йодтиронинов [35] Витамины [36] Лабораторная работа №27 [36.1] Качественные реакции на витамины [37] Биохимия печени [38] Лабораторная работа №27 [38.1] Качественное определение «прямого» и «непрямого» билирубина в сыворотке крови [39] Лабораторная работа №28 [39.1] Количественное определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови [40] Лабораторная работа №29 [40.1] Тимоловая проба (проба коллоидоустойчивости) [41] Биохимия крови [42] Лабораторная работа №30 [42.1] Определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом (набором реагентов) [43] БИОХИМИЯ мочи [44] Лабораторная работа №31 [44.1] Качественные реакции на белок в моче [44.2] Определение глюкозы в моче [44.3] Качественные реакции на кровяные пигменты в моче [44.4] Качественная реакция на желчные пигменты в моче [44.5] Качественные реакции на ацетон и ацетоуксусную кислоту в моче [44.6] Качественная реакция на индикан в моче
[45] [45.1] Техника безопасности при работе в биохимических лабораториях [45.2] Способы взятия крови [45.3] Множители и приставки, применяемые для обозначений кратных и дольных единиц [45.4] Фотоколориметрия [45.5] Разделение белков сыворотки методом электрофореза на бумаге [45.6] Метод сахарной нагрузки [45.7] Количественное определение кислотности желудочного сока [45.8] Экспресс-методы обнаружения патологических компонентов мочи с помощью комбинированных тест-полосок |
Основную роль в структуре и процессах жизнедеятельности живых организмов играют белки, представляющие собой высокомолекулярные азотсодержащие биополимеры со специфическими структурами, состоящие из 20 природных аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. Простые белки (протеины) состоят только из аминокислот и являются высокомолекулярными полимерными органическими соединениями – полипептидами.
При взаимодействии белка с отдельными химическими веществами возникают окрашенные продукты реакции. Образование их обусловлено присутствием в молекуле белка той или иной аминокислоты, имеющей в своем составе определенную химическую группировку.
Значение качественных цветных реакций на функциональные группы белков и аминокислот в том, что они дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, растворах, лекарственных препаратах и идентифицировать индивидуальные аминокислоты. Эти реакции применяют как для качественного, так и для количественного определения белка и содержащихся в нем аминокислот.
Биуретовая реакция открывает пепетидную связь в белке.
Её способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Положительную биуретовую реакцию отдельные аминокислоты не дают, за исключением гистидина (His), серина (Ser), треонина (The) и аспарагина (Asn), с которыми биуретовая реакция получается при условии больших концентраций их в растворе. При добавлении сернокислой меди к сильнощелочному раствору белка или полипептида образуются соединения меди с пепетидной группировкой, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет в зависимости от длины полипептидной цепи. Раствор белка даёт сине-фиолетовое окрашивание, а продукты неполного гидролиза (пептоны) – розовое или красное окрашивание.
Принцип метода. В сильно щелочной среде пептидные группы полипептидных цепей переходят в енольную форму, которая, взаимодействуя с ионами Cu2+ , образует окрашенный (фиолетового цвета) биуретовый комплекс.
При этом енольная форма полипептида, образованная в сильнощелочной среде, дает отрицательный заряд, и ее кислород, взаимодействуя с медью, образует ковалентную связь, а медь, взаимодействуя с атомами азота, образует координационные связи.
Енольная форма пептидной связи ()
Комплекс фиолетового цвета
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Гидроксид натрия (10%). 3. Сернокислая медь (1%).
Ход работы
К 5 каплям раствора белка прибавляют 3 капли 10% раствора едкого натра и 1 каплю 1% раствора сернокислой меди и перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовый цвет.
Нельзя добавлять избыток сернокислой меди, так как синий осадок гидрата окиси меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.
Нингидриновая реакция характерна для аминогрупп, находящихся в альфа-положении. Растворы белка, альфа-аминокислот и пептидов при нагревании с нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание.
Принцип метода. В этой реакции альфа-аминокислоты и пептиды окисляются нингидрином и подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию с образованием аммиака, альдегида и СО2. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина – в желтый цвет.
Нингидриновая реакция используется для количественного определения альфа-аминокислот в аминокислотных анализаторах, а также широко используется в хроматографическом анализе и для колориметрического количественного определения аминокислот.
1.
нингидрин аминокислота альдегид нингидрин
окисленный восстановленный
(гидриндантин (бесцветный))
2.
нингидрин нингидрин продукт конденсации
окисленный восстановленный пурпур Роумэна (сине-фиолетовый)
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Раствор нингидрина (0,5%).
Ход работы
В пробирку наливают 0,5 мл раствора яичного белка и прибавляют 5 капель 0,5% водного раствора нингидрина и нагревают на водяной бане до кипения. Появляется розово-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание. С течением времени раствор синеет.
Данная реакция не является специфичной, поскольку её дают некоторые амины и амиды кислот.
Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот – фенилаланина (Phe), тирозина (Tyr), триптофана (Trp), а также свободные перечисленные кислоты. Белки, в которых циклические аминокислоты отсутствуют, не дают ксантопротенновой реакции.
Принцип метода. Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца циклических аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета. При взаимодействии азотной кислоты с тирозином реакция нитрования протекает по следующему уравнению:
1.
тирозин (Tyr) динитротирозин
при подщелачивании возникает хиноидная структура, окрашенная в оранжевый цвет:
2.
динитротирозин натриевая соль динитротирозина
хиноидная форма хиноидной структуры
(насыщенный желтый) (оранжевый)
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Азотная кислота концентрированная. 3. Гидроскид натрия (10%).
Ход работы
В пробирку вносят 0,5 мл раствора яичного белка. Добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты и осторожно нагревают. Вначале появляется осадок свернувшегося белка (под влиянием кислоты), который при нагревании окрашивается в желтый цвет.
После охлаждения в пробирку наливают по каплям 10% раствор едкого натра до появления оранжевого окрашивания вследствие образования натриевой соли динитротирозина.
Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистеина (Cys) и цистина, содержащих слабосвязанную серу. Метионин (Met), хотя и является содержащей серу аминокислотой, этой реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно.
Принцип метода. Реакция состоит в том, что при кипячении белка с реактивом Фоля (плюмбит натрия в избытке NаОН) под действием щелочи цистеин или цистин легко отщепляет серу в виде сернистого натрия, который с плюмбитом дает черный или бурый осадок сернистого свинца. Интенсивность окраски зависит от количества в белке аминокислот цистеина и цистина, содержащих слабосвязанную серу и от количества белка в растворе. Реакция протекает по следующим уровням:
1.2. .
цистеин серин осадок черного
цвета
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Реактив Фоля.
Ход работы
В пробирку вносят 0,5 мл яичного белка и прибавляют 5 капель реактива Фоля. Кипятят и дают постоять 1-2 минуты. При стоянии появляется бурый или черный осадок черного цвета сернистого свинца.
Реакция Адамкевича открывает в белках аминокислоту триптофан (Trp).
Принцип метода. При добавлении к раствору белка незначительных количеств глиоксиловой кислоты и при подслаивании концентрированной серной кислоты получаем красно-фиолетовое кольцо на границе раздела жидкостей, обусловленное способностью триптофана в кислой среде взаимодействовать с альдегидной группой глиоксиловой кислоты, давая окрашенные продукты конденсации. В качестве источника глиоксиловой кислоты можно использовать ледяную уксусную, в которой глиоксиловая всегда присутствует в небольшом, но вполне достаточном для этих целей количестве.
триптофан глиоксиловая кислота триптофан продукт конденсации
(красно-фиолетовое кольцо)
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Уксусная кислота ледяная. 3. Серная кислота концентрированная.
Ход работы
В пробирку наливают 1 мл раствора белка и 1 мл уксусной кислоты. Осторожно (!) по стенке подслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты, Наблюдают появление красно-фиолетового кольца. Записывают химизм реакции.
Реакция Сакагучи открывает в белках аминокислоту аргинин (Arg).
Принцип метода. Аминокислота аргинин и полипептиды, содержащие ее в присутствии щелочи окисляются гипобромитом или гипохлоридом натрия и в присутствии α-нафтола образуют продукт конденсации красного цвета (гуанидиновая группировка). Реакция не является строго специфичной для аргинина. Ее дают и другие монозамещенные гуанидина (метилгуанидин, гликоциамин, агматин и др.), но они отсутствуют в молекуле белка и не мешают определению в белке аргинина.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Гидроскид натрия (10%). 3. Раствор α-нафтола в спирте (0,1%). 4. Раствор гипобромита.
Ход работы
Вносят в пробирку 0,5 мл раствора яичного белка, добавляют 0,5 мл 10% раствора едкого натра, 5 капель 0,1% раствора α-нафтола в спирте и 1-5 капель раствора гипобромита. Появляется розово-красное окрашивание, обусловленное образованием продукта конденсации окисленного аргинина с α-нафтолом.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ отметьте цель занятия. Полученные результаты всех цветных реакций необходимо записать в виде таблицы. Химизм каждой цветной реакции записать отдельно.
|
№ п/п |
Название реакции |
Ход работы |
Наблюдаемая окраска |
Определяемая аминокислота (группировка) |
Сделайте выводы о специфичности цветных реакций на белки и аминокислоты.
Контрольные вопросы
Изучение физико-химических свойств белков необходимо для понимания механизмов развития многих патологических состояний (например, отеков), механизмов транспорта веществ (в том числе лекарственных препаратов). На знании физико-химических свойств белков основано их получение и использование в качестве лекарственных препаратов. Реакции осаждения используются в медицине для качественного и количественного определения белка в биологических жидкостях, для удаления белков из растворов. Пробы коллоидоустойчивости используются для функциональной диагностики болезней внутренних органов.
Реакции осаждения белков в зависимости от применяемого осадителя могут быть обратимыми и необратимыми. В случае необратимых реакций белки не подвергаются глубоким изменениям, и получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе, обычно в воде. Белки при этом сохраняют свои первоначальные нативные свойства. При необратимых реакциях, осажденные белки подвергаются глубоким изменениям, получаемые осадки не могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе, обычно в воде, т.е. наступает денатурация белков. Обратимые реакции осаждения можно получить путем так называемого высаливания при помощи нейтральных солей: NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4, спиртом (в случае непродолжительного действия его га белок при низкой температуре) и др.
Значение реакций осаждения белков в том, что они дают возможность: 1) изучить свойства белков; 2) освободить жидкость от присутствия белка, что бывает необходимо при некоторых исследованиях; 3) установить наличие белка, например, в моче, при различных патологических состояниях (заболеваниях почек – нефрите, сердечная декомпенсация и др.); 4) высаливанием с помощью различных концентраций нейтральных солей (или спиртом) можно выделить отдельные белковые фракции.
Почти все белки свертываются при нагревании в нейтральной или слабокислой среде. Более полное и быстрое осаждение белков происходит в изоэлектрической точке. Для большинства белков ИЭТ соответствует слабокислой среде (рН около 5,0). Протамины и гистоны имеют ИЭТ в щелочной среде (рН около 8,0). Кроме рН среды важную роль в свертывании белков при нагревании играет концентрация солей.
Устойчивость белка в растворе к нагреванию зависит от наличия заряда (положительного в сильнокислой среде и отрицательного - в щелочной среде). Полное и быстрое осаждение белков происходит в изоэлектрической точке, которая для большинства белков соответствует слабокислой среде (рН около 5,5).
Принцип метода. При нагревании растворов белка вначале отмечается увеличение опалесценции и появление мути (коагуляции). При дальнейшем повышении температуры - появление хлопьевидного осадка белка (седиментация). При кипячении происходит необратимое изменение природных свойств белка (денатурация).
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Раствор уксусной кислоты (1%). 3. Насыщенный раствор хлористого натрия. 4. Раствор гидроксида натрия (10%).
Ход работы
В 5 пробирок наливают по 0,5 мл раствора яичного белка.
В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают до кипения. Отмечают появление мути, связанное с разрушением водной оболочки вокруг молекул белка и укрупнению его частиц; мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии.
Во вторую пробирку прибавляют 3 капли 1% раствора уксусной кислоты, создавая слабокислую среду. Раствор белка нагревают до кипения и частицы белка при этом теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию.
В третью пробирку добавляют 15 капель 1% раствора уксусной кислоты и нагревают раствор до кипения.
В четвертую пробирку наливают 15 капель 1% раствора уксусной кислоты для получения сильнокислой реакции, 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагревают. Выпадает хлопьевидный осадок белка, так как частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами хлористого натрия.
В пятую пробирку добавляют 6 капель 10% раствора едкого натра, создавая щелочную среду, и нагревают. В каждой пробирке определяют рН среды с помощью индикатора. При кипячении жидкости осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.
Отмечают, в какой пробирке произошло осаждение белка, а в какой - нет.
Делают выводы о влиянии рН среды на белковые макромолекулы и выпадение белка в осадок. Результаты оформляют в виде таблицы (1).
Осаждение белков из растворов при действии высоких концентраций нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов называют высаливанием. Метод высаливания позволяет получить белки в кристаллическом виде и применяется для разделения и очистки.
Принцип метода. Реакция высаливания (осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей) обусловлена дегидротацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация одних и тех же солей. Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины – в насыщенном растворе сернокислого аммония.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Насыщенный раствор сульфата натрия. 3. Насыщенный раствор сульфата магния. 4. Насыщенный раствор сульфата аммония. 5. Вода дистиллированная.
Ход работы
В 3 пробирки вносят по 1 мл раствора белка и добавляют по 1 мл насыщенных растворов: Na2S04, Mg2SO4, (NH4)2SO4. После добавления осадителей к растворам белка, смеси необходимо перемешать встряхиванием. Определяют, в какой пробирке объем осадка больше. Затем проверяют растворимость осажденного белка добавлением 2 мл воды. Выясняют, в какой пробирке происходит растворение осадка. Делают вывод о необратимом или обратимом растворении белков. Результаты оформляют с помощью таблицы (2).
Осаждение белков солями тяжелых металлов, в отличие от высаливания, происходит при небольших концентрациях солей.
Принцип метода. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные и комплексные соединения (на этом основано применение белков в качестве противоядия при отравлении солями тяжелых металлов), растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO3 , HgCl2), но нерастворимые в воде. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатурацию.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Раствор сернокислой меди,100 г/л. 3. Раствор уксуснокислого свинца, 50 г/л. Раствор уксусной кислоты, 10 г/л. 4. Вода дистиллированная.
Ход работы
В 2 пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка и добавляют по 1-2 капли растворов CuS04,(CH3COO)2Pb. Отмечают выпадение осадка в пробирках. Затем добавляют в каждую пробирку по 1-2 мл воды и определяют растворимость осадка белка. Далее в эти пробирки добавляют по каплям соответствующие растворы осадителей и перемешивают содержимое. Делают вывод о причинах обратимости осаждения белка в растворах солей тяжелых металлов. Результаты опыта оформляют в виде таблицы (2).
В реакциях осаждения белков большое практическое значение получили трихлоруксусная и сульфосалициловая кислоты. Сульфосалициловой кислотой широко пользуются в клинике при обнаружении малых количеств белка в моче и других биологических жидкостях (чувствительность реакции 1:50000). Сульфосалициловая кислота, помимо белков, осаждает продукты их распада – высокомолекулярные пептоны и полипептиды. ТХУ осаждает только белки и не осаждает продуктов их распада. В связи с этим ТХУ осаждают, например, белки крови, когда хотят отделить их от высокомолекулярных пептидов.
Принцип метода. При действии на раствор белка органические кислоты способны нейтрализовать заряд белка и разрушить его пространственную структуру, что приводит к необратимой денатурации и осаждению белка.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Раствор сульфосалициловой кислоты, 200 г/л. 3. Раствор трихлоруксусной кислоты, 100 г/л.
Ход работы
В 3 пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка и добавляют по 1-2 капли растворов сульфосалициловой кислоты. Определяют растворимость выпавшего осадка в воде.
Во 2 пробирку наливают 2 мл раствора белка и 2 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты; взбалтывают содержимое и фильтруют через складчатый фильтр, в другую пробирку. Полноту осаждения белков определяют при добавлении к фильтрату сульфосалициловой кислоты. Результаты опытов оформляют в виде таблицы (2).
Алкалоидные реактивы – танин, пикриновая кислота, фосфорно-вольфрамовая, фосфорно-молибденовая кислота раствор йодной ртути в йодистом калии и др. – вызывают необратимое осаждение белка в кислой среде.
Принцип метода. Реакция обусловлена наличием в белке азотистых гетероциклических группировок, аналогично тем, которые встречаются в молекулах алкалоидов (индольные, имидазольныее, пиррольные и др.). При этом алкалоидные реактивы являются анионами, а белки – катионами. Слабое подкисление белкового раствора уксусной кислотой ведет к появлению положительного заряда на поверхности белка и облегчает взаимодействие белка с отрицательно заряженными ионами осадителя. Белки, обладающие основным свойствами (гистоны, протамины), хорошо растворяются в нейтральной среде без подкисления.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 1. Раствор уксусной кислоты (1%). 2. Раствор пикриновой кислоты (10%). 3. Насыщенный раствор танина. 4. Вода дистиллированная.
Ход работы
В 2 пробирки вносят по 0,5 мл раствора белка и добавляют по 5 капель 1% раствора уксусной кислоты. Затем добавляют в одну 5 капель пикриновой кислоты, в другую 5 капель танина. Определяют растворимость выпавшего осадка добавлением 1 мл воды. Результаты оформляют в виде таблицы (2).
Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка и выпадение его в осадок (образуются комплексные соли белка с минеральными кислотами). Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных солей, за исключением азотной, выпавший в осадок белок растворяется. В связи с этим реакция осаждения белков азотной кислотой особенно распространена при клинических исследованиях мочи (проба Геллера). Эта качественная реакция с концентрированной азотной кислотой лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса-Стольникова-Брандберга.
Принцип метода. Выпадение белка в осадок связано с дегидратацией белковых частиц и их нейтрализацией, что приводит к разрушению пространственной структуры белка и выпадению его в осадок.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Концентрированная азотная кислота. 3. Концентрированная соляная кислота. 4. Концентрированная серная кислота. 5. Вода дистиллированная.
Ход работы
В 3 пробирки вносят по 1 мл раствора белка и добавляют по 2-3 капли следующих концентрированных растворов кислот НNО3, НС1, Н2SO4. Содержимое пробирок осторожно перемешивают и добавляют еще несколько капель соответствующих кислот. Определяют растворимость выпавшего осадка добавлением 1 мл воды. Результаты опыта оформляют в виде таблицы (2).
В органических растворителях, таких как спирт, ацетон и др., белки не растворяются и выпадают в осадок. Однако, кратковременное воздействии органических растворителей при низкой температуре от 0 до 100С сохраняет белок в нативном состоянии, что используется в фармацевтической практике для получения отдельных белковых препаратов, например гормона инсулина. При длительном воздействии органических растворителей наступает необратимая денатурация белка.
