Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА № 12
ТЕМА: Иммунитет и естественная резистентность организма к инфекции. Оценка общего реактивного потенциала организма. Факторы резистентности, методы их выявления.
МОТИВАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА: Иммунитет и естественная резистентность организма к инфекции нуждается в детальном и поэтапном изучении. Поэтому, важное значение имеют материальная основа и функции защитных систем.
Естественная резистентность организма во многом определяется состоянием его различных анатомо-физиологических механизмов и находится в тесном взаимодействии с высоко специализированной иммунобиологической системой. Она является первой, а в некоторых случаях единственной, линией обороны от инфекции, в единстве с иммунной системой определяет напряженность сопротивление ей инфекции. Иммунитет - это комплексная система защитных реакций, но первой принимает на себя атаку возбудителей естественная резистентность и её факторы. От неё зависит начало заболевания.
УЧЕБНАЯ ЦЕЛЬ:
Общая: дать представление о видах иммунитета, системе естественной резистентности организма к инфекции, её механизмах.
Конкретная: научить определению факторов неспецифической защиты организма от инфекции
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ И ВВОДНОГО КОНТРОЛЯ ЗНАНИЙ
1.Виды иммунитета макроорганизма к возбудителям инфекционных заболеваний, их классификация: врождённый и приобретённый, естественный и искусственный, активный и пассивный иммунитет, стерильный и нестерильный.
2. Видовой иммунитет и его варианты: абсолютный, относительный, временный (иммунитет новорождённых).
3. Классификация факторов естественной резистентности к инфекциям.
4. Физиологический (барьерная функция покровов, антимикробное действие секретов, выделительная система, антагонистическое действие нормальной микрофлоры, адсорбционная функция тканей, фагоцитоз, антимикробные факторы, лизоцим, бета лизины, комплемент и др.) и патофизиологические (стресс) механизмы неспецифической резистентности.
5. Фагоцитоз. Макро- и микрофаги, их функциональные отличия. Механизмы, определение, этапы фагоцитоза, его оценка (показатели). Завершённый и незавершённый фагоцитоз.
6. Комплементарная система, её состав. Классический и альтернативный пути её активации, функции, определение.
7. Бета-лизины и общая бактерицидность, назначение, определение.
8. Лизоцим, его продукция, действие, определение.
9. Интерферон, его продуценты, функции, определение.
10. Роль персистенции микробов в регуляции защиты от инфекции, факторы, их определение.
11. Значение неспецифической резистентности в подготовке специфической иммунной защиты организма (переработка антигенной информации микробов) и её презентация.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ С ПОЛНЫМ РЕГЛАМЕНТОМ ПРОТОКОЛА ЗАНЯТИЯ
|
№ |
Наименование учебного элемента (задания) |
Методическое решение |
Регламент протокола |
|
1. |
Составить классификацию видов иммунитета |
Рекомендуемая литература |
Записать в протокол |
|
2. |
Составить классификацию факторов естественной резистентности |
Рекомендуемая литература |
Записать в протокол |
|
3. |
Поставить опыт фагоцитоза и определить ФП, ФЧ, ОФИ, составить схему оценки завершённости фагоцитоза |
Приложение 1 |
Записать в протокол |
|
4. |
Изучить технику постановки реакций по определению титра лизоцима, комплемента, бета-лизинов, общей бактерицидности и пути активации комплемента |
Приложение 6 |
Заполнить таблицу и записать в протокол |
|
5. |
Используя демонстрационный материал, установить титр всех факторов |
Приложение 2, 3, 4, 5 |
Записать в протокол |
|
6. |
Тестовый контроль по теме |
Приложение 7 |
Приложение 1
ОПЫТ ФАГОЦИТОЗА
/по Алексеевой О.Г., Волковой А.П., 1966/
К 0,1 мл З % стерильного раствора антикоагулянта лимоннокислого натрия добавить 0.2 мл крови больного и 0,1 мл 2 млрд взвеси суточной культуры золотистого стафилококка (S.aureus №209P). Смесь тщательно перемешать и инкубировать при 37 С0 30-40 минут. Из кровяно-микробной взвеси приготовить мазок, высушить на воздухе, зафиксировать, окрасить по Романовскому-Гимза в модификации Филипсона: на высохший препарат нанести 11 капель спиртового раствора краски Романовского (1 часть краски и З части этилового спирта), окрашивать до 30 минут, затем препарат тщательно промыть водой, высушить. Микроскопировать с иммерсией.
В мазке следует определить:
1. Интенсивность фагоцитоза — процент фагоцитирующих лейкоцитов в общей их массе (фагоцитарный показатель - ФП).
