Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
45.Плазмидные векторы
Первые векторы для клонирования фрагментов чужеродной ДНК были получены с использованием бактериальных плазмид. Большая серия векторных плазмид, обозначенных символом pBR , создана на основе репликона природной плазмиды ColEI , придающей клеткам E. coli устойчивость к колицину путем его объединения с генами устойчивости к антибиотикам. Бактериальные клетки, несущие подобные комбинированные плазмиды, приобретали устойчивость к соответствующим антибиотикам, и их было легко отличить от бесплазмидных клеток путем простого посева на питательную среду с антибиотиками.
Наличие в векторных молекулах селектируемых маркеров повышает эффективность клонирования из-за возможности проведения быстрого отбора рекомбинантных плазмид на селективных питательных средах.
В качестве селектируемых маркеров применяются гены различных ферментов, присутствие которых в клетках в составе плазмиды обнаруживают по появлению соответствующей ферментативной активности. В векторах серии pUC таким селектируемым маркером является 5'-концевая часть гена бета-галактозидазы E. coli- lacZ' ( рис. II.5,б ). Эта часть гена, находящаяся под контролем lac-промотора, кодирует N-концевую часть бета-галактозидазы (так называемый альфа-пептид ), которая путем объединения с недостающей С-концевой частью полипептида без образования пептидной связи восстанавливает ферментативную активность бета-галактозидазы. Бета-галактозидаза обладает способностью расщеплять искусственный субстрат Xgal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид)с образованием окрашенного в голубой цвет продукта реакции. В том случае, когда в бактериальных клетках, которые содержат в хромосоме недостающую экспрессирующуюся 3'-концевую часть гена lacZ и выращиваются на среде с Xgal, в результате комплементации альфа-пептидом вектора появляется активность бета-галактозидазы, образованные этими клетками бактериальные колонии окрашиваются в голубой цвет. Уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК локализованы в начале гена бета-галактозидазы в составе полилинкера (синтетической последовательности нуклеотидов, содержащей несколько перекрывающихся уникальных сайтов рестрикции), который не нарушает функциональной целостности последовательности нуклеотидов альфа-пептида. Вставка рекомбинантной ДНК в эти векторы разрывает структурную часть гена бета-галактозидазы и инактивирует его, в связи с чем колонии бактерий с подобными рекомбинантными плазмидами, выросшие на питательной среде с Xgal, не окрашены. Поскольку векторы серии pUC одновременно содержат и ген устойчивости к ампициллину , отбор бактерий, несущих рекомбинантные плазмиды, можно проводить одновременно по двум маркерам. На питательной среде с ампициллином и Xgal вырастают только бактерии, устойчивые к антибиотику, т.е. содержащие плазмиду pUC , а среди выросших колоний лишь неокрашенные содержат вставку чужеродной ДНК.
В качестве селектируемых маркеров в векторных молекулах используются гены, присутствие которых косвенно обнаруживается по комплементации генетических дефектов бактериальных клеток-хозяев, что делает их жизнеспособными в определенных селективных условиях.
Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Размер вставок клонируемой ДНК в плазмидных векторах, которые способны стабильно в них существовать, как правило, не превышает нескольких тысяч пар оснований. Большие вставки ДНК в векторных плазмидах нестабильны, и их размеры постепенно уменьшаются по мере увеличения числа раундов репликации рекомбинантных плазмид in vivo. