Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Академія медичних наук України
Інститут гігієни та медичної екології імені О.М. Марзеєва
УДК: 576.312.35/381:616-056.7-053.2
ЦЕНТРОМЕРНА НЕСТАБІЛЬНІСТЬ ТА ПОЛІМОРФІЗМ ХРОМОСОМ
В НОРМІ І ПРИ ПАТОЛОГІЇ ЛЮДИНИ
03.00.15 –генетика
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора медичних наук
Київ –
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті спадкової патології АМН України (м.Львів)
Науковий консультант: доктор медичних наук, професор
Гнатейко Олег Зіновійович,
Інститут спадкової патології АМН України, директор
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
Пілінська Марія Андріївна,
Інститут експериментальної радіології
Наукового Центру радіаційної медицини АМН України, завідувач лабораторії цитогенетики відділу медичної генетики
доктор медичних наук, професор
Гордієнко Ірина Юріївна,
Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України, завідувач відділення медицини плода
доктор медичних наук, професор Бажора Юрій Іванович,
Одеський державний медичний університет,
завідувач кафедри клінічної імунології,
генетики та медичної біології
Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика, кафедра медичної генетики
Захист дисертації відбудеться 17 травня 2006 р. об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.604.02 Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50
Автореферат розісланий 14 квітня 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Омельченко Е.М.
Актуальність теми. Збереження стабільності геному є обов’язковою умовою повноцінного розвитку організму, а його дестабілізація асоціюється з формуванням патологічного фенотипу, високим ризиком апоптичної загибелі клітин або їх вступом на шлях онкогенної трансформації (J.H.J. Hoeijmakers, 2001). Локальна дезорганізація хроматину в центромерних і перицентромерних ділянках хромосом загрожує дисфункцією центромерного білкового комплексу і асоціюється з високим ризиком аномального перебігу мітозу. Ознаки центромерної хромосомної нестабільності (ламкість, міжхромосомні перебудови, передчасне розділення центромер) знаходять у пацієнтів із спадковою патологією та в пухлинних клітинах і розглядають як вірогідний ефект генотоксичних впливів (J. Major et al., 1999; L.H. Yih et al., 2003; J.B. Mailhes et al., 2003; K. Prabhakara, R. Ramadevi, 2004; K. Mehes et al., 2004).
Індукцію центромерної нестабільності пов’язують із структурно-функціональними особливостями конститутивного або С-гетерохроматину, який формує центромерні і прицентромерні ділянки хромосом. Саме завдяки специфічній структурній організації С-гетерохроматину та його здатності до епігеномних модифікацій забезпечується локальне формування комплексу центромерних білків, задіяних у процесах мітотичного поділу (N. Dillon, R. Festenstein, 2002; P. Bernard, R. Allshire, 2002; M.G. Mattei, J. Luciani, 2003). Вміст макросателітних ДНК у складі С-гетерохроматину відзначається суттєвою міжхромосомною та міжособовою варіабельністю і проявляється явищем С-поліморфізму хромосом 1, 9, 13—, 21, 22 та Y (K.W. Jones, G. Corneo, 1971; A.P. Craig-Holmes, M.W. Shaw, 1971). В численних дослідженнях зроблено спроби пов’язати явище С-поліморфізму з формуванням патологічного фенотипу у людини, проте й надалі відсутні обґрунтовані рекомендації щодо його врахування в практиці медико-генетичного консультування. Відсутня концепція, яка могла б пояснити причини частого виявлення носіїв екстремальних С-поліморфних варіантів серед пацієнтів медико-генетичних консультацій та обґрунтувати зв’язок даного явища з аномальним розділенням хромосом і формуванням анеуплоїдних клітин, що складає важливу медико-соціальну проблему.
Найбільш вірогідним механізмом втрати хромосом та формування гіподиплоїдної анеуплодії вважається передчасне розділення центромер сестринських хроматид (ПРЦ) (P.H. Fitzgerald, 1975). Вагомі докази порушення плоїдності мітотичних клітин внаслідок центромерної дисфункції отримано в роботах останніх років, присвячених дослідженню цитологічних ефектів інактивації центромерних білків (V.L. Johnson et al., 2004; L. Michel et al., 2004; T.S. Kitajima et al., 2005; B.E. McGuinness et al., 2005). В переважній більшості згаданих робіт цитогенетичний аналіз не проводився, а його застосування для дослідження секурин-дефіцитних клітин дозволило виявити достовірну індукцію ПРЦ та анеуплоїдії в популяції мітотичних клітин (Z. Wang et al., 2001).
Поряд із значним поступом у розшифровці молекулярних основ аномального перебігу мітозу, цитогенетичні ознаки центромерної дисфункції вивчені недостатньо і не враховуються в практиці медико-генетичних досліджень. Виконані роботи характеризуються суперечливістю у визначенні феноменології ПРЦ, різнорідністю за методами його реєстрації, обмеженістю обсягу досліджених випадків. Відсутня інформація про рівень спонтанної індукції ПРЦ в різних тканинах та на різних етапах нормального онтогенезу людини, що не дозволяє об’єктивно охарактеризувати його параметри при патологічних станах. Немає концепції, яка б обґрунтувала закономірності виникнення ПРЦ та його функціональну роль в реалізації життєвого циклу клітини з урахуванням результатів сучасних досліджень центромерних білків та конститутивного гетерохроматину. Все вище викладене створило потребу проведення цілеспрямованого дослідження центромерної хромосомної нестабільності, яке б дозволило визначити закономірності індукції ПРЦ в нормі і при патології людини, охарактеризувати зв’язок даного явища з маніфестацією інших ознак хромосомної нестабільності і фенотипом конститутивного гетерохроматину та обгрунтувати доцільність його врахування в практиці медико-генетичних досліджень.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в межах наукових комплексних тем Інституту спадкової патології АМН України: “Дослідження ендогенного впливу гормонів щитовидної залози, особливостей імунного та хромосомного статусу на виникнення анеуплоїдій в потомстві людини” (№ держреєстрації 0195U023204); “Проспективне визначення інформативних маркерів в геномі сімей з анеуплоїдним потомством для оптимізації підходів до пренатальної діагностики” (№ держреєстрації 0198U002189), “Проспективне спостереження за частотою та спектром поширеної спадкової патології серед дітей Західного регіону України в умовах масового та селективного скринінгу” (№ держреєстрації 0199U001345), “Дослідження інформативних генетичних маркерів людини в системі преконцепційної профілактики спадкової патології та соматичного мутагенезу” (№ держреєстрації 0101U001297, “Геногеографічні дослідження поширеної моногенної патології (фенілкетонурія, муковісцидоз, спільна м’язова атрофія, м’язова дистрофія Дюшена) у Західному регіоні України” (№ держреєстрації 0102U001773, “Дослідження ролі генетичних чинників в реалізації схильності до анеуплоїдної патології та захворювань хромосомної ламкості” (№ держреєстрації 0104U010088).
Мета роботи: Дослідити закономірності маніфестації явища центромерної нестабільності в мітотичних клітинах людини та визначити інформативність його використання в практиці медико-генетичних досліджень.
Задачі дослідження:
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сформовано концепцію про передчасне розділення центромер (ПРЦ) сестринських хроматид як закономірний прояв індукованої нестабільності геному проліферуючих клітин. Вперше розроблено алгоритм об’єктивної оцінки ПРЦ та охарактеризовано фенотип і спонтанний рівень даного явища в різних тканинах та на різних етапах нормального онтогенезу людини. В серії порівняльних досліджень в нормі та при різноманітних патологічних станах у людини вперше доведено, що індукція ПРЦ —це закономірна реакція геному у відповідь на екзогенне або ендогенне пошкодження ДНК та вірогідний елемент генетичних програм, пов’язаних з процесами тканинної диференціації, онкогенної трансформації та клітинної загибелі. Вперше встановлено, що індукція часткового ПРЦ маніфестує послідовно з індукцією хромосомних аберацій і є вірогідним наслідком генотоксичного впливу, а його виникнення загрожує клітині втратою хромосом, формуванням анеуплоїдії та підвищеним ризиком онкогенної трансформації. Вперше розроблено та частково обґрунтовано концепцію, що індукція повного ПРЦ в культурі соматичних клітин є свідченням вродженого або набутого дефекту G2 checkpoint і загрожує клітині передчасною загибеллю або ендоредуплікацією за відсутності експресії p53 дикого типу.
Вперше сформовано концепцію про неконститутивну природу значної частки екстраваріантів С-поліморфізму, що реєструються в практиці медико-генетичних досліджень. У розвиток даної концепції вперше постульовано і доведено, що фенокопії макроваріантів і часткових перицентричних інверсій утворюються внаслідок перманентної деконденсації прицентромерного гетерохроматину у відповідь на зміни клітинного метаболізму та (або) гормональної регуляції, які супроводжують процеси клітинної диференціації, реалізацію адаптативно-стресових реакцій та розгортання патологічного процесу. Вперше запропоновано розцінювати факти реєстрації 2-х і більше макроваріантів С-поліморфізму та часткових перицентричних інверсій як вірогідні ознаки індукованої хромосомної нестабільності. Вперше висловлено гіпотезу, що потенційно негативний вплив носійства мікроваріантів та повних перицентричних інверсій 9-ої хромосоми реалізується через дисфункцію адаптативно-стресових реакцій в клітині внаслідок неспроможності невеликих ділянок С-гетерохроматину ефективно зв’язуватись з фактором термального шоку HSF1 (Heat Shock Factor I). Вперше постульовано роль конститутивного гетерохроматину хромосом 1-ої пари в нормальній реалізації програми spindle checkpoint та збереженні диплоїдного набору соматичних клітин. При цьому, індукція хромосомних перебудов 1-ої хромосоми із втратою балансу прицентромерного гетерохроматину розглядається як пусковий елемент анеуплоїдизації клітин.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблено алгоритм оцінки центромерної хромосомної нестабільності соматичних клітин, який відзначився високою інформативністю в діагностиці та прогнозуванні синдромів хромосомної нестабільності, поширених гемобластозів дітей і дорослих та екологічно детермінованому захворюванні, обумовленому впливом фтору і солей важких металів. Запропоновано враховувати рівень індукції центромерної хромосомної нестабільності в практиці цитогенетичного моніторингу генотоксичних впливів та для прогнозування онкогенетичної трансформації клітин.
В практику медико-генетичного консультування населення України вперше впроваджено алгоритм цитогенетичної та молекулярно-генетичної діагностики синдромів Ніймеген (NBS) та атаксії-телеангіектазії, що дозволило встановити значну поширеність NBS у Львівській області, виявити перші випадки в Івано-Франківської, Волинської, Тернопільської, Рівненській та Запорізькій областях та обґрунтувати доцільність впровадження його селективного скринінгу в усіх регіонах країни.
Сформовано реєстр сімей високого ризику щодо відтворення синдромів хромосомної нестабільності, який дозволяє ефективно спостерігати за репродуктивною функцією в родинах, своєчасно здійснювати заходи пренатальної діагностики, запобігати впливу іонізуючого випромінювання на гомозиготних і гетерозиготних носіїв мутацій, проводити лікувальну корекцію вродженого комбінованого імунодефіциту та профілактику онкологічної патології.
В практиці медико-генетичного консультування пропонується враховувати носійство повної перицентричної інверсії 9-ої хромосоми (9ph+) та високої делеції довгого плеча Y-хромосоми (Yq12-) як фактори ризику порушень статевої диференціації, фертильності та формування анеуплоїдних гамет в осіб чоловічої статі. Факти поєднання в каріотипі двох і більше великих гетерохроматинових районів та часткових перицентричних інверсій разом із ознаками хромосомної нестабільності вказують на високу ймовірність реєстрації фенокопій С-поліморфних варіантів, індукція яких відбулася внаслідок змін гомеостазу соматичних клітин.
Отримані результати склали основу нововведень та інформаційних листів: “Комплексна система заходів ефективного формування груп ризику сімей по народженню анеуплоїдного потомства” (МОЗ України, Реєстр галузевих нововведень, випуск 8—, К., 1998, стор. 75; №130/9/8), “Алгоритм ефективної профілактики природжених вад розвитку у дітей” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 15, К., 2002, стор. 68; №271-2003), “Порядок селективного скринінгу синдрому хромосомної ламкості Ніймегена” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 15, К., 2002, стор. 69; №274-2003), “Спосіб діагностики аномального розділення центромер метафазних хромосом” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 15, К., 2002, стор. 69; №275-2003), “Профілактика природженої та спадкової патології плоду у жінок з порушеним репродуктивним анамнезом” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 19, К., 2004, стор. 69; №77-2005), “Спосіб цитогенетичної діагностики синдрому Ніймеген та атаксії-телеангіектазії” (АМН України, Інформаційний бюлетень, випуск 20, К., 2005, стор. 126). Використані в роботі удосконалені методи пренатальної діагностики хромосомної патології оформлені та видані у вигляді деклараційного патенту на винахід “Спосіб отримання препаратів метафазних хромосом із культури амніоцитів”(Деклараційний патент на винахід UA58404А.—Бюл. №7, 2003). Результати роботи впроваджені у Львівському міжобласному медико-генетичному центрі, Харківському спеціалізованому медико-генетичному центрі, Донецькому спеціалізованому медико-генетичному центрі та міжобласному центрі медичної генетики і пренатальної діагностики м. Кривий Ріг.
Особистий внесок здобувача. Автор особисто опрацювала новий підхід до вивчення явища центромерної нестабільності, розробила алгоритм його оцінки, особисто приймала участь у проведенні клінічних і цитогенетичних досліджень, здійснила узагальнення отриманих результатів. Автор особисто сформулювала власні наукові концепції і практичні рекомендації. Робота виконана в межах комплексних науково-дослідних робіт, керівником та відповідальним виконавцем яких був здобувач. Співучасть співробітників Інституту та інших установ у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.
Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на II з’їзді медичних генетиків України (Львів, 1995), XVIII міжнародному конгресі з аналітичної цитології (Ріміні, Італія, 1996), XVI Європейському конгресі з гематології та імунології (Тессалоніки, Греція), II конференції Європейської цитогенетичної асоціації (Відень, Австрія, 1999), міжнародній конференції “Placentologic monitoring studies and ecotoxicologic aspects of genetic diseases” (Краків, Польща, 2000), NATO Advanced Research Workshop “Endocrine Disrupters and Carcinogenetic Risk Assessment” (Бялисток, Польща, 2001), III науково-практичної конференції “Проблеми онкогенетики: наукові та прикладні аспекти”(Київ, 2002), ІІІ з’їзді медичних генетиків України (Львів, 2002), I конгресі з клінічної генетики з міжнародною участю “Метаболічні спадкові хвороби” (Харків, 2003), Всеросійській науково-практичній конференції “Современные достижения клинической генетики” (Москва, 2003), Республіканській науково-практичній конференції “Профілактика вроджених вад розвитку і спадкової патології” (Київ, 2004), Республіканській науково-практичній конференції “Сучасні лабораторні методи дослідження спадкової патології” (Київ, 2004), II конгресі з клінічної генетики з міжнародною участю “Метаболічні спадкові хвороби” (Харків, 2005).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 55 робіт, з них: у провідних фахових журналах і збірниках —, у матеріалах з’їздів, симпозіумів та конференцій —, отримано 1 деклараційний патент на винахід та видано 5 інформаційних листів.
Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 278 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, шести глав власних досліджень, узагальнення, висновків, практичних рекомендацій та переліку використаних джерел. Текст дисертації ілюстрований 59 таблицями та 47 рисунками, містить 7 додатків. Перелік використаних джерел складає 762 посилань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Обсяг досліджень. Основний контингент для досліджень склали пацієнти Львівського міжобласного медико-генетичного центру (ЛММГЦ) та Львівської дитячої спеціалізованої клінічної лікарні (ЛДСКЛ). Досліджено 874 особи та 163 зразки пренатального матеріалу. Зроблено 937 цитогенетичних, 99 молекулярно-генетичних та 131 досліджень апоптозу.
Цитогенетичні дослідження здійснено у 812 випадках дослідної та 125 —контрольної групи. До складу контрольної групи увійшли 30 дорослих волонтерів, 60 новонароджених дітей та 35 дітей віком 3—років, які проходили обстеження в ЛДСКЛ. Контингент постнатальних досліджень (681) склали 84 випадки синдромів хромосомних анеуплодій (трисомія-21, Х-моносомія, синдром Клайнфельтера), 32 —синдромів хромосомної нестабільності (СХН), 98 —гемобластозів у дітей, 24 —гемобластозів дорослих; 19 —хронічних захворювань інфекційно-токсичного генезу у дітей, 42 —дітей з регіону, забрудненого солями важких металів та фтору (м. Соснівка Львівської області); 10 —дітей із зони радіаційного контролю (м. Коростень Житомирської області); 91 –порушень менструальної функції з нормальним каріотипом; 33 —випадків первинної аменореї з ознаками чоловічого псевдогермафродитизму (каріотип 46,XY); 39 —порушень статевого розвитку та сперматогенезу у чоловіків в асоціації з нормальним каріотипом; 108 —членів подружніх пар з невиношуванням вагітності в анамнезі; 101 —батьків пацієнтів. Поряд з цим досліджено 131 зразок пренатального матеріалу: 62 —цитотрофобласту хоріону і гемопоетичних ембріональних печінкових клітин (ГЕПК) від артифіціальних абортусів (7—тижнів гестації) та 69 —цитотрофобласту плаценти і клітин амніотичної рідини в матеріалі інвазивної пренатальної діагностики стану плоду (18—тижні).
Рівень індукції апоптозу досліджено у 35 дорослих волонтерів (контрольна група), 13 хворих на гемобластози дитячого віку, 39 дітей з екологічно несприятливого регіону (м. Соснівка Львівської області), 10 пацієнтів з СХН, а також у 32 зразках ГЕПК людини. Імуногістохімічні дослідження експресії білків P53 та Bcl-2 проводили у 10 зразках ембріональної печінки та 11 —ворсин хоріону. Молекулярно-генетичні дослідження здійснено у 54 випадках NBS-подібного фенотипу, у 2 плодів з високим ризиком NBS, 9 випадках вірогідної атаксії-телеангіектазії, 14 батьків дітей з СХН, а також у 20 пацієнтів чоловічої і жіночої статі з порушеннями статевої диференціації.
Матеріали та методи досліджень. Дослідження проводили на клітинах крові, кісткового мозку, ГЕПК, хоріону, плаценти та амніотичної рідини людини, культивованих ex vivo або in vitro.
Культивування лімфоцитів периферичної крові та отримання препаратів метафазних хромосом проводили за стандартним методом D.A. Hungerford (1965). При виготовленні препаратів хромосом з культивованих клітин кісткового мозку та крові хворих на гемобластози враховували рекомендації B. Gibbons та B.H. Czepulkowski (1992). Препарати хромосом гемопоетичних ембріональних печінкових клітин отримували з матеріалу ембріональної печінки артифіціальних абортусів після 2-годинного культивування в присутності колхіцину (ex vivo) за методикою О.О. Созанського із співавторами (1989). Отримання препаратів метафазних хромосом з клітин плаценти та ворсин хоріону ex vivo проводили за методом G. Simoni (1983). Для культивування клітин амніотичної рідини використовували метод Д.В. Заставної (2003). Виготовлення препаратів хромосом з амніоцитів проводили за методом, розробленим Н.Л. Гулеюк і за нашої участі (2003), новизна якого засвідчена патентом на винахід.
Рівномірно забарвлені препарати хромосом з використанням 4% розчину барвника Гімза (“Merck”, Німеччина) застосовували для реєстрації хромосомних аберацій, передчасного розділення центромер (ПРЦ) та для аналізу плоїдності клітин. Дослідження структурної організації хромосом проводили з використанням G-забарвлення препаратів хромосом 2% розчином барвника Гімза за методом M.A. Seabright (1971) у власній модифікації. Структурно-функціональну організацію центромерних ділянок хромосом оцінювали на C-забарвлених препаратах хромосом (A.T. Sumner, 1972).
Візуальний хромосомний аналіз проводили при збільшенні х 1000 на мікроскопах “Axioplan” (Німеччина) та “Nikon” (Японія) з фотографуванням препаратів хромосом. При аналізі 100 метафазних пластинок (м.п.) реєстрували кількісні та структурні аномалії хромосом, факти анеуплоїдії, поліплоїдії та передчасного розділення центромер сестринських хроматид (ПРЦ). Для визначення структурних перебудов застосовували Міжнародну номенклатуру ISCN—. При аналізі хромосомних аберацій враховували всі аберації хромосомного та хроматидного типів, за винятком пробілів. Дослідження явища ПРЦ проводили на основі алгоритму, вперше запропонованого і впровадженого у даному дослідженні. Оцінку С-поліморфних варіантів хромосом 1, 9, 16, 13—, 21, 22 та Y проводили за 5-бальною напівкількісною системою, розробленою в Інституті медичної генетики РАМН (1981), та із застосуванням методики кількісного аналізу, розробленої при виконанні кандидатської дисертаційної роботи (Г.Р. Акопян, 1988).
Молекулярно-генетичні дослідження проводили з використанням ДНК лейкоцитів периферичної крові, виділеної методом ферментативного розщеплення та подальшої фенольної екстракції (Т. Маниатис, 1988; G.D. Efremov, 1999). Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили в автоматичному режимі на термоциклерах “АМП-4” (м. Новосибірськ, РФ), “Perkin Elmer” 4800 nf 2400 (“Cetus”, США), “AMPLY-4” (ф-ма “Биоком”, м. Москва, РФ). Реактиви виробництва “MBI Fermentas” (Литва), олігонуклеотидні праймери синтезовані в Інституті біоорганічної хімії РАН (м. Москва, РФ). Молекулярно-генетичний аналіз мутації 657del5 гена NBS1, асоційованого з синдромом Ніймеген (NBS), проводили за методом R. Varon із співавторами (1998) на основі ПЛР з використанням олігонуклеотидних послідовностей, що фланкують сайт виникнення делеції. Фрагменти розділяли в 8% поліакриламідному гелі. Для верифікації мутації 657del5 гена NBS1 зразки було секвеновано на автоматичному секвенаторі ABI PRIZM 310 з використанням флюоресцентно мічених ddNTP згідно технології BigDyeTM (“Applied Biosystems”). За методом M. Telatar із співавторами (1998) проводили дослідження 7 типових мутацій гена ATM, асоційованих з атаксією-телеангіектазією (А-Т): IVS53-2AC (codon 2544del 159nt екзону 54), 6095GA (codon 2003 екзону 43), 7010 del GT (codon 2337 екзону 50), 5932GT (codon 1973del88nt екзону 42), 3214GT (codon 1026del207nt екзону 24), 3245 ATCTGAT (codon 1081 екзону 24), 7636del9nt (codon 2546 екзону 54). Ефективність ПЛР перевіряли шляхом гель електрофорезу в 3% агарозному гелі з наступною візуалізацією бромистим етидієм.
Проточноцитометричні дослідження апоптозу проводили у відділі клінічної імунології Інституту онкології АМН України та у клінічній лабораторії ЛДСКЛ з використанням приладів FACScan (“Becton Dickinson, USA), обладнаних аргоновим лазером з довжиною хвилі 488 нм та програмним забезпеченням CellQuest для комп’ютерів Мас. Клітини забарвлювали пропідієм йодидом, а для вимірювання його флюоресценції застосовували вузькосмуговий фільтр 585/42 нм. Реєстрацію клітин з апоптотичною втратою ДНК проводили шляхом кількісного аналізу гіподиплоїдної зони гістограми (“sub-G1-peak”) за методом I. Nicoletti із співавторами (1991). Показники питомого вмісту клітин з різною кількістю ДНК в основних фазах мітотичного циклу (G1/0, S, G2+М) обробляли з використанням програми Mod Fit LT 2.0 (BDIS, USA).