Принцип метода. Спирт, связывает воду, т.е. обезвоживает коллоидные частицы белка, вызывая дегидратацию мицелл белка, нарушение гидрофобных взаимодействий внутри белковой молекулы и вызывают ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению денатурированного белка в осадок.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор яичного белка (1%). 2. Спирт этиловый (95%). 3. Насыщенный раствор хлористого натрия.
Ход работы
К 5 каплям раствора белка прибавить 15-20 капель этилового спирта. Раствор мутнеет. Добавить 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия. При стоянии выпадает осадок белка. Результаты опыта оформляют в виде таблицы (2).
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ отметьте цель занятия, принцип метода, порядок работы (кратко, в виде таблицы). Результаты работ по осаждению белков представьте в виде двух таблиц:
1) Осаждение белка при кипячении при различных реакциях среды.
|
№ |
Содержимое |
РН |
Процесс |
Вывод |
|
1 |
||||
|
2 |
||||
|
3 |
||||
|
4 |
||||
|
5 |
2) Реакции осаждения белков различными веществами.
|
Названия веществ, осаждающих белки |
Употребляемые реактивы |
Характер и цвет осадка |
Чем обусловлена реакция и её особенности |
Сделайте выводы:
1) о механизме осаждения белков при кипячении;
2) о влиянии концентрации водородных ионов и ионов солей на устойчивость в растворе молекул денатурированного при кипячении белка;
3) о возможности применения реакций осаждения в лабораторной практике.
Контрольные вопросы
Сложные белки относятся к смешанным макромолекулам – белок-небелковым комплексам, которые содержат два компонента – простой беок и небелковый компонент, соединенные между собой ковалентными или слабыми (ионными, водородными, вандервальсовыми, фосфоэфирными и др.) связями. Небелковый компонент называется – простетическая группа. К сложным белкам относятся: нуклеопротеины, хромопротеины, фосфопротеины, гликопротеины, липопротеины, сложные белки-ферменты, металлопротеины.
Качественные реакции на небелковую часть гемопротеинов позволяют выявить структурные компоненты (геминовую группировку и входящее в ее состав железо) в биологическом материале. Пробой Тейхмана пользуются в судебно-медицинской экспертизе для доказательства наличия кровяных пятен. Эта проба заключается в образовании кристаллического солянокислого гемина при действии на кровь уксусной кислоты и хлорида натрия. Гемин отличается от гема наличием трехвалентного железа, соединенного с атомом хлора.
Принцип метода. При нагревании крови с ледяной уксусной кислотой гемоглобин распадается на гем и глобин. Если гидролиз крови проводить в присутствии уксусной кислоты и хлорида натрия, гемм превращается в солянокислую соль – гемин. Образуются характерные кристаллы солянокислого гемина.
Исследуемый материал и реактивы
1. Кровь. 2. Спирт 3. Вата. 4. Скарификаторы. 5. Предметные и покровные стекла. 6. Раствор хлорида натрия (0,9%). 7. Концентрированная уксусная кислота.
Ход работы
Каплю свежей крови помещают на предметное стекло и дают ей высохнуть на воздухе. К подсушенной крови добавляют 1-2 капли 0,9% раствора хлорида натрия; тщательно перемешивают стеклянной палочкой, далее, туда добавляют 1-2 капли концентрированной уксусной кислоты и еще раз тщательно перемешивают стеклянной палочкой, покрывают покровным стеклом и осторожно нагревают до начала кипения (не кипятить!). При этом предметное стекло следует держать высоко над пламенем горелки, чтобы избежать выкипания жидкости. Затем препарат охлаждают и рассматривают под микроскопом образовавшиеся при разрушении гемоглобина кристаллы солянокислого гемина, имеющие форму ромбоидальных палочек (смотри рисунок).
Если обнаружить кристаллы не удается, то приподнимают покровное стекло, добавляют 2-3 капли концентрированной уксусной кислоты, нагревают и после охлаждения вновь исследуют под микроскопом.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, зарисуйте наблюдаемую картину в поле зрения и сделайте выводы об исследуемом веществе.
Контрольные вопросы
Казеиноген белок молока относятся к сложным белкам – фосфопротеинам – содержит в качестве небелковой группы остатки фосфорной кислоты (0,5-0,9%).
К фосфопротеинам относятся также вителлин, вителлинин и витин яичного желтка, ихтулин рыбьей икры, а также ферменты – фосфорилаза, фосфоглюкомутаза, пепсин и др. Все фосфопротеины с химической точки зрения характеризуются эфирной связью фосфорной кислоты в белковых молекулах. Эфирная связь в молекулах фосфопротеинов осуществляется благодаря присоединению остатков фосфорной кислоты к оксигруппе остатков серина и треонина (оксиаминокислот). Биологическая роль фосфопротеинов заключается в том, что они служат типичным материалом для растущих организмов.
Присутствие фосфопротеинов в материале можно открыть реакциями на фосфаты, на белки и продукты их постепенного гидролиза. Казеиноген – фосфопротеин молока – под действием пищеварительных ферментов (пепсин) превращается в казеин, который с солями кальция образует казеинат кальция, что сопровождается свертыванием молока.
Кальциевая соль казеина в противоположность кальциевой соли казеиногена нерастворима в воде. Превращением казеиногена в казеин объясняется ферментативное свертывание молока. В простокваше и других кисло-молочных продуктах в свернутом состоянии находится казеиноген. Качественные реакции на фосфатную группу используются для открытия фосфопротеинов в исследуемых образцах.
Принцип метода. Казеиноген обладает свойствами кислоты и в молоке находится в виде анионов, растворимых в воде. Недиссоциированные молекулы казеиногена малорастворимы в воде. Изоэлектическая точка казеиногена находиться при рН=4,7. Этим объясняется, что при подкислении при рН=4,7 молоко свертывается благодаря выпадению в осадок казеиногена. Свертывание молока возможно также и в присутствии молочной кислоты, образовавшейся из лактозы под влиянием молочнокислых бактерий.
При щелочном гидролизе казеиноген (казеин) распадается на фосфат и белок. Фосфат может быть обнаружен специфической реакцией с молибденовым реактивом.
Исследуемый материал и реактивы
1. Молоко. 2. Уксусная кислота концентрированная. 3. Сернокислая медь (1%). 4. Едкий натр (10%). 5. Реактив Милона. 6. Реактив Фоля. 7. Фильтры. 8. Раствор гидроксида натрия (10%). 9. Биуретовый реактив. 10. Азотная кислота (концентрированная). 12. Раствор молибдата аммония. 13. Раствор аскорбиновой кислоты (1%) на 1М растворе соляной кислоты. 14. Лакмусовая бумага.
Ход работы
К 2 мл молока приливают равный объем дистиллированной воды. Осаждают казеиноген добавлением 1 капли концентрированной уксусной кислоты. Не следует добавлять избыток кислоты, поскольку молекулы белка казеиногена перезаряжаются и вновь переходят в раствор, что мешает осаждению. Выпавший осадок казеиногена отфильтровывают и промывают на фильтре дистиллированной водой 2 раза. Часть осадка снимают с фильтра стеклянной палочкой и проводят с ним цветные реакции на белки (биуретовую, Фоля, Милона).
В пробирку вносят 0,1г сухого порошка казеина, прибавляют 5 мл 10% раствора гидроксида натрия и ставят в кипящую водяную баню на 30 мин. Охлаждают пробирку и проводят реакцию на продукты гидролиза.
А. Обнаружение белка. Проводят реакцию 10 капель гидролизата и проводят реакцию с биуретовым реактивом, добавляя 3-5 капель его к 10 каплям гидролизата (см. лаб. № 2). Отмечают появление характерного окрашивания.
Б. Обнаружение фосфата. В другую пробирку вносят 20 капель гидролизата и нейтрализуют его, прибавляя по каплям концентрированную азотную кислоту до слабокислой реакции по лакмусовой бумаге. Затем прибавляют 10 капель раствора молибдата аммония, перемешивают содержимое и приливают 10 капель 1% раствора аскорбиновой кислоты, приготовленной на 1М растворе соляной кислоты. Вновь перемешивают, оставляют стоять пробы до развития синего окрашивания и записывают химизм реакции.
Н3РО4+12(NH4)2МоО4+21НNО3→(NН3)3(РО4•12МоО3)+21N4NО3+12Н2О
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, принцип метода, химизм реакций и сделайте выводы о составе и растворимости сложного белка молока – казеиногена.
Контрольные вопросы
Муцин – сложный белок – гликопротеин, обнаруживается в секретах слизистых желез. Гликопротеиды содержаться почти во всех тканях и жидкостях организма и носят общее название муцинов и мукоидов. Муцины встречаются в секретах слизистых желез. Мукоиды входят в состав различных тканей: костной (оссеомукоид), хрящевой (хондромукоид), соединительной (тендомукоид), а также яичного белка (овомукоид).
В состав небелкового фрагмента гликопротеинов входят разнообразные моносахариды и их производные (глюкоза, галактоза, манноза, фруктоза, глюкозоамин, N-ацетилглюкозамин, галактозамин, нейраминовая кислота, глюкуроновая кислота), а также гетерополисахариды (гиалуроновая кислота, гепарин, хондроитинсульфат). Для качественного и количественного анализа используются углеводные компоненты, например глюкозоамин, галактозоамин.
Гликопротеиды играют важную роль в организме, неся опорную и защитную функции.
Качественные реакции на простетические группы гликопротеинов используются для выявления и количественного определения их в различном биологическом материале и лекарственных средствах (стекловидное тело, гонадотропины и др.).
В клинической практике наиболее распространено суммарное определение гликопротеинов и мукопротеинов сыворотки крови по одному из входящих в них компонентов: гексозаминов, фукозе, сиаловым кислотам.
Принцип метода. Из гексоз, входящих в состав гликопротеинов, в присутствии концентрированной серной кислоты образуется гидроксиметилфурфурол, который с α-нафтолом дает продукт конденсации красно-фиолетового цвета.
Исследуемый материал и реактивы
1. Слюна. 2. Уксусная кислота ледяная. 3. Спиртовой раствор α–нафтола (1%). 4. Серная кислота концентрированная.
Ход работы
В пробирку собирают 1-2 мл слюны и по каплям (10-20 капель) приливают концентрированную уксусную кислоту, помешивая содержимое пробирки стеклянной палочкой. Выпадает осадок муцина. Осторожно сливают жидкость из пробирки, а сгусток слегка высушивают фильтровальной бумагой. К муцину прибавляют 10-20 капель 1% спиртового раствора α–нафтола и по стенке пробирки, наклонив ее, осторожно наслаивают 20 капель концентрированной серной кислоты. При стоянии образуется красно-фиолетовое кольцо.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, принцип метода, химизм реакции и сделайте выводы о природе простетической группы сложного белка муцина.
Контрольные вопросы
Ферменты – биологические катализаторы белковой природы. Синтезируются в клетках организма. Каталитические свойства ферментов связаны с их способностью специфически активировать химические реакции.
Работа, которую выполняют ферменты в качестве биологических катализаторов, необычайно эффективна. В некоторых случаях реакции под действием ферментов протекают более чем в миллион раз быстрее нежели в их отсутствие.
Высокая каталитическая активность ферментов связана с тем, что они временно соединяются с субстратами, образуя фермент-субстратные комплексы.
Ферменты могут быть как простыми (состоят только из аминокислот), так и сложными, т.е. в своем составе имеют небелковый компонент – кофермент. Коферментами могут быть ионы металлов, нуклеотиды, производные нуклеотидов и др.
Для знакомства со свойствами ферментов используют в качестве объектов α-амилазу слюны. Она катализирует гидролиз крахмала и гликогена и является эндополиглюкозидазой, разрушающей α-1,4-гликозидные связи в молекуле этих полисахаридов. Фермент амилаза осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные соединения (декстрины) до мальтозы Источником амилазы может быть слюна, содержащая α-амилазу. Гидролиз крахмала α-амилазой происходит через ряд стадий. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, декстрины в зависимости от размера их молекулы: амилодекстрины – фиолетовое; эритродекстрины – красное; арходекстрины и мальтоза – бесцветное (желтое окрашивание раствора связано с окраской самого раствора йода).
Этим методом определяют активность амилазы в слюне, в сыворотке крови, в моче.
Принцип метода. Метод заключается в том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и тоже количество раствора крахмала, находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество крахмала, затем производят пересчет на 1 мл слюны.
Амилазная активность слюны выражается в количестве 0,1% раствора крахмала, которое гидролизуется 1 мл неразбавленной слюны при t = 38°C в течение 30 мин. В норме амилазная активность слюны .
Исследуемый материал и реактивы
1. Слюна в разведении 1:20. 2. Раствор крахмала (0,1%). 3. Раствор 0,1% йода в 0,2% йодистом калии.
Ход работы
Приготовить разведение слюны в 20 раз. Для этого в мерный цилиндр собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта споласкивается водой) и доводят водой до метки 20 мл.
Одновременно готовят ряд растворов с возрастающим разведением слюны. Для этой цели берут 11 пробирок, в которые за исключением пробирки №1 наливают по 1 мл дистиллированной воды. В пробирки №1 и №2 разливают по 1 мл слюны. После перемешивания жидкости из пробирки №2 отбирают 1 мл и вносят его в пробирку №3. Повторяют ту же операцию с жидкостью в пробирке №3 и т.д. В результате получают ряд с возрастающим разведением слюны.
Затем в каждую из пробирок наливают по 2 мл 0,1%раствора крахмала и все содержимое пробирки перемешивают, ставят на 30 мин в водяную баню при температуре 38°С. После этого добавляют по несколько капель реактива Люголя (раствор J2 в KJ) в каждую пробирку и перемешивают. Жидкость в пробирках окрашивается в желтоватый, розовый и фиолетовый цвет. В розовый – благодаря наличию декстринов, а в фиолетовый – благодаря присутствию нерасщепившегося крахмала.
Рассчитывают количество слюны в последней пробирке с желтоватой окраской. Если слюна в ней, например, была разведена в 320 раз, составляют следующую пропорцию и находят амилокластическую силу слюны:
1/320 мл слюны расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала
1 мл слюны расщепил Х мл 0,1 % раствора крахмала
0,1% раствора крахмала.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, принцип метода, составьте таблицу для записи реакций окрашивания содержимого всех пробирок с йодом и рассчитайте амилокластическую силу слюны исследуемого.
|
№ п/п |
Количество 0,1% раствора крахмала, мл |
Разведение слюны |
Температура |
Время течения реакции |
Окрашивание с йодом |
Амилокластическая сила слюны |
Контрольные вопросы
Одно из наиболее характерных свойств ферментов – их высокая специфичность. Ферменты специфичны в отношении как типа катализируемых реакций, так и субстратов, на которые они воздействуют. По специфичности действия ферменты делят на 4 группы: обладающие абсолютной (субстратной) специфичностью, относительной (групповой) специфичностью, стереоспецифичностью и специфичностью путей превращения.
Принцип метода. Амилаза слюны обладает групповой специфичностью, т.е. ускоряет гидролиз только полисахаридов, не оказывая действия на дисахариды. При гидролизе крахмала под действием амилазы слюны до промежуточных или конечных продуктов в них открывается свободная альдегидная группа, которой нет в дисахаре сахарозе. Поэтому сахароза в отличие от мальтозы не дает положительной реакции Троммера. Реакция Троммера может быть положительной только в том случае если сахароза расщепиться на свои составляющие – глюкозу и фруктозу.
Исследуемый материал и реактивы
1. Слюна в разведении 1:5. 2. Раствор крахмала (1%). 3. Раствор сахарозы (1%). 4. Гидроксид натрия (10%). 5. Сернокислая медь (II) (1%). 6. 0,1%раствор йода в 0,2% йодистом калии.
Ход работы
В две пробирки наливают по 1 мл раствора амилазы слюны (разведенной в 5 раз) и в первую добавляют 1 мл крахмала, а во вторую – 1 мл раствора сахарозы. Пробы выдерживают в термостате 15 мин при 37-400С. Затем с пробами проделывают две качественные реакции: на крахмал и на продукты гидролиза.
А. Реакция на крахмал. К 5 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю раствора йода в йодистом калии. В присутствии крахмала появляется синее окрашивание.
Б. Реакция Троммера. К 5 каплям исследуемой жидкости добавляют 0,5 мл раствора сульфата меди (II) и прибавляют по каплям (до появления темно-голубого осадка) раствор гидроксида натрия. Далее пробирку с содержимым нагревают и наблюдают за появлением окраски. Наличие кирпично-красного окрашивания (оксид меди I) указывает на присутствие глюкозы (свободного гликозидного гидроксила).
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, принцип метода, зарисуйте полученные результаты (окрашивание проб) и сделайте вывод о специфичности действия амилазы слюны.
Контрольные вопросы
Температура, при которой наблюдается максимальная скорость реакции, называется оптимальной и для большинства ферментов организма человека она составляет 37-400С. При повышении температуры выше 40-500С скорость большинства ферментативных реакций снижается. Это объясняется тепловой денатурацией белковой молекулы фермента и потерей им каталитической активности (потеря комплементарности между активным центром фермента и субстратом). Степень инактивации зависит и от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа резко снижается. На этом основано сохранение пищевых продуктов, скоропортящихся фармпрепаратов и лекарственных форм. В термолабильности ферментом можно убедиться на примере действия фермента слюны – α-амилазы.
Принцип метода. Метод основан на различной скорости реакции гидролиза крахмала под действием α-амилазы слюны в различных температурных условиях. Т.к., реакция протекает в несколько этапов, на каждом из которых получаются свои продукты гидролиза крахмала, то и окрашивание растворов при добавлении йода получается различное (см. лабораторную работу №6).
Исследуемый материал и реактивы
1. Слюна в разведении 1:5. 2. Раствор крахмала (1%). 3. Йод.
Ход работы
В 4 пробирки помещают 1 мл 1% раствора крахмала и по 1 мл разведенной слюны (количество фермента и субстрата в каждой пробирке должно быть одинаково!). Пробирки помещают на 15 мин: первую – в термостат (при 40оС); вторую – в ледяную баню (при 4оС); третью – на кипящую водяную баню (при 100оС); четвертую оставляют при комнатной температуре (+20оС). Через 15 минут пробирки охлаждают и в каждую пробирку добавляют по 2 капле йода. По интенсивности и цвету возникшего окрашивания судят о скорости протекания ферментативной реакции гидролиза крахмала амилазой слюны.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, зарисуйте полученный результаты (окрашивание расторов) и сделайте выводы о влиянии температуры на скорость гидролиза крахмала α-амилазой слюны.
Контрольные вопросы
Для проявления максимальной каталитической активности ферментов требуются определенные условия, в том числе и оптимальная концентрация водородных ионов в среде. Кислотность (рН) среды, при которой наблюдается максимальная скорость реакции, называется оптимальной. Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН (пепсин – 1,5-2,5; трипсин – 8,0-9,0; сахараза кишечная – 6,2; амилаза слюны – 6,9-7,0; липаза желудочного сока – 6,0; липаза панкреатическая – 7,0-8,5; каталаза – 7,0). Активность фермента уменьшается если рН среды смещается в сторону от оптимального значения. Это объясняется тем, что белковая молекула фермента является амфотерным полиэлектролитом и его каталитическая активность зависит от степени ионизации функциональных групп, которые входят в активный центр фермента. Отклонение рН от оптимума может нарушить связь между белковой частью ферментов и их простетическими группами, и, следовательно, может влиять на связывание субстрата в активном центре фермента.
