Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
17
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ
на правах рукопису
Ісакова Ірина Анатоліївна
УДК 577.212
ІНСЕКТИЦИДНІ КРИСТАЛІЧНІ БІЛКИ НОВИХ ШТАМІВ
BACILLUS THURINGIENSIS ТА ГЕНИ,
ЩО ЇХ КОДУЮТЬ
03. 00. 26- молекулярна генетика
автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 1999
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України
Науковий керівник - член-кореспондент НАН України і АМН України,
доктор біологічних наук, професор, Віталій Арнольдович Кордюм, завідуючий відділом регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології та генетики НАН України,
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Станіслав Станіславович Малюта, завідуючий відділом
молекулярної генетики Інституту молекулярної
біології та генетики НАН України,
кандидат біологічних наук
Олександр Миколайович Живолуп,
старший науковий співробітник Інституту
клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.
Провідна установа – Інститут мікробіології та вірусології НАН України
Захист дисертації відбудеться 25 травня 1999 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої ради Д.26.237.01 з захисту докторських дисертацій в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: м. Київ-143, вул. ак.Заболотного,150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України
Автореферат розіслано 24 квітня 1999 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук
старший науковий співробітник Л.Л. Лукаш
Актуальність теми. Bacillus thuringiensis, спороутворюючий грунтовий мікроорганізм, відомий здатністю продукувати під час спороутворення кристалічні включення, що складаються з білків, які називаються інсектицидними кристалічними білками (ІСР), Cry білками або -ендотоксинами. Ці білки мають токсичні властивості для різних комах, що є або шкідниками важливих сількогосподарських культур, або переносниками деяких захворювань (малярія, тропічна лихоманка). Завдяки таким властивостям, Cry білки B.thuringiensis (B.t.) вважаються найперспективнішим біоінсектицидом. Переваги кристалічних білків B.t. полягають у специфічності до певних видів комах (настільки вузької, що кожен білок токсичний тільки до одного або декількох шкідників), відсутності токсичності для хребетних, в тому числі і для людини, що робить їх використання безпечним для довкілля.
Розвиток методів генетичної інженерії у 80-х роках відкрив нові безпрецедентні перспективи використання B.t. як біоінсектициду внаслідок переносу генів B.t., які кодують кристалічні білки, до геному інших організмів (вірусів, бактерій, рослин). Такий шлях використання Cry генів дає змогу обійти недоліки, які мають кристалічні включення (інактивація кристалів під впливом УФ, недоступність для шкідників, що ушкоджують внутрішні частини рослин) і які обмежують можливості їх використання за допомогою обробки рослин біологічними препаратами на основі B.t.. Різке зростання інтересу до вивчення нових штамів B.t привело до відкриття різноманітних кристалічних білків з невідомими раніше властивостями, клонуванню та секвенуванню більш ніж 130 Cry генів, а також створенню генно-інженерної індустрії, що використовує ці відкриття.
Актуальність дослідження кристалічних білків та їх генів обумовлена необхідністю, з одного боку, мати вибір генів різної специфічності для створення систем захисту рослин від комах-шкідників, а з другого боку, проблемою виникнення стійкості комах-шкідників до B.t. токсинів, яка, хоч і набагато повільніше, ніж до хімічних інсектицидів, все ж виникає.
Вивчення кристалічних інсектицидних білків та ідентифікація генів, що відповідають за їх продукцію, у нових штамах B.t., ізольованих в Україні, є необхідним етапом для клонування генів найперспективніших кристалічних білків з метою їх подальшого використання у біотехнологічних дослідженнях по створенню систем захисту рослин від комах-шкідників.
Мета і завдання дослідження
Метою данної роботи було вивчення молекулярно-біологічних характеристик, що обумовлюють інсектицидну активність нових штамів B.thuringiensis, ізольованих в Україні (Кримська філія відділу грунтової мікробіології Інституту сільськогосподарської мікробіології ААН України), а саме: виявлення і дослідження кристалічних білків, які вони продукують, та ідентифікація генів, що кодують ці білки.
Відповідно до мети, було поставлено такі завдання:
1. Вивчити білковий склад кристалів, що продукують досліджувані штами B.thuringiensis, які характеризуються токсичністю до представників двох рядів комах: Lepidoptera та Coleoptera.
2. Проаналізувати спектр плазмідних ДНК, що містять ці штами B.thuringiensis.
3. Виявити за допомогою ПЛР гени, що відповідають за синтез кристалічних білків у досліджуваних штамах B.thuringiensis.
4. Визначити специфічність генів, що кодують кристалічні інсектицидні білки B.thuringiensis і їх локалізацію в геномі досліджуваних штамів B.thuringiensis.
Наукова новизна роботи
1. Вперше виявлено і вивчено кристалічні білки, що продукуються новими штамами B.thuringiensis з оригінальної української колекції, які відібрані за наявністю у них подвійної специфічності до комах двох рядів( Lepidoptera - лускокрилі та Coleoptera - жорсткокрилі), досліджено спектр їх плазмідних ДНК, визначено специфічність генів кристалічних білків окремих штамів B.t..