Дослідження апоптозу шляхом люмінесцентної мікроскопії препаратів клітин, прижиттєво забарвлених акридином оранжевим, проводили у відділенні регуляторних систем клітини Інституту біології клітини НАН України за методом Н.В. Крищишина та М.Д. Луцика (1978) у власній модифікації. Препарати клітин аналізували з використанням люмінесцентного мікроскопу ЛЮМАМ-Р2 (ЛОМО, м. Санкт-Петербург, Росія) при збільшенні х 500 в області збудження 360—нм та емісії 480— нм. Аналізували по 300 клітин випадково знайдених під мікроскопом з фотографуванням препаратів на кольорову фотоплівку Fuji 100. Факт життєздатності або апоптичної загибелі клітин встановлювали в залежності від характеру люмінесценції з врахуванням рекомендацій K. Gasiorowski із співавторами (2001).
Реєстрацію цитологічних ознак апоптозу проводили за методом B.C. Trauth та J. Keesey (1995) на стандартно зафіксованих мазках крові та препаратах метафазних хромосом, забарвлених 4% барвником Гімза при збільшенні х 1000. При аналізі 150—клітин у кожному зразку проводили вибіркову реєстрацію клітин з виразною фрагментацією ядра та відшаруванням апоптичних тілець. Інші ознаки апоптичної морфології клітин не враховували.
Імуногістохімічні дослідження проводили в інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького з використанням моноклональних антитіл (DAKO, Данія). По завершенні імуногістохімічної реакції, зрізи тканин фарбували гематоксиліном, укладали в бальзам та досліджували у світловому мікроскопі при збільшенні х 400. При аналізі 200 клітин проводили напівкількісну реєстрацію інтенсивності сигналу із визначенням особливостей його локалізації.
Статистична обробка результатів дослідження проводилась за допомогою пакету програм “Statistica 5” та Microsoft Excel —. Достовірність різниці середніх значень показників в досліді і контролі, а також значимість коефіцієнтів лінійної регресії і кореляції оцінювали при 95%-й ймовірності і вище. Застосовували критерій Пірсона ч2 у випадках доведеного нормального характеру розподілу вибірок, а також метод непараметричної статистики (U-тест Mанна-Уітні) для порівняльного аналізу рядів з незалежним розподілом вибірок при 95%-й ймовірності і вище.
Результати досліджень та їх обговорення.
Фенотип та рівень спонтанної індукції центромерної хромосомної нестабільності в культивованих соматичних клітинах людини
Нами встановлено, що на препаратах хромосом, виготовлених із застосуванням колхіцину з короткочасних культур крові, кісткового мозку, цитотрофобласту, амніоцитів та ГЕПК, зустрічаються клітини з передчасним розділенням різної кількості хромосом із середньометафазним ступенем конденсації (рис. 1). Фенотип часткового ПРЦ відзначається передчасним розділенням від 1 до 20 хромосом каріотипу і проявляється паралельним розташуванням сестринських хроматид, що у випадках невеликих хромосом створює фенокопію парного фрагменту (рис. 1а). Цитогенетичний фенотип повного ПРЦ представлений передчасним розділенням 23—хромосом каріотипу і характеризується непаралельним взаєморозташуванням сестринських хроматид, коли відстань між центромерами є меншою ніж між хромосомними плечами (рис. 1б). Фенотип повного ПРЦ не відзначається ознаками пуфінгу або “розщеплення” центромер.
В даному дослідженні охарактеризовано рівень спонтанної індукції повного і часткового ПРЦ в різних тканинах та на різних стадіях нормального і патологічного розвитку людини (табл. 1). Встановлено низький рівень повного ПРЦ в культивованих лімфоцитах пуповинної і периферичної венозної крові та в клітинах кісткового мозку практично здорових дітей і дорослих (0,06—,7 на 100 м.п. відповідно). Часткове ПРЦ виявилось більш поширеним явищем і реєструвалось практично в усіх досліджених культурах крові та кісткового мозку здорових осіб з індивідуальними коливаннями 1—на 100 м.п. Рівень спонтанної індукції часткового ПРЦ не відрізнявся в культурах крові і кісткового мозку осіб дитячого віку і був вищий в лімфоцитах in vitro жінок репродуктивного віку (1,6±0,2 та 3,0±0,6 на 100 м.п. відповідно). Характерною рисою часткового ПРЦ в культурах крові і кісткового мозку здорових осіб було передчасне розділення не більше 2 хромосом каріотипу з вибірковим залученням хромосом групи C (6, Х, 11, 12) та групи Е (18).
В пренатальний період нормального розвитку людини зареєстровано достовірну індукцію повного ПРЦ в гемопоетичних ембріональних печінкових клітинах (ГЕПК), цитотрофобласті хоріону і амніоцитах порівняно з клітинами крові і кісткового мозку постнатально обстежених осіб: 2,1—,9 та 0,04—,7 на 100 м.п. відповідно (P<0,001) (табл. 1). Найвищі показники індукції повного ПРЦ спостерігались в ГЕПК (14,9±2,2 на 100 м.п.), найнижчі —в амніоцитах (2,1±0,5 на 100 м.п.) і проміжні —в клітинах цитотрофобласту хоріону (7,4±1,7 на 100 м.п.). Отримані нами дані щодо значної індукції повного ПРЦ в ГЕПК ex vivo в 7—тижнів гестації людини узгоджуються з результатами попередніх досліджень (О.О. Созанський із співавт., 1987; О.М. Яворовська, 1992; М.Р. Лозинська, 1995). Рівень часткового ПРЦ виявився практично однаковий у зразках пренатального матеріалу і незначно перевищував параметри постнатальних тканин (3,1—,4 та 1,4—,6 на 100 м.п. відповідно) (табл. 1).
|
Таблиця 1 |
|
Частота реєстрації клітин з передчасним розділенням центромер (ПРЦ) в культурах соматичних клітин в нормі і при патології людини (на 100 м.п.) |
|
Об’єкт дослідження |
Культура клітин |
К-сть культур/метафаз |
ПРЦ повне |
P1 |
ПРЦ часткове |
P2 |
|
Нормальний постнатальний розвиток |
||||||
|
Новонароджені |
пвк |
14/1400 |
— |
,4±0,4 |
— |
|
|
3—років |
пк |
23/2300 |
,04±0,04 |
— |
,4±0,3 |
— |
|
3—років |
км |
9/900 |
0,1±0,1 |
— |
,7±0,6 |
— |
|
3—років |
пк+км |
32/3200 |
,06±0,04 |
— |
,6±0,2 |
— |
|
18—років |
пк |
10/1000 |
,7±0,2 |
— |
,0±0,6 |
— |
|
Нормальний пренатальний розвиток |
||||||
|
Ембріон |
ГЕПК |
35/3500 |
,9±2,2 |
<0,001 |
,1±1,1 |
>0,05 |
|
Ембріон |
хоріон |
20/1580 |
,4±1,7 |
<0,001 |
,4±1,3 |
=0,01 |
|
Плід |
амніоцити |
41/1687 |
,1±0,5 |
<0,01 |
,1±0,6 |
<0,05 |
|
Патологічні стани у дітей |
||||||
|
ГЛЛ |
пк+км |
33/2800 |
,1±2,1 |
<0,001 |
,4±4,6 |
<0,001 |
|
ГЛЛ (ремісія) |
пк+км |
25/2180 |
,2±0,6 |
<0,05 |
,8±1,5 |
<0,01 |
|
ГЛЛ (ремісія повна) |
пк+км |
13/1130 |
,3±0,2 |
>0,05 |
,9±0,9 |
<0,01 |
|
НЗЛ |
пк+км |
8/800 |
53,9±4,8 |
<0,001 |
,3±2,3 |
<0,001 |
|
ГМЛ |
км |
5/500 |
,8±15,6 |
<0,01 |
,8±4,1 |
<0,001 |
|
Синдром Ніймеген |
пк |
7/500 |
,3±1,0 |
<0,01 |
,8±1,5 |
>0,05 |
|
Атаксія-телеангіектазія |
пк |
7/700 |
,9±0,9 |
<0,05 |
1,4±0,9 |
>0,05 |
|
Екологічна патологія |
пк |
42/4200 |
,5±0,4 |
<0,001 |
,5±0,1 |
>0,05 |
|
Інф.-токсичні стани |
пк |
19/1900 |
,2±0,3 |
<0,01 |
,3±0,1 |
>0,05 |
|
Патологічні стани у дорослих |
||||||
|
ГМЛ |
км |
8/500 |
2,5±0,7 |
<0,01 |
,8±3,8 |
<0,05 |
|
ХМЛ |
км |
14/800 |
4,1±0,6 |
<0,001 |
,7±2,1 |
<0,001 |
|
НЗЛ |
км |
7/350 |
6,0±1,5 |
<0,001 |
,3±4,2 |
<0,05 |
|
Репродуктивні втрати |
пк |
48/4800 |
,9±0,2 |
<0,05 |
,2±0,3 |
<0,05 |
|
Ïðèì³òêè |
ïâê —ïóïîâèííà âåíîçíà êðîâ, пк — периферична кров, км — кістковий мозок |
|
ÃÅÏÊ —ãåìîïîåòè÷í³ åìáð³îíàëüí³ ïå÷³íêîâ³ êë³òèíè |
|
|
ÃËË —ãîñòðà ë³ìôîáëàñòíà ëåéêåì³ÿ |
|
|
ÃÌË —ãîñòðà 쳺ëî¿äíà ëåéêåì³ÿ |
|
|
ÍÇË —íåãîäæê³íñüêà çëîÿê³ñíà ë³ìôîìà |
|
|
ÕÌË —õðîí³÷íà 쳺ëî¿äíà ëåéêåì³ÿ |
|
|
Підбір контролю для порівняння проводили в залежності від культури клітин |
|
|
В якості контролю порівняльно-онтогенетичних досліджень використано пк+км |
|
|
P1 —достовірне перевищення контрольних показників за рівнем повного ПРЦ |
|
|
P2 —достовірне перевищення контрольних показників за рівнем часткового ПРЦ |
З іншого боку, структура часткового ПРЦ в ГЕПК відзначилась появою суттєвої частки метафазних клітин з передчасним розділенням більше 3-х хромосом набору, приналежних до всіх хромосомних груп.
Отже, за нашими даними, явище центромерної нестабільності у проявах повного і часткового ПРЦ достовірно індукується в проліферуючих клітинах різного тканинного походження в пренатальний і постнатальний період нормального онтогенезу людини. Часткове ПРЦ відзначається стабільністю маніфестації в різних тканинах та на різних етапах онтогенезу. Індукція повного ПРЦ є нетиповим явищем для культивованих клітин крові і кісткового мозку в період постнатального розвитку і достовірно маніфестує в тканинах пренатального походження (гемопоетичні ембріональні клітини, цитотрофобласт хоріону, клітини амніотичної рідини), де відзначається суттєвою міжтканинною варіабельністю.
Фенотип та рівень індукованої центромерної хромосомної нестабільності в культивованих соматичних клітинах людини
Дотримуючись концепції про вірогідний зв’язок явища ПРЦ з індукцією хромосомної нестабільності, ми дослідили характер його маніфестації за умов підвищеної напруженості процесів ендогенного та екзогенного мутагенезу. Для цього проведено комплексний цитогенетичний аналіз клітин крові і кісткового мозку у пацієнтів із спадковими синдромами хромосомної нестабільності (СХН), у хворих на гемобластози, у випадках вторинних імунодефіцитних станів інфекційно-токсичного ґенезу у дітей, в осіб, що проживають на територіях, забруднених генотоксичними чинниками, у членів подружніх пар з репродуктивними втратами в анамнезі, а також у батьків пацієнтів з СХН та хворих на гемобластози. Всього обстежено 325 осіб (60 контрольної групи) та проаналізовано 26200 метафазних пластинок.