Принцип метода. Различная величина рН среды оказывает влияние на каталитическую активность α-амилазы слюны, что в свою очередь оказывает влияние на степень гидролиза крахмала под действием этого фермента, т.е. получение промежуточных продуктов гидролиза крахмала. Это обуславливает соответствующую окраску исследуемых растворов (см. лабораторную работу №6).
Исследуемый материал и реактивы
1. Слюна в разведении 1:5. 2. Раствор крахмала (0,5%). 3. Раствор йода. 4. Буферный раствор (натрий фосфорнокислый двузамещенный Na2HPO4 и 0,1М раствор лимонной кислоты).
Ход работы
В 6 пробирок наливают по 2 мл буферного раствора различной величины рН (6.0; 6.4; 6.8; 7.2; 7.6; 8.0). В каждую пробирку наливают по 1 мл 0,5% раствора крахмала и по 1 мл разведенной слюны. Содержимое пробирок перемешивают и ставят в термостат при 37°С на 10 минут. После термостата в каждую пробирку добавляют по 1 капле раствора йода, отмечают наличие или отсутствие синей окраски и определяют рН среды, при котором α-амилаза слюны действует наиболее активно, т.е. где произошел наиболее полный гидролиз крахмала.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, зарисуйте полученный результаты (окраска растворов) и сделайте выводы о влиянии кислотности (рН) среды на скорость гидролиза крахмала α-амилазой слюны, определите оптимальную рН для этого фермента.
Контрольные вопросы
Активность некоторых ферментов зависит от природы и концентрации ионов, присутствующих в реакционной среде. Некоторые ионы абсолютно необходимы для нормального действия ряда ферментов.
Вещества, усиливающие действие ферментов, называются активаторами. Активаторы стимулируют действие ферментов, но в отличие от коферментов не принимают участия в реакции.
Некоторые природные и синтетические вещества оказывают избирательное ингибирующее действие на ферменты и используются в качестве лекарственных средств. В больших дозах подобные вещества могут оказаться ядами. Ингибиторами называются вещества, снижающие скорость ферментативной реакции. Ингибиторами нередко являются продукты промежуточных или конечных реакций какого-либо биохимического процесса.
Исследования природы и механизма действия активаторов и ингибиторов ферментов очень важны для изучения кинетики ферментативных процессов, для понимания механизма действия различных лекарственных средств, многих токсических веществ и соединений, которые используются в практике народного хозяйства и здравоохранения.
Принцип метода. Активность амилазы слюны усиливается в присутствии хлористого натрия – специфического активатора амилазы.
Сернокислая медь оказывает тормозящее действие на активность амилазы. Если добавить к смеси, содержащей слюну, крахмал, в одном случае хлористый натрий, в другом – сернокислую медь и в третьем – воду (контрольная проба), то за один и тот же промежуток времени в первой пробирке произойдет полное расщепление крахмала, в третьей – распад его только до декстринов, а во второй обнаружится нерасщепленный крахмал. Крахмал и декстрины открывают реакцией с раствором йода.
Исследуемый материал и реактивы
1 Слюны в разведении 1:5. 2. Раствор крахмала (1%). 3. Раствор йода. 4.Вода. 5. Раствор NаС1 (1%). 6. Раствор СuSО4 (1%).
Ход работы
В три пробирки налить по 1 мл разведенной слюны. В первую пробирку налить 2 капли воды, во вторую - 2 капли 1% NаС1, в третью - 1% СuSО4. Во все пробирки добавить по 5 капель 1% крахмала и оставить стоять при комнатной температуре 2 минуты. Далее во все пробирки добавить по 1 капле раствора КJ и по 2 мл воды, перемешать и отметить наличие или отсутствие синей окраски.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, зарисуйте полученные результаты (окраска растворов) и сделайте выводы – какое вещество является активатором, а какое ингибитором для α-амилазы слюны.
Контрольные вопросы
Нуклеиновые кислоты – ДНК и РНК – представляют собой линейные биологические полимеры, построенные из мононуклеотидов, соединенных 3΄5΄-фосфодиэфирными связями. Последние состоят из гидрофобных циклических структур - азотистых оснований (пуриновых и пиримидиновых), гидрофильной части, представленной пентозами (рибозой или дезоксирибозой) и остатками фосфорной кислоты. Остатки фосфорной кислоты соединяют два смежных мононуклеотида при помощи 3΄5΄-фосфодиэфирной связи.
Нуклеиновые кислоты находятся в клетке в составе нуклеопротеинов.
Биологическая роль нуклеиновых кислот огромна. Они принимают участие в передаче наследственной информации и в биосинтезе белка, являясь структурными элементами ядра и цитоплазмы.
Нуклеиновые кислоты являются небелковой частью нуклеопротеинов. Нуклеопротеины – это сложные белки, белковой частью которых являются в основном протамины или гистоны, которые обладают щелочными свойствами, за счет большого количества входящих в них диаминокарбоновых кислот (аргинин, лизин и гистидин).
Нуклеопротеины могут быть легко выделены из тканей, содержащих большое количество ядер, например из зобной, панкреатической железы, селезенки, печени, почек и др. Особенно богаты нуклеопротеинами дрожжи, бактерии, простейшие, грибы, одноклеточные водоросли. Вирусы почти полностью построены из нуклеопротеинов.
Биологическая роль нуклеиновых кислот огромна. Они принимают участие в передаче наследственной информации и в биосинтезе белка, являясь структурными элементами ядра и протоплазмы. Производные моно- (АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ, ДТФ, ФМН, КоА и др.) и динуклеотидов (НАД+, НАДФ+, ФАД и др.) также выполняют в организме важные функции.
Принцип метода. Определить состав нуклеиновых кислот удается с помощью кислотного гидролиза нуклеопротеинов клеток, например, дрожжей, в присутствии серной кислоты. При кислотном гидролизе нуклеопротеины вначале распадаются на белок и нуклеиновые кислоты, а затем при продолжительном гидролизе наступает их полный распад на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу, дезоксирибозу и фосфорную кислоту, которые могут быть обнаружены специфическими реакциями.
Исследуемый материал и реактивы
1. Дрожжи (сухие). 2. Песок (щепотка). 3. Эфир. 4. Раствор NaOH (0,4%), (10%). 5. Раствор уксусной кислоты (1%). 6. Раствор Н2SО4 (10%). 7. Раствор СuSO4 (1%). 8. Раствор NH4OH (концентрированный). 9. Раствор AgNО3 (1%). 10. Спиртовой раствор α-нафтола. 11. Раствор H2SO4 (концентрированный). 12. Молибденовый реактив. 13. Фильтровальная бумага.
Ход работы
Одним из источников для выделения нуклеопротеидов являются дрожжи. Для этой цели 10 г дрожжей растирают в ступке со щепоткой песка, 0,5 мл эфира, добавляют 20 мл 0,4% раствора NaOH и продолжают растирание в течение 15 мин. После этого разливают содержимое ступки в центрифужные пробирки, уравновешивают их и центрифугируют в течение 5-10 мин при 2500 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в стакан и при постоянном помешивании добавляют раствор уксусной кислоты (1%) в количестве 15-20 мл для осаждения нуклеопротеида. Выпавший осадок РНК-протеина отделяют путем центрифугирования и выделенный нуклеопротеид гидролизуют.
А. Гидролиз нуклеопротеина. Полученный осадок переносят в коническую колбу, добавляют к нему 10 мл 10% раствора Н2SО4 и закрывают пробкой со вставленной в нее стеклянной трубкой 20-30 мл длинной (воздушный холодильник). Колбу помещают в водяную баню и нагревают в кипящей водяной бане 1 час. После этого охлаждают колбу до комнатной температуры и фильтруют. В фильтрате определяют продукты гидролиза.
Б. Биуретовая реакция на пептиды. К 5-6 каплям гидролизата добавляют 10 капель 10% раствора NаОН и 1 каплю 1% -го раствора СuSO4. При наличии белка жидкость приобретает характерную сине-фиолетовую окраску.
В. Проба на пуриновые основания. 0,5 мл гидролизата нейтрализуют 1-2 каплями концентрированного раствора NH4OH и добавляют 5 капель 1% раствора AgNО3. Через несколько минут образуется рыхлый осадок соединений пуриновых оснований с серебром, окрашенный в бурый цвет.
Г. Качественная реакция на углеводный компонент. (Реакция Подобедова-Молиша). К 0,5 мл гидролизата добавляют 1 -2 капли спиртового раствора α-нафтола, перемешивают и осторожно наслаивают 0,5 мл концентрированной H2SO4. На границе раздела жидкостей появляется фиолетовое кольцо, свидетельствующее о наличии углеводного компонента в нуклеопротеидах.
Д. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. К 0,5 мл молибденового реактива добавляют 5 капель гидролизата и кипятят смесь на пламени горелки. В присутствии фосфорной кислоты жидкость окрашивается в лимонный цвет. После охлаждения в струе воды наблюдают появление желтого кристаллического осадка - фосфомолибдата аммония,
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите принцип метода, ход работы и зарисуйте схему полного распада РНК–протеинов с указанием, входящих в них компонентов.
Контрольные вопросы
Биологическое окисление – это окисление различных веществ в клетке в процессе её жизнедеятельности.
Основной функцией биологического окисления является обеспечение организма энергией в доступной для использования форме (прежде всего в форме АТФ) и превращение питательных веществ в компоненты клеток.
Окисление субстрата в процессе дыхания начинается с его дегидрирования – отнятия водорода. Этот процесс катализируется ферментами дегидрогеназами, которые относятся к I классу ферментов – окисдоредуктазам. По химической природе анаэробные дегидрогеназы относятся к пиридинпротеинам и флавинпротеинам. Пиридинзависимые дегидрогеназы в качестве кофактора (кофермента) содержат никотинамидаденидиникулеотид (НАД+) или никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ+). Флавинзависимые дегидрогеназы – флавинадениндинуклеотид (ФАД) или флавинмононуклеотид (ФМН).
Фермент альдегиддегидрогеназа вырабатывается микроорганизмами, попадающими в молоко извне. По химической природе он относится к флавопротеинам, способным окислять альдегиды, в частности, формальдегид.
Принцип метода. При добавлении к некипяченому молоку формальдегида и метиленовой сини альдегиддегидрогеназа окисляет формальдегид в муравьиную кислоту, а освобождающийся при этом водород переносится на метиленовую синь, восстанавливая ее в бесцветное соединение.
Исследуемый материал и реактивы
1. Кипяченое молоко. 2. Некипяченое молоко. 3. Раствор формальдегида (0,4%). 4. Раствор метиленовой сини (0,01%).
Ход работы
В одну пробирку вносят 15 капель кипяченого молока, в другую — 15 капель некипяченого. В каждую пробирку вносят по капле 0,4% раствора формальдегида и по капле 0,01% раствора метиленовой сини. Пробирки встряхивают и закрывают пробками, чтобы создать относительно анаэробные условия. Пробирки помещают в термостат при 370С и отмечают через 5 мин. Постепенное обесцвечивание метиленовой сини.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите, принцип метода, ход работы, зарисуйте полученные результаты (окраска проб), сделайте вывод и укажите класс исследуемого Вами фермента.
Контрольные вопросы
В процессе окислительно-восстановительных процессов в организме образуется токсичная для клеток перекись водорода. Обезвреживание перекиси водорода, путем разложения её на воду и молекулярный кислород, катализируется геминсодержащим ферментом – каталазой.
Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях организма.
Принцип метода. В результате разложения перекиси водорода под действием каталазы крови происходит бурное выделение кислорода в виде пузырьков.
Исследуемый материал и реактивы
1. Кровь. 2. Спирт. 3. Вата. 4. Скарификатор. 5. Перекись водорода (3%).
Ход работы
Взятие крови. Кровь для клинического анализа берут обычно после укола скарификатором в мякоть пальца. Перед взятием крови мякоть пальца должна быть высушена и обезжирена. Для этого кожу протирают спиртом и вытирают насухо стерилизованной марлей или ватным тампоном (см. Приложение).
Укол не должен быть слишком поверхностным: от того, как нанесен укол, зависит интенсивность и длительность кровотечения. Первую выступившую каплю крови стирают и дают появиться второй. Выдавливать кровь их пальца не рекомендуется.
В пробирку вносят 10-15 капель 3% Н2О2 и 1 каплю крови. Отмечают бурное выделение пузырьков кислорода и пена заполняет всю пробирку.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите принцип метода, реакцию, катализируемую каталазой крови, ход работы, зарисуйте полученные результаты и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
Какова биологическая роль фермента каталазы?
Что является простетической группой фермента каталазы?
Где в организме содержится каталаза?
Как и каталаза, пероксидаза – геминсодержащий фермент. Пероксидаза катализирует окисление некоторых веществ (фенолы, полифенолы, ароматические амины) в присутствии перекиси водорода. От субстратов под действием пероксидазы переносятся электроны на перекись водорода. Образуется окисленный субстрат и вода. В организме млекопитающих слабой пероксидазной активностью обладают гемоглобин, миоглобин и цитохромы. Пероксидаза содержится почти во всех растительных клетках.
Принцип метода. От бензидина под действием пероксидазы переносятся электроны и протоны на перекись водорода. В результате образуется окисленный бензидин и вода. Окисленный бензидин приобретает зеленую, синюю, постепенно переходящую в бурую окраску.
Исследуемый материал и реактивы
1. Кровь. 2. Спирт. 3. Вата. 4. Скарификатор. 5. Раствор бензидина в ледяной уксусной кислоте (1%). 6. Перекись водорода (3%). 7. Вода.
Ход работы
В две пробирки наливают по 5 капель 1% раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте и по 5 капель 3% раствора перекиси водорода. В первую пробирку добавляют 5 капель крови, во вторую – 5 капель воды. Наблюдают за изменением окраски.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите принцип метода, ход работы, зарисуйте полученные результаты (окраска проб) и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
В организме человека и животных фермент тирозиназа катализирует превращение адреналина в физиологически неактивный красный пигмент адренохром. Последний, конденсируясь, превращается в бурый пигмент меланин. Если к раствору тирозина прибавить вытяжку из картофеля, содержащую фермент тирозиназу, и смесь для контакта с воздухом встряхивать, то жидкость через некоторое время постепенно окрашивается в розовый, бурый и, наконец, в черный цвет.
Принцип метода. Реакция обусловлена окислением тирозина кислородом воздуха и протекает благодаря каталитическому действию тирозиназы. В процессе окисления тирозина образуется красный пигмент галахром и затем темный пигмент меланин:
Исследуемый материал и реактивы
1. Клубень сырого картофеля. 2. Вода. 3. Раствор тирозина (0,1%) или раствор адреналина (0,1%). 4. Марля.
Ход работы
А. Получение тирозиназы из картофеля. 1г картофеля растирают в ступке с 3 мл воды и процеживают через двойной слой марли.
Б. Окисление тирозина кислородом воздуха в присутствии тирозиназы. В две пробирки наливают по 1 мл вытяжки из картофеля, содержащей фермент тирозиназу. Содержимое одной пробирки кипятят 1-2 мин и охлаждают в стакане с холодной водой. В обе пробирки добавляют по 5-10 капель 0,1% раствора тирозина, перемешивают и обе пробирки помещают в баню при 40-450С. Каждые 5 мин пробирки вынимают и содержимое их сильно встряхивают. Жидкость в пробирке с активной вытяжкой постепенно принимает сначала розовую, затем бурую и черную окраску. В контрольной пробе с прокипяченной вытяжкой цвет жидкости не изменяется.
Аналогичную работу можно проделать, взяв вместо тирозина 0,1% раствор адреналина.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, зарисуйте полученные окраски проб, запишите химизм реакции и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
Углеводы наряду с белками – наиболее распространенные соединения, участвующие в построении клетки и используемые в процессе её жизнедеятельности. Углеводами называют полигидроксикарбонильные соединения, содержащие альдегидную или кетонную группу либо образующие их при гидролизе.
Углеводам в организме принадлежат разнообразные функции: энергетическая, структурная, опорная, защитно-механическая, гидроосмотическая, кофакторная.
С углеводами связаны многие эффекты лекарственной терапии. В медицинской практике углеводы и их производные широко используют как фармпрепараты, как вспомогательные вещества при приготовлении различных лекарственных форм (глюкоза, фруктоза, сахароза, лактоза, крахмал, пектины, целлюлоза и др.) и как плазмозаменяющие растворы на основе декстрана (полиглюкин, реополиглюкин, реоглюман, рондекс и др.).
Содержание глюкозы в крови – основной биохимический показатель состояния углеводного обмена. Нормальная концентрация глюкозы в крови – 3,5-5,5 (6,4)ммоль/л. Отклонение его от нормы происходит при ряде заболеваний.
Увеличение содержания глюкозы в крови (гипергликемия) наблюдается при сахарном диабете, остром панкреатите, панкреатических циррозах, эмоциональных стрессах, после эфирного наркоза, обильного приема углеводов с пищей, а также при повышении гормональной активности ряда желез (щитовидной, гипофиза, коркового и мозгового слоя надпочечников).
Снижение уровня глюкозы в крови (гипогликемия) встречается при поражении паренхимы печени, нарушении ферментативной активности при распаде гликогена; недостаточной функции щитовидной железы, надпочечников, гипофиза; передозировке инсулина при лечении сахарного диабета, нарушении всасывания углеводов, отравлениях фосфором, бензолом, хлороформом, при недостатке приема с пищей углеводов, после больших потерь крови.
Принцип метода. В основе метода лежит ферментативное окисление глюкозы кислородом воздуха при участии фермента глюкозооксидазы. При этой реакции образуется перекись водорода в количестве эквимолярном окисленной глюкозе. Перекись водорода в присутствии пероксидазы крови окисляет добавленный σ-толуидин, который приобретает синее окрашивание. Интенсивность возникшей окраски прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре. Метод специфичен для глюкозы.
Исследуемый материал и реактивы
1. Кровь. 2. Вата. 3. Спирт. 4. Скарификатор. 5. Ферментно-хромогенная смесь (1таблетка). 6. Антикоагулянт (оксалат натрия, фторид натрия). 7. Калибратор (раствор глюкозы с концентрацией 10ммоль/л). 8. Дистиллированная вода.
Ход работы
А. Приготовление рабочих растворов. 1. Таблетку «ферменты-хромогены» растворить в 100 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивая, не встряхивая (!). Допускается наличие мелких нерастворимых частиц. 2. Таблетку антикоагулянта растворить в 50 мл дистиллированной воды.
Б. Приготовления калибровочной пробы. В пробирку внести 1 часть калибратора и 9 частей раствора антикоагулянта, тщательно перемешать. Полученную калибровочную смесь использовать для анализа.