2. Сконструйовано 2 оригінальні пари праймерів для ПЛР: одна - високоспецифічна до консервативної групи генів кристалічних білків класів Cry3, друга - вироджена, що має специфічність до більш широкого кола генів типу Cry1, Cry3 і Cry5, що визначають токсичність відповідно до лускокрилих, жорсткокрилих та комбіновану - до лускокрилих і жорсткокрилих одночасно.
3. Вперше ампліфіковано фрагменти генів, що відповідають за синтез кристалічних білків в досліджуваних штамах B.t., клоновано одержані продукти ПЛР і секвеновано 5'- і 3'-кінці цих продуктів, ідентифіковано гени кристалічних білків які гомологічні генам Cry1Ba2, Cry1Bc та групі генів Cry1A.
Практичне значення роботи. Результати дослідження інсектицидних кристалічних білків і генів, що їх кодують, можуть бути використані при створенні біоінсектицидних препаратів на основі цих штамів.
Фрагменти генів кристалічних білків, що одержано за допомогою cконструйованих вироджених праймерів ПЛР, можуть бути використані як зонди для пошуку Cry генів у геномах різних штамів B.t. з метою їх клонування та застосування для створення системи біологічного контролю комах-шкідників.
Особистий внесок автора полягає у безпосередній участі у виконанні всього обсягу експериментальної частини дисертації, обробці літературних даних, аналізі та інтерпретації отриманих результатів.
Апробація роботи відбулася на міжнародній конференції “Молекулярная генетика и биотехнология”, м. Мінськ, 6-8 квітня 1998 р. та на спільному науковому семінарі відділу регуляторних механізмів клітини і відділу молекулярної генетики ІМБіГ НАНУ 1 березня 1999 р. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експеріментальної частини (методи, результати дослідження та їх обговорювання) і висновків. Роботу викладено на 115 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 23 рисунками і 4 таблицями. Список цитованої літератури охоплює 245 джерел.
Матеріали і методи
Мікроорганізми, які були використані у дослідженні. E. coli HB101, E. coli XL1, A. tumefaciens C58 i A. tumefaciens 1058, B.t. 820, B.t. 949, B.t. 834, B.t. 836, B.t. 014, B.t. 021, B.t. 076, B.t. 85 i B.t. 888.
Плазміди, які були використані у дослідженні: pUC18, pBR322, pAp2034, pBlueScript SKII, pTiC58, pTi1058, F' фактор E.coli та плазміди досліджуваних штамів B.t..
Об’єктом дослідження були 9 нових штамів B.t., що були виділені на території України (Кримська філія грунтової мікробіології Інститута сільськогосподарської мікробіології ААН України, м. Чернігів). В основу відбору штамів було покладено подвійну специфічність, яку виявляли дані штами у біологічних експериментах по відношенню до лускокрилих і жорсткокрилих та відсутність продукції їми -екзотоксину.
Методи. Для продукції кристалічних білків культури B.t. вирощували в середовищах С2, АП, КС, LB, NSM, GYS, GYCS, GYN, SP за умов аерації при 30°С до закінчення спороутворення (як правило, 4 доби).
Наявність кристалів, що продукували досліджувані штами B.t., контролювалася за допомогою мікроскопії їх спорових культур при х 450 збільшенні на люмінісцентному мікроскопі ЛМ фазово-контрастним методом.
Інсектицидні кристалічні білки, що продукували досліджувані штами, аналізували в 10% ПААГ-SDS в трис-гліциновому буфері (Laemmlі U.K., 1970), попередньо розчинивши їх кип’ятінням протягом 10 хв. у буфері такого складу: 0,125 M трис-HCl (pH 6,8), 5% SDS, 5% бета-меркаптоетанол, 10% цукроза, 0,005% бромфеноловий блакитний (Lecadet M.et al.,1992).
Молекулярну масу білків визначали за допомогою калібрувальних графіків залежності логарифма молекулярної маси маркерних білків (набори HWM і LWM фірми Pharmacia) від їх відносної рухливості в 10% ПААГ-SDS.
Культуру B.t. для виділення ДНК вирощували в середовищі IM (0,75 % бактопептон, 1% глюкоза, 10мМ трис-HCl, рН 7,6) за умов аерації при 30°С протягом ночі. Для одержання сумарного препарату плазмідної ДНК вегетативні клітини B.t. відмивали в ТЕ-буфері, лізували обробкою лізоцимом (10 мг/мл) протягом 20 хв. при 37°С, після чого до лізатів додавали проназу (0,5 мг/мл) і продовжували інкубацію ще 30 хв. при 34°С у присутності 1% SDS. Далі виділення ДНК проводили лужним методом (Casse F.et al.,1979) з депротеїнізацією фенолом та хлороформом і осадженням етанолом. Плазміди B.t вивчали методом електрофорезу в 0,7% гелі агарози в ТАЕ-буфері (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М EDTA).