При тому, що в контролі клітини з повним ПРЦ практично не виявлялись, достовірну індукцію даного явища зареєстровано у 80—% короткочасних культур крові і кісткового мозку хворих на гемобластози, інфекційно-токсичну та екологічно-детерміновану патологію. Поряд з цим, індукцію повного ПРЦ знайдено у двох третинах випадків синдромів хромосомної нестабільності, у кожного другого з батьків дітей з гострою лімфобластною лейкемією або СХН, а також у третини членів подружніх пар з репродуктивними втратами в анамнезі. Найвищі параметри індукції повного ПРЦ відмічено в культурах крові і кісткового мозку дітей, хворих на гемобластози, а саме, у випадках гострої лімфобластної лейкемії (ГЛЛ), гострої мієлоїдної лейкемії (ГМЛ), мієлодиспластичного синдрому (МДС) та негоджкінської злоякісної лімфоми (НЗЛ) (табл. 1). Досліджені випадки ГЛЛ, ГМЛ та МДС у дітей відзначились значними міжособовими коливаннями рівня індукції повного ПРЦ (2—на 100 м.п.), тоді як у пацієнтів з НЗЛ дане явище стабільно відтворювалось в половині мітотичних клітин (коефіцієнт варіації v=10%). В єдиному дослідженому нами випадку NBS, ускладненому розвитком НЗЛ, відсоток повного ПРЦ в культурах крові і кісткового мозку відповідав параметрам культур пацієнтів з НЗЛ (47,8±6,1 та 53,9±4,8 на 100 м.п. відповідно) і достовірно перевищував показники групи пацієнтів з NBS без онкологічних ускладнень (2,4±1,3 на 100 м.п., P<0,001). Це свідчить про високу специфічність індукції повного ПРЦ в гемопоетичних клітинах під час маніфестації НЗЛ у дітей. У дорослих пацієнтів з хронічною мієлоїдною лейкемією (ХМЛ), ГМЛ та НЗЛ рівень індукції повного ПРЦ в клітинах кісткового мозку також достовірно перевищував контрольні показники (табл. 1), що вказує на закономірність індукції даного явища під час маніфестації гемобластозів незалежно від нозологічної форми та віку особи. В ремісії ГЛЛ у дітей зареєстровано достовірну регресію рівня індукції повного ПРЦ в клітинах крові і кісткового мозку з досягненням показників здорових осіб на стадії повної ремісії: 0,3±0,2 та 0,06±0,04 на 100 м.п. відповідно (P>0,05).
Поряд з дослідженими випадками гемобластозів, достовірну індукцію повного ПРЦ в межах 2,2—,5 на 100 м.п. встановлено в переважній більшості культур лімфоцитів пацієнтів з СХН та вторинними імунодефіцитними станами інфекційно-токсичного генезу, а також у дітей з проявами екологічно детермінованого захворювання, викликаного впливом солей важких металів і фтору (табл. 1). Рентгенівське опромінення культивованих лімфоцитів пацієнтів з атаксією-телеангіектазією (А-Т) в дозі 1 грей викликало значне зростання відсотка повного ПРЦ порівняно з параметрами неопромінених культур пацієнтів і контролю: 4,0±0,7, 2,9±0,9 та 0,04±0,04 на 100 м.п. відповідно. Зважаючи на доведену генетичну нездатність лімфоцитів пацієнтів з A-T та синдромом Ніймеген (NBS) здійснювати зупинку клітинного циклу у відповідь на радіаційне пошкодження ДНК (intra-S або G2 checkpoint) (H. Beamish et al., 1996; M.H. Takagi et al., 1998; A. Ito et al., 1999), ми припускаємо зв’язок підвищеної індукції повного ПРЦ в опромінених мітотичних клітинах з вродженим або набутим дефіцитом G2 checkpoint.
Якщо спонтанний рівень часткового ПРЦ у здорових осіб не перевищував 4 на 100 м.п., то його достовірну індукцію зареєстровано в культурах крові і кісткового мозку в усіх досліджених випадках гемобластозів у дітей (6,3—,4 на 100 м.п., P<0,001) та дорослих (11,8—,7 на 100 м.п., P<0,05) (табл. 1). Порівняно з контролем, де ПРЦ демонстрували 1—хромосоми каріотипу, в гострому періоді гемобластозів з’являвся репрезентативний пул мітотичних клітин з передчасним розділенням 3—20 хромосом, який, зокрема, становив більше половини випадків часткового ПРЦ в клітинах кісткового мозку пацієнтів з ГЛЛ. Якщо в контролі передчасно розділялися хромосоми груп С і E, то в гострому періоді гемобластозів дане явище поширювалось на представників всіх хромосомних груп. 80% всіх зареєстрованих ПРЦ-хромосом були представниками груп С і E, наступну позицію обіймали ПРЦ-хромосоми групи G, A, B і найменш часто зустрічалося передчасне розділення хромосом F і D. Передчасне розділення хромосом груп A, B, C і E переважно спостерігалось у пацієнтів дитячого віку, тоді як типовим явищем в культурах дорослих хворих на гемобластози виявилось ПРЦ-G. В ремісії ГЛЛ у дітей зареєстровано достовірну регресію рівня часткового ПРЦ (38,4±4,6 та 3,9±0,9 на 100 м.п. відповідно, P<0,001).
В літературі описано поодинокі випадки реєстрації явища ПРЦ з ознаками “розщеплення центромер” при гемобластозах дорослих (Y. Shiraishi et al., 1982; J.H. Gallo et al., 1984; L.G. Littlefield et al., 1985), а також знахідки повного ПРЦ в окремих випадках ГМЛ у дітей (P.W. Tompson et al., 1993). В нашій роботі на репрезентативному матеріалі статистично доведено закономірність відтворення явища ПРЦ у двох альтернативних фенотипах (повне і часткове ПРЦ), достовірність його індукції в гострому періоді гемобластозів у дітей і дорослих та достовірну регресію в ремісії з практичним досягненням показників здорових осіб. Отже, індукція повного і часткового ПРЦ є закономірними проявами хромосомної нестабільності при гемобластозах, причому інформативними ознаками гострого періоду захворювання є поява в популяції мітотичних клітин крові та кісткового мозку більше 2% метафазних пластинок з повним ПРЦ та більше 10% клітин з частковим ПРЦ, які відзначаються передчасним розділенням 3—хромосом набору за участі представників груп G, A, B, D, F.
У пацієнтів з СХН, рівень часткового ПРЦ в культивованих лімфоцитах не відрізнявся від контрольних показників (табл. 1), проте структура даного явища виявилася відмінною і відзначалася появою репрезентативного пулу клітин з ПРЦ 3—хромосом каріотипу та залученням у дане явище хромосом всіх відомих груп, подібно до того, як це спостерігалось в ГЕПК та клітинах хворих на гемобластози. Специфічним проявом часткового ПРЦ у випадках СХН виявилась вибіркова індукція передчасного розділення хромосом групи B при повній відсутності даного явища в контролі (0,9±0,3 на 100 м.п., P<0,001). Рентгенівське опромінення культур лімфоцитів пацієнтів з А-Т в дозі 1 грей також супроводжувалось достовірною індукцією ПРЦ-B порівняно з неопроміненими культурами (0,6±0,2 та 2,8±0,7 хромосом на 100 м.п., P<0,01). Поряд з цим, нами виявлено вибіркову достовірну індукцію передчасного розділення хромосом групи D (13—) у випадках атаксії-телеангіектазії та хромосом групи A (2, 3) у пацієнтів з синдромом Ніймеген (NBS) порівняно з контролем. Отримані дані узгоджуються з повідомленням про знахідки ПРЦ-D у 2 пацієнтів з атаксією-телеангіектазією (K. Mehes, E.M. Bьhler, 1995), проте достовірну індукцію ПРЦ-B в досліджених випадках А-Т та NBS, а також ПРЦ-А у випадках NBS, виявлено нами вперше. Єдиний досліджений нами випадок NBS, ускладнений розвитком НЗЛ, характеризувався достовірним підвищенням індукції часткового ПРЦ порівняно з відповідними параметрами у випадках НЗЛ та NBS без онкологічних ускладнень: 26,0±5,7, 6,3±2,3 та 2,8±1,5 на 100 м.п. відповідно (P<0,001). Одночасно відмічено парадоксальне зростання частки клітин з ПРЦ більше 3 хромосом каріотипу: 11,5±4,9, 2,6±2,2 та 1,8±1,3 на 100 м.п. відповідно (P<0,001). Виявлені особливості індукції часткового ПРЦ у випадку NBS, ускладненого розвитком НЗЛ, можуть відображати цитогенетичний фенотип нестабільності геному NBS1-дефіцитних клітин на шляху їх онкогенної трансформації. Якщо ж узагальнити всі отримані нами дані, достовірна індукції повного ПРЦ в культурах клітин хворих на гемобластози, синдроми хромосомної нестабільності та екологічно детерміновану патологію вказує на високу вірогідність асоціації даного явища з напруженням процесів ендогенного і екзогенного мутагенезу.
Функціонально-асоціативні зв’язки між індукцією передчасного розділення центромер та відомих цитологічних ознак
Достовірна індукція ПРЦ у гострому періоді гемобластозів, регресія його параметрів на стадії ремісії та поширеність в культурах крові без мітогенної стимуляції бласттрансформації вказували на високу вірогідність бластної природи ПРЦ-клітин. Таке припущенням було зроблене Y. Shiraishi et al. (1982) та L.G. Littlefield et al. (1985) за результатами поодиноких знахідок “розщеплення центромер”у дорослих хворих на ГМЛ. Нами встановлено існування достовірної позитивної лінійної залежності між рівнем бластів у крові та індукцією часткового ПРЦ в культурах крові і кісткового мозку (коефіцієнт кореляції p=0,81, P<0,001). Це обґрунтовано доводить, що часткове ПРЦ є вірогідною ознакою цитогенетичного фенотипу бластних клітин.
Часткове ПРЦ вважається одним із провідних механізмів нерозходження хромосом, втрати клітин та утворення анеуплоїдії, в тому числі і при формуванні гіподиплоїдних клонів лейкемічних клітин (P.H. Fitzgerald et al., 1975; K. Mehes, 78; J.H. Gallo et al., 1984). Основу для даної концепції створили випадкові знахідки одночасної індукції ПРЦ та анеуплоїдних клітин в практиці каріотипування пацієнтів та досліджень трансформованих культур клітин. Нами доведено існування позитивної лінійної залежності між рівнем індукції часткового ПРЦ та анеуплоїдії в культурах крові і кісткового мозку хворих на гемобластози (коефіцієнт кореляції p=0,84, P<0,001). Достовірний характер даної залежності відтворювався при диференційному врахуванні ПРЦ різної кількості хромосом, причому найбільш тісний зв’язок з продукцією анеуплодії виказало явище ПРЦ 1 хромосоми: p=0,85, (P<0,001) при 0,63<p<0,68 (P<0,001) в інших випадках. Це вказує на провідну роль передчасного розділення однієї хромосоми в генезі анеуплоїдії проліферуючих клітин, а беручи до уваги виявлену нами позитивну лінійну залежність між рівнем бластних клітин у крові та часткою ПРЦ-1 в культурі (p=0,71, P<0,001), втрату однієї хромосоми можна розглядати як первинну подію на шляху онкогенної трансформації. Узагальнюючі все вище викладене, нами вперше статистично обгрунтовано гіпотезу, що передчасне розділення центромер метафазних хромосом є високоймовірною причиною втрати хромосом та формування анеуплоїдії.
E. Bьhler із співавторами (1987) одними з перших припустили, що ПРЦ є ознакою хромосомної нестабільності. Якщо притримуватись даного положення, то виникнення ПРЦ повинно відбуватись у взаємозв’язку з індукцією достовірних маркерів хромосомної нестабільності і, в першу чергу, з появою хромосомних аберацій. Нами встановлено відповідність у спонтанному рівні часткового ПРЦ (1,4±0,3 на 100 м.п.) та хромосомних аберацій в лімфоцитах дітей з Львівської популяції (1,20±0,09 та 1,25±0,10 на 100 м.п.), визначених відповідно в нашій роботі та дослідженні М.А. Пілінської із співавторами (2004). Аналогічну картину зареєстровано при дослідженні лімфоцитів in vitro здорових жінок: 3,0±0,6 та 2,6±0,3 на 100 м.п. часткового ПРЦ та аберантних клітин відповідно. Підвищений рівень хромосомних аберацій в культурах клітин пацієнтів з ГЛЛ та дітей з ЗРК Житомирської області (6,4±0,6 та 7,2±1,9 на 100 м.п. відповідно) також асоціювався з достовірною індукцією часткового ПРЦ порівняно з контролем (табл. 1). Поряд з цим, нами встановлено позитивний лінійний зв’язок між рівнем індукції аберантних клітин та часткового ПРЦ (p=0,54 P<0,001), який вибірково стосувався аберацій хроматидного типу (p=0,52, P<0,001) і не поширювався на аберації хромосомного типу (p=0,17, P>0,05). Отже, індукція часткового ПРЦ відбувається послідовно з утворенням хромосомних аберацій, що дозволяє трактувати передчасне розділення окремих хромосом як закономірну ознаку хромосомної нестабільності. Це узгоджується з рекомендаціями J. Major із співавторами (1999) про доцільність врахування часткового ПРЦ в практиці цитогенетичного моніторингу генотоксичних впливів.
Індукція повного ПРЦ не виявила лінійної залежності з формуванням хромосомних аберацій, що могло пояснюватись суттєвими міжособовими відмінностями його маніфестації в клітинах крові і кісткового мозку обстежених пацієнтів. Так, третина дітей, хворих на ГЛЛ або ГМЛ виявились нездатними генерувати дане явище (0—% м.п. в культурі), третина —відтворювали його у 2—% м.п. і третина —демонстрували парадоксально високий рівень в межах 20—% м.п. Це дозволило припустити вірогідний зв’язок між рівнем індукції повного ПРЦ та особливостями клінічного перебігу гемобластозів. Нами проведено ретроспективний аналіз характеру перебігу ГЛЛ або ГМЛ у 36 пацієнтів через 6—років після цитогенетичного обстеження в гострому періоді захворювання. У випадках швидкого рецидиву або летального кінця захворювання зареєстровано незначну продукцію повного ПРЦ: 2,5±1,3 проти 12,6±3,3 на 100 м.п. за умов досягнення стійкої ремісії (P<0,05). Летальний кінець захворювання відмічено у 9 з 14 пацієнтів, в яких відсоток повного ПРЦ у гострому періоді ГЛЛ або ГМЛ складав 0—%, і лише у 4 з 21 випадках, де він дорівнював 2—% клітин (P<0,05). Отже, вірогідність досягнення ремісії ГЛЛ та ГМЛ виявилась достовірно вищою за умов індукції в культурах крові та кісткового мозку більше 2% мітотичних клітин з явищем повного ПРЦ.
Для того, щоб глибше оцінити можливості використання явища повного ПРЦ з прогностичною метою, у 30 пацієнтів з різним клінічним перебігом захворювання проаналізовано інформативні клініко-лабораторні критерії прогнозування ГЛЛ. Випадки практичної відсутності повного ПРЦ асоціювались з більш вагомими проявами геморагічного синдрому та з тотальним збільшенням печінки, селезінки і лімфовузлів (P<0,01). Індукція повного ПРЦ більше ніж в 2% мітотичних клітин асоціювалась з досягненням стійкої ремісії (>5 років), порівняно низьким рівнем лейкоцитів і бластів, більш високим рівнем тромбоцитів та гемоглобіну, ізольованим збільшенням печінки, селезінки або лімфовузлів (0,001<P<0,02). Отже, рівень індукції повного ПРЦ в культурах крові і кісткового мозку в гострому періоді ГЛЛ та ГМЛ достовірно корелював з інформативними клініко-лабораторними ознаками, які використовуються для прогнозування перебігу гемобластозів у дітей. Це вказує на перспективність врахування рівня індукції повного ПРЦ в гострому періоді ГЛЛ та ГМЛ у дітей для прогнозування перебігу захворювання. “Контрольні”показники індукції повного ПРЦ можна трактувати як вірогідну ознаку несприятливого перебігу захворювання, що передбачає застосування більш радикальних схем хіміотерапії, а його реєстрація більше ніж в 2% мітотичних клітин асоціюється з позитивним прогнозом за умов застосування стандартних протокольних схем хіміотерапії.
Інтенсивність процесів апоптозу в клітинах з достовірною індукцією явища центромерної нестабільності
Підвищена індукція повного ПРЦ в культурах клітин обстежених нами пацієнтів, як правило, асоціювалась з позитивним перебігом захворювання. На це вказували достовірно більш висока частота випадків досягнення стійкої ремісії у пацієнтів з ГЛЛ та ГМЛ, асоціація підвищеної індукції повного ПРЦ з більш легким перебігом екологічно детермінованого захворювання, викликаного впливом солей важких металів і фтору, а також низький рівень клональної анеуплоїдії клітин крові і кісткового мозку у випадках МДС у дітей, які відзначились високою індукцією повного ПРЦ (16—% м.п.). З іншого боку, незначна індукція повного ПРЦ асоціювалась з швидким рецидивом або летальним кінцем ГЛЛ та ГМЛ, високим рівнем анеуплоїдних клітин в культурах крові і кісткового мозку дітей з МДС (10—%) та підвищеним ризиком його трансформації в ГМЛ. Все це створило підстави для припущення, що індукція повного ПРЦ відбувається в клітинах з нестабільним геномом. Свідченнями правомірності даного положення виявились факти одночасної реєстрації підвищеної індукції повного ПРЦ та хромосомних аберацій в лімфоцитах пацієнтів з синдромами хромосомної нестабільності. Особливо демонстративним це виявилось у випадках синдрому Ніймеген: 2,3±1,0 повного ПРЦ та 11,3±3,3 аберантних клітин на 100 м.п. відповідно (0,04±0,04 та 1,2±0,2% м.п. відповідно в контролі, P<0,001). Специфічні перебудови хромосом 7 та 14 знаходили в середньому у 8% м.п. пацієнтів з NBS: inv(7)(p13;q35), t(7;14)(q35;q11), t(7;14)(p13;q11), t(7;7)(p13;q35), t(7p13;14q32), del(7)(q35), del(14)(q11). У 5% м.п. зареєстровано аберації хромосомного типу з частим ураженням центромерних і перицентромерних ділянок хромосом 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10 та Y.
Ми першими припустили, що індукція повного ПРЦ відбувається в клітині, яка вступає в мітоз з нестабільним геномом, і це явище можна вважати цитогенетичною ознакою реалізації програми “мітотичної катастрофи”. Доведено, що індукція мітотичної катастрофи відбувається за умов дисфункції елементів G2 checkpoint (в першу чергу, протеїнкіназ ATM, NBS1 та СHK2), а її природнім завершенням є апоптична загибель клітини в G1 фазі (M.C. Raff, 1992; T.A. Chan et al., 1999; Castedo et al., 2004). Поряд із значним поступом в розшифровці молекулярних механізмів мітотичної катастрофи, її цитогенетичні ознаки практично не досліджувались. Достовірне підвищення рівня хромосомних аберацій і повного ПРЦ, виявлене нами в культурах ATM- та NBS1-дефіцитних лімфоцитів пацієнтів з СХН, доводить закономірність індукції повного передчасного розділення хромосом в мітотичних клітинах з нестабільним геномом та дисфункцією G2 checkpoint.
Вступ у мітоз клітини з нестабільним геномом загрожує відтворенням анеуплоїдних дочірніх клітин з підвищеною схильністю до онкогенної трансформації (K.K. Khanna et al., 2001). На нашу думку, індукція повного ПРЦ дозволяє заблокувати ефективний мітотичний поділ, щоб не допустити відтворення хромосомної нестабільності в дочірніх клітинах. Оскільки індукція повного ПРЦ відбувається у прометафазі (P.H. Fitzgerald, 2002), це виключає можливість повноцінної організації метафазної пластинки і гальмує індукцію клітинного поділу та утворення дочірніх клітин. Як результат, клітина завершує мітоз з тетраплоїдним геномом і в G1 фазі стає суб’єктом p53-залежного tetraploidy checkpoint, під час якого відбувається індукція апоптозу (J.S. Lanni et al., 1998; K.H. Baek et al., 2004; L. Michel et al., 2004; M. Castedo et al., 2004). Отже, формування повного ПРЦ супроводжує реалізацію програми мітотичної катастрофи і з високою ймовірністю спрямоване на ефективну елімінацію аберантних клітин з проліферативного пулу шляхом індукції апоптозу в G1 фазі циклу.
Для того, щоб оцінити рівень напруженості апоптозу в клітинах, які в культурі відзначились високою індукцією повного ПРЦ, нами застосовано автоматичну проточну цитометрію, аналіз люмінесценції клітин, оброблених прижиттєво акридином оранжевим та визначення інформативних цитологічних ознак апоптичної трансформації клітини (фрагментація ядра, відбрунькування апоптичних тілець). Достовірно підвищений рівень апоптозу порівняно з контролем зареєстровано в лімфоцитах пацієнтів з СХН, в клітинах крові і кісткового мозку хворих на гемобластози, а також в ГЕПК (табл. 2), тобто в усіх випадках, які за даними цитогенетичних досліджень, відзначились високою індукцією повного ПРЦ (табл. 1). Поряд з цим, встановлено достовірну позитивну лінійну залежність між відсотком повного ПРЦ і вмістом апоптичних клітин у крові хворих на гемобластози (коефіцієнт кореляції с=0,87, Р<0,01) та частотою реєстрації клітин з цитологічними ознаками апоптозу на препаратах хромосом ГЕПК (с=0,40, P<0,05). Отже, гемопоетичні клітини ембріонів та хворих на гемобластози виявились найбільш інформативними для аналізу залежності між рівнем індукції повного ПРЦ та інтенсивністю апоптозу.
|
|
|
Рівень напруженості апоптозу в лімфоцитах здорових осіб, гемопоетичних ембріональних печінкових клітинах людини та лімфоцитах хворих на гемобластози, синдроми хромосомної нестабільності і екологічно детерміноване захворювання |
|
Об’єкт дослідження |
Кількість зразків I / II / III |
Відсоток апоптичних клітин, виявлених за методами |
|||||
|
Проточна цитометрія (I) |
Люмінесцентний аналіз (II) |
Цитологічні ознаки (III) |
|||||
|
% |
Р |
% |
Р |
% |
Р |
||
|
Контроль* |
20/ 15/ 15 |
,2±0,02 |
— |
,9±1,4 |
— |
,1±0,9 |
— |
|
Контроль** |
15/ 15/ 15 |
,1±0,8 |
— |
,9±1,4 |
— |
,1±0,9 |
— |
|
ГЕПК |
12/ 10/ 10 |
27,5±1,7 |
<0,001 |
,4±3,1 |
<0,001 |
,8±1,3 |
<0,05 |
|
Гемобластози |
13/ —/ — |
3,3±1,0 |
<0,001 |
— |
— |
— |
— |
|
СХН |
10/ —/ — |
,0±5,9 |
<0,001 |
— |
— |
— |
— |
|
ЕДЗ |
12/ 32/ 23 |
,3±1,5 |
>0,05 |
19,8±1,3 |
<0,01 |
,2±0,8 |
<0,01 |
|
Примітки |
Кількість зразків подано відповідно до їх обсягу при застосуванні методів I, II, III |
|
Контроль* —для порівняльних досліджень у випадках ГЕПК і гемобластозів |
|
|
Контроль** —для порівняльних досліджень у випадках СХН та ЕДЗ |
|
|
ГЕПК —гемопоетичні ембріональні печінкові клітини |
|
|
СХН —синдроми хромосомної нестабільності |
|
|
ЕДЗ —екологічно детерміноване захворювання |
|
|
Р —ступінь достовірності різниці з контролем |
|
|
—визначення не проводили |
В спеціальній літературі представлено лише 2 роботи, в яких постулюється позитивний зв'язок між індукцією повного ПРЦ під впливом солей миш'яку та напруженістю апоптозу в трансформованих клітинах HeLa (S. Huang et al., 2000) і фібробластах людини (L.H. Yih, T.C. Lee, 2003). В нашій роботі закономірність даного зв’язку обґрунтовано для короткочасних культур гемопоетичних клітин людини, що є максимально наближеним до практики медико-генетичних досліджень.