2. Фагоцитарное число — ФЧ (среднее число поглощённых микробных клеток в одном фагоците).
3. Опсонофагоцитарный индекс по формуле:
ОФИ должен быть больше единицы, что говорит о накоплении антител — опсонинов, помощников фагоцитов.
4. ОФИ можно оценить также по уровню и динамике ФЧ по таблице:
Таблица 1
Определение опсонофагоцитарного показателя по методу и таблице
Шриттер — Мурсаловой
|
Количество микробов, фагоцитированных одним фагоцитом (ФИ) |
Оценка фагоцитоза по выраженности |
Количество нейтрофилов с таким фагоцитозом |
ОФИ |
|
0 1-20 21-40 41 и более |
0 + /1/ ++ /2/ +++ /3/ |
0 10 10 5 |
0 10 20 15 |
|
ИТОГО: 25 45 |
ОФИ, равный 10-24, характеризует слабоположительную реакцию, 25-49 — ясно выраженную, 50-75 резко положительную.
Кроме того, в отношении ОФИ по отношению к возбудителям некоторых инфекций (например, к бруцеллам) есть специальная оценочная шкала
5. а) Оценка завершённости фагоцитарной реакции по индексу завершённости.
Кровяно — микробную взвесь инкубируют при +37Сº 2 часа. После этого из неё готовят мазок, высушивают и отдельно не фиксируют, окрашивают сначала раствором прочного зелёного 20 минут и докрашивают 0,1 % водным раствором азура П.
При этом жизнеспособные клетки окрашиваются в сине-сиреневый цвет.
Определяют ИЗФ – индекс завершённости фагоцитоза рассчитывается по формуле:
.
ИЗФ = Е 30 мин , где
Е 2 часа
Е 30 мин. – общее количество микробных клеток в 100 фагоцитах через 30 минут;
Е 2 часа – общее количество микробных клеток в 100 фагоцитах через 2 часа, то есть после окончания фагоцитоза.
Завершённым должен быть фагоцитоз с не менее 2/3 фагоцитов (~60 % и >).
б) Оценка завершенности фагоцитоза ускоренным методом Мотавкиной Н.С.,
Ховриной М.П. (1962).
Она осуществляется сразу после окончания опыта путем обработки микробо-кровяной (лейкоцитарной) взвеси раствором флюорохрома - акридина оранжевого 1:1000. Мёртвые особи под люминисцентным микроскопом оранжево-жёлтые, живые – зелёные. Расчёт завершённости делают по проценту фагоцитов с поглощёнными микроробами.
Приложение 2
а) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ЛИЗОЦИМА КЛАССИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
По лизису индикаторной культуры чувствительного микрококка M. lysodeikticus
|
Ингредиенты |
Разведения сыворотки, слюны |
|||||||
|
1:10 |
1:20 |
1:40 |
1:80 |
1:160 |
1:320 |
1:640 |
К. к. |
|
|
Физиологический 0,85% раствор поваренной соли |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
Субстрат (сыворотка) испытуемый |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 до 1 % р-р |
|
Тест-культура микрококка (1 млрд мт в 1 мл) в каплях |
2 к. |
2 к. |
2 к. |
2 к. |
2 к. |
2 к. |
2 к. |
2 к. |
|
Инкубировать 3 часа при +37С° |
||||||||
|
Учет результатов |
Лизис тест-культуры |
Отсутствие лизиса |
Титр лизоцима в исследуемом субстрате равен 1:40 (максимальное разведение, или минимальное количество, давшее лизис культуры и просветление).
б) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ЛИЗОЦИМА МИКРОМЕТОДОМ
по Н.С. Мотавкиной, Б.М. Ковалеву, А.С. Шаронову (1979)
В камеру, состоящую из 2 фотопластин и ограничивающей прокладки между ними, внести смесь расплавленной и остуженной до +45С° 2% агарозы и культуры микрококка в концентрации 500 тыс. мт/мл. После застывания агарового субстрата, верхнюю пластинку снимают скользящим движением и с помощью пробойника делают лунки, вносят в одну из них испытуемое вещество, в другую - раствор кристаллического лизоцима. Последний служит контролем и вносится в разных концентрациях в равных объемах. Инкубировать 3 часа при +37С° во влажной камере.
По лизису тест-микроба в присутствии кристаллического лизоцима в контроле строится график зависимости диаметра зоны лизиса от концентрации этого вещества. Диаметр лизиса опытных проб сопоставляют с показателями графика и определяют в них активность (титр) лизоцима.