В. Определение содержания глюкозы в плазме крови. Для получения плазмы крови в центрифужную пробирку внести 0,9 мл раствора антикоагулянта, добавить 0,1 мл крови (или 0,45 мл и 0,05 мл соответственно), тщательно перемешать и центрифугировать при 1000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость перенести в чистую пробирку и использовать для анализа.
Для проведенения анализа на КФК в пробирки внести 2,0 мл рабочего раствора и добавить по 0,2 мл надосадочной жидкости, калибровочной смеси и дистиллированной воды для кюветы с длиной оптического пути 10мм, и по 0,4 мл – для кюветы с длиной оптического пути 5мм.
При использовании FP-901 в кюветы внести 0,7 мл рабочего раствора и 0,1 мл надосадочной жидкости.
Г. Определение содержания глюкозы в сыворотке крови. При использовании КФК внести в пробирки образцы сыворотки крови и реагенты по схеме:
|
Для кювет |
с длиной оптического пути 10мм |
с длиной оптического пути 5мм |
||||
|
Реагенты |
Опытная проба, мл |
Калибр. проба, мл |
Холостая проба, мл |
Опытная проба, мл |
Калибр. проба, мл |
Холостая проба, мл |
|
Рабочий раствор |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
|
Сыворотка крови |
0,02 |
– |
– |
0,04 |
– |
– |
|
Калибратор |
– |
0,02 |
– |
– |
0,04 |
– |
|
Вода дистил. |
– |
– |
0,02 |
– |
– |
0,04 |
Пробы тщательно перемешать и инкубировать в течение 15 мин при +370С (водный термостат) или в течение 25 мин при 18-250С («на столе»). Через 5-10 мин после начала инкубации пробирки с пробами интенсивно встряхнуть вручную.
После инкубации измерить величину оптической плотности опытной и калибровочной проб против холостой пробы в кюветах с длиной оптического пути 5 или 10мм при длине волны 500 (490-540)нм. Окраска проб сохраняет стабильность в течение более 4-х часов после окончания инкубации.
Концентрации глюкозы в пробах провести по формуле:
где С – концентрация глюкозы, моль/л; ЕО – оптическая плотность опытной пробы, ед.опт.плот.; ЕСТ – оптическая плотность калибровочной пробы, ед.опт.плот.; 10 – концентрация глюкозы в калибраторе, моль/л.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученный результат и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
Липиды – биологически важные органические соединения растительного и животного происхождения разнообразной химической структуры, нерастворимые в воде и растворимые в малополярных органических растворителях (эфир, спирт, хлороформ, ацетон и др.).
Липиды – важная составная часть пищевых продуктов не только вследствие высокой энергетической ценности, но также и потому, что в натуральных пищевых жирах содержатся жирорастворимые витамины и «незаменимые» жирные кислоты (полиненасыщенные), которые являются предшественниками таких биологически активных веществ как гормоны, витамины, простагландины. Липиды, наряду с белками, играют важную роль в структурной организации клеточных мембран, поэтому с ними связаны многие эффекты лекарственной терапии.
Переваривание липидов происходит в основном в кишечнике под влиянием активной панкреатической липазы, так как в желудочном соке липаза малоактивна и действует только на эмульгированный жир, например, молока. Чтобы подвергнуться действию липаз, липиды должны быть эмульгированы. Основным эмульгатором липидов являются желчные кислоты, вырабатываемые в печени (10-15 г в сутки).
Принцип метода. Желчные кислоты являются поверхностно-активными веществами и при взбалтывании триацилглицеридов с раствором желчи образуется стойкая эмульсия, так как молекулы желчных кислот снижают поверхностное натяжение обволакивают капельки жира и препятствуют их слиянию.
Исследуемый материал и реактивы
1. Желчь. 2. Растительное масло. 3. Вода.
Ход работы
В две пробирки наливают по 20 капель: в первую – желчи, разведенной вдвое, во вторую – воды. В каждую пробирку добавляют по 2 капли растительного масла и тщательно взбалтывают. Через 5 минут наблюдают стойкость эмульсии.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
В организме человека основными желчными кислотами являются холевая, дезоксихолевая, хенодезоксихолевая, литохолевая и другие кислоты, которые выделяются с желчью в свободном виде и в виде парных желчных кислот, связанных с глицином или таурином.
Принцип метода. Реакция основана на образовании окрашенного соединения холевых кислот с оксиметилфурфуролом, который образуется из тростникового сахара под влиянием серной кислоты.
При добавлении к раствору желчи или желчных кислот раствора сахарозы и подслоении смеси концентрированной серной кислоты на границе двух жидкостей появляется красное кольцо.
Реакция обусловлена образованием окрашенных продуктов желчных кислот с фурфуролом, который образуется из фруктозы при действии на сахарозу концентрированной серной кислоты.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор желчи. 2. Раствор сахарозы (5%). 3. Серная кислота концентрированная.
Ход работы
К 10 каплям разведенного (1:2) раствора желчи добавляют 1 каплю 5% раствора сахарозы и осторожно(!), по стенке пробирки, наклоненной под углом 45о, добавляют равный объем концентрированной серной кислоты. На границе двух жидкостей образуется осадок желчных кислот и появляется красно-фиолетовое кольцо. Охлаждая пробирку под краном, осторожно смешивают обе жидкости. Смесь приобретает вишнево-красную окраску.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, зарисуйте полученный результат и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
Большинство липидов находятся в крови не в свободном состоянии, а в составе белково-липидных комплексов (липопротеинов). Фракции липопротеинов отличаются по количеству белка, относительной молекулярной массе липопротеинов и процентному содержанию отдельных липидных компонентов. При электрофоретическом разделении липопротеинов плазмы крови получают фракции хиломикронов и липопротеинов различной плотности: α-липопротеины (ЛПВП) – имеют подвижность α-глобулинов, β-липопротеины (ЛПНП) – обладают подвижностью β-глобулинов, и пре-β-липопротеины (ЛПОНП).
Определение содержания β-липопротеинов в плазме крови имеет значение для диагностики атеросклероза, острых и хронических заболеваний печени, ксантоматоза и другой патологии. Нормальная концентрация β-липопротеинов в сыворотке крови составляет: у женщин – 1,9-6,0 г/л; у мужчин – 2,2-7,4 г/л. Повышение уровня липопротеинов в крови тесно связано с гиперхолистеринемией, поскольку холестерол входит главным образом в состав β-липопротеинов. Увеличение фракции β-липопротеинов может иметь место при диабете, гипотиреозе, некоторых острых гепатитах, резких гипопротеинемиях. Уменьшение может наблюдаться при острых инфекциях, тяжелых анемиях, гипертиреоидизме.
Принцип метода. Спектрофотометрический метод. В основу метода положена способность β-липопротеинов (ЛПНП) осаждаться в присутствии хлорида кальция и гепарина; при этом изменяется мутность раствора. По степени помутнения раствора и судят о концентрации β-липопротеинов в сыворотке крови.
Исследуемый материал и реактивы
1. Кровь. 2. Вата. 3. Спирт. 4. Скарификатор.5. Раствор хлорида кальция (0,025М). 6. Раствор гепарина.
Ход работы
В пробирку вносят 2 мл 0,025М раствора хлорида кальция и 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают и определяют экстинкцию (Е1) на фотоэлектроколориметре против раствора хлорида кальция в кюветах толщиной слоя 5мм при красном светофильтре (630 нм). Затем в кювету добавляют 0,1 мл раствора гепарина, перемешивают и точно через 4 мин снова определяют оптическую плотность раствора (Е2) в тех же условиях. Разница Е2- Е1 приходится на экстинкцию, обусловленную β-липопротеинами.
Вычисляют разность оптической плотности и умножают ее на 10 – эмпирический коэффициент, предложенный Ледвиной, т. к. построение калибровочной кривой сопряжено с рядом трудностей. В норме содержание β-липопротеинов составляет 3–4,5 г/л. Содержание β-липопротеинов колеблется в зависимости от возраста и пола.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты:
Е1= Е2= х(г/л) = (Е2 – Е1)*10, x (г/л) =
Сделайте выводы о возможных причинах отклонения полученных результатов от нормальных величин.
Контрольные вопросы
Свободный холестерол и его эфиры являются одними из основных липидных компонентов крови. Уровень холестерола в крови колеблется в пределах 3,6-6,4 ммоль/л. Холестерол – важный элемент мембранной структуры, предшественник стероидных гормонов, витамина Д, желчных кислот. Холестерол присутствует в пищевых жирах и может синтезироваться многими тканями. Уровень холестерола даже у здорового человека может колебаться в зависимости от возраста, физической нагрузки, умственного напряжения и времени года.
При нарушении жирового обмена холестерол может накапливаться в крови. Увеличение уровня холестерола в плазме крови (гиперхолестеролемия) наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, механической желтухе, нефрите, нефрозе (особенно при липоидных нефрозах), гипотиреозе. Понижение холестерола в крови (гипохолестеролемия) наблюдается при анемиях, голодании, туберкулезе, гипертиреозе, раковой кахексии, паренхиматозной желтухе, поражении центральной нервной системы, лихорадочных состояниях, при введении инсулина.
Принцип метода. При добавлении к хлороформенному раствору холестерола или растительного масла концентрированной серной кислоты жидкость окрашивается в красный цвет. Реакция обусловлена образованием холестерилена – продукта дегидратации холестерола красного цвета:
Исследуемый материал и реактивы
1. Хлороформный раствор холестерола (1%). 2. Серная кислота концентрированная.
Ход работы
В сухую пробирку наливают 10 капель хлороформного раствора холестерола и добавляют равный объем концентрированной серной кислоты (Осторожно! По стенке пробирки!). При легком встряхивании на границе двух слоев жидкости образуется оранжевое кольцо, которое при стоянии переходит в красное.
Принцип метода. Метод основан на дегидратации холестерола с последующим соединением двух молекул холестерола в бихолестадиен, который в присутствии уксусного ангидрида и сульфокислоты дает сульфопроизводное зеленого цвета.
Исследуемый материал и реактивы
1. Хлороформный раствор холестерола (1%). 2. Уксусный ангидрид. 3. Серная кислота концентрированная.
Ход работы
В сухую пробирку наливают 10 капель хлороформного раствора холестерола и добавляют в неё 10 капель уксусного ангидрида и 2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется вначале красное окрашивание, преходящее затем в сине-зеленое и зеленое.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (окраска исследуемой жидкости), химизм реакций и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
Обмен белковых соединений занимает ведущее место в многообразных превращениях веществ, характерных для всех живых организмов. Исключительно перспективно перспективным является изучение обмена белков с целью выяснения особенностей их метаболизма и биосинтеза, овладения тонкими молекулярными механизмами, дающими ключ к пониманию развития и течения патологических процессов, а также целенаправленному воздействия на многие процессы жизнедеятельности, в том числе и для понимания механизмов действия лекарственных средств, направленных на коррекцию нарушений белкового обмена.
Важное место в переваривании белков принадлежит желудку. Под влиянием соляной кислоты желудочного сока белки набухают и подвергаются действию фермента пепсина, который гидролизует молекулы белка на крупные полипептиды.
Желудочный сок представляет собой прозрачную бесцветную жидкость резко кислой реакции, являющуюся секретом желудочных желез. В состав нормального желудочного сока входят вода, ферменты пепсин и липаза, муцин, белки, соляная кислота, кисло реагирующие фосфаты, хлористый натрий и некоторые другие вещества. Чистый желудочный сок взрослого человека имеет сильнокислую реакцию (рН ≈ 1). Желудочное содержимое, в котором желудочный сок смешан с пробным завтраком, имеет менее кислую реакцию (рН=1,5-2,0). (*) У детей кислотность желудочного сока гораздо ниже. Желудочный сок новорожденных имеет рН=7,0, к 1 году жизни кислотность достигает рН=3,4, к 4-7 годам – 2,5 и к 7-14 годам 2,0. Это связано с низким содержанием в желудочном соке детей соляной кислоты, уровень которой достигает нормы взрослых только к 7 годам. Количество желудочного сока, образующегося у человека за сутки, составляет около 2,5 л. Удельный вес его колеблется в пределах от 1,003 до 1,01.
Нормальный желудочный сок всегда содержит свободную соляную кислоту. Её можно обнаружить по сильнокислой реакции (рН ниже 3,0).
Принцип метода. В присутствии соляной кислоты универсальная индикаторная бумага принимает красную окраску, которая свидетельствует о кислой реакции желудочного сока.
Исследуемый материал и реактивы
1. Нативный желудочный сок. 2. Универсальная индикаторная бумага
Ход работы
Одну каплю желудочного сока наносят стеклянной палочной на универсальную индикаторную бумагу. Отмечают изменение окраски универсального индикатора и делают вывод о реакции исследуемого желудочного сока
При отсутствии соляной кислоты в желудке развиваются процессы брожения (под влиянием микроорганизмов), в результате чего образуется молочная кислота, содержание которой иногда достигает больших количеств. Молочная кислота может появляться в желудочном содержимом при раке желудка. Обнаружить молочную кислоту можно реактивом Уфельмана, который получается при смешивании хлорного железа с фенолом. При этом возникает аметистово-фиолетовое окрашивание за счет образования комплексного фенолята железа.
Принцип метода. В присутствии молочной кислоты окраска реактива Уфельмана становится зелено-желтой вследствие образования малодиссоциирующей соли железа (молочнокислого железа). Сильные кислоты, в том числе соляная, полностью разрушают комплекс железа с фенолом и обесцвечивают раствор.
Исследуемый материал и реактивы
1. Желудочный сок (без соляной кислоты) с молочной кислотой. 2. Фенол (1%) 3. Хлорное железо (1%). 3. Молочная кислота (0,1%) 4. Соляная кислота (0,2%).
Ход работы
Готовят реактив Уфельмана. Для этого к 10 мл раствора фенола добавляют несколько капель хлорного железа и взбалтывают. Жидкость окрашивается в аметистово-фиолетовый цвет. Реактив разводят водой в случае слишком интенсивной окраски. В 3 пробирку наливают по 2-3 мл реактива Уфельмана. В превую добавляют по каплям раствор молочной кислоты, во вторую пробирку – желудочный сок, содержащий молочную кислоту, и в третью – раствор соляной кислоты. В первой и второй пробирках появляется зелено-желтое окрашивание, в третьей – раствор обесцвечивается (реакция отрицательная).
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты и сделайте выводы о реакции и составе желудочного сока.
Контрольные вопросы
Аминотрансферазы (трансаминазы) – ферменты, осуществляющие трансаминирование аминокислот, содержащие в качестве кофермента фосфопиридоксаль. Аминотрансферазы относятся к индикаторным ферментам, так как трансаминазы обладают высокой активностью внутри клеток различных тканей и органов человека и сравнительно низкой активностью в крови (в тысячу раз ниже). Содержание этих ферментов в тканях неодинакова, так, аспартатаминотрансфераза (АсАТ) в наибольших количествах содержится в печени и сердечной мышце; содержание аланинаминотрансферазы (АлАТ) в печени во много раз выше, чем в сердце. Поэтому определение их активности широко применяется в диагностике заболеваний сердца и печени. Нормальные концентрации АсАТ (или АлАТ) – 0,14-0,68 ммоль/л*ч (0,028-0,19 ммкат/л).
В клинике трансаминазный тест используется не только для постановки диагноза заболевания, но и для прогноза и проверки эффективности методов лечения.
Принцип метода. В результате переаминирования, происходящего под действием аминотрансфераз, образуются щавелевоуксусная (ЩУК) и пировиноградная (ПВК) кислоты, которые в щелочной среде образуют с 2,4-динитрофенилгидразином окрашенные гидразоны. Интенсивность окраски пропорциональна активности ферментов и измеряется фотометрически.
Исследуемый материал и реактивы
1. Сыворотка крови. 2. Субстратный раствор для определения АСТ – 100 мл (D.L.-аспарагиновая кислота – 0,2 моль/л; α-кетоглутаровая кислота – 2,0 ммоль/л; фосфатный буфер рН=7,4). 3. Субстратный раствор для определения АЛТ – 100 мл (D.L.-аланин – 0,2 моль/л; α-кетоглутаровая кислота – 2,0 ммоль/л; фосфатный буфер рН=7,4). 3. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГ) – 1 ммоль/л – 100 мл. 4. Стандартный раствор пирувата натрия – 2 ммоль/л – 3 мл. 5. Натрий едкий – 16г (0,4 моль). 6. Физиологический раствор.
Ход работы
Реактивы 2,3,4 содержат готовые к использованию реагенты. Хранить при t – 2-80С.
Содержимое пакета с натрием едким количественно перенести в колбу вместимостью 1л, растворить и довести до метки дистиллированной водой, свободной от карбонатов. Хранить при комнатной температуре.
А. Приготовление опытной пробы. В пробирку вносят 0,25 мл субстратного раствора для определения АсАТ (или АлАТ), нагревают при 370С в течение 5 минут, добавляют 0,05 мл сыворотки крови, инкубируют при 370С 60 минут. Затем добавляют 0,25 мл 2,4-ДНФГ и выдерживают 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 2,5 мл 0,4М раствора натрия едкого, перемешивают и через 10 минут фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против холостой пробы.
Б. Приготовление холостой пробы. Эту пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки крови добавляют 0,05 мл физиологического раствора.
Расчет активности ферментов в сыворотке крови производят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика
В пробирки вносят растворы в соответствии с таблицей, затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 2,4-ДНФГ, тщательно перемешивают и через 20 минут (18-250С) вносят по 0,5 мл 0,4н NaOH.
|
№ п/п |
Стандартный р-р пирувата натрия |
Физиологич. раствор |
Субстратный раствор АлАТ/АсАТ |
Активность фермента (АсАТ, АлАТ) |
|
|
мл |
мл |
мл |
ммоль/(ч*л) |
мккат/л |
|
|
1 |
0,05 |
0,1 |
0,45 |
1,0 |
0,28 |
|
2 |
0,1 |
0,1 |
0,40 |
2,0 |
0,56 |
|
3 |
0,15 |
0,1 |
0,35 |
3,0 |
0,83 |
|
4 |
0,2 |
0,1 |
0,30 |
4,0 |
1,11 |
|
5 |
0,25 |
0,1 |
0,25 |
5,0 |
1,39 |
|
контроль |
– |
0,1 |
0,50 |
Инкубирую при комнатной температуре 10 минут и затем фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против контроля. На оси координат откладывают найденную величину оптической плотности, на оси абсцисс – активность фермента в ммоль/ч*л или в мккат/л («ммоль/ч*л» соответствует 0,278 «мккат/л»).
Калибровочная кривая до величины оптической плотности 0,3. При более высоких значениях оптической плотности сыворотку крови необходимо развести и повторить анализ. При расчете активности учесть степень разведения сыворотки (пропорциональность между степенью разведения и активностью фермента в разведенной сыворотке наблюдается не всегда).
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (активность фермента, моль/ч*л) и сделайте выводы о возможных причинах отклонения полученных результатов от нормальных величин.
