Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Методы изучения возбудимых клеток
Электрические явления, которые возникают в возбудимых тка нях, обусловлены электрическими свойствами клеточных мембран. Поэтому необходимо остановиться на методических подходах совре менной физиологии возбудимых тканей, используемых при иссле довании электрических характеристик клеточных мембран.
Любая физиологическая установка, предназначенная для изучения возбудимых клеток и тканей, должна содержать следующие основные элементы: 1) электроды для регистрации и стимуляции; 2) усилители биоэлектрических сигналов; 3) реги стратор; 4) стимулятор; 5) систему для обработки физиологической информации. В зависимости от задач исследования обычно требуется дополнительное оборудование. Поскольку в современной медицине широко используются методы электрофизиоло гического исследования и воздействия электрическим током, необходимо кратко познакомиться с основными методическими приемами.
При работе на изолированных органах, тканях и отдельных клетках применяют специальные камеры и растворы определенного состава, например Рингера-Локка, Тироде, Хэнкса, позволяющие в течение длительного времени поддерживать нор мальную жизнедеятельность биологического объекта. Во время эксперимента раствор должен быть насыщен кислородом и иметь соответствующую температуру (для хладнокровных животных +20°С, для теплокровных +37°С). В процессе эксперимента необходимо использовать проточные камеры для непрерывного обновления раствора, в котором находится биологический объект.
При электрофизиологических исследованиях используют различные типы электро дов, детальное описание которых можно найти в соответствующих руководствах. В то же время есть определенные требования ко всем без исключения электродным системам.
Электроды, которые используют в эксперименте, должны оказывать минимальное влияние на объект исследования, т. е. они должны только передавать информацию от объекта или на объект.
Если в электрофизиологическом эксперименте исследуют собственно процесс возбуждения, то необходимо применять два электрода с различной величиной площади контактной поверхности (желательно в соотношении не менее 1:100), при этом электрод меньшей площади называют активным, или референтным, большей пло щади — пассивным, или индифферентным. При исследовании процесса распрост ранения возбуждения необходимо использовать два активиых электрода с одинаковой площадью контактных поверхностей, устанавливаемых на возбудимой ткани на не котором расстоянии друг от друга, и индифферентный электрод, который устанав ливается в отдалении. В первом случае говорят о моно-(уни-) полярном способе отведения потенциала (раздражении), во втором — о биполярном способе. Необходимо подчеркнуть, что термин «униполярный» способ весьма условен, поскольку всегда регистрируется разность потенциалов, а не абсолютное значение потенциала.
Поскольку работа с биологическим объектом подразумевает контакт электрода с жидкостью, содержащейся в биологическом объекте, высока вероятность возникно вения контактных поляризационных потенциалов, которые могут существенно иска зить результаты исследования. Чтобы избежать возможных искажений в электрофи зиологических экспериментах, как правило, используют специальные слабополяризующиеся электроды, например хлорсеребряные или каломельные, имеющие незначительный поляризационный потенциал.
При исследовании электрофизиологических характеристик отдельных клеток ис пользуют стеклянные микроэлектроды. Они представляют собой микропипетку с диаметром кончика менее 0,5 мкм, заполненные ЗМ раствором хлорида калия.
В электрофизиологических экспериментах применяют самые различные усили тели биологических сигналов, позволяющие измерять минимальные изменения тока (до 10 А) и напряжения (до 10 -7 В) В связи с тем что регистрируемые сигналы могут иметь высокую скорость нарастания переднего фронта, усилители должны иметь достаточно широкую полосу пропускания (сотни кГц). Наибольшие требования предъявляются ко входным каскадам усилителей, которые должны быть согласованы с внутренним сопротивлением измерительного электрода, причем наибольшие труд ности экспериментатор встречает при использовании микроэлектродов для регистра ции быстрых изменений тока или потенциала, поскольку микроэлектроды могут иметь очень высокое внутреннее сопротивление (до 150 мОм).