Приложение 3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА КОМПЛЕМЕНТА ПО 100% ГЕМОЛИЗУ
ГЕМОСИСТЕМЫ
Приготовить гемосистему:
а) приготовить 3% взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе;
б) гемолитическую сыворотку развести до рабочего титра, указанного на этикетке;
в) приготовить гемолитическую систему, смешав равные объемы 3% взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки;
г) инкубировать при +37С° 30 минут;
д) определение титра комплемента осуществить по схеме:
|
Ингредиенты |
Номера пробирок и их содержимого |
|||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
К |
|
|
Сыворотка крови больного 1:10 в мл |
0,1 |
0,15 |
0,2 |
0,25 |
0,3 |
0,35 |
0,4 |
0,45 |
0,5 |
- |
|
Физиологический раствор 0,85% в мл |
0,4 |
0,35 |
0,3 |
0,25 |
0,2 |
0,15 |
0,1 |
0,05 |
- |
0,5 |
|
Гемолитическая система в мл |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
|
Инкубировать при +37 С° 30-40 минут |
||||||||||
|
Учет результатов |
Отсутствие гемолиза |
Гемолиз |
Нет гемолиза |
Титр комплемента - 0,3 мл (минимальное количество, дающее гемолиз гемосистемы).
Это количество можно представить в гемолитических единицах.
Пример: Расчет в гемолитических единицах
0,2 мл - 1 гем.ед.
1,0 мл – х
С учетом разведения сыворотки 1: 10 титр комплемента в гемолитических единицах будет равен: 5 х 10 = 50 гем. ед.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА КОМПЛЕМЕНТА МИКРОМЕТОДОМ
/ Н. С. Мотавкина, Б. М. Ковалев, А. С. Шаронов, 1989/
Приготовить равные объемы гемолитической системы 2% и 2% расплавленной и остуженной до +45С° агарозы. Смесь залить в камеру, приготовлен ную из двух фотопластин и прокладки между ними. После застывания геля и осторожного удаления верхней пластины сделать в нем с помощью гель-пробойника луноч ки. В них внести испытуемые и контрольные сыворотки, содержащие комплемент крови, инкубировать во влажной камере 2 часа при 37º С. Активность комплемента определяют по формуле:
, где
Со – активность элемента в опытной сыворотке,
До - диаметр зоны лизиса вокруг опытной сыворотки,
Дк – диаметр зоны лизиса вокруг контрольной сыворотки,
Ск - активность комплемента в контрольной сыворотке
Приложение 4
а) ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕТА- ЛИЗИНОВ МИКРОМЕТОДОМ
/по Н.С. Мотавкиной, Б.М. Ковалеву, А.С. Шаронову,1989/
Камера заполняется по вышеприведенному описанию смесью расплавленного и остуженного до +45С° 2% раствора агарозы и тест - культуры Bac. subtilis (сенная палочка) в концентрации 10 тыс. м.т./мл. После застывания в геле делают микролунки, куда вносят исследуемый субстрат и соответствующие контроли. Пластины инкубируют при +37 С° 18-24 часа. Расчет активности бета-лизинов проводят по формуле, описанной для комплемента.
б) ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕТА-ЛИЗИНОВ КЛАССИЧЕСКИМ МЕТОДОМ СЕРИЙНЫХ
РАЗВЕДЕНИЙ
|
Ингредиенты |
1:10 |
1:20 |
1:40 |
1:80 |
1:160 |
1:320 |
К.к. |
К.с. |
|
МПБ |
1,8 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
- |
- |
|
Сыворотка крови больного |
0,2 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
Тест-микроб Bac. subtilis 600 млн. мт/ в каплях |
2к |
2к |
2к |
2к |
2к |
2к |
2к |
- |
|
Инкубировать при +37 С° 18 часов |
||||||||
|
Учет результатов по лизису тест - культуры |
ПОЛНЫЙ ЛИЗИС |
Нет лизиса |
Рост тест-культуры |
Нет роста |
Титр бета-лизинов - 1:160 (максимальное разведение или минимальное количество, дающее лизис) тест – культуры Bac. subtilis (сенная палочка).
Приложение 5
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ
Определенный объем сыворотки крови смешивают с тест – культурой S.flexneri и E. coli (опыт). В контрольную пробу в таком же объеме вместо сыворотки крови вносят стерильный 0,85 % раствор поваренной соли и одну из тест – культур.
Посев инкубируют в термостате при +37С º. Последующая оценка бактерицидной активности может быть определена одним из следующих способов:
а) Путем высева из опытных и контрольной проб на чашки с МПА и инкубирования последней при +37С° 18-24 час., подсчетом колоний на опытных и контрольных чашках с их сопоставлением.