Комп’ютерний аналіз нуклеотидних послідовностей відомих генів кристалічних білків та амінокислотних послідовностей цих білків з метою вибору праймерів для ПЛР проводили з використанням пакету програм PC/Gene.
Олігонуклеотиди, які використовували як праймери, були люб’язно синтезовані к.б.н. С.М. Кириленком за допомогою ДНК-синтезатора (модель “Gene Assembler,” Pharmacia Biotech.).
ПЛР суміш готували за стандартною методикою (Burke J.F.,1996). Ампліфікацію виконували на приладі “Gene ATAQ Controller” (Pharmacia Biotech.) за такою програмою: денатурація - 94°С - 3 хв., потім 40 циклів за таких умов: 94°С - 1 хв., 53°С - 1 хв., 72°С - 1 хв., останній етап 72°С - 5 хв. для праймерів Sn567-Asn1373. Для пари праймерів 5’Т-3’С програма відрізнялась температурою відпалення (44°С). Продукти ПЛР вивчали методом електрофорезу в 1,5% гелі агарози в ТАЕ-буфері.
Виділення продуктів ПЛР з гелю проводили за допомогою набору “Gene Clean” (Bio 101, Inc ) відповідно до доданого протоколу. Вектори для клонування ПЛР фрагментів ДНК одержували розщепленням плазмідної ДНК pUC18 або рBluescript SKII рестрикційними ендонуклеазами EcoRV (або Eco32) та інкубацією з Taq полімеразою у присутності 2 mM dTTP 2 години при 70°С (Marchuk D, Drumm M. et al., 1990).
Компетентні клітини E. coli, одержували за методом А. Nishimura (1990). Обробку плазмідних ДНК рестриктазами, лігування, трансформацію E. coli, аналіз рекомбінантних клонів проводили за стандартними методами (Sambrook J.et al., 1988).
Первинну послідовність клонованих ПЛР фрагментів визначали за методом Сенгера (Sanger F.et al., 1977) із застосуванням флуорисцентних праймерів з використанням набору для секвенування “Cy5TM autocycle” (Pharmacia Biotech.) на автоматичному секвенаторі ALF express (Pharmacia LKB).
З метою аналізу ДНК методом гібридизації плазмідну ДНК B.t. (нативні плазміди або ДНК, оброблену рестриктазами), що була розділена в 0,7% гелі агарози, переносили на нейлонові фільтри (Sambrook J.et al., 1988). Зонди (відповідні фрагменти ДНК) мітили нерадіоактивною міткою (дігоксигеніном) з використанням набору “DIG Nucleic Acid Labeling Detection Kit” (Boeringer Mannheim) за рекомендацією виробника. Предгібридизацію, гібридизацію, відмивку фільтрів та детекцію проводили за тими ж рекомендаціями.
Результати і їх обговорення
Вивчення кристалічних білків досліджуваних штамів B.t.
Ефективність синтезу кристалічних білків штамів B.t. було перевірено на 9 середовищах з метою виявити найбільш придатні для цього середовища. З'ясувалося, що більшисть досліджуваних штамів B.t.: 949, 834, 820, 014, 85 і 888 з високою ефективністю (Рис. 1) продукують кристали на середовищі С2, а штам B.t. 076 - на NSM. Штами B.t. 021 і B.t. 836 на жодному з перевірених середовищ не давали високого рівня продукції кристалічних білків.
Білковий склад кристалів, що продукуються досліджуваними штамами B.t., вивчали за допомогою електрофорезу в 10% ПААГ-SDS після їх солюбілізації як описано в розділі “Методи”. Електрофоретичні дослідження показали, що 5 штамів з 9 продукують кристалічні білки с молекулярною масою більше 130 кДа, а саме: штами B.t. 820 і B.t. 949 продукують кристалічні білки з молекулярною масою 164 кДа, штам B.t. 834 - 144 кДа, штами B.t. 85 і B.t. 888 відрізняються тим, що продукують два високомолекулярних кристалічних білка - 146 кДа і 137 кДа (Рис. 1 а,б), (Табл. 1).
Штами B.t. 85, 888, 949 і 820 в ряді експериментів в ПААГ-SDS демонстрували інтенсивну смугу, що відповідає поліпептиду з молекулярною масою 76,5 кДа.