Контрольные вопросы
Одним из главных продуктов азотистого обмена в организме является мочевина. Синтезируется она в печени, оттуда поступает в кровь и выделяется с мочой. Мочевина составляет около 50% остаточного азота крови. В норме в сыворотке крови содержание мочевины колеблется от 2,5-8,3 ммоль/л. У детей от 1 года до 14 лет – 1,63-6,64 ммоль/л. С мочой взрослого человека за сутки выводится 20-35г, а в возрасте от 1 года до 14 лет – 4,0-16,0г мочевины.
В клинической лабораторной практике определение мочевины необходимо для оценки белкового обмена; своевременной диагностики и лечения врожденных нарушений орнитинового цикла реакций синтеза мочевины; помощи в оценке работы выделительной функции почек, степени почечной и печеночной недостаточности.
Повышение концентрации мочевины в крови (азотемия) отмечается при заболеваниях почек (нарушение их выделительной функции), при усиленном распаде белков, избыточном белковом питании, в случае обезвоживания организма (относительная азотемия), при отравлении фосфором.
Пониженное содержание мочевины в крови и выделение её с мочой наблюдается при заболеваниях печени (дистрофия печени, цирроз, паренхиматозная желтуха), что связано с нарушением её мочевинообразовательной функции; при нефрите, ацидозе, уремии.
Принцип метода. В кислой среде в присутсвии тисемикарбазида и ионов трехвалентного железа мочевина образует с диацетилмонооксимом комплексное соединение красного цвета, оптическая плотность которого при 510нм пропорциональна концентрации мочевины.
Исследуемый материал и реактивы
1. Сыворотка (плазма) крови без гемолиза. 2. Вата. 3. Спирт. 4. Скарификатор. 5. Реакционная смесь сухая (4 пробирки). 6. Раствор соли железа трехвалентного (5 ммоль/л). 7. Калибровочный раствор мочевины (8 ммоль/л). 8. Кислота серная, концентрированная (96%), х.ч. 9. Кислота трихлоруксусная, ч
Ход работы
А. Приготовление раствора серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают около 300 мл дистиллированной воды и при постоянном помешивании добавляют 50 мл серной кислоты. После охлаждения доливают водой до метки. Раствор устойчив.
Б. Приготовление раствора реакционной смеси. В мерную колбу вместимостью 100 мл количественно переносят содержимое пробирки сухой реакционной смеси и растворяют его примерно в 60 мл дистиллированной воды при нагревании 40-500С. После охлаждения добавляют 1 мл раствора соли железа трехвалентного и доливают водой до метки. Раствор стабилен при комнатной температуре в течение 2 недель. Наличие небольшого количества нерастворимого осадка не мешает определению.
В. Приготовление рабочего раствора. Приготовляют смешением 1 доли раствора реакционной смеси с 1 долей раствора серной кислоты. Ежедневно готовят свежий рабочий раствор.
Г. Приготовление раствора ТХУ 50 г/л (для депротеинирования). 10г ТХУ растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Раствор устойчив.
Д. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (без депротеинирования). Образцы: сыворотка (плазма) крови. В пробирки внести реактивы по следующей схеме:
|
Холостая проба, мл |
Калибровочная проба, мл (DК ) |
Опытная проба, мл (D0) |
|
|
Сыворотка (плазма) крови |
– |
– |
0,01 |
|
Калибровочный раствор мочевины |
– |
0,01 |
– |
|
Рабочий раствор |
2,00 |
2,00 |
2,00 |
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, отверстия закрывают алюминиевой фольгой и пробирки помещают точно на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охлаждают в потоке холодной воды и измеряют оптическую плотность при 510нм (490-540нм, зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 или 0,5см. Параллельно обрабатывают калибровочный раствор. Окраска устойчива в течение 15 минут.
Е. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (с депротеинированием). Образцы: сыворотка (плазма) крови липимическая или гемолизированная, цельная кровь.
В пробирки внести реактивы по следующей схеме:
|
Холостая проба, мл |
Калибровочная проба, мл (DК ) |
Опытная проба, мл (D0) |
|
|
Раствор ТХУ |
0,1 |
0,5 |
0,5 |
|
Сыворотка (плазма) крови |
– |
– |
0,05 |
|
Калибровочный раствор мочевины |
– |
0,05 |
– |
|
Перемешать и центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин |
|||
|
Надосадочная жидкость |
– |
0,1 |
0,1 |
|
Рабочий раствор |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
Далее проводят определение, как при анализе без депротеинирования.
Содержания мочевины производят по формуле:
,
где: С – содержание мочевины в опытной пробе, ммоль/л; D0 – оптическая плотность опытной пробы; DК – оптическая плотность калибровочной пробы; 8,0 – содержание мочевины в калибровочном раствора, ммоль/л.
Примечания: при содержании мочевины в крови свыше 17 ммоль/л пробу следует развести дистиллированной водой и анализ провести повторно. Результат умножить на разведение.
При использовании кюветы другого объема расход реактивов может быть пропорционально изменен при сохранении соотношения проба/рабочий раствор 1:100.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (концентрацию мочевины в сыворотке крови, ммоль/л) и сделайте выводы о состоянии белкового обмена, работе печени и почек исследуемого.
Контрольные вопросы
Гормоны – класс регуляторных химических соединений, синтезируемых железами внутренней секреции и/или специальными клетками. Значение гормональной продукции заключается в том, что секретируемые гормоны осуществляют регуляцию метаболизма отдельных органов и тканей, определяют состояние физиологических процессов и жизнедеятельности организма в целом. Нарушение синтеза, секреции, транспорта и рецепции гормонов клетками лежит в основе многообразных эндокринных расстройств. В связи с этим понимание механизма эндокринных нарушений чрезвычайно важно для диагностики и целенаправленной терапии эндокринных заболеваний. Механизм действия индивидуальных гормонов необходимо знать не только врачу-эндокринологу, но и медику любой специализации. Гормоны нашли широкое применение в медицине.
Диагностика эндокринной патологии на основании изменения биохимических показателей метаболизма. В клинико-биохимических лабораториях используют методы качественного и количественного определения гормонов, гормоноидов и медиаторов в биологическом материале и лекарственных средствах.
Катехоламины – адреналин и норадреналин – производные аминокислоты тирозина вырабатываются в мозговом слое надпочечников. Эти биологически активные вещества оказывают влияние на углеводный обмен: способствуя распаду гликогена, стимулируя фосфорилазную активность в печени, мышцах, надпочечниках опосредовано через аденилатциклазу; на жировой обмен: усиливают мобилизацию жира из жирового депо и распад триацилглицеринов в тканях, активируя липазу. Адреналин чаще применяют для стимуляции сердечных сокращений и повышения кровяного давления.
Принцип метода. Цветные реакции на адреналин и его аналоги основаны на их окислении. При взаимодействии адреналина и норадреналина с хлоридом железа (III) образуется окрашенный в изумрудно-зеленый цвет комплекс. При добавлении капли раствора едкого натра окраска раствора изменяется на вишнево-красное, а затем на оранжево-красное.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор адреналина (0,1%). 2. Раствор хлорида железа (III) (1%). 3. Раствор гидроксида натрия (10%).
Ход работы
В пробирку наливают 10 капель раствора адреналина из ампулы и добавляют 1 каплю раствора хлорида железа (III). Наблюдают за появлением зеленого окрашивания вследствие присутствия пирокатехинового кольца в молекуле адреналина. Добавив 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия, наблюдают изменение окраски раствора на вишнево-красное, а затем на оранжево-красное.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученный результата (окраска раствора) и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
Йодтиронины (тироксин, 3,5,31-трийодтиронин, а также нейодированный гормон-полипептид – кальцитонин) синтезируются и секретируются щитовидной железой. Все йодтиронины, за исключение кальцитонина являются производными аминокислоты тирозина.
Принцип метода. Метод основан на отщеплении при кислотном гидролизе тиреоидных гормонов (йодтиронины) йодистоводородной кислоты, при взаимодействии которой с йодатом калия выделяется свободный йод:
В хлороформе йод имеет фиолетовую окраску.
Исследуемый материал и реактивы
1. Тиреоидин (кристаллический). 2. Азотная кислота (концентрированная). 3. Раствор йодата калия (10%). 4. Хлороформ.
Ход работы
В пробирку помещают несколько кристаллов тиреоидина, добавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты и нагревают 3-5 минут в кипящей водяной бане. Затем приливают 20 капель раствора йодата калия. Содержимое пробирки перемешивают и охлаждают. Далее прибавляют 15 капель хлороформа, встряхивают и наблюдают за изменением окраски.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученный результат (окраска раствора) и сделайте вывод.
Контрольные вопросы
Витамины – жизненно необходимые низкомолекулярные органические вещества. Они требуются организму в очень малых количествах, поступают с пищей, частично синтезируются микрофлорой кишечника или клетками. Все витамины делят на жирорастворимые и водорастворимые. Активно вмешиваясь в обмен веществ в качестве коферментов в составе сложных ферментов, витамины могут оказывать положительный эффект при различных нарушениях метаболических процессов. Дефицит любого витамина ведет к появлению специфических нарушений реакций обмена с характерными клиническими проявлениями. Знание коферментных функций витаминов в организме позволяет понять механизмы развития и профилактики гипо- и авитаминозов и использовать витамины с профилактической и лечебной целью.
Качественные реакции на витамины позволяют обнаружить их наличие в лекарственных препаратах, продуктах питания, в лекарственных растениях. Принципы, положенные в основу качественных реакций на витамины, используются и при разработке количественного их определения. Определение концентрации витаминов в различных органах и тканях имеет практическое значение при установлении гипервитаминозов.
Жирорастворимые витамины
Ретинол – циклический непредельный спирт, состоящий из шестичленного кольца и боковой цепочки, состоящее из двух остатков изопрена и первичной спиртовой группы в конце.
Ретинолы включают витамины группы А (антиксерофтальмические): А1 получен из печени морских рыб, А2 – из печени пресноводных рыб, а также их каротина, содержащегося в овощах и фруктах – предшественника витамина А2. Витамин А входит в состав зрительного пурпура – родопсина, накапливается в печени.
Принцип метода. Реакция основана на водоотнимающем действии хлорида сурьмы (III). При добавлении к ретинолу раствора хлорида сурьмы (III) образуется продукт присоединения, окрашенный в интенсивно синий цвет с максимумом поглощения света в области 620 нм. Эту реакцию используют для количественного определения ретинола спектрофотометрическим или фотоколориметрическим методом.
Исследуемый материал и реактивы
1. Рыбий жир или масляный раствор ретинола в хлороформе (0,05%). 2. Раствор хлорида сурьмы в хлороформе (33%).
Ход работы
В сухую пробирку (или на часовое стекло) вносят 1 каплю свежего рыбьего жира или 0,05% масляного раствора ретинола и добавляют 4-5 капель 33% хлороформного раствора хлорида сурьмы (III). При смешивании содержимое пробирки окрашивается в синий цвет.
Кальциферолы или витамины D (антирахитические) существуют в виде нескольких изомеров. Различные кальциферолы отличаются друг от друга биологической активностью. Наиболее распространены эргокальциферол (витамин D2) и холекальциферол (витамин D3). В организме человека и животных образуется витамин D3 из 7-дегидрохолестерола после воздействия ультрафиолетовых лучей.
Принцип метода. Витамин D, содержащийся в рыбьем жире, при взаимодействии с раствором брома в хлороформе приобретает зеленовато-голубую окраску.
Исследуемый материал и реактивы
1. Рыбий жир 2. Раствор брома в хлороформе (1:60).
Ход работы
В сухую пробирку (или на часовое стекло) вносят 2-3 капли рыбьего жира и 2-4 капли раствора брома в хлороформе. Перемешивают. В присутствии витамина D постепенно появляется зеленовато-голубое окрашивание.
Витамины К (антигеморрагические) относятся к группе хинонов. В их основе лежит кольцо 1,4-нафтохинона с боковыми цепями – изопреноидными звеньями. Известны два природных витамина: К1 – филлохинон, желтоватая маслянистая жидкость и К2 – менахинон, представляет собой желтые кристаллы. У здорового человека витамин К постоянно синтезируется микрофлорой кишечника.
Витамин К входит в состав простетической группы фермента, участвующего в биосинтезе протромбина, необходимого компонента в процессе свертывания крови.
В лечебной практике широкое применение получил водорастворимый, синтетический препарат витамина К – «викасол».
Принцип метода. Викасол в присутствии цистеина в щелочной среде окрашивается в лимонно-желтый цвет, переходящий при стоянии в оранжевый.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор викасола (0,05%). 2. Раствор цистеина (0,025%). 3. Раствор гидроксида натрия (10%).
Ход работы
На сухое часовое стекло наносят 5 капель 0,05% раствора викасола, добавляют 5 капель 0,025% раствора цистеина и 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия. Появляется лимонно-желтое окрашивание.
К витамину Е (антистерильный) относятся производные токола и токотриенола. В их структуре имеется ароматический спирт токол и боковая изопреноидная цепь. Известно несклько изомеров витамина Е, которые отличаются расположением метильных групп в бензольном кольце. Наибольшей биологической активностью обладает α-токоферол. Полагают, что некоторые производные витамина Е наряду с убихиноном участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, связанных с окислительным фосфорилированием. Запасы витамина Е могут откладываться в жировой ткани человека.
Принцип метода. Характерным свойством токоферолов является способность их к окислению за счет фенольного гидроксила. Химическая структура продуктов окисления и их окраска зависят от характера окислителя.
При действии слабых окислителей – хлорида железа (III), сульфата церия (IV) – образуется n-токоферилхинон желтого цвета. При действии на токоферол сильных окислителей, например, концентрированной азотной кислоты, образуется о-токоферилхинон красного цвета.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор токоферола спиртовой (0,1%). 2. Азотная кислота (концентрированная).
Ход работы
В сухую пробирку вносят 5 капель 0,1% спиртового раствора α-токоферола и добавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты. Встряхивают пробирку. Наблюдают за развитием красной окраски.
Водорастворимые витамины
Витамин В1 (антиневритный) состоит из пиримидинового и тиазолового колец. Витамин В1 получил название тиамина поскольку содержит серу и азот. Коферментная форма витамина – тиаминпирофосфат (ТПФ) входит в состав пируватдегидрогеназного и α-кетоглутаратдегидрогеназного комплексов, катализирующих окислительное декарбоксилирование пировиноградной и других кетокислот, а также является коферментом транскетолазы пентозо-фосфатного пути (ПФП).
Принцип метода. В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого цвета.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор тиамина или поливитаминов. 2. Диазореактив (5 капель 1% раствора сульфониловой кислоты и 5 капель 5% раствора нитрита натрия). 3. Раствор бикарбоната натрия (10%).
Ход работы
К диазореактиву, состоящему из 5 капель 1% раствора сульфаниловой кислоты и 5 капель 5% раствора нитрата натрия, добавляют 1–2 капли 5% раствора тиамина (или поливитаминов) и затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно добавляют 5–7 капель 10% раствора бикарбоната натрия. На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета.
Витамин В2 (антисеборейный) – рибофлавин – состоит из изоаллоксазинового ядра и спирта рибитола. Коферментной формой витамина являются: флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД), входящие в состав флавиновых ферментов и принимающие участие в биологическом окислении. Небольшое количество витамина В2 образуется в кишечнике человека под действием микрофлоры.
Принцип метода. Метод основан на способности рибофлавина легко восстанавливаться, при этом раствор рибофлавина, обладающий желтой окраской, приобретает сначала розовый цвет за счет образования промежуточного продукта (родофлавин), а затем обесцвечивается, так как восстановленная форма рибофлавина бесцветна.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор рибофлавина (0,025%) или поливитаминов. 2. Соляная кислота (концентрированная). 3. Цинк металлический (зерна).
Ход работы
В пробирку наливают 10 капель раствора витамина В2 (или поливитаминов), добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и опускают зернышко металлического цинка. Начинается выделение пузырьков водорода, жидкость постепенно розовеет, затем обесцвечивается.
Витамин В6 (антидерматитный) носит название пиридоксина, этим термином обычно обозначается группа веществ, обладающих активностью витамина В6. К ним принадлежат пиридоксол, пиридоксаль, пиридоксамин, являющиеся производными пиридина. Кофермнтная форма витамина В6 – фосфопиридоксаль (ФП) – участвует в ферментативных реакциях белкового обмена: трансаминирования, декарбоксилирования, десульфирования аминокислот и др. небольшое количество этого витамина синтезируется в организме человека кишечной микрофлорой.
Принцип метода. Витамин В6 при взаимодействии с раствором хлорного железа образует комплексную соль типа фенолята железа красного цвета.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор витамина В6 (1%) или поливитаминов. 2. Раствор хлорного железа (III) (1%).
Ход работы
К 5 каплям 1% раствора витамина В6 приливают равное количество 1% раствора хлорного железа и перемешивают. Наблюдают за появлением красного окрашивания.
Фолиевая кислота была выделена из зеленых листьев растений, в связи с чем получила свое название (от лат. Folium – лист). Она состоит из трех структурных единиц: остатка птеридина (конденсированного бицикла, состоящего из пиримидинового и пиразинового колец), парааминобензойной кислоты (ПАБК) и глутаминовой кислоты. Фолиевая кислота ограничено растворима в воде. Коферментная форма витамина Вс – тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК) – участвует в переносе одноуглеродных фрагментов (формильных, метенильных, метиленовых, метильных и др.). Входит в составферментов, участвующих в синтезе пуринов и пиримидинов, некоторых аминокислот (глицина из серина, метионина из гомоцистеина). Поэтому фолиевая кислота (фолацин) играет исключительную роль в биосинтезе нуклеиновых кислот и процессах деления клеток. Синтезируется микрофлорой кишечника человека и животных.
Принцип метода. Наличие в птеридиновой части молекулы фолиевой кислоты гидроксильных групп и третичных атомов азота позволяет получать нерастворимые внутримолекулярные соли с катионами тяжелых металлов. При этом образуются окрашенные осадки: с ацетатом свинца – лимонно-желтый, сульфатом меди (II) – зеленый, нитратом серебра – желто-оранжевый, нитратом кобальта – темно желтый, хлоридом железа (III) – красно-желтый.
Исследуемый материал и реактивы
1. Фолиевая кислота. 2. Раствор гидроксида натрия (0,1н). 3. Растворы металлов (1%): ацетата свинца, сульфата меди (II), нитрата серебра, нитрата кобальта, хлорида железа (III).
Ход работы
0,01 г фолиевой кислоты взбалтывают с 1,0-1,5 мл 0,1н раствора гидроксида натрия (важно не допустить избытка щелочи во избежание образования гидроксидов металлов) в течение 2-3 минут и фильтруют. Затем по 1-2 капли фильтрата переносят на часовое или предметное стекло и прибавляют 1 каплю 1% раствора вышеуказанных солей металлов. Наблюдают за появлением окраски.
Витамин РР (антипеллагрический) – производный пиридинового ядра. Антипеллагрической активностью, помимо никотиновой кислоты, обладает и ее амид. Коферментные формы витамина РР – никатинамидадениндинуклеотид (НАД) и никатинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ) – входят в состав дегидрогеназ, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях (переносят протоны и электроны от окисляемых субстратов).
Принцип метода. Витамин РР при нагревании с раствором ацетата меди образует плохо растворимый синий осадок медной соли никотиновой кислоты.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор витамина РР (3%) или поливитаминов. 2. Раствор ацетата меди (5%).
Ход работы
Наливают в пробирку 20 капель 3% раствора витамина РР (перед определением раствор обязательно следует взболтать) и нагревают до кипения; при этом мутный раствор становится прозрачным. Взболтав 5% раствор ацетата меди, приливают 20 капель его к нагретому раствору витамина РР. Содержимое пробирки доводят до кипения и сразу охлаждают под струей холодной воды. На дне пробирки выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.
Витамин С (антискорбутный, антицинготный) является ненасыщенным соединением, кислый характер её обусловлен наличием двух енольных гидроксильных групп, способных к диссоциации с отщеплением водородных ионов. Аскорбиновая кислота участвует в окислительно-восстановительных реакциях, являясь донором водорода; в реакциях гидроксилирования: при превращении триптофана в серотонин; пролина и лизина в оксипролин и оксилизин соответственно при синтезе коллагена; стероидов при синтезе гормонов коры надпочечников; при биосинтезе карнитина; при образовании норадреналина и др. С аскорбиновой кислотой связано освобождение железа из трансферрина, восстановление ионов Fe3+ до Fe2+; превращение фолиевой кислоты в её коферментные формы.
А. Восстановление раствора гексацианоферрата (III) калия витамином С.
Принцип метода. Аскорбиновая кислота восстанавливает K3[Fe(CN)6] в K4[Fe(CN)6], который с хлоридом железа (III) образует синее окрашивание или осадок – берлинскую лазурь.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор витамина С или поливитаминов. 2. Раствор гексацианоферрата (III) калия (5%). 3. Раствор хлорида железа (III) (1%). 4. Вода.
Ход работы
В две пробирки наливают по 1 капле 5% раствора гексацианоферрата (III) калия и по 1 капле 1% раствора хлорида железа (III). В первую пробирку к зеленовато-бурой жидкости добавляют 5-10 капель раствора витамина С; во вторую – столько же воды. Жидкость в первой пробирке приобретает зеленовато-синюю окраску и выпадает синий осадок берлинской лазури. Во второй пробирке зеленовато-бурая окраска остается без изменения.
Б. Йодная проба на аскорбиновую кислоту.
Принцип метода. Раствор йода в йодите калия при добавлении к нему раствора витамина С обесцвечивается за счет восстановления аскорбиновой кислотой молекулярного йода.
Исследуемый материал и реактивы
1. Раствор витамина С или поливитаминов. 2. Раствор йода в йодите калия. 3. Вода.
Ход работы
В две пробирки наливают по 10 капель воды и по 1-2 капли раствора йода в растворе йодита калия. В одну пробирку добавляют 10 капель раствора витамина С, в другую – столько же воды. В пробирке с аскорбиновой кислотой раствор йода обесцвечивается.
Под термином витамин Р (витамин проницаемости), повышающим резистентность капилляров объединяется группа веществ со сходной биологической активностью: флавоны, флавононы, изофлавоны, флаванолы и т.д. Все они обладают Р-витаминной активностью и в основе их структуры лежит дифенилпропановый углеродный скелет хромана или флавона. Этим объясняется их общее название «биофлавоноиды». Витамин Р стабилизирует основное вещество соединительной ткани путем ингибирования гиалуронидазы. Биофлавоноиды вместе с витамином С участвуют в окислительно-восстановительных процессах организма и образуют единую систему.
Принцип метода. При взаимодействии рутина с хлоридом железа (III) образуется комплексное соединение зеленого цвета.
Исследуемый материал и реактивы
1. Листья чая сухие. 2. Хлорид железа (III) кристаллический. 3. Вода.
Ход работы
Берут навеску 100 мг чая, добавляют 25 мл воды и кипятят в течении 3 минут. Дают остыть, отбирают в пробирку 1 мл жидкости и добавляют несколько кристалликов хлорида железа (III). Перемешивают и разводят в 2-3 раза водой. Развивается зеленое окрашивание.
Указания к оформлению лабораторной работы
Полученные результаты лабораторной работы запишите в виде таблицы:
|
№ п/п |
Название витамина, его формула |
Реактивы |
Принцип реакции |
Наблюдаемое окрашивание |
Контрольные вопросы
|
Название витамина |
Формула коферментной формы |
Роль витамина в обмене веществ |
Клиническая картина гипо- или авитаминоза |
Источник витамина в природе; суточная потребность человека в витамине |
Печень играет центральную роль в промежуточном обмене веществ. Особенности ферментативного аппарата печени и ее анатомических связей с другими органами дает возможность печени участвовать в регуляции практически всех видов обмена веществ и поддерживать постоянство концентрации в крови многих жизненно важных соединений.
Печень – большая промежуточная станция между портальным и общим кругами кровообращения организма, поэтому все вещества, всасывающиеся из кишечника, должны пройти через печень. Функции печени обуславливают ее своеобразный «биохимический альтруизм»: многие происходящие в ней процессы настроены на синтез различных веществ для других органов, а также на защиту этих органов от образующихся в них (или поступающих извне) токсических соединений.
В состав органа входят клетки Купфера, принимающие участие в фагоцитозе. Печень выделяет желчь, необходимую для переваривания жира. Значительную роль играет печень в процессах свертывании крови, т. к. синтезирует белки–компоненты свертывающей и антисвертывающей систем крови.
В печени депонируются железо, медь и витамин В12, необходимые для эритропоэза. Продолжительность жизни эритроцитов составляет 110–120 дней. После этого они разрушаются с освобождением гемоглобина (Нb). В печени, селезенке, костном мозге гемоглобин распадается с образованием билирубина. Дальнейшая судьба желчных пигментов (билирубина) связана с их метаболизмом в печени и в кишечнике. Определение в клинике содержания общего билирубина, его фракций и продуктов их деградации имеет важное значение в дифференциальной диагностике желтух различной этиологии.
Следует отметить значительную вариабельность химического состава печени, который зависит от характера питания, состояния обмена веществ. Особенно существенные изменения в соотношении отдельных компонентов наблюдаются при голодании и патологических процессах, например, жировой инфильтрации печени, гликогенозах и др. В связи с вышеизложенным понятна необходимость правильной оценки функционального состояния печени с использованием различных биохимических тестов, позволяющих установить факт заболевания и отслеживать его течение.
Билирубин образуется в организме в результате распада гемоглобина эритроцитов в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (печень, селезенка). Из тканей билирубин поступает в кровь, и как соединение токсичное захватывается печенью, где и обезвреживается путем соединения его с глюкуроновой кислотой, образуя моно- и диглюкурониды. Транспортируется билирубин к месту обезвреживания в комплексе с белком.
В сыворотке крови содержится два вида билирубина: нерастворимый «непрямой» (в виде комплекса с белками, обеспечивающими транспорт) и растворимый «прямой» (диглюкуронид билирубина). Вместе обе формы составляют общий билирубин.
Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая дает со связанным билирубином (хорошо растворимым в воде) розово-фиолетовое окрашивание, а «непрямой» билирубин, в присутствии спирта (спирт переводит «непрямой» билирубин в растворимое состояние) – красно-розовое.
Исследуемый материал и реактивы
1. Сыворотка крови. 2. Диазореактив (свежеприготовленный). 3. Этиловый спирт. 4. Фильтровальная бумага.
Ход работы
А) Обнаружение «прямого» билирубина. На часовое стекло, под которое подложен лист белой бумаги, наносят каплю сыворотки крови, содержащей «прямой» билирубин, добавляют 3 капли свежеприготовленного диазореактива и перемешивают стеклянной палочкой. Образуется характерное для билирубина розово-фиолетовое окрашивание.
Б) Обнаружение «непрямого» билирубина. В пробирку отмеривают 1 мл сыворотки крови, 2 мл этилового спирта и фильтруют. К фильтрату добавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива – появляется красно-розовое окрашивание.
Указания к оформлению лабораторной работы
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
В крови билирубин содержится в небольших, но постоянных количествах: 8-20 мкмоль/л. В сыворотке крови содержатся две формы билирубина – связанный, или билирубинглюкуронид, хорошо растворимый в воде, и несвязанный, или свободный билирубин, плохо растворимый в воде. Свободная форма его циркулирует в крови в виде комплекса с альбумином. У здоровых людей 75% общего билирубина сыворотки крови составляет свободный билирубин.
В клинической практике чаще всего приходится встречаться с гипербилирубинемиями различного происхождения. Повышение уровня свободного билирубина в крови встречается при гемолитических желтухах, некоторых анемиях, желтухе новорожденных и др. Желтухи, связанные с затруднением оттока желчи (механические), сопровождаются повышением уровня глюкуронида билирубина («прямой»). При паренхиматозных желтухах наблюдается также повышение содержания глюкуронида билирубина, с преобладанием однако моноглюкуронида.
Принцип метода. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он вызывает розово-фиолетовое окрашивание раствора со смесью диазореактивов. По интенсивности окрашивания последнего фотометрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между содержанием общего и связанного билирубина находят количество свободного.
Исследуемый материал и реактивы
1. Сыворотка крови. 2. Диазореактив I. 3. Диазореактив II. 4. Кофеиновый реактив. 5. Физиологический раствор хлорида натрия.
Ход работы
Перед работой готовят диазосмесь: смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II. В три пробирки (1 – для определения уровня общего билирубина, 2 – связанного билирубина и 3 – контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме:
|
Реактив, мл |
Общий билирубин |
Конъюгированный (связанный) билирубин |
Контрольная проба |
|
1 |
2 |
3 |
|
|
Сыворотка |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
|
Кофеиновый реактив |
1,75 |
– |
1,75 |
|
Физиологический раствор |
– |
1,75 |
1,75 |
|
Диазосмесь |
0,25 |
0,25 |
– |
При определении уровня общего билирубина пробу оставляют при комнатной температуре на 20 мин для развития окраски. В дальнейшем окраска пробы не изменяется. Для установления содержания коньюгированного (связанного) билирубина колориметрирование осуществляют спустя 5–10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии пробы в реакцию вступает свободный билирубин.
Колориметрируют опытные пробы против контроля при зеленом светофильтре (500–560 нм) в кювете шириной 5мм. Оценку результатов производят по калибровочному графику. В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л, 75% его количества приходится на долю свободного билирубина.
Калибровочный график для определения билирубина крови
Указания к оформлению лабораторной работы
В таблицу показателей норм основных клинико-биохимических исследований впишите нормальные значения концентрации билирубина в крови.
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты – концентрации общего и конъюгированного билирубина и сделайте выводы о причинах возможного отклонения этих показателей от нормы в исследуемом материале.
Контрольные вопросы
В клинико-диагностических лабораториях широко используют методы, при которых простыми коллоидными реакциями косвенно обнаруживаются изменения в составе белков сыворотки крови (диспротеинемические тесты). Все эти методы основываются на изменениях, наступающих в коллоидной устойчивости сыворотки, поэтому получили известность под названием проб коллоидной устойчивости (или проб на лабильность белков сыворотки). Поскольку нарушение коллоидной устойчивости сыворотки под действием какого-либо реактива выражается сначала коагуляцией (склеиванием), а затем флокуляцией (осаждением), коллоидно-устойчивые пробы именуются нередко коагуляционными или флокуляционными (коллоидно-осадочными).
Лабильность сывороточных белков во многом зависит от соотношения между альбуминами (гидрофильными, защитными коллоидами) и глобулинами. Установлено, что положительный результат коллоидно-химических проб чаще всего вызывается количественными изменениями в глобулиновых фракциях (, , ), или изменением соотношения альбумины/глобулины, т.е. он связан с увеличением содержания глобулинов. Либо с уменьшением уровня альбуминов.
Тимоловая проба более пригодна для функционального исследования печени, чем другие коллоидно-устойчивые пробы. Считают, что она положительна в 90-100% случаев болезни Боткина (уже в преджелтушной ее стадии и при безжелтушной форме) и при токсическом гепатите. Реакция положительна при послегепатитном и постнекротическом, особенно желтушном циррозе. В отличие от других форм циррозов, при коллагеновых заболеваниях, малярии и вирусных инфекциях. При механической желтухе она (в 75% случаев) отрицательна, что имеет дифференциально-диагностическое значение.
Принцип метода. Сывороточные β-глобулины, γ-глобулины и липопротеиды осаждаются при рН=7,55 тимоловым реактивом. В зависимости от количества и взаимного соотношения отдельных белковых фракций при реакции возникает помутнение, интенсивность которого измеряют турбодинамически.
Считают, что причиной помутнения тимоловой пробы является взаимодействие коллоидных частиц тимола и некоторых крупнодисперсных белков: -глобулинов и -липопротеидов. По представлению Маклагана, который предложил эту пробу в 1944 году, эта реакция связана с образованием глобулин-тимол-липидного комплекса (содержащего 40% глобулинов, 32% тимола, 18% холестерина и 10 % фосфолипидов).
Исследуемый материал и реактивы
1. Сыворотка крови. 2. Тимоловый реактив. 3. Физиологический раствор натрия хлористого. 4. Раствор сравнения 1: серная кислота 0,01 моль/л. 5. Раствор сравнения 2: барий хлористый 0,3 ммоль/л, серная кислота 0,097 моль/л.
Ход работы
В трех пробирках готовят растворы в соответствии с таблицей:
|
Отмерить (мл) |
Проба, мл |
Контрольный раствор I, мл |
Контрольный раствор II, мл |
|
Сыворотка крови |
0,05 |
- |
0,05 |
|
Тимоловый реактив |
3,00 |
3,00 |
- |
|
Физиологический раствор |
- |
0,05 |
3,00 |
Растворы перемешивают и оставляют стоять точно 30 мин при (+15-+25оС). Потом снова перемешивают и измеряют экстинкцию пробы и контрольного раствора I против контрольного раствора II (длина волны 620-660нм) в кювете с толщиной слоя 10мм.
Построение калибровочной кривой
Из раствора сравнения 1 и 2 разбавлением приготавливают растворы с помутнением, соответствующим (5-20) единицам помутнения по Shank-Hoagland (ед. S-H) в соответствии с таблицей:
|
Раствор № |
Раствор сравнения 1, мл |
Раствор сравнения 2, мл |
Единицы помутнения |
|
1 |
4,50 |
1,50 |
5 |
|
2 |
3,00 |
3,00 |
10 |
|
3 |
1,50 |
4,50 |
15 |
|
4 |
- |
6,00 |
20 |
В четырех пробирках смешивают раствор сравнения 1 с раствором сравнения 2 и точно через 30 мин содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего измеряют экстинкцию растворов против дистиллированной воды. Измерение проводят при такой же длине волны, как и при измерении пробы.
Строят график, на оси абсцисс откладывая единицы помутнения, а на оси ординат соответствующие им значения экстинкции. Выводят кривые зависимости величины экстинкции от единиц помутнения. Определив экстинкцию исследуемой пробы и контрольного раствора I, находим по графику каким единицам помутнения соответствуют их оптические плотности.
Рассчитываем результат по формуле:
Т=Ед1–Ед2, где
Т – единицы тимоловой пробы; Ед1 – единицы помутнения, соответствующие оптической плотности пробы; Ед2 – единицы помутнения, соответствующие оптической плотности контрольного раствора I.
Указания к оформлению лабораторной работы
В таблицу показателей норм основных клинико-биохимических исследований впишите нормальные значения единиц тимоловой пробы.
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (единицы помутнения) и сделайте выводы.
Контрольные вопросы
Назовите известные Вам белки крови человека.
Назовите автора, который предложил тимоловую пробу.
Для характеристики функционирования какого органа наиболее пригодна Тимоловая проба?
Кровь – жидкая ткань, состоящая из клеток (форменных элементов крови) и внеклеточной жидкой среды – плазмы, и выполняющая следующие функции: транспортную, осморегуляторную, буферную, обезвреживающую, защитную, регуляторную и гомеостатическую.
Состав крови отражает нормальные и патологические процессы, происходящие в организме человека. На долю крови приходится 7% от веса тела. Жидкая часть – плазма составляет 55-60%, форменные элементы (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, лимфоциты) – 40-45%. Удельный вес крови 1,055-1,065. Осмотическое давление крови 7,7- 8,1 атм. Вязкость крови в 5 раз больше вязкости воды. В крови 77-82% воды, сухой остаток составляет 18- 23%.
При удалении форменных элементов из крови остается плазма, а при извлечении из нее фибриногена – сыворотка крови. Общее количество белков в плазме составляет 70-85 г/л. С возрастом количество белков в плазме крови уменьшается до 65-67 г/л. Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови у взрослых 65-85 г/л, у детей до 6 лет – 56-86 г/л.
Основными группами белков плазмы являются альбумины (54-65 г/л), глобулины (34-46 г/л) и фибрин (2-4 г/л). С помощью электрофореза можно разделить их на несколько фракций: преальбумины, альбумины (от3 до 5 фракций), глобулины (от 5 и более фракций). Глобулины составляют в среднем 36,8 % общего количества белков сыворотки крови, в том числе: α1-глобул 2-5%, α2-глобулины – 7-13%, β-глобулинов – 8-15%, γ-глобулинов – 12-22%. Большинство белков находится в плазме в виде комплексов (липопротеины, гликопротеины и др.).
Белки крови выполняют разнообразные функции: дыхательная, транспортная, поддерживают осмотическое и онкотическое, обладают антигенной активностью.
Принцип метода: пептидные связи белков образуют в щелочной среде с ионами двухвалентной меди комплекс сине-фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации белка и измеряется фотометрически.
Исследуемый материал и реактивы
1. Сыворотка крови. 2. Биуретовый реактив. 3. Стандартный раствор белка. () Тимоловый реактив. 4. Раствор хлорида натрия (0,9%).
Ход работы
Внести в пробирки реагенты в соответствии со схемой:
|
Реагенты |
Опытная проба (мл) |
Калибровочная проба (мл) |
Контрольная проба (мл) |
|
0,9: р-р NaCl |
0,45 |
0,45 |
0,50 |
|
Сыворотка |
0,05 |
– |
– |
|
Стандарт |
– |
0,05 |
– |
|
Биуретовый реактив |
2,00 |
2,00 |
2,00 |
Содержимое пробирок перемешать, избегая образования пены. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре (18-250С).
После инкубации измерить экстинкцию опытных проб против контрольной пробы в кювете с длиной оптического пути 10мм при длине волны 540 нм (500-560 нм).
Концентрацию общего белка рассчитывают по формуле:
где С – концентрация общего белка, г/л; ЕО – экстинкция опытной пробы; ЕСТ – экстинкция стандартного раствора белка; А – концентрация белка в стандарте, г/л.
или определяют по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика.