Стимулвторы, регистраторы, системы управления экспериментом и обработки физиологической информации еще более разнообразны и их описание можно найти в специальной литературе.
|
Рис. 1. Внутриклеточная регистрация трансмембранных потенциалов и электростимуляция клеточной мемб раны. К — схема установки для изучения электрических характеристик клеточных мембран; Б — момент введения микроэлектрода а клетку. 1 — стеклянный микроэлектрод для подачи тока; 2 — стеклянный микроэлектрод для регистрации реакции клеточной мембраны; 3 — электроды сравнения; 4 — измеритель величины раздражающего тока; 5 — усилитель; 6 — регистратор. |
На рис.1, А показана схема простейшей установки для из мерения трансмембранной разности потенциалов и изучения реакций возбудимой мембраны при ее электрической стимуляции.
Исследуемый биообъект (клетка, кусочек ткани) помещен в каме ру, содержащую солевой раствор и электрод сравнения. Если измери тельный электрод также находится в растворе, то разность потенциа лов между ним и электродом сравнения стремится к нулю. В момент проникновения микроэлектрода внутрь клетки регистрируют отрица тельный потенциал относительно внешней среды (рис. 1, Б). Пере мещение кончика микроэлектрода внутри клетки не приводит к изме нению измеряемой разности потенциалов, если электрод не повредил клетку. У покоящейся клетки с нормальным метаболизмом и стабиль ными условиями внешней и внутренней среды постоянная разность потенциалов будет регистрироваться неопределенно долго. Эта посто янная разность потенциалов называется потенциалом покоя, или мембранным потенциалом покоя. При этом потенциал внеклеточной среды принимается равным нулю. Величина потенциала покоя неоди накова у различных типов клеток и колеблется обычно от -70 до -95 мВ.
В том случае, если в клетку введен второй, стимулирующий микроэлектрод, можно исследовать реакцию возбудимой мембраны на действие электрического тока. Если стимулирующий электрод электроотрицателен по отношению к внутренней среде клетки, то говорят о входящем токе, при этом общая трансмембранная разность потенциалов увеличивается, т. е. происходит гиперполяризация кле точной мембраны. Напротив, если стимулирующий электрод элек троположителен по отношению к внутренней среде клетки, то го ворят о выходящем токе, при этом общая трансмембранная разность потенциалов уменьшается, т. е. происходит деполяризация клеточ ной мембраны (рис. 2). Как правило, при действии гиперполяризующего тока потенциал мембраны изменяется в соответствии с законом Ома. При этом изменение потенциала не зависит от мо лекулярных процессов в мембране, поэтому говорят, что изменяются пассивные электрические свойства мембраны. При действии депо ляризующего тока потенциал мембраны не подчиняется закону Ома, что связано с изменением функциональных характеристик ионных каналов клеточной мембраны. Если деполяризация клеточной мем браны достигает так называемого критического уровня, происходит активация ионных каналов клеточной мембраны и возникает по тенциал действия. Критический потенциал (Eкp) — уровень мемб ранного потенциала, при котором начинается генерация потенциала действия. Потенциал действия (ПД, спайк, импульс) — быстрое колебание мембранного потенциала покоя в положительном направ лении. В этом случае мембрана реагирует активно, поскольку из менение трансмембранной разности потенциалов обусловлено изме нением функциональных свойств ионных каналов.
Детальный анализ процессов, протекающих в мембранах возбу димых клеток, был проведен Ходжкиным, Хаксли и Катцем в опытах на гигантском аксоне кальмара и привел к созданию современной теории происхождения потенциала покоя и потенциала действия.
|
Рис. 2. Реакция возбудимой мембраны на действие деполяризующего и гиперполяризующего токов. А — реакция клеточной мембраны на гиперполяризуюший (I, 2) и деполяризующий (3, 4) ток; Б — величина и направление гиперполяриэующего 1',2') и деполяризующего (3' ,4' ) стимулирующего тока. |
Потенциал покоя
Схема опыта Ходжкина—Хаксли приведена на рис.3. В аксон кальмара диаметром около 1 мм, помещенный в морскую воду, вводили активный электрод, второй электрод (электрод сравнения) находился в морской воде. В момент введения электрода внутрь аксона регистрировали скачок отрицательного потенциала, т. е. внутренняя среда аксона была заряжена отрицательно относительно внешней среды.
|
Рис. 3. Опыт Ходжкина—Хаксли на гигантском аксоне кальмара. А — стимуляция аксона электрическим стимулом прямоугольной формы; Б — форма потенциала действия, зарегистрированная в данном опыте. 1 — аксон; 2 — активный электрод; 3 — электрод сравнения; 4 — усилитель. Стрелками показано направление распространения возбуждения.
|
Считают синонимами такие понятия, как трансмембранная разность потенциалов в покое, потенциал покоя, мембранный по тенциал. Обычно величина потенциала покоя колеблется от -70 до -95 мВ. Согласно концепции Ходжкина и Хаксли, величина потенциала покоя зависит от ряда факторов, в частности от селек тивной (избирательной) проницаемости клеточной мембраны для различных ионов; различной концентрации ионов цитоплазмы клет ки и ионов окружающей среды (ионной асимметрии); работы ме ханизмов активного транспорта ионов. Все эти факторы тесно свя заны между собой и их разделение имеет определенную условность.
Известно, что в невозбужденном состоянии клеточная мембрана высокопроницаема для ионов калия и малопроницаема для ионов натрия. Это было показано в опытах с использованием изотопов натрия и калия: спустя некоторое время после введения внутрь аксона радиоактивного калия его обнаруживали во внешней среде. Таким образом, происходит пассивный (по градиенту концентраций) выход ионов калия из аксона. Добавление радиоактивного натрия во внешнюю среду приводило к незначительному повышению его концентрации внутри аксона. Пассивный вход натрия внутрь аксона несколько уменьшает величину потенциала покоя.
Установлено, что имеется разность концентраций ионов калия вне и внутри клетки, причем внутри клетки ионов калия примерно в 20—50 раз больше, чем вне клетки (табл. 1).
Таблица 1. Концентрация ионов снаружи и внутри клетки, ммоль/л
|
Ионы |
Аксон кальмара |
Мышечное волокно (лягушка) |
||
|
внутри клетки |
снаружи клетки |
внутри клетки |
снаружи клетки |
|
|
к+ |
397 |
20 |
124 |
2.2 |
|
Na+ |
50 |
437 |
4 |
109 |
|
Сl- |
40 |
556 |
1.5 |
77 |
Разность концентраций ионов калия вне и внутри клетки и высо кая проницаемость клеточной мембраны для ионов калия обеспечива ют диффузионный ток этих ионов из клетки наружу и накопление избытка положительных ионов К+ на наружной стороне клеточной мембраны, что противодействует дальнейшему выходу ионов К+ из клетки. Диффузионный ток ионов калия существует до тех пор, пока стремление их двигаться по концентрационному градиенту не уравно весится разностью потенциалов на мембране. Эта разность потенциа лов называется калиевым равновесным потенциалом.
Равновесный потенциал (для соответствующего иона, Ек) — разность потенциалов между внутренней средой клетки и внекле точной жидкостью, при которой вход и выход иона уравновешен (химическая разность потенциалов равна электрической).
Важно подчеркнуть следующие два момента: 1) состояние рав новесия наступает в результате диффузии лишь очень небольшого количества ионов (по сравнению с их общим содержанием); кали евый равновесный потенциал всегда больше (по абсолютному зна чению) реального потенциала покоя, поскольку мембрана в покое не является идеальным изолятором, в частности имеется небольшая утечка ионов Na+. Сопоставление теоретических расчетов с исполь зованием уравнений постоянного поля Д. Голдмана, формулы Нернста показали хорошее совпадение с экспериментальными данными при изменении вне- и внутриклеточной концентрации К+ (рис. 4).