Таблиця 1. Молекулярна маса кристалічних білків досліджуваних штамів B. thuringiensis
|
Штами B. thuringiensis |
Молекулярна маса кристалічних білків B. thuringiensis (кДа) |
|
820 |
164,0 4; 18,0 2 |
|
949 |
164,0 4; 18,0 2 |
|
834 |
144,5 4 |
|
85 |
146,0 4; 137,0 4; 18,0 2 |
|
888 |
146,0 4; 137 4; 18,0 2 |
|
014 |
76,5 2; 18,0 2 |
|
076 |
96,5 2; 77,0 2 |
|
836 |
76,5 2; 18,0 2 |
|
021 |
76,5 2; 18,0 2 |
Це явище може бути зумовлено як можливістю розщеплення нативних білків протеазами, що локалізовані на поверхні кристалів, так і тим, що в залежності від умов вирощування можуть утилізуватись різні сайти ініціації трансляції. Штами B.t.014, 021 і 836 продукують кристалічні білки з молекулярною масою 76,5 кДа, а B.t. 076 - два кристалічні білки 96,5 кДа і 77,0 кДа (Табл. 1). Крім високомолекулярних білків, штами B.t. 820, B.t. 949, B.t. 014, B.t. 85, B.t. 888 продукують також низькомолекулярні білки (приблизно 18 кДа) (Табл. 1).
Крім великої кількості, що характерна для кристалічних (до 30% сухої ваги) білків B.t., яка виявляється у ПААГ електрофорезі спорових препаратів досліджуваних штамів за інтенсивністю поліпептидних смуг, що відповідають кристалічним білкам, було одержано ще один доказ того, що описані білки є кристалічними. Було проведено дослідження динаміки синтезу кристалічних білків вивчених штамів, бо, як відомо, продукція кристалічних білків B.t. відбувається переважно під час спороутворення. Вивчення динаміки синтезу високомолекулярних кристалічних білків штамів B.t. 820, B.t. 949, B.t. 834, B.t. 014 методом електрофорезу в 10% ПААГ-SDS показало, що у вегетативній (6-годиний) культурі вивчених B.t. штамів високомолекулярні кристалічні білкі відсутні, тоді як вже через 24 години спостерігалося накопичення цих білків; а через 3 доби було виявлено гіперпродукцію досліджуваних білків, звичайну для даних B.t.штамів, якщо їх вирощувати на середовищі С2 (Рис.2).
Таким чином, більшисть досліджуваних B.t. штамів синтезують високомолекулярні кристалічні білки 137 кДа -164 кДа, які, як правило, є типовими представниками B.t. токсинів, що специфічні до Lepidoptera. Штами B.t. 014, B.t. 021 і B.t. 836 продукують білки, що за молекулярною масою подібні до B.t. токсинів, що специфічні до Coleoptera. До складу кристалів, що продукує штам B.t. 076, входять досить оригинальні білки, що робить перспективним їх подальше вивчення.
Визначення плазмідного складу ряду нових штамів B.t. Відомо, що відмінною рисою B.t. є наявність в них складного комплексу екстрахромосомних елементів (від 1,7 Мда до 180 Мда), відомішою функцією яких є те, що, в основному, на високомолекулярних плазмідах локалізовано Cry гени, що забезпечують продукцію -ендотоксинів. Оскільки подальшою метою дослідження було пошук Cry генів, важливо було одержати препарати ДНК досліджуваних штамів B.t., що містили б ДНК всіх плазмід, які представляють геном даних штамів. Зважаючи на залежність між складом середовища для культивування B.t. і тим, які плазмідні ДНК переважно виділяються, було підібрано середовище (див. розділ "Методи"), що забезпечувало стабільну відтворюванність виділення високомолекулярних плазмід.
Вивчення препаратів сумарної ДНК методом електрофорезу в 0,7% агарозному гелі показало, що всі вивчені штами B.t. містять складний комплекс екстрахромосомних елементів, як високомолекулярних (більш ніж 30 Мда), так і низькомолекулярних (менш ніж 30 Мда) (Рис. 3 а,б). Штами B.t. 820 і B.t. 949 мають дуже схожий набір високомолекулярних плазмід: 2 плазміди на рівні приблизно 120 Мда і три дуже близькі плазмідні смуги, що демонструють рухливість приблизно на рівні 63 Мда. Штам B.t. 834 відрізняється від інших тим, що не містить низькомолекулярних плазмід, а містить дві пари високомолекулярних плазмід. Всі штами містять декілька плазмід з молекулярною масою вище 63 Мда (F’фактор E coli). Найбільші високомолекулярні плазміди менш рухливі, ніж ДНК pTi C58 A. tumefaciens (Рис. 4), яка була використана як маркер, тобто мають молекулярну масу більш 120 Мда. Найбільші плазміди присутні в препаратах сумарної ДНК штамів B.t. 014 і B.t. 076 - більше 120 Мда, а штами B.t. 85 і B.t. 888 схожі за плазмідний набором. Таким чином, отримані препарати плазмідної ДНК вивчених штамів B.t. містили достатньо складний набір високомолекулярних плазмід і могли бути використаними в ПЛР як матриці для пошуку Cry генів.