б) Методом фотонефелометрической оценки бактерицидной активности сыворотки крови (Смирнова, Кузьмина, 1966), при котором сопоставляются показатели оптической плотности опытных и контрольных проб и определяется бактерицидная активность в % по формуле:
в) Путём учёта просветления в опытных пробах в результате проявления бактерицидности.
Приложение 6
ПУТИ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА
Многочисленные функции комплемента могут быть реализованы только после его активации, которая осуществляется двумя путями: классическим (каскадным) способом и альтернативным способом.
Этапы классического пути активации комплемента
1. Начало - связывание антител с клеточной поверхностью микроорганизма, чужеродной клетки, ткани и т.д.
2. Распознавание антител и связывание их с 1 компонентом комплемента (С'1).
З. Прикрепление С'2 компонента к этому сессильному (прикрепленному) антителу.
4. Последовательная активация С'1, С'4, С'2 компонентов.
5. Включение в процесс С'3, С'5, С'6, С'7 компонентов. Их активация сопровождается привлечением лейкоцитов к мембране связанной клетки.
б. При участии С'8 С'9, лейкоцитов происходит лизис клетки (цитолиз).
Этапы альтернативного пути активации комплемента
1. Инициатор процесса активации комплемента здесь не антитело. Начинают процесс активации С' полисахариды, эндотоксины микробов, они активируют пропердин.
2. У пропердина активируются факторы Д и В (аналоги С'1, С'2 компонентов комплемента).
З. Активация центрального звена комплемента - С'3.
4. От С'3 по принципу обратной связи - активация Д, В компонентов пропердина.
5. Импульс от Д, В компонентов и С'3 далее идет по цепи к С'5, С'6, С'7, затем — С'8 С'9, что завершается лизисом клетки.
Приложение 7
Тестовый контроль усвоения темы
Выберите правильный ответ:
1. Лизоцим - это фермент, расщепляющий:
а) мурамилпептид
б) лизин
2. Для оценки уровня неспецифической резистентности не используется:
а) бактерицидную активность кожи
б) вирулентность
в) титр лизоцима
г) титр комплемента
д) показатели фагоцитоза
3. Существуют пути активации комплемента:
а) лектиновый
б) альтернативный
в) классический
г) все вышеперечисленные
4. Укажите, что является начальным активатором комплемента в классическом пути
а) липополисахарид
б) пропердин
в) антиген
г) антитело
д) комплекс антиген – антитело
5. Укажите, что является начальным активатором комплемента в альтернативном пути
а) липополисахарид
б) пропердин
в) антиген
г) антитело
д) комплекс антиген - антитело
6. Функция комплемента:
а) нейтрализация токсинов
б) лизис клеток-антигенов
в) усиление фагоцитоза
г) участие в патогенезе аллергических реакций
д) все вышеперечисленное
7. Пропердин - это:
а) неспецифический фактор противовирусного иммунитета
б) белок, принимающий участие в активации комплемента по классическому пути
в) белок, принимающий участие в активации комплемента по альтернативному пути
г) все перечисленное
8. Интерферон – это:
а) неспецифический фактор противовирусного иммунитета
б) белок, принимающий участие в активации комплемента по альтернативному пути
в) белок, принимающий участие в активации комплемента по классическому пути
9. Для оценки гуморального звена неспецифической резистентности используют:
а) фагоцитарный индекс
б) бактерицидность кожи
в) титр комплемента
г) лейкоцитарную формулу
10. Для характеристики фагоцитарной реакции определяют:
а) лейкоцитарную формулу крови
б) % активных фагоцитов
в) фагоцитарное число
г) завершенность фагоцитоза
д) все перечисленное
11. К макрофагальной системе не относятся:
а) моноциты
б) тканевые макрофаги
в) гранулоциты
12. Выберите правильные утверждения:
а) собаки не болеют брюшным тифом по причине видовой невосприимчивости
б) по причине приобретенного иммунитета
13. Может ли быть дефицит в естественной резистентности?
а) Да
б) Нет
14. Отразится ли дефицит резистентности на специфическом иммунитете?
а) Да
б) Нет.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Основная
1. Лекции по теме.
2. Методическая разработка по теме.
3. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. С-Пб, 2005. С.209-235.
4. Поздеев O.K. Медицинская микробиология (под ред. Покровского В.И.). М., 2006. С.182-202.
5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и
вирусология. С-Пб., 2002. С. 148-166.
Дополнительная:
1. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Под ред. Воробьева А.А., Быкова А.С. М., 2003. С.185-189.
2. Медицинская микробиология. Под ред. Покровского В.И., O.K. Поздеева. М., 1999. С. 77-108.
3. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М., 2000. С.18-96.
4. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М., 2000. С. 50-70.
5. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. М, 2003. С. 13-42.
PAGE 94