Из стандартного раствора белка готовят калибровочные растворы в соответствии с таблицей:
|
№ п/п |
Стандартный р-р белка, мл |
0,9% р-р NaCl |
Концентрация белка, г/л |
|
1 |
0,1 |
0,4 |
0,2хА |
|
2 |
0,2 |
0,3 |
0,4хА |
|
3 |
0,3 |
0,2 |
0,6хА |
|
4 |
0,4 |
0,1 |
0,8хА |
|
5 |
0,5 |
– |
1,0хА |
Примечание. А – концентрация белка в стандарте, г/л.
0,5 мл каждого калибровочного раствора вносят в пробирки с 0,45 мл 0,9% раствора NaCl, добавляют по 0,2 мл биуретового реактива. Перемешивают и через 30 минут фотометрируют против контрольной пробы (см. ход определения). По полученным данным строят калибровочный график или рассчитывают фактор пересчета.
Указания к оформлению лабораторной работы
В таблицу показателей норм основных клинико-биохимических исследований впишите нормальные значения концентрации общего белка в сыворотке крови.
В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (концентрацию общего белка в сыворотке крови) и сделайте выводы причинах возможного отклонения полученных результатов от нормы.
Контрольные вопросы
Моча образуется и выделяется почками. Первичная моча представляет собой ультрафильтрат крови. Она содержит все компоненты крови, кроме форменных элементов и белков. В результате реабсорбционных и секреторных процессов в канальцах и собирательных трубочках почек формируется окончательная моча. С мочой выделяется до 150 различных веществ. Моча выделяется периодически и отдельные её порции в течение дня имеют неодинаковый химический состав, разную относительную плотность и кислотность. При многих болезнях качественный и количественный состав мочи меняется, в ней появляются химические и морфологические составные части, не встречающиеся при нормальных условиях. Исследование мочи имеет очень большое значение при диагностике. Она отражает состояние обмена веществ в организме и функцию ряда органов (печень, почки и др.). Моча широко доступна для различных видов ее исследования.
В клинико-биохимических лабораториях проводят общий и специальный анализ мочи. Общий анализ включает исследование физико-химических свойств мочи (удельный вес, цвет, прозрачность, запах, кислотность, а также органические и неорганические составные части) и определение в ней ряда патологических компонентов: сахар, кетоновые «тела», белок, гемоглобин, пигменты и индикан. При необходимости подсчитывают также количество эритроцитов и лейкоцитов в моче. Анализ мочи дает возможность судить о характере течения болезни и об эффекте терапевтических мероприятий. Химический состав мочи отражает также сдвиги в химизме крови. В связи со всем этим исследование мочи является важной составной частью в общем обследовании каждого вновь поступающего больного.
Общий анализ обязателен при первичном обследовании пациента и диспансерном наблюдении. Специальный анализ, т.е. определение прочих составных частей мочи (метаболиты, ферменты, отдельные минеральные вещества и т.д.), проводиться при подозрении на поражение определенного органа, конкретного звена обмена.
Патологические компоненты мочи
Белок в нормальной моче находиться в виде следов, которые не открываются обычными реакциями, применяемыми в клинической лаборатории. Появление белка в моче называется протеинурией, которая может быть двух видов: «почечная» и «внепочечная». При «почечной» или истинной протеинурии белки сыворотки крови попадают в мочу через почки (при нефрите, т.е. при воспалении клубочков почек, когда увеличивается их проницаемость; в случае сердечной декомпенсации; при некоторых формах повышенного артериального давления; иногда при беременности). «Внепочечная» или ложная протеинурия наблюдается при попадании в мочу слизи, крови, гноя, но не из почек, а из мочевыводящих путей. Белок появляется в моче при нефрите (т.е. воспалении сосудистых клубочков почек, когда увеличивается их проницаемость), а в случае сердечной декомпенсации, при некоторых формах повышенного кровяного давления и иногда при беременности. Моча, содержащая белок, становится мутной.
Для обнаружения белка в моче обычно применяют три реакции на его осаждение: 1. Осаждение кипячением. 2. Осаждение концентрированной азотной кислотой. 3. Осаждение сульфосалициловой кислотой (самая чувствительная).
Принцип метода. При кипячении нейтральных или слабокислых растворов белка, последний денатурирует и выпадает в осадок. При денатурации белка нарушаются четвертичная, третичная и даже вторичная структуры, т.е. отмечается разрыв цементирующих белковую молекулу вторичных связей (водородных, дисульфидных, электростатических, эфирных, вандервальсовых и др.), что ведет к изменению пространственной структуры и уменьшению гидрофильности белковой молекулы.
Исследуемый материал и реактивы
1. Патологическая моча. 2. Раствор уксусной кислоты (1%). 3. Раствор уксусной кислоты (10%). 4. Лакмусовая бумага.
Ход работы
Предварительно проверяют мочу на лакмус. Если моча имеет кислую реакцию, то её (2-3 мл) сразу кипятят в пробирке, а если моча имеет щелочную реакцию, то её сначала очень слабо подкисляют на лакмус добавлением по каплям 1% уксусной кислоты. В присутствии белка при кипячении образуется муть или осадок, не растворяющийся при повторном кипячении после добавления к жидкости 3-5 капель 10% уксусной кислоты. Этим осадок свернувшихся белков отличается от осадков фосфатов и карбонатов кальция и магния, которые могут выпасть при кипячении в слабокислой среде, но растворяются при нагревании в более кислом растворе уксусной кислоты.
Принцип метода. Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию, что связано с дегидратацией белковых частиц, их нейтрализацией и образованием комплексных солей белка с кислотами Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется.
Исследуемый материал и реактивы
1. Патологическая моча. 2. Азотная кислота (концентрированная).
Ход работы
В пробирку наливают около 1 мл концентрированной азотной кислоты и осторожно из пипетки по стенке пробирки наливают мочу. В присутствии белка на границе раздела двух жидкостей образуется белый аморфный слой или муть, так называемое белковое кольцо. При отсутствии белка в моче на границе обоих жидкостей появляется цветное кольцо, обусловленное изменением пигментов мочи под действием азотной кислоты.
Принцип метода. Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков обусловленное нейтрализацией заряда белка, что приводит к разрушению пространственной структуры, денатурации и осаждению белка.
Исследуемый материал и реактивы
1. Патологическая моча. 2. Раствор сульфосалициловой кислоты (20% свежеприготовленный).
Ход работы
К 1-2 мл мочи добавляют 2-3 капли свежеприготовленного 20% раствора сульфосалициловой кислоты. При наличии белка в моче образуется белый осадок или муть.
В моче здорового человека глюкоза присутствует в виде следов (0,4 г/л) и не может быть обнаружена обычными химическими реакциями. Выделение сахара с мочой (глюкозурия) в количестве, превышающем норму, обусловлено повышением либо его содержания в крови (внепочечная глюкозурия), либо пропускной способностью почек (почечная глукозурия). Наиболее часто появление глюкозы в моче отмечается при сахарном диабете, реже при действии глюкокортикоидов (стероидный диабет). Для обнаружения сахара в моче пользуются пробами Троммера (см. л/р №4), Фелинга.
Принцип метода. Реакция основана на способности глюкозы при нагревании восстанавливать Cu2+ в щелочной среде. При этом выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди.
Исследуемый материал и реактивы
1. Патологическая моча. 2. Реактив Фелинга.
Ход работы
К 5 каплям реактива Фелинга добавляют 5 капель исследуемой мочи. Жидкость перемешивают и нагревают до начала кипения. Следует отметить, что в моче содержится много органических веществ (мочевая кислота, креатинин и др.), которые при длительном кипячении могут восстанавливать тяжелые металлы. В противоположность этому восстановление металлов в присутствии глюкозы происходит до кипения.
К числу патологических составных частей мочи относятся также кровь (точнее форменные элементы) и кровяные пигменты (гемоглобин и метгемоглобин). Появление крови в моче называется гематурия, а при наличие кровяных пигментов говорят о гемоглобинурии. Гемоглобинурия наблюдается в основном при отравлении гемолитическими ядами и при ряде заболеваний, связанных с гемолизом (распадом) эритроцитов. Гематурия имеет место при кровотечениях из почек или мочевыводящих путей. При наличии крови моча принимает красноватый оттенок, интенсивность которого зависит от количества примешанной крови. При гематурии моча бывает мутной от взвешенных форменных элементов крови, которые в моче не гемолизируются, так как она является по отношению к крови гипертоническим раствором. Окраска мочи при этом может быть разных оттенков: от ярко-красного – при переходе гемоглобина в оксигемоглобин, до вишневого – при наличии восстановленного гемоглобина. Если гемоглобин находится в виде метгемоглобина, моча принимает буроватый цвет (цвет мясных помоев). В случаях гематурии и гемоглобинурии в моче определяется белок.
Принцип метода. Проба основана на окислении бензидина атомарным кислородом, который образуется при разложении пероксида водорода кровяным пигментом – гемоглобином, оказывающим пероксидазное действие.
Исследуемый материал и реактивы
1. Нормальная и патологическая моча. 2. Раствор бензидина (1% в 32% растворе уксусной кислоты). 3. Раствор пероксида водорода (3%).
Ход работы
В одну пробирку вносят 5 капель нормальной мочи, а в другую – патологической и добавляют по 3 капли 1% раствора бензидина в 32% уксусной кислоте и 3% раствора пероксида водорода. При наличии кровяных пигментов моча окрашивается в синий или сине-зеленый цвет.
Принцип метода. При кипячении со щелочью фосфаты, содержащиеся в моче, выпадают в осадок и увлекают за собой кровяные пигменты. В присутствии кровяного пигмента отстоявшийся осадок темнее мочи, в отсутствие пигмента осадок фосфатов будет более светлым, чем моча.
Исследуемый материал и реактивы
1. Нормальная и патологическая моча. 2. Раствор гидроксида натрия (10%).
Ход работы
К 3-4 мл нефильтрованной мочи прибавляют 5-7 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и кипятят. Дают полностью остыть и отстояться осадку фосфатов и сравнивают окраску осадка с окраской исследуемой мочи. В присутствии кровяного пигмента осадок будет темнее мочи. В моче, не содержащей крови, осадок будет светлее, чем раствор.
Важнейшим желчным пигментом является билирубин. Нормальная моча содержит лишь небольшие количества билирубина, которые обычными реакциями не обнаруживаются. При различного рода желтухах билирубин появляется в моче (билирубинурия). Моча, содержащая билирубин, имеет желтовато-коричневый цвет и при взбалтывании легко образует пену, которая долго не исчезает (вследствие понижения поверхностного натяжения под влиянием попадающих одновременно в мочу желчных кислот).
Принцип метода. Метод основан на окислении билирубина в биливердин (зеленое окрашивание) под действием йода.
Исследуемый материал и реактивы
1. Нормальная и патологическая моча. 2. Раствор йода спиртовой (1%).
Ход работы
В одну пробирку вносят 5 мл нормальной, а в другую – патологической мочи и осторожно наслаивают 1% спиртовой раствор йода. Если в моче присутствует билирубин, то на границе двух жидкостей появляется зеленой кольцо.
Ацетон, ацетоуксусная кислота и бета-гидрокисмасляная кислота относятся к кетоновым телам. Нормальная моча содержит незначительные количества кетоновых тел, которые не выявляются обычными реакциями (меньше 50мг в суточном количестве). Однако, при недостатке углеводов, диабете и голодании, когда идет усиленный распад жиров и белков, в крови появляются в большом количестве недоокисленные продукты – кетоновые тела. Появление кетоновых тел в моче называется кетонурией.
Для обнаружения ацетоновых «тел» в моче в лабораторной практике используют реакции Либена, Легаля, Ланге, Герхарда и др.
Принцип метода. Ацетон и АУК в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия оранжево-красное окрашивание.
Исследуемый материал и реактивы
1. Моча. 2. Раствор гидроксида натрия (10%). 3. Раствор нитропруссида натрия (10% свежеприготовленный). 4. Ледяная уксусная кислота.
Ход работы
На часовое стекло наносят 1 каплю мочи, 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю свежеприготовленного 10% раствора нитропруссида натрия. Появляется оранжево-красное окрашивание. Добавление 3 капель ледяной уксусной кислоты дает вишнево-красное окрашивание. Реакцию можно проводить также и в пробирке.
Принцип метода. Ацетон мочи в щелочной среде при взаимодействии с реактива Люголя образует йодоформ, который можно узнать по запаху. При больших концентрациях ацетона в моче выпадает кристаллический осадок йодоформа.
Исследуемый материал и реактивы
1. Моча. 2. Раствор гидроксида натрия (10%). 3. Реактив Люголя.
Ход работы
К 1-2 мл мочи добавляют 5-6 капель 10% раствора гидрокисда натрия и 3-4 капли реактива Люголя. Отмечают характерный запах йодоформа.
Принцип метода. При осторожном наслоении концентрированного раствора аммиака на раствор подкисленной мочи с добавлением нитропруссида натрия, в присутствии ацетона и АУК на границе раздела двух жидкостей образуется красно-фиолетовое или фиолетовое кольцо.
Исследуемый материал и реактивы
1. Моча. 2. Ледяная уксусная кислота 3. Раствор нитропруссида натрия (10% свежеприготовленный). 4. Раствор аммиака (концентрированный).
Ход работы
К 1-2 мл мочи добавляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты и 5-6 капель нитропруссида натрия. Встряхивают содержимое пробирки и осторожно по стенке (!) наслаивают 1-2 мл концентрированного раствора аммиака.
Принцип метода. Метод основан на взаимодействии Fe3+ с енольной формой АУК с образованием комплекса красно-фиолетового цвета.
Реакция не специфична. Креатин мочи с нитропруссидом натрия дает аналогичное окрашивание, но в этом случае при добавлении концентрированной уксусной кислоты жидкость не окрашивается в вишневый цвет.
Исследуемый материал и реактивы
1. Моча. 2. Раствор хлорида железа (III) (5%).
Ход работы
К 5 капелям мочи прибавляют по каплям 5% раствор хлорида железа (III); при этом выпадает осадок фосфатов в форме фосфата железа (III). При наличии АУК от дальнейшего прибавления хлорида железа (III) появляется вишнево-красное окрашивание. При стоянии окраска бледнеет вследствие самопроизвольного декарбоксилирования АУК.
Индикан – это калиевая или натриевая соль индоксилсерной кислоты, которая образуется в печени в процессе обезвреживания токсичных соединений всасывающихся в кровь при гниении аминокислот в кишечнике.
Индикан в нормальной моче содержится в незначительных количествах (за сутки выделяется около 0,01г). При избытке индикана моча приобретает коричневый цвет. Увеличение содержания индикана в моче наблюдается при ретенционных азотемиях, нарушениях функции кишечника (запоры, заворот кишечника, наличия большого количества гнилостных бактерий), в послеоперационный период у больных, оперированных по поводу «острого живота», при перитонитах.
Принцип метода. Метод основан на превращении индикана в индоксил после гидролиза эфирной связи в присутствии концентрированных кислот с последующим окислением индоксила хлоридом железа (III) или перманганатом калия с образованием синего индиго.
Исследуемый материал и реактивы
1. Моча. 2. Раствор ацетата свинца (100 г/л). 3. Раствор хлорида железа (0,4 г железа (III) в 100 мл концентрированной соляной кислоте). 4. Хлороформ. 5. Раствор тиосульфата натрия (200 г/л). 6. Соляная кислота (концентрированная). 7. Раствор перманганата калия (1%). 8. Фильтры.
Ход работы
1. К 4 мл мочи прибавляют 0,4 мл раствора ацетата свинца для осаждения желчных пигментов, солей и других веществ, мешающих реакции. Фильтруют. 1-2 мл фильтрата смешивают с равным объемом реактива, содержащего 0,4 г хлорида железа (III) в 100 мл концентрированной соляной кислоты, прибавляют 0,5-1 мл хлороформа и осторожно перемешивают. Нижний слой хлороформа окрашивается в синий или красный цвет, не исчезающий при добавлении раствора тиосульфата натрия.
2. К 20 каплям мочи добавляют равный объем концентрированной соляной кислоты, 1-2 капли 1% раствора перманганата калия и 2-3 капли хлороформа. Порибирку закрывают пробкой и в течение 1-2 минут осторожно опрокидывают. В присутствии индикана нижний хлороформный слой окрашивается в голубой или синий цвет.
Указания к оформлению лабораторной работы
Результаты качественных реакций на патологические компоненты мочи представьте в виде таблицы:
|
Название патологического компонента |
Название реакции |
Принцип реакции |
Полученный результат |
Вывод |
Контрольные вопросы
После нагревания немедленно гасите пламя.
Взятие крови следует проводить в резиновых перчатках, соблюдая правила асептики, обрабатывая перчатки 700 спиртом перед каждым взятием. Перед проколом кожа пальца обследуемого обрабатывается стерильным тампоном (шариком из ваты), смоченным 700 спиртом. После взятия крови к раневой поверхности прикладывается новый стерильный тампон, смоченный 700 спиртом.
Извлечение скарификаторов проводится только с помощью пинцета, хранящегося в растворе дезсредства.
Стерильные тампоны хранятся в упаковке из бумаги, указанной в ОСТ 42-21-2-85, в количестве не более 20 штук.
Стерильные лабораторные инструменты хранятся в той же упаковке, в которой проводилась их стерилизация.
Взятие крови для гематологического исследования может осуществляться:
I вариант. После прокола пальца несколько капель крови (не менее 3-4) спускают на индивидуальное предметное (часовое) стекло, перемешивают и используют для работы.
II вариант. Кровь набирается в индивидуальные, стерильные, предварительно выверенные капилляры объёмом 20 мкл и капилляра Панченко непосредственно с поверхности кожи проколотого индивидуальным копьём пальца пациента.
III вариант. Кровь в количестве 40 мкл набирают стерильным индивидуальным капилляром Панченко, предварительно смоченным цитратом в соотношении цитрата и крови 1:4 по объёму.
IV вариант. После прокола кожи пальца, 6-8 капель крови спускают в пластиковую пробирку, в которую предварительно внесено небольшое (на кончике глазной лопаточки) количество трилона Б. Пробирку с кровью тщательно перемешивают, вращая её между ладонями. Разлив крови пипетками по пробиркам осуществляется в лаборатории. (Инструкции по мерам профилактики распространения инфекционных заболеваний при работе в клинико-диагностических лабораториях лечебных и профилактических учреждений. Утверждена МЗ СССР от 17.01.91г.).
Таблица 1
|
Множитель |
Приставка |
Обозначение приставки |
Множитель |
Приставка |
Обозначение приставки |
|
1018 |
экза |
э |
10-1 |
деци |
д |
|
1015 |
пета |
п |
10-2 |
санти |
с |
|
1012 |
пера |
Т |
10-3 |
милли |
м |
|
109 |
гига |
Г |
10-6 |
микро |
мк |
|
106 |
мега |
М |
10-9 |
нано |
н |
|
103 |
кило |
к |
10-12 |
пико |
п |
|
102 |
гекто |
г |
10-15 |
фемпто |
Ф |
|
101 |
дека |
дк |
10-18 |
атто |
а |
Под колориметрией понимают метод определения низких концентраций веществ в окрашенных растворах по интенсивности окраски. В фотоколориметре интенсивность окраски оценивается по величине светопропускания. Концентрацию вещества в растворе определяют либо с помощью калибровочной кривой, либо по сравнению с оптической плотностью (экстинкцией) раствора с известной концентрацией.
Построение калибровочных кривых.
Количество вещества в пробе определяют с помощью калибровочного графика, отражающего зависимость между концентрацией раствора и его оптической плотностью. Для получения калибровочного графика готовят несколько растворов определяемого в биологическом объекте вещества с различными известными концентрациями, но пределах концентраций, в которых это вещество содержится в крови (моче), и с учетом изменения его содержания в сторону повышения или снижения при патологических состояниях. Нулевое значение устанавливают по раствору, приготовленному не содержащему исследуемое вещество,
На миллиметровой бумаге откладывают по оси абсцисс величины концентрации белка в растворе, по оси ординат - соответствующее значение оптической плотности растворов. Проводят прямую через найденные точки и , пользуясь этим графиком находят концентрацию белка в сыворотке.
Подготовка фотоколориметра к работе.
1.1. Колориметр включить в сеть за 15 минут до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто.
1.2. Ввести необходимый по роду измерений цветной фильтр.
1.3. Установить минимальную чувствительность колориметра. Для этого ручку ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ установить в положение «1», ручку УСТАНОВКА 100 ГРУБО в крайнее левое положение. При измерении со светофильтрами 315, 364, 400, 440, 490, 540 нм отмеченными на лицевой панели колориметра черным цветом, ручку ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ устанавливать в одно из положений «1», «2», «3», отмеченных на лицевой панели также черным цветом. При измерении со светофильтрами 590, 670, 759, 870, 980 нм , отмеченными на лицевой панели колориметра красным цветом, ручку ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ устанавливать в одно из положений «1», «2», «3», отмеченных на лицевой панели красным цветом.
1.4. Рабочие поверхности кювет должны перед каждым измерением тщательно протираться спиртово-эфирной смесью. При установке кювет в кюветодержатели нельзя касаться пальцами рабочих участков поверхностей (ниже уровня жидкости в кювете). Наливать жидкость в кюветы до метки на боковой стенке кюветы.
После смены светофильтра и при выдержке колориметра при открытой крышке кюветного отделения в течение длительного времени (более 5 мин) измерения начинать после пятиминутной засветки фотоприемника.
1.5. После завершения работ на колориметре до его выключения ручку ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ установить в положение «1», обозначенное красным цветом, а ручку УСТАНОВКА 100 ГРУБО – в крайнее левое положение, и только после этого выключить тумблер СЕТЬ колориметра.
Измерение коэффициента пропускания.
2.1. В световой пучок поместить кювету с растворителем или контрольным раствором, по отношению к которому производятся измерения.
2.2.Закрыть крышку кюветного отделения.
2.3.Ручками ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и УСТАНОВКА 100 ГРУБО и ТОЧНО установить отсчет 0 по шкале колориметра. Ручка ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ может находиться в одном из трех положений: «1», «2» или «3».
2.4. Затем поворотом ручки кювету с растворителем или контрольным раствором заменить кюветой с исследуемым раствором.
2.5. Снять отсчет по шкале колориметра, соответствующий коэффициенту пропускания исследуемого раствора в единицах оптической плотности.
В клинических лабораториях наиболее распространены электрофоретические методы исследования белкового спектра плазмы (сыворотки) крови.
Принцип метода. Метод основан на том, что под влиянием постоянного электрического поля белки сыворотки, обладающие электрическим зарядом, движутся по смоченной буферным раствором бумаге со скоростью, зависящей от величины заряда и молекулярного веса частиц. Вследствие этого белки сыворотки разделяются обычно на 5–7 фракций: альбумины и глобулины α1, α2, β и γ, содержание которых определяется фотометрически. Относительное содержание белковых фракций в сыворотке крови здорового человека выражается следующими цифрами: Альбумины – 52–65%; глобулины – 29–54%: α1-глобулины – 2-5%, α2-глобулины – 7-13%, β-глобулины – 8-14%, γ-глобулины – 12-22%.
Исследуемый материал и реактивы
1. Сыворотка крови. 2. Буферный раствор. 3. Хроматографическая бумага. 4. Краситель амидо черный 10 В. 5. Раствор уксусной кислоты (2%). 6. Раствор гидроксида натрия (0,1н).
Ход работы
1. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови.
Полоска хроматографической бумаги пропитывается буферным раствором, концы полоски опускаются в кюветы с буферным раствором, а в кюветы помещают электроды — катод и анод. В средней трети бумажной полоски поперек на полосу на линию старта наносят исследуемую сыворотку и включают электрический ток. Через определенное время ток выключают и бумажку подсушивают при 900С (при этом белки подвергаются денатурации и фиксируются на бумаге). Далее фракции нужно проявить.
2. Окраска электрофореграмм.
Фиксированные полосы помещают в кювету с краской (амидо черный 10 В) и оставляют там на 15–20 минут. Для удаления избытка краски бумажные полоски переносят в кювету с 2% раствором уксусной кислоты. Через 5–10 минут кислоту сливают и полоски заливают чистым раствором уксусной кислоты. В результате такой обработки синие пятна, соответствующие различным фракциям белков, отчетливо видны на белом фоне. Полученные электрофореграммы сушат на воздухе.
3. Количественная оценка электрофореграмм.
В 5 пробирок наливают из бюретки по 5мл 0,1н. NаОН. Вырезают ножницами участки электрофореграммы, соответствующие каждой фракции, помещают в пронумерованные пробирки со щелочью. В качестве контроля берут неокрашенный участок бумажной полоски шириной 3–10 мм. Пробирки осторожно встряхивают и оставляют на 30–60 минут для полного извлечения краски из бумаги. Затем определяют оптическую плотность каждого раствора на фотоэлектроколориметре (кювета 10 мм, красный светофильтр с длиной волны = 670 нм). Зная оптические плотности растворов, соответствующие каждой фракции, вычисляют сумму оптических плотностей всех фракций и выражают относительное содержание белка в каждой фракции. Например:
Еальбум = , Еα1-глобул = , Еα2-глобул = , Еβ-глобул = , Еγ-глобул = , Σ = .
% = , % = , % = , % = , % = .
Углубленное изучение углеводного обмена производится методом сахарной нагрузки, при котором определение глюкозы в крови проводят через определенные промежутки времени. Эти данные являются более ценными, чем однократное определение содержания глюкозы в крови. Они позволяют выявить скрытые формы диабета и нарушение гликогенобразовательной функции печени.
Показания для проведения теста на толерантность к глюкозе:
▪ Неоднозначные результаты однократных анализов крови натощак.
▪ Глюкозурия: панкреатическая и внепанкреатическая (первая связана с недостатком секреции или недостаточностью самого инсулина; внепанкреатическая глюкозурия развивается при поражении других органов внутренней секреции, ЦНС, при эмоциональном стрессе, заболеваниях почек, печени, избытке углеводов в диете, при беременности).
▪ Клинические признаки сахарного диабета или его осложнений при нормальной концентрации глюкозы крови натощак (скрытые формы диабета).
Исследуемый материал и реактивы
1. Кровь. 2. Стандартный раствор глюкозы. 3. Раствор хлорида натрия (0,9%). 4. Раствор сернокислого цинка (5%). 5. Раствор едкого натра (0,3н). 6. Рабочий раствор фермента (глюкозооксидаза). 7. Дистиллированная вода. 8. Глюкоза (кристаллическая). 9. Кипяченая вода. 10. Скарификаторы. 11. Спирт. 12. Вата.
Ход работы
Утром натощак у пациента берут кровь из пальца и определяют в ней содержание глюкозы. После этого пациенту дают выпить 50 или 100г глюкозы в 200 мл теплой кипяченой воды (из расчета 1 г глюкозы на 1кг массы тела) в течение не более 5 мин. Глюкозу можно заменить сахарозой (из расчета 1,5г сахарозы на 1кг массы тела). Затем повторно исследуют содержание глюкозы в крови каждые 30 мин (иногда через 15 мин) в течение 2,5 ч (если было принято 50г глюкозы), в течение 3 ч (если было принято 100г глюкозы). У детей сахарную нагрузку проводят так же как у взрослых, изменяя только дозы вводимой глюкозы. На основании полученных данных строят график, откладывая на оси ординат содержание глюкозы в крови (в г/л), а на оси абсцисс – время взятия пробы (в мин или ч.).
Анализ гликемических кривых
У здорового человека уже через 15 мин после приема глюкозы наблюдается увеличение ее содержания в крови, которое между 30-й и 60-й минутами достигает максимального значения. Затем начинается снижение и к 120-й минуте содержание глюкоз достигает исходного уровня, отмечавшегося натощак, или с небольшими отклонениями в сторону как повышения, и так и снижения. Через 3 часа содержание глюкозы в крови достигает исходной цифры. Гликемические кривые отличаются от нормы (рис.1) при сахарном диабете (чрезвычайно высокая вершина сахарной кривой; повышенный уровень глюкозы остается через 3ч), аддисоновой болезни (низкие гипогликемические кривые до и после нагрузки, небольшой пик), поражении паренхимы печени, гипофункции щитовидной железы, тяжелых анемиях, заболеваниях центральной нервной системы, инфекционных болезнях токсических состояниях.
Kлинико-диагностическое значение оценки гликемических кривых
У больных с разными формами диабета нарастание гликемической кривой происходит медленнее, достигая через 60–150 мин. значительной величины (более чем в 1,8 раза превышая исходное значение), в большинстве случаев отмечается глюкозурия. Чем тяжелее заболевание, тем позже достигается максимум гликемии и тем он выше. Понижение кривой происходит очень медленно, чаще оно растягивается на 3–4 ч.
Заболеваниям щитовидной железы, связанным с ее гиперфункцией, свойственны гликемические кривые с более быстрым, чем в норме, подъемом, что, возможно, вызвано более интенсивным обменом веществ и возбуждением симпатического отдела вегетативной нервной системы.
Для больных с аденомой островков Лангерганса, гипотиреозом (микседемой), болезнью Аддисона характерен низкий исходным уровень кривой, низкая ее вершина и высокий постгликемический коэффициент. При некоторых тяжелых заболеваниях (энцефалит и др.) глюкоза может появляться в моче в результате ренальной глюкозурии.
Желудочный сок является секретом желез слизистой оболочки желудка, представляет собой бесцветную жидкость с сильнокислой реакцией (рН=1,5-2,5), объемом 1,5-2 л в сутки. Желудочный сок сложен по составу – состоит из различных органических и неорганических веществ, среди которых особое место занимают соляная кислота и белки-ферменты, а также вода (до 99,2%). Переваривание белков во многом зависит от кислотности желудочного сока.
Определение кислотности желудочного сока и наличие молочной кислоты в нем имеет важное диагностическое значение для определения желудочно-кишечных заболеваний. При патологии кислотность желудочного сока может быть нулевой, пониженной или повышенной. Отсутствие соляной кислоты и пепсина (ахилия) часто наблюдается при злокачественных новообразованиях желудка. Пониженная кислотность (гипохлоргидрия) встречается при гипоацидном гастрите, иногда при язвенной болезни желудка. Повышенная кислотность (гиперхлоргидрия) имеет место при гиперацидном гастрите и часто сопровождается язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки. При определении кислотности различают общую кислотность (сумма всех кислореагирующих веществ), общую соляную кислоту: свободную и связанную.
Принцип метода. Метод основан на определении кислотных веществ желудочного сока путем титрования их раствором гидроксида натрия с использованием двух различных индикаторов: n-диметиаминоазобензола (зона перехода окраски при рН=2,3-4,2) и фенолфталеина (зона перехода окраски рН=8,2-10,0). По изменению окраски (от красной к оранжевой) индикатора n-диметиаминоазобензола определяется свободная соляная кислота, а по переходу окраски фенолфталеина (от бесцветной к розовой) – общая кислотность желудочного сока.
В норме общая кислотность для взрослого человека составляет 40 – 60 ммоль/л, у новорожденных – 2,8 ммоль/л, у детей от 1 месяца до 1 года – 4 – 20 ммоль/л.
Содержание свободной соляной кислоты в норме составляет 20 – 40 ммоль/л (у новорожденных – 0,5 ммоль/л).
Определение общей кислотности, общей соляной кислоты, свободной соляной кислоты и связанной соляной кислоты проводится в одной порции желудочного сока.
Исследуемый материал и реактивы
1. Желудочный сок. 2. Раствор диметиламиноазобензола. 3. Фенолфталеин. 4. Раствор гидроксида натрия (0,1н).
Ход работы
Отмеривают пипеткой в колбочку 10 мл желудочного сока, добавляют 1 каплю диметиламиноазобензола и 2 капли фенолфталеина. При наличии в желудочном соке свободной соляной кислоты он окрашивается в красный цвет с розовым оттенком, при ее отсутствии сразу появляется оранжевая окраска. Титруют свободную соляную кислоту 0,1н NaOH из микробюретки до появления оранжевого окрашивания и результат записывают (1-ая отметка). Не добавляя щелочи в бюретку, продолжают титрование до появления лимонно-желтого цвета и результат записывают (2-ая отметка от 0). Продолжают титрование до появления розового окрашивания (3-я отметка от 0). 1-ая отметка соответствует количеству свободной соляной кислоты (см. расчет), 2-я – используется для определения связанной соляной кислоты, а последняя отметка соответствует общей кислотности.
Расчет. Если на титрование 10 мл желудочного сока израсходовано 3,0 мл 0,1н раствора NaOH, то количество свободной соляной кислоты равно:
Х = 3,0*1000 * 0,1 / 10 = 30 ммоль/л.
где 3,0 – количество 0,1н раствора NaOH, мл;
10 – количество желудочного сока, взятого для титрования, мл;
0,1 – количество мг–экв. щелочи в 1 мл 0,1н раствора, ммоль;
1000 – пересчет на 1литр.
Комбинированными тест-полосками можно определить в моче пять важных показателей: рН, белок, глюкозу, кетоновые тела и кровь.
Экспресс-методы – это лабораторные методы диагностики, применяемые врачом у постели больного без лабораторного оборудования. Эти методы - простые и быстрые, но не достаточно прочные. Наиболее часто применяются экспресс-методы определения сахара и кетоновых тел в моче, что бывает необходимым для диагностики сахарного диабета, особенно при бессознательном состоянии больных.
Xод работы
Берут нецентрифугированную мочу, хорошо перемешанную. Тест полоску всю опускают в сосуд с мочой на 1с. Избыток мочи снимают с полоски путем соприкосновения ее со стенкой сосуда. Через 30-60 с. окраску сравнивают со стандартной шкалой. Изменение окраски, которое наступило только на краях индикаторной зоны или только через две мин., не имеет диагностического значения. Моча не должна перед исследованием стоять больше 4 ч при комнатной температуре.
Белок. При наличии белка наблюдается изменение цвета тест-полоски от желтого к зеленому (0,3; 1,0, 5,0 г/л) ; патологическая протеинурия при содержании белка более 0,25 г/л.
Глюкоза. Положительная реакция от оранжевого до коричневого цвета отмечается через 60с (5,55; 16,65; 55,55 ммоль/л). Окраска появляется даже при небольшой концентрации глюкозы (2,2 ммоль/л).
Кетоновые тела. Положительная реакция от розового до фиолетового цвета (+, ++, +++). Чувствительность тест-полоски на ацетоуксусную кислоту выше, чем на ацетон; на бета-гидроксимасляную кислоту тест-полоска не реагирует. Граница обнаружения: 100 мг/л для ацетоуксусной кислоты и от 400 мг/л для ацетона
Кровь. Для эритроцитов и гемоглобина дается отдельная шкала. Интактные эритроциты видны в виде отдельных сидящих зеленых точек на желтом фоне (5-10, 50, 250 эрит/мкл). Равномерная зеленая окраска обозначает свободный гемоглобин или гемолизированные эритроциты или миоглобин (50, 250 эрит/мкл). При малых примесях крови в моче или при более длительном смачивании полосок реакция может наступить уже через 1-2 мин.
Источники ошибок. Ошибочные результаты получаются после приема больших количеств витамина С и некоторых медикаментов.
PAGE 61
EMBED Equation.3
О
//
\\
О
ОН
/
//
\
ОН
+
EMBED Equation.3
+
\
ОН
Н
/
//
\\
О
О
//
О
//
\\
О
+
О–
/
N
\\
O
+
NО2
EMBED Equation.3
EMBED Equation.3
H2O + NaBr+2NaOH
CH2-CH-COOH
/
NH2
N
H
+
О О
C–C
Н ОН
+
N
H
COOH-CH-CH2
/
NH2
-H2O
COOH
/
CH-H2N
CH
/
COOH
N
H
N
H
HOOC
/
H2N-CH
Продукт конденсации окисленного Arg с α-нафтолом розово-красного цвета
α-нафтол
аргинин
+
C=NH
/
NH
/
(CH2)3
/
CH-NH2
/
COOH
N
O
Br
O
Br
3 NaBrO
OH
2
+
NH2
/
C=NH
/
NH
/
(CH2)3
/
CH-NH2
/
COOH
ОН
+
α-нафтол
ОН
α-нафтол
О
//
СН
/
О
/
СН2ОН
гидроксиметилфурфурол
-Н2О; -2Н+
О
ОН
С
/
СН2ОН
О
продукт конденсации
n
темный пигмент, родственный меланину
О
О
О
О
N
H
H N
галахром (красный пигмент)
CH2
CH–COOH
HО
H3C
H3C
CH
CH3
(CH2)3–СН
CH3
CH3
H2SO4
– H2O
холестерол
NH
C=O
H3C
H3C
CH
CH3
(CH2)3–СН
CH3
CH3
холестерилен
+FeCl3
ОН
ОН-СН-СН2-NH-CH3
2
ОН
адреналин
Fe
O
O
O
O
СН-СН2-NH-CH3
/
ОН
CH3-NH-СН2-СН
/
ОН
окрашенный комплекс адреналина с железом
N
H
О
О
– Н2О
+1/2 О2
дофа-хинон
СН2
/
СН-СООН
/
NH2
О
О
диоксифенилаланин (ДОФА)
тирозин
тирозиназа
+1/2 О2
СН2
/
СН-СООН
/
NH2
НО
НО
тирозиназа
+1/2 О2
СН2
/
СН-СООН
/
NH2
НО
– –
NH3
EMBED Equation.3
+
NH3 + CO2
+
\
ОН
ОН
/
//
\\
О
О
//
NH3 +
+
\
ОН
Н
/
//
\\
О
О
//
-3H2О
Н+
Сu
О
//
-2H2O
+2НNO3
+NаOН
О2N
EMBED Equation.3
О
О2N
NО2
EMBED Equation.3
ОН
/
-2H2O
О
//
EMBED Equation.3
ОNa
/
N=О
О2N