Ідентифікація генів, що кодують кристалічні білки в досліджуваних штамах B.t. за допомогою полімеразної ланцюгової реакції
Оскільки гени, які кодують кристалічні білки з різною специфічністю до комах-шкідників, становлять багаточисельну родину, окремі представники якої мають різний ступінь гомології, то конструювання ПЛР праймерів, які були б специфічні до певних генів, стало окремим етапом дослідження нових штамів.
Виходячи з першочергового інтересу до генів типу Cry3, тобто специфічних до жорсткокрилих, було проведено аналіз нуклеотидних послідовностей відомих генів такого типу. Як ПЛР праймери було обрано послідовності двох ділянок ДНК з 100% гомологією, що характерні для генів з високим ступенем гомології таких як Cry3А, Cry3В і Cry3D (Табл. 2). Як матриці в ПЛР з цими праймерами (Sn567 - Asn1373) були використані сумарні препарати ДНК досліджуваних штамів B.t., але жоден з використаних штамів не давав ПЛР продукт очікуваного розміру (836 нп.), хоча всі штами, що продукують високомолекулярні білки (більше 130 кДа) та штам B.t. 014, демонструють в ПЛР тільки один продукт (Рис. 4 (а)).
ПЛР продукт штаму B.t. 014, одержаний з праймерами Sn567 - Asn1373, було клоновано, після чого частково визначено нуклеотидну послідовність цього фрагменту. Цей фрагмент, як з’ясувалося, не має гомології з відомими Cry генами.
Таблиця 2. Праймери, що було використано в ПЛР.
|
Назва праймеру |
Первинна послідовність |
|
Sn 567 Asn1373 5’T 3’С |
5’—AAATGAATCCGAACAATCGAAGTGAACATGA-3’ 5’—CGCAGAGAGATGACATTAACAGTATTAGAT –3’ 5’ – TAIGCICAIGCIGCIAAIIIICATTT –3’ 5’ – ATIICCICCTGTIAAICIIGGICC – 3’ |
Для конструювання другої пари праймерів було застосовано інший підхід - пошук амінокислотної гомології серед кристалічних білків, токсичних до жорсткокрилих. Цей аналіз виявив тільки дві ділянки в амінокислотних послідовностях таких білків, які демонстрували високий ступінь гомології. Повернення до відповідної нуклеотидної послідовності цих генів показало, що у більшості випадків відсутність гомології припадає на третій нуклеотид кодону.
Праймерами для ПЛР стали послідовності цих ділянок ДНК з заміною негомологічних нуклеотидів на інозин. Тобто були сконструйовані вироджені праймери 5’T - 3’C (Табл. 2). Використання в ПЛР виродженої пари праймерів (5’T - 3’C) і сумарних плазмідних ДНК як матриці показало, що продукти ПЛР очікуваних розмірів ( приблизно 1000 нп) були одержані для штамів B.t. 820, B.t. 949, B.t. 834, B.t. 014, B.t. 85, B.t. 888 (Рис. 4 (б.)). Продукти ПЛР не вдалося одержати для B.t. 836, B.t. 021 і B.t. 076.
Для того, щоб з’ясувати, що являють собою одержані ПЛР продукти, ампліфіковані фрагменти ДНК штамів B.t. 949, B.t. 834 і B.t. 85 було клоновано в плазміді Blue Script SK II. Після клонування було проведено визначення первинної послідовності 5’- і 3’- кінців цих ампліфікованих фрагментів (Рис. 5, 6).
а) 5’-GGCTTATGCTCAAGCTGCAAATTTACACCTATTATTATTGAGA
GAT GCCTCTTTTTGGTAGTGAATTTGGGCTTACATCGCAGGAAATT
CAACGCTATTATGAGCGCCAAGTGGAACGAACGAGAGATTATTCCGACTATTGCGTAGAATGGTATAATACAGGTCTAAATAGCTT-3’
б) 5’-TATCCCCACCTGTAAATCCTGGTCCTCTAACAACAGTGGTAC
CTT GAGGAAGTTCGGATGCTTTTACCATTGGGATTTGGGTGATTCT
ATTTGGTCCAATCGTATTCGTACGATCTGCACTACGATGCGTCCAAGAATATACCGGTACATTCACCCTGGATTGTAAAATTATACCTATATGAGATAACCTGTGACTGTAAGACTCATAATTTGGTCGTTCTGTTGTTTCTGGTGGTAATTCAAGGT-3’
Рис. 5. Первинна послідовність 5’ кінця (а.) і 3’ кінця (б.) ПЛР продукту, одержаного при використанні ДНК B. thuringiensis штаму 949 як матриці.