Обов’язковою умовою ефективної індукції апоптозу в G1 фазі циклу є збереження функціональної активності білка-супресора пухлин P53 дикого типу, дисфункція якого асоціюється з формуванням анеуплоїдних клітин з високою онкогенною здатністю (K. Matsumoto, T. Ohta, 1993; M. Castedo et al., 2004). За сучасними поглядами, які розвивають концепцію B. Dutrillaux (1991), найбільш вірогідним джерелом утворення анеуплоїдних клонів є поліплоїдія, що виникає внаслідок ендоредуплікації диплоїдного набору хромосом. Питання про цитогенетичні ознаки клітини-попередника ендоредупліканта було нез’ясованим. Ми припустили, що найбільш вірогідним кандидатом на цю роль є фенотип повного ПРЦ. Якщо уявити, що клітина з повним ПРЦ увійде в наступний мітотичний цикл, то після реплікації вона з високою ймовірністю набуде вигляду, який відповідає класичній конституції ендоредуплікованої поліплоїдної клітини (рис. 3).
За повної відсутності поліплоїдії в контролі, такі клітини зареєстровано в усіх випадках, які відзначились достовірною маніфестацією повного ПРЦ: 0,6—,8 на 100 м.п. в культурах крові і кісткового мозку хворих на гемобластози і СХН та 0,7—,2 на 100 м.п. в культурах пренатальних тканин. Зразки пренатального матеріалу продемонстрували значну міжтканинну варіабельність за рівнем маніфестації повного ПРЦ і поліплоїдії. Так, при 15% повного ПРЦ в ГЕПК рівень поліплоїдних клітин не перевищував 1%, тоді як в цитотрофобласті хоріону удвічі нижчий рівень індукції повного ПРЦ асоціювався з підвищеною продукцією поліплоїдії: 7,4±1,7 і 2,2±0,8 на 100 м.п. відповідно. Найбільш парадоксальні відмінності за рівнем індукції повного ПРЦ і поліплоїдії зареєстровано в амніоцитах: 2,1±0,5 та 8,2±1,0 на 100 м.п. відповідно. Ми припустили, що причиною виявлених відмінностей за частотою появи поліплоїдних клітин в тканинах з виразною індукцією повного ПРЦ може бути різниця в експресії білка P53 дикого типу —провідного індуктора апоптозу клітин в G1 фазі циклу. За результатами порівняльно-імуногістохімічних досліджень зразків цитотрофобласту хоріону і ембріональної печінки людини, нами вперше встановлено достовірну експресію P53 в 60%—% ГЕПК, тоді як клітини цитотрофобласту хоріону відзначились значною експресією його антагоніста Bcl-2. Отримані результати дозволяють пов’язати різницю у ступені поліплоїдизації клітин цитотрофобласту хоріону і ГЕПК з тканиноспецифічним профілем експресії індукторів та протекторів апоптозу. В ГЕПК, клітини з повним ПРЦ вірогідно завершують свій життєвий цикл шляхом індукції p53-залежного апоптозу і тому не вступають в подальший редуплікаційний цикл з відтворенням поліплоїдного каріотипу. Правомірність даного положення засвідчують і найвищі показники індукції апоптозу в ГЕПК порівняно з іншими модельними об’єктами, зареєстровані за результатами застосування 3-х незалежних методів детекції апоптозу (табл. 2). В цитотрофобласті хоріону частка клітин з повним ПРЦ вірогідно уникає апоптозу за рахунок експресії Bcl-2, що надає їм можливість ендоредуплікації в наступному мітотичному циклі з відтворенням поліплоїдних клітин. Отже, індукція повного ПРЦ асоціюється з апоптичною загибеллю постмітотичних клітин, а в поєднанні із зниженою експресією P53 дикого типу загрожує продукцією поліплоїдії в наступному мітотичному циклі.
Узагальнюючі проведені дослідження центромерної нестабільності в короткочасних культурах соматичних клітин людини, ми вважаємо, що індукція передчасного розділення центромер (ПРЦ) мітотичних хромосом —це закономірна реакція геному у відповідь на екзогенне або ендогенне пошкодження ДНК, а також вірогідний елемент генетичних програм, пов’язаних з процесами тканинної диференціації, онкогенної трансформації та клітинної загибелі. Часткове ПРЦ є вірогідним наслідком генотоксичного впливу і маніфестує послідовно з індукцією хромосомних аберацій, а його виникнення можна розглядати як результат інактивації центромерного білкового комплексу внаслідок локальної хромосомної ламкості. Індукція часткового ПРЦ загрожує клітині втратою хромосом та утворенням анеуплоїдії і асоціюється з ризиком онкогенної трансформації. Індукція повного ПРЦ відбувається в клітинах з нестабільним геномом, які не змогли здійснити ефективну репарацію пошкоджень ДНК або індукцію апоптозу в G2 фазі циклу і увійшли в мітоз. Індукція повного ПРЦ попереджує ефективний перебіг мітотичного поділу, через що клітина опиняється в G1 фазі з тетраплоїдним вмістом ДНК, де за умов повноцінної експресії P53 дикого типу, гине шляхом апоптозу. Аномальна експресія P53 асоціюється з уникненням апоптозу та вступом клітини з повним ПРЦ в подальший мітотичний цикл, що загрожує продукцією поліплоїдії та утворенням анеуплоїдних дочірніх клітин з високою онкогенною здатністю.
Основні характеристики С-поліморфізму хромосом в пренатальний та постнатальний період нормального онтогенезу людини
При аналізі С-поліморфізму хромосом 1, 9, 16 і Y в лімфоцитах in vitro здорових осіб, які представляли досліджену популяцію, виявлено 5 класів С-варіантів. Модальним класом виявились С-сегменти 3-бальної величини, які зустрічались на 55—% досліджених хромосом 1, 9, 16 пар та 80% Y-хромосом. 2-бальні та 4-бальні С-варіанти склали 10—20% та 8—30% хромосом відповідно, тобто зустрічались практично з однаковою частотою. С-сегменти розмірами 1 і 5 балів та випадки повних перицентричних інверсій 9 хромосоми розглядались як екстраваріанти С-поліморфізму (ЕВП) і були зареєстровані 7,8% обстежених осіб, з них 5,8% виявилися носіями одного і 2% —двох ЕВП в каріотипі. Отримані дані вказують на нормальний розподіл С-поліморфних варіантів в дослідженій популяції і незначну частку носіїв екстраваріантів, що узгоджуються з результатами інших досліджень, виконаних із застосуванням аналогічного методу (Т.Г. Цветкова, 1981; О.А. Подугольникова с соавт., 1981).
Достовірно підвищену частоту С-сегментів 4-бального розміру виявлено в клітинах цитотрофобласту ex vivo та амніоцитах in vitro порівняно з лімфоцитами постнатально обстежених осіб на хромосомах 9 пари (56—70% і 34% відповідно, P<0,01) і 16 пари (23—30% і 9% відповідно, P<0,01). За результатами напівкількісного та кількісного аналізу С-поліморфізму в ГЕПК встановлено достовірне зменшення лінійних розмірів С-сегментів на хромосомах 1, 9 та 16 порівняно з лімфоцитами постнатально обстежених осіб, що узгоджується з даними власних попередніх досліджень (Г.Р. Акопян, 1988). ГЕПК і клітини цитотрофобласту також відзначились достовірним вкорочення гетерохроматинової ділянки довгого плеча Y-хромосоми (Yqh-), про що свідчила достовірно підвищена частота реєстрації невеликих 2-бальних С-сегментів: 40—53% та 11% в лімфоцитах відповідно (P<0,01). Частота реєстрації 1- і 5-бальних С-сегментів та повних перицентричних інверсій виявилась однаковою в клітинах пренатального і постнатального походження, тоді як рівень часткових перицентричних інверсій достовірно перевищував показники лімфоцитів: у цитотрофобласті на хромосомах 1 пари (13,3% та 0% відповідно, P<0,01) та в цитотрофобласті і амніоцитах на хромосомах 9 пари (33,3—,8% і 6,7% відповідно, P<0,01). Отже, за результатами порівняльно-онтогенетичних досліджень не виявлено відмінностей за частотою носійства класичних екстраваріантів С-поліморфізму хромосом 1, 9, 16 і Y (1- і 5-бальних С-сегментів та повних перицентричних інверсій). При цьому, клітини цитотрофобласту і амніоцити відзначились достовірно більш високою частотою реєстрації 4-бальних макроваріантів і часткових перицентричних інверсій, а гемопоетичні ембріональні печінкові клітини — 2-бальних мікроваріантів С-поліморфізму.
Абсолютні розміри С-сегментів хромосом 1, 9, 16 і Y в ГЕПК ex vivo виявились відповідними до параметрів фібробластів in vitro спонтанних і артифіціальних абортусів, визначених С.А. Назаренко (1992) на основі запропонованого нами методу. Це вказує на закономірний характер виявленої різниці у розмірах гетерохроматинових районів в ГЕПК та лімфоцитах постнатально обстежених осіб. Вірогідною причиною відносного зменшення розмірів С-сегментів в ГЕПК ми вважаємо прискорення клітинного циклу в попередниках ембріональних еритроцитів, спрямоване на підвищення їх проліферативної активності в процесі реалізації програми печінкового еритропоезу. Це не виключає можливості стадіоспецифічної мінливості балансу конститутивного гетерохроматину в ранньому онтогенезі людини, яку пов’язують з необхідністю активації ембріоспецифічних генів (А.А. Прокофьева-Бельговская, 1986; О.А. Подугольников; В.Г. Солониченко, 1994; Т.В. Кузнецова, 2000).
Потребували пояснення знахідки підвищеної частоти носійства макроваріантів і часткових перицентричних інверсій в матеріалі цитотрофобласту і клітин амніотичної рідини. Відмінності за їх частотою порівняно з лімфоцитами постнатально обстежених осіб були настільки значними, що виключали можливість успадкування, а відтак, вказували на високу ймовірність утворення згаданих С-варіантів в соматичних клітинах de novo. Зважаючи на відсутність повідомлень про можливість локальної ампліфікації сателітних ДНК в нетрансформованих клітинах людини, ми припустили, що причиною формування фенокопій макроваріантів і часткових перицентричних інверсій в культивованих клітинах цитотрофобласту і амніотичної рідини є деконденсація прицентромерного гетерохроматину. Це узгоджується з результатами досліджень, в яких доведено мінливість ступеня деконденсації прицентромерного гетерохроматину в культурах цитотрофобласту і амніотичної рідини (D. Cruz et al., 1999; M. Ehrlich et al., 2001; F. Tsien et al., 2002), виникнення якої в клітинах цитотрофобласту зумовлене гіпометильованим станом С-гетерохроматину (Т.В. Кузнецова, 2000; А.А. Пендина, 2002, F. Tsien et al., 2002). Отже, значна частка макроваріантів С-поліморфізму і часткових перицентричних інверсій в досліджених зразках цитотрофобласту хоріону ex vivo та амніоцитах in vitro є вірогідними фенокопіями конститутивних С-варіантів, які формуються в соматичних клітинах внаслідок деконденсації прицентромерного гетерохроматину. Відтак, представлялось доцільним оцінити структуру хромосомного поліморфізму при патологічних станах у людини в аспекті вірогідної деконденсації ділянок конститутивного гетерохроматину.
С-поліморфізм хромосом при патологічних станах у людини
При порівнянні з контролем не виявлено відмінностей за частотою екстраваріантів С-поліморфізму хромосом 1, 9, 13—, 21, 22 та Y в контингенті пацієнтів з невиношуванням вагітності (табл. 3). В групі подружніх пар з непліддям, серед чоловіків достовірно переважали носії Y-хромосоми із вкороченою гетерохроматиновою ділянкою (Yqh-), за повної відсутності таких випадків в контролі (10,2%, ч2=6,0, P<0,02). Підвищений відсоток носіїв Yqh- також виявлено серед пацієнтів з азооспермією і нормальним каріотипом (17,9%, ч2=16,8; P<0,01), серед жінок з псевдочоловічим гермафродитизмом і каріотипом 46,XY (18,2%, ч2=7,69, P<0,01), а також в контингенті пацієнтів з трисомією-21 та серед їх батьків (10% та 6% відповідно, ч2=11,3 та 7,3; P<0,01). Отримані результати узгоджуються з даними літератури про підвищену частоту високої делеції Y-хромосоми серед пацієнтів з непліддям і азооспермією та доцільність врахування даного С-поліморфного варіанта для визначення причини репродуктивних порушень в родині.
Значна поширеність високої делеції Y-хромосоми в контингенті пацієнток з чоловічим псевдогермафродитизмом виявлена нами вперше і потребує подальших досліджень. Пацієнти чоловічої статі з порушеннями фертильності та батьки дітей з трисомією-21 також відзначились достовірно підвищеною частотою повної перицентричної інверсії 9 хромосоми: 15,4% та 12,3% носіїв відповідно при 2,2% в контролі (ч2=6,5, P<0,02). Отже, за результатами дослідження С-поліморфізму хромосом 1, 9, 16, Y, D, G в контингентах високого ризику за народженням анеуплоїдного потомства, високовірогідну асоціацію з нерозходженням хромосом та формуванням клініки непліддя і народження дітей з трисомією-21 продемонстрували С-поліморфні варіанти Yqh- та 9ph+, тобто висока делеція довгого плеча Y-хромосоми та повна перицентрична інверсія гетерохроматину на хромосомах 9 пари.
|
Таблиця 3 |
|
Частота реєстрації екстремальних варіантів С-поліморфізму хромосом 1, 9, 16, 13–15 (D), 21–(G) та Y в культивованих лімфоцитах пацієнтів Львівського медико-генетичного центру |
|
Об’єкт дослідження |
К-сть обсте-жених/ чолов. статі |
% носіїв НСХ |
% носіїв ЕВП |
% носіїв >1 ЕВП |
% носіїв ЕВП окремих хромосом |
|
qh+ |
qh+ |
ph+ |
qh+ |
qh- qh- qh- |
Yqh+ |
Yqh- |
Dph+ Gph+ |
|||||
|
КОНТРОЛЬ |
90/39 |
,8 |
,2 |
,1 |
,2 |
,3 |
,2 |
|||||
|
Непліддя |
172/88 |
,7 |
,9 |
,3 |
,1 |
,9 |
,2 |
,2* |
,5 |
|||
|
Невиношування вагітності |
721/358 |
,3 |
,3 |
,1 |
,3 |
,5 |
,6 |
,4 |
,1 |
,8 |
,1 |
,9 |
|
Синдроми анеуплоїдій |
84/40 |
,8* |
,1* |
,5* |
,3 |
,0* |
,0 |
,1* |
,2 |
,5 |
,0 |
,5* |
|
Батьки дітей з трисомією-21 |
73/34 |
,7* |
42,5* |
,0* |
,4 |
,3* |
,3* |
,7 |
,9 |
,9* |
,1* |
|
|
Азооспермія (46, XY) |
39 |
,3* |
,1* |
,8* |
,1* |
,8* |
,4* |
,6 |
,1 |
,6 |
,9* |
,8* |
|
Аменорея (46, XY) |
33 |
,1* |
,3 |
,2* |
,2* |
,1 |
,2* |
,1 |
||||
|
Аменорея (46, XX) |
81 |
4,9* |
69,1* |
37,0* |
11,1* |
55,6* |
12,3* |
14,8* |
8,6 |
— |
— |
,5* |
|
Примітки |
ÍÑÕ –íåñòàá³ëüí³ñòü õðîìîñîì (àáåðàö³¿, ÏÐÖ) |
|
ЕВП –екстремальні варіанти С-поліморфізму (qh+, qh-, ph+) |
|
|
(qh+) –макроваріанти С-поліморфізму, коли розміри С-сегментів перевищують 4 бали |
|
|
(qh-) –мікроваріанти С-поліморфізму, коли розміри С-сегментів є меншими ніж 2 бали |
|
|
(9ph+) –повна перицентрична інверсія прицентромерного гетерохроматину 9 хромосоми |
|
|
(Dph+, Gph+) –збільшені короткі плечі акроцентричних хромосом |
|
|
Синдроми анеуплоїдій –випадки трисомії-21, X-моносомії та синдрому Клайнфельтера |
|
|
*достовірно підвищена частота реєстрації порівняно з контролем (P<0,05; P<0,01) |
Випадки верифікованих хромосомних анеуплодій (трисомія-21, X-моносомія, синдром Клайнфельтера) та батьки пацієнтів відзначились підвищеною частотою носійства макроваріантів С-поліморфізму, розміри яких перевищували 4-бальні: 42,5–,4% носіїв при 4,5% в контролі (ч2=19,5–,2; P<0,01). Найбільш часто великі С-сегменти локалізувались на хромосомах 9 пари (42,7% всіх зареєстрованих ЕВП), наступним за частотою виявилось збільшення коротких плеч акроцентричних хромосом, переважно Dph+ (18,2% всіх ЕВП), і порівняно рідко ЕВП локалізувались на хромосомах 1 і 16 пар (9,4% та 8,7% відповідно). Якщо здорові особи переважно були носіями 1 ЕВП, то в контингентах пацієнтів і їх батьків достовірно переважали носії декількох макроваріантів (10,8—,6% носіїв при 2,2% в контролі, ч2=4,1—,1; 0,001<P<0,05). Виявлене нами майже 10-кратне перевищення популяційних показників за частотою реєстрації макроваріантів С-поліморфізму та випадків носійства декількох макроваріантів серед пацієнтів з хромосомними анеуплоїдіями та їх батьків суперечили можливості їх успадкування і дозволяло розглядати як вірогідні фенокопії макроваріантів, що утворилися de novo в соматичних клітинах.
Відомо, що деконденсація С-гетерохроматину може бути індукована гормональними чинниками і притаманна для гормон-продукуючих тканин плаценти та щитоподібної залози. Це підтверджується результатами наших досліджень стосовно достовірно підвищеної реєстрації макроваріантів та часткових перицентричних інверсій в клітинах цитотрофобласту хоріону. Аналогічні параметри С-поліморфізму виявлено в лімфоцитах пацієнтів з порушеннями статевої диференціації, фертильності та схильності до народження анеуплоїдного потомсва, у яких дисбаланс гонадотропних, стероїдних або тиреоїдних гормонів відіграє провідну роль в патогенезі захворювання. Згідно гіпотези D. D'Souza із співавторами (1988), існує висока ймовірність “ендогенного мутагенезу”, зумовленого гормональним дисбалансом. Все це створює підстави для асоціації явища деконденсації прицентромерного гетерохроматину з індукцією нестабільності геному внаслідок тривалого гормонального дисбалансу, а з іншого боку, дозволяє розглядати фенотип макроваріанту та часткової перицентричної інверсії як прояви хромосомної нестабільності.
Дане положення підтверджується результатами реєстрації підвищеного рівня хромосомної нестабільності в культивованих лімфоцитах носіїв макроваріантів, встановлених за даними літератури (В.Г. Дружинин, 1991) та власних досліджень. Парадоксально високий рівень часткових перицентричних інверсій знайдено нами в матеріалі цитотрофобласту хоріону, для якого доведено прямий зв’язок між деконденсацією гетерохроматину та індукцією хромосомної нестабільності (F. Tsien et al., 2002; T. Suzuki et al., 2002). В досліджених нами випадках порушень статевої функції у чоловіків з нормальним каріотипом 40% виявились носіями макроваріантів (4,5% в популяції), а в 10% досліджених культур відмічено достовірну індукцію хромосомної нестабільності з реєстрацією хромосомних аберацій та (або) ПРЦ більше ніж в 4% м.п. Часткові перицентричні інверсії 9 хромосоми зареєстровано у кожної другої пацієнтки з вторинною аменореєю та нормальним каріотипом і лише у 4—% випадках первинної аменореї та популяційного контролю. При цьому, групи пацієнток з первинною аменореєю різного ґенезу (в асоціації з нормальним каріотипом, X-моносомія, XY-жінки) не відрізнялись за параметрами С-поліморфізму, хоча в усіх випадках продемонстрували достовірне перевищення популяційних показників за частотою реєстрації макроваріантів. Отримані результати узгоджуються з даними літератури стосовно високої частоти носійства макроваріантів і часткових інверсій С-сегментів, а також щодо підвищеної індукції хромосомної нестабільності при порушеннях менструальної функції різного генезу (И.Г. Дзенис, 1982; H.-A. Freye, K. Zernahle; И.П. Кривич, 1990; Е.А. Кириллова, Т.Г. Цветкова, 1994) і підтверджують правомірність положення про неспецифічність фенотипу С-поліморфізму у випадках поліетіологічного гормонального дисбалансу (Е.А. Кириллова, Т. Г. Цветкова, 1994).
Узагальнюючі все вище викладене, ми вважаємо, що фенотип макроваріанту хромосомного С-поліморфізму може перманентно виникати в соматичних клітинах людини під дією чинників, здатних порушувати метаболізм гетерохроматину та індукувати його деконденсацію. Зважаючи на вагому роль метилювання гетерохроматину у збереженні його конститутивного фенотипу та функціональних властивостей (M. Ehrlich, 2003; T. Cheutin, 2003), можна припустити зв’язок індукції макроваріантів С-поліморфізму в соматичних клітинах з локальним дефіцитом метилювання або гіпометилюванням геному в цілому. Беручи до уваги достовірну асоціацію гіпометилювання ДНК геному з онкогенною трансформацією клітин, ми пропонуємо відносити носіїв 2-х та більше великих гетерохроматинових районів та часткових перицентричних інверсій до групи ризику підвищеної індукції хромосомної нестабільності, яка підлягає цитогенетичному моніторингу.
Переважна більшість знахідок асоціації екстремальних С-поліморфних варіантів з патологічним фенотипом у людини пов’язана з видовженням лінійних розмірів прицентромерного гетерохроматину 9-ої хромосоми. При цьому, можливість перманентної мінливості розмірів прицентромерного гетерохроматину хромосоми 9 в соматичних клітинах практично не розглядалася. Доведено, що послідовно з індукцією термального шоку в мітотичних клітинах людини, в ділянці прицентромерного гетерохроматину 9-ої хромосоми з’являються білкові гранули із вмістом фактору термального шоку HSF1, з яким пов'язують реалізацію генетичної програми адаптативно-стресової реакції (M. Denegri et al., 2001; C. Jolly et al., 2002). Це вказує на високу ймовірність деконденсації прицентромерного гетерохроматину 9 хромосоми у відповідь на індукцію стресових реакцій, зокрема, для збільшення площі складування HSF1. Відповідно, знахідки великих блоків гетерохроматину на 9 хромосомі з набагато більшою ймовірністю свідчать про його перманентну деконденсацію в процесі реалізації адаптативно-стресових реакцій ніж про специфічну асоціацію з окресленим патологічним фенотипом. В даному контексті проглядається більш вагомий патологічний вплив мікроваріантів та повної перицентричної інверсії 9 хромосоми, що реалізується через обмеження ділянки складування активних сполук, асоційованих з HSF1.
Ми також пропонуємо власну концепцію щодо можливого залучення конститутивного гетерохроматину 1-ої хромосоми в реалізацію впорядкованого розділення хромосом в мітозі. На наш погляд, збереження критичної кількості прицентромерного гетерохроматину на згаданій хромосомі є необхідною умовою повноцінної реалізації затримки анафази (spindle checkpoint), до моменту повноцінної фіксації всіх хромосом набору на мітотичному веретені. Відомо, що пізнє розділення хромосоми 1, 9 і 16 пов’язують з великою кількістю локалізованого на них гетерохроматину (B.K. Vig et al., 1989). Периферичне розташування ділянок С-гетерохроматину в інтерфазному ядрі обумовлює більш пізню міграцію хромосом до центру і пізню фіксацію на мітотичному веретені, що підтримує сигнальну активацію механізму spindle checkpoint і сприяє вивільненню часу для повноцінної фіксації решта хромосом набору. Особлива роль 1-ої хромосоми в підтримці spindle checkpoint проглядається в тому, що вона належить до найдовших хромосом каріотипу і потребує найбільше часу для мітотичної конденсації перед зв’язуванням з веретеном. Оскільки швидкість конденсації прицентромерного гетерохроматину є набагато нижчою ніж еухроматинових плеч, це надає додатковий резерв для затримки фіксації хромосоми 1 на веретені порівняно з іншими представниками групи A, що є рівнозначними за довжиною, проте не містять прицентромерного гетерохроматину. Отже, пізня фіксація хромосом 1-ої пари на веретені з високою ймовірністю попереджує формування анеуплоїдної клітини і, в першу чергу, втрату великих хромосом, приналежних до груп A і B.
Узагальнюючі результати проведених досліджень, слід відзначити, що фенотип хромосомної нестабільності соматичних клітин ex vivo та in vitro, поряд з індукцією хромосомних аберацій і порушень плоїдності геному, характеризується достовірною маніфестацією явища центромерної нестабільності у проявах повного та часткового передчасного розділення центромер, формування псевдомакроваріантів хромосомного С-поліморфізму і часткових перицентричних інверсій прицентромерного гетерохроматину. Ми пропонуємо розглядати прояви центромерної нестабільності як достовірні ознаки хромосомної нестабільності і враховувати їх в практиці медико-генетичних досліджень та цитогенетичного моніторингу генотоксичних впливів.
ВИСНОВКИ
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
СПИСОК ОСНОВНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
АНОТАЦІЇ
Акопян Г.Р. Центромерна нестабільність та поліморфізм хромосом в нормі і при патології людини.—Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 03.00.15 —генетика. Інститут гігієни та медичної екології імені О.М. Марзеєва АМН України, Київ, 2006.
В дисертації представлені результати дослідження центромерної хромосомної нестабільності та С-поліморфізму хромосом в короткочасних культурах соматичних клітин людини на різних етапах нормального онтогенезу, при поширених патологічних станах, у взаємозв’язку з індукцією хромосомної нестабільності та апоптозу. Визначено фенотип і спонтанний рівень передчасного розділення центромер сестринських хроматид (ПРЦ) та доведено закономірність його індукції у взаємозв’язку з екзогенним або ендогенним пошкодженням ДНК, процесами тканинної диференціації, онкогенної трансформації і клітинної загибелі. Індукція часткового ПРЦ відбувається послідовно з утворенням хромосомних аберацій і загрожує втратою хромосом та формуванням анеуплоїдних клітин. Фенотип повного ПРЦ асоціюється з індукцією апоптозу та ендоредуплікацією. Значна частка знахідок макроваріантів С-поліморфізму в практиці медико-генетичних досліджень є фенокопіями, які утворюються в соматичних клітинах внаслідок деконденсації конститутивного гетерохроматину. Рекомендовано визначати параметри центромерної хромосомної нестабільності для діагностики і прогнозування синдромів хромосомної нестабільності, поширених гемобластозів та в практиці цитогенетичного моніторингу генотоксичних впливів.
Ключові слова: передчасне розділення центромер, хромосоми, хромосомна нестабільність, С-поліморфізм хромосом, захворювання людини.
Акопян Г.Р. Центромерная нестабильность и полиморфизм хромосом в норме и при патологии человека.—Рукопись.
Диссертация на соискание научной степени доктора медицинских наук по специальности 03.00.15 —генетика. Институт гигиены и медицинской экологии имени А.М. Марзеева АМН Украины, Киев, 2006.
В диссертации представлены результаты исследования центромерной хромосомной нестабильности и С-полиморфизма хромосом в кратковременных культурах соматических клеток человека в пренатальный и постнатальный период нормального онтогенеза, при различных патологических состояниях, во взаимосвязи с параметрами индуцированной хромосомной нестабильности и уровнем апоптоза. Выдвинуто концепцию про преждевременное разделение центромер сестринских хроматид (ПРЦ) как закономерное проявление индуцированной хромосомной нестабильности пролиферирующих клеток человека. Определены фенотип и спонтанный уровень ПРЦ в гемопоэтических эмбриональных печеночных клетках ex vivo, цитотрофобласте хориона и плаценты ex vivo, клетках амниотической жидкости in vitro, лимфоцитах крови и клетках костного мозга in vitro. Выявлены закономерности индукции ПРЦ в ответ на экзогенное или эндогенное повреждение ДНК, во взаимосвязи с процессами тканевой дифференцировки, онкогенной трансформации и клеточной гибели.
Установлено, что в условиях нормального пренатального и постнатального развития организма, преждевременное разделение 1—3 хромосом кариотипа (частичное ПРЦ), преимущественно групп С и E, воспроизводится в 1—4% митотических клеток, независимо от их тканевой принадлежности. Индукция частичного ПРЦ более чем 4% митотических клеток происходит последовательно с образованием хромосомных аберраций, достоверно ассоциируется с утратой хромосом и формированием анеуплоидии дочерних клеток. Регистрация преждевременного разделения 3—20 хромосом всех хромосомных групп ассоциируется с доклиническим течением и клинической манифестацией гемобластозов детского и взрослого возраста, демонстрирует позитивную линейную зависимость с уровнем бластов в периферической крови и достоверную регрессию на стадии ремиссии. Выборочная индукция преждевременного разделения хромосом группы B является типичным признаком лимфоцитов in vitro пациентов с синдромами хромосомной нестабильности и сочетается со специфической индукцией ПРЦ хромосом группы D в случаях атаксии-телеангиэктазии и хромосом группы A при синдроме Ниймеген.
Преждевременное разделение всех хромосом или одного гаплоидного набора (полное ПРЦ) практически не регистрируется в культивированных лимфоцитах и клетках костного мозга здоровых индивидов (0,06±0,04% м.п.), а в пренатальный период нормального онтогенеза является типичным для гемопоэтических эмбриональных печеночных клеток (14,9±2,2 на 100 м.п.), цитотрофобласта хориона и плаценты (7,4±1,7 на 100 м.п.) и амниоцитов (2,1±0,5 на 100 м.п.). Индукция полного ПРЦ более чем в 2% митотических клеток крови и костного мезга ассоциируется с доклиническим течением и клинической манифестацией гемобластозов, синдромов хромосомной нестабильности (атаксия-телеангиэктазия, синдром Ниймеген), повреждающим воздействием солей тяжелых металлов и фтора. В ремиссии гемобластозов уровень индукции полного ПРЦ соответствует показателям здоровых индивидов. Фенотип полного ПРЦ ассоциируется с клеточной гибелью в G1 фазе цикла, что подтверждено фактами достоверной индукции апоптоза в гемопоэтических эмбриональных печеночных клетках, лимфоцитах пациентов с синдромами хромосомной нестабильности, лимфоцитах детей с экологически детерминированным заболеванием, клетках костного мозга больных острым лейкозом, установленными за данными 3-х методов детекции апоптоза. Индукция полного ПРЦ и апоптоза в ГЕПК ассоциируется с достоверной экспрессией P53 дикого типа, что может служить объяснением низкого уровня формирования полиплоидии. Достоверная экспрессия Bcl-2 в цитотрофобласте хориона является вероятной причиной повышенного уровня полиплоидии, формирующейся вследствие блокады апоптоза в постмитотических клетках с полным ПРЦ. Таким образом, дисфункция P53 дикого типа в клеточных моделях с высокой индукцией полного ПРЦ ассоциируется с эндоредупликацией и формированием полиплоидии в последующем митотическом цикле.
Частота регистрации макровариантов С-полиморфизма хромосом 9, 16, D, G и частичных перицентрических инверсий 1-й и 9-й хромосом в цитотрофобласте, амниоцитах и в лимфоцитах пациентов с хромосомными анеуплоидиями и нарушениями фертильности, достоверно отличается от популяционных параметров, что опровергает возможность их унаследования и указывает на высокую вероятность формирования в соматических клетках. Обосновано высокую вероятность того, что значительная часть макровариантов С-полиморфизма и частичных перицентрических инверсий, регистрируемых в практике медико-генетических исследований, являются фенокопиями и формируются вследствие деконденсации прицентромерного гетерохроматина.
Рекомендуется учитывать параметры центромерной хромосомной нестабильности в практике диагностики и прогнозирования синдромов хромосомной нестабильности, гемобластозов и генотоксических воздействий на геном человека. Рекомендуется учитывать факты регистрации 2 и более макровариантов С-полиморфизма и частичных перицентрических инверсий как признаки индуцированной хромосомной нестабильности.
Ключевые слова: преждевременное разделение центромер,хромосомы, нестабильность кариотипа, С-полиморфизм хромосом, заболевания человека.
Akopyan H.R. Centromere instability and chromosomal polymorphism upon normal state and pathology of humans.—Manuscript.
Thesis for Doctor’s Degree in Medical Sciences on the specialty 03.00.15 —Genetics. Institute of Hygiene and Medical Ecology of Medical Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.
Chromosomal instability and C-polymorphism of chromosomes in short-term human somatic cells cultures were investigated on different stages of normal ontogenesis and upon wide-spread pathologic conditions in association with induction of karyotype instability and apoptosis. The phenotype and spontaneous level of premature centromere division (PCD) was established. We found evidences of PCD induction resulting from exogenous or endogenous DNA damage, tissue differentiation processes, malignant transformation and cell’s death. Induction of partial PCD leads to aberrations of chromosomes and may cause chromosome’s losses and formation of aneuploidy. Total PCD phenotype is associated with induction of apoptosis or endoreduplication in following mitotic cycle. The major part of large C-polymorphism variants, which were found in medical-genetic investigation practices, considered phenocopies formed in somatic cells as a result of heterochromatin decondensation. We recommend determination of centromere chromosomal instability parameters for diagnostics and prognosis of chromosomal instability syndromes, spread hemoblastosis and for cytogenetic monitoring of genotoxic influence.
Keywords: chromosomes, karyotype instability, premature centromere division, C-polymorphism of chromosomes, human diseases.