Трансмембранная диффузионная разность потенциалов рассчи тывается по формуле Нернста:
Ek=(RT/ZF)ln(Ko/Ki)
где Ек — равновесный потенциал, R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура, Z — валентность нона, F — постоянная Фарадея, Ко и Ki — концентрации ионов К+ вне и внутри клетки соответственно.
|
Рис. 4. Зависимость величины потенциала покоя от внеклеточной концентрации К+ (расчетная и экспериментальная кривые). По оси абсцисс – содержание калия во внешней среде в мМ, по оси ординат – величина мембранного потенциала в мВ. |
В состоянии покоя клеточная мембрана высокопроницаема не только для ионов К+. У мышечных волокон мембрана высокопро ницаема для ионов СГ. В клетках с высокой проницаемостью для ионов Сl-, как правило, оба иона (Сl- и К+) практически в одинаковой степени участвуют в создании потенциала покоя.
Известно, что в любой точке электролита количество анионов всегда соответствует количеству катионов (принцип электронейт ральности), поэтому внутренняя среда клетки в любой точке электронейтральна. Действительно, в опытах Ходжкина, Хаксли и Катца перемещение электрода внутри аксона не выявило различие в транс мембранной разности потенциалов.
Поскольку мембраны живых клеток в той или иной степени проницаемы для всех ионов, совершенно очевидно, что без специ альных механизмов невозможно поддерживать постоянную разность концентрации ионов (ионную асимметрию). В клеточных мембранах существуют специальные системы активного транспорта, работаю щие с затратой энергии и перемещающие ионы против градиента концентраций. Экспериментальным доказательством существования механизмов активного транспорта служат результаты опытов, в которых активность АТФазы подавляли различными способами, на пример сердечным гликозидом оуабаином. При этом происходило выравнивание концентраций ионов К+ вне и внутри клетки и мем бранный потенциал уменьшался до нуля.
Важнейшим механизмом, поддерживающим низкую внутрикле точную концентрацию ионов Na+ и высокую концентрацию ионов К+, является натрий-калиевый насос (рис. 5). Известно, что в клеточной мембране имеется система переносчиков, каждый из ко торых связывается с 3 находящимися внутри клетки ионами Na+ и выводит их наружу. С наружной стороны переносчик связывается с 2 находящимися вне клетки ионами К+, которые переносятся в цитоплазму. Энергообеспечение работы систем переносчиков обес печивается АТФ. Функционирование насоса по такой схеме приводит к следующим результатам.
1. Поддерживается высокая концентрация ионов К+ внутри клет ки, что обеспечивает постоянство величины потенциала покоя. Вследствие того что за один цикл обмена ионов из клетки выводится на один положительный ион больше, чем вводится, активный транс порт играет роль в создании потенциала покоя. В этом случае говорят об электрогенном насосе. Однако величина вклада электрогенного насоса в общее значение потенциала покоя обычно невелика и составляет несколько милливольт.
2. Поддерживается низкая концентрация ионов натрия внутри клетки, что, с одной стороны, обеспечивает работу механизма генерации потенциала действия, с другой — обеспечивает сохранение нормальных осмолярности и объема клетки.
3. Поддерживая стабильный концентрационный градиент Na+, натрий-калиевый насос способствует сопряженному транспорту ами нокислот и сахаров через клеточную мембрану.
Таким образом, возникновение трансмембранной разности по тенциалов (потенциала покоя) обусловлено высокой проводимостью клеточной мембраны в состоянии покоя для ионов К+ (для мышечных клеток и ионов Сl-), ионной асимметрией концентраций для ионов К+ (для мышечных клеток и для ионов Cl-), работой систем активного транспорта, которые создают и поддерживают ионную асимметрию.
|
Рис. 5. Участие натрий-калиевого насоса в генерации потенциала покоя. А — внеклеточная среда; Б — внутриклеточная среда.
|