а). 5’-GGTATATGCTCAAGCTGCAAATTTACACCTATTA
TTATTGAGAACGCATCCCTTTTTGGTAGTGAATGGGGGA
TGGCATCTTCCGATGTTAACCAATATTACCAAGAACAAA
TCAGATATACAGAGGAATATTCTAACCATTGCGTACAAT
GGTATAATACAGGGCTAAATAACTTAAGAGGGACAAAT
GCTGAAAGTTGGT- 3’
б).5’-CCCTTCACTGCAGGAATTTGAGTAATTCTATTTGGTCCAATC
GTATTCGTACGATCTGCACTACGATGCGTCCAAGATTAGACTGGT
GCTCTCAAAGTGTTTCCTATGATTAGTCCTATATGAGATACTCTATG
TCTATATGAT- 3’
Рис. 6. Первинна послідовність 5’ кінця (а.) і 3’ кінця (б.) ПЛР продукту, одержаного при використанні сумарного препарату ДНК B. thuringiensis штаму 834 як матриці.
Порівняння нуклеотидних послідовностей цих фрагментів з нуклеотидними послідовностями відомих Cry генів B.t. показало, що з B.t. 834 клоновано фрагмент ДНК, який дійсно є фрагментом гена, що відповідає за синтез кристалічного білка і демонструє високу гомологію з геном Cry1Вс (Z46442, неопубліковані дані, BishopA.H., 1994). Продукт ПЛР, одержаний з ДНК B.t. 949, є ампліфікованим фрагментом Cry гена, що має у визначеному районі 100% гомологію з генами Cry1Ва1 (Х06711, Brizzard B.L., 1988), Cry1Ва2 (Х95704, Soetaert P., 1996). Послідовність ПЛР продукту штаму B.t. 85, який продукує два кристалічні білки з близькою молекулярною масою (Рис. 1), демонструє гомологію з висококонсервативною ділянкою групи генів типу Cry1А, а саме: Cry1Ab (X13233, Haider, 1988), Cry1Ab1 (M13898, Wabiko H.K., 1986), які кодують кристалічні білки, що токсичні для представників Lepidopterа. Не виключено, що для штамів, які продукують різні кристалічні білки, ПЛР продукти, що одержано з виродженими праймерами, містять суміш фрагментів, ампліфікованих з різних Cry генів. Цей факт підтверджено для штаму B.t. 85 за допомогою гібридизації за Саузерном. Таким чином, праймери для ПЛР, які створені на основі амінокислотної гомології кристалічних білків, що токсичні для жорсткокрилих, дозволили ампліфікувати фрагменти ДНК генів, що кодують білки з іншим типом токсичності. Цей факт знайшов своє пояснення після подальшого аналізу тих ділянок ДНК генів типу Cry3, з яких вибрано вироджені праймери. Завдяки своїй виродженості, сконструйовані праймери мають високий ступінь гомології з генами типу Cry1, Cry3 та нового типу Cry5, що кодують білки з молекулярною масою 81 кДа і демонструють специфічність до Lepidoptera i Coleoptera, тобто сконструйовані вироджені праймери є універсальними для пошуку та ідентифікації цих трьох типів Cry генів.
Як показав аналіз первинної послідовності фрагменту ПЛР з штаму B.t. 949, геном цього штаму містить ген такий же як Cry 1Ва2. Для дослідження цей штам був відібраний за ознакою подвійної специфічності - до Lepidoptera і до Coleoptera. Відомо, що ген Cry 1Ва2 кодує кристалічний білок, що токсичний для комах двох рядів - Lepidoptera і до Coleoptera. Аналіз нуклеотидних послідовностей ампліфікованих фрагментів штамів B.t. 834 і B.t. 85 показав, що вони містять гени, специфічні до Lepidoptera. Три штами B.t. 836, 021 і 076 містять Cry гени, які не взаємодіють з виродженими праймерами з даною специфічністю і потребують використання інших праймерів.
Вивчення гомології між Cry генами досліджуваних штамів за допомогою гібридизації. Продукти ПЛР, які було одержано з виродженими праймерами і клоновано, були використані для вивчення гомології між Cry генами досліджуваних штамів та для визначення локалізації цих цих генів в геномі B.t.. Використання клонованого фрагменту Cry гена з штаму B.t. 949 як гібридизаційної проби показало наявність гібридизації з однаковими за розміром HindIII-фрагментами (більше 5 тис. н.п.) ДНК штамів B.t. 949, B.t. 820 і B.t. 85 (Рис 7). Клонований фрагмент штаму B.t. 949 слабо гібридизується з трьома HindIII-фрагментами ДНК штаму B.t. 834. З Cry генами інших досліджуваних B.t. штамів не спостерігалось скільки-небудь помітної гомології. Таким чином, геноми штамів B.t. 949, B.t. 820 і B.t. 85 містять гени кристалічних білків з високим ступенем гомології до відомого гена Cry1Ва2, тобто їх інсектицидну активність до Lepidoptera і Coleoptera обумовлено присутністю саме цього гена.
Cry ген штаму B.t. 834, який, як показав порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей, демонструє високий ступінь гомології з геном Cry1Вс, проявляє слабку гомологію по відношенню до гену Cry1Ва2 і розрізається HindIII на три фрагменти принаймні в районі гібридизації з ПЛР продуктом B.t. 949, що має розмір приблизно 1000 н.п..
Гібридизація сумарних препаратів плазмідних ДНК з міченим фрагментом ДНК Cry гена B.t. 949 дозволила визначити, що в геномах B.t. 949 і B.t. 820 цей ген локалізовано на однакових за молекулярною масою плазмідах (~63 МДа) (Рис. 3(а), локалізація Cry гену позначена стрілкою). Цей же фрагмент гібридизується з однією з плазмід B.t. 85 (Рис. 3(б)), локалізація Cry гена позначена стрілкою). Секвенування ПЛР продукту B.t. 85 дозволило ідентифікувати присутність в його геномі гена типу Crу1А, тобто специфічного до Lepidoptera. Фрагмент ДНК цього гена гібридизується з іншою плазмідою (>63 МДа) (Рис.3(б), локалізація Cry гену позначена стрілкою). Таким чином, B.t. 85, який продукує два високомолекулярні кристалічні білки (146 кДа і 137 кДа), містить два гени різних класів (Cry1А і Cry1В), які локалізовано на різних плазмідах.
Фрагмент ДНК Cry гена B.t. 834 гібридизується з високомолекулярною плазмідою цього ж штаму (приблизно 120 Мда) (Рис. 3(б), локалізація Cry гена позначена стрілкою).
Таким чином, проведене дослідження ряду нових штамів B.t. забезпечило базу для подальших біотехнологічних розробок. Воно дає змогу проводити широкий скринінг колекцій і нових ізолятів B.t. з використанням запропонованих праймерів, забезпечує зонди для визначення локалізації Cry генів трьох типів як на плазмідах, так і в рестрикційних фрагментах ДНК, дозволяючи клонувати ідентифіковані Cry гени з геному нових штамів B.t. і використовувати їх для створення системи біологічного контролю шкідників, наприклад, за допомогою переносу клонованих генів до геному бактерій фітосфери.
Висновки
1. Виявлено кристалічні білки, які обумовлюють інсектицидну активність нових штамів Bacillus thuringiensis з оригінальної української колекції і визначено їх молекулярну масу.
2. Визначено спектр плазмідних ДНК досліджуваних штамів Bacillus thuringiensis, який представлено плазмідами з молекулярною масою від 1,7 МДа до більш ніж 150 МДа.
3. Сконструйовано 2 оригінальні пари праймерів для ПЛР: одна - високоспецифічна до консервативної групи генів кристалічних білків класу Cry3, а друга - вироджена і специфічна до широкого кола генів типу Cry1, Cry3 і Cry5, що визначають токсичність до лускокрилих, жорсткокрилих і комбіновану - до обох рядів відповідно. Встановлено, що з ДНК 6 штамів B. thuringiensis в ПЛР з виродженими праймерами ампліфікуються специфічні фрагменти ДНК довжиною ~1000 нп.
4. Вперше клоновано і частково секвеновано продукти ПЛР, що було одержано з ДНК штамів B.t. 949, B.t. 834 і B.t. 85. Показано, що вони є фрагментами Cry генів, гомологічних генам Cry1Bа2 (характеризується подвійною специфічністю до Lepidoptera і Coleoptera), Cry1Bс та гену класу Cry1А (характеризуються спецефічністю до Lepidoptera).
5. За допомогою гибридизації виявлено гомологію між генами досліджуваних штамів, яка дозволяє передбачити специфічність Cry генів в штамах B.t. 85 і B.t. 820, в ряді штамів встановлено локалізацію Cry генів на високомолекулярних плазмідах.
Перелік праць, що надруковано за темою дисертації
1. Ісакова І.А., Римар С.Ю., Кузнєцова Л.Н.,. Кордюм В.А Молекулярно-біологічні характеристики штамів Bacillus thurengiensis, ізольованих на території України// Агроекологія і біотехнологія. - 1999. - 2. - с. 153-157;
2. Исакова И.А., Рымарь С.Е., Кузнецова Л.Н., Кордюм В.А. Сравнительный анализ спектра кристаллических белков и плазмид ряда новых штаммов Bacillus thuringiensis// Биополимери и клетка. - 1999. - 15, N 2. - с. 164-168;
3. Рымарь С.Е., Исакова И.А., Кириленко С.Д., Кордюм В.А. Конструирование и использование праймеров, содержащих инозин, для поиска и идентификации генов инсектицидных кристаллических белков Bacillus thuringiensis// Цитологія і генетика. - 1999. - 33, N 2. - с. 74-78;
4. Рымарь С.Е., Исакова И.А., Кириленко С.Д., Негрудская В.В., Кузнецова Л.Н. Поиск и определение специфичности Cry генов природных изолятов Bacillus thuringiensis с помощью ПЦР// Матеріали міжнародної конференції "Молекулярная генетика и биотехнология м. Мінськ", 6–8 квітня 1998 р. - с. 91-92.
Аннотация
Исакова И.А. Инсектицидные кристаллические белки новых штаммов Bacillus thuringiensis и гены, которые их кодируют. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26. - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1999.
Диссертация посвящена изучению молекулярно-биологических характеристик, обуславливающих инсектицидную активность ряда штамов B.thuringiensis (B.t.) из украинской коллекции (Крымский филиал отдела грунтовой микробиологии Института сельскохозяйственной микробиологии ААН Украины), а именно: исследованию инсектицидных кристаллических белков, которые продуцируют данные штаммы B.thuringiensis и идентификации генов, кодирующих эти белки. Исследован белковый состав кристаллических включений, продуцируемых исследуемыми штаммами B.t., определена молекулярная масса кристаллических белков. Изучен спектр экстрахромосомных ДНК исследуемых штаммов. Сконструированы 2 пары праймеров для поиска генов, кодирующих продукцию кристаллических белков: одна - высокоспецифичная к консервативной группе генов типа Cry3 и другая - вырожденная, проявляющая специфичность к широкому кругу генов типа Cry1, Cry3 и Cry5. ПЦР продукты нескольких исследованных штаммов были клонированы и секвенированы 5'- и 3'-концы этих фрагментов ДНК. Показано, что они представляют собой фрагменты генов Cry1Ва2, Cry1Вс и гена из класса Cry1А. Изучена степень гомологии между Cry генами исследуемых штаммов, которая позволила предсказать специфичность Cry генов еще в 2 штаммах, в ряде штаммов установлена локализация Cry генов на высокомолекулярных плазмидах.
Ключевые слова: Bacillus thuringiensis (B.t.), инсектицидные кристалические белки, Cry гены
Анотація
Ісакова І.А. Інсектицидні кристалічні білки нових штамів Bacillus thuringiensis та гени, що їх кодують. - Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеню кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.26. - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології и генетики НАН Украины, Київ, 1999.
Дисертація присвячена вивченню молекулярно-біологічних характеристик, що обумовлюють інсектицидну активність нових штамів B.thuringiensis (B.t.) з української колекції (Кримська філія відділу грунтової мікробіології Інституту сільськогосподаської мікробіології ААН України), а саме: дослідженню інсектицидних кристалічних білків, які продукують дані штами B.thuringiensis та ідентифікації генів, що кодують ці білки. Встановлено білковий склад кристалічних включень, що продукуються досліджуваними штамами B.t., визначена молекулярна маса кристалічних білків. Вивчено спектр екстрахромосомних ДНК досліджуваних штамів. Сконструйовано 2 пари праймерів для пошуку генів, що кодують продукцію кристалічних білків: одна - високоспецифічна до консервативної группи генів типу Cry3, і друга - вироджена, що проявляє специфічність до широкого кругу генів типу Cry1, Cry3 и Cry5. ПЦР продукти декількох досліджуваних штамів було клоновано і секвеновано 5'- і 3'-кінці цих фрагментів ДНК. Показано, що вони є фрагментами генів Cry1Ва2, Cry1Вс і гену класу Cry1А. Вивчено ступінь гомології між Cry генами досліджуваних штамів, яка дозволила передбачити специфічність Cry генів ще в 2 штамах, в деяких штамах встановлена локалізація Cry генів на високомолекулярних плазмидах.
Ключові слова
Bacillus thuringiensis (B.t.), інсектицидні кристалічні білки, Cry гени.
Summary
Isakova I.A. The insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis new strains and crystal protein genes. - Manuscript.
Thesis for gaining a scientific degree of Candidate of Biological Sciences, Institute of Molecular Biology and Genetics, Ukrainian National Academy of Sciences, Kyiv, 1999.
The dissertation is devoted of the molecular-biological characterization of new B.thuringiensis (B.t.) strains from the Ukrainian collection (Krym department of soil microbiology of Institute of Agricultural Microbiology of Ukrainian Agricultural Academia of Sciences), that were selected by the dual specificity to Lepidoptera and Coleoptera. The proteins of Crystal inclusions produced of the investigated B.t.strains were studied, the molecular weights of these Crystal proteins were defined. The complexes of plasmid DNA of investigated B.t. strains were detected. Two pairs of PCR primers for Cry gene detection were constructed: the one was highly specific to homologic group of genes Cry3, the second was degenerated with wide specific to gene groups Cry1, Cry2 and Cry3. The PCR products of the same investigated B.t. strains were cloned and 5'- and 3'-ends of PCR products were sequenced. It was shown, that these PCR products were fragments of genes Cry1Ва2, Cry1Вс gene from Cry1А gene class. The specificity of other two investigated B.t. strains were predicted proceeding from the results of investigatioms of homology of Cry genes of these B.t. strains. In same investigated B.t. strains Cry genes are located on the high weight molecular plasmids.
Кey words
Bacillus thuringiensis (B.t.), insectisidal crystal proteins, Cry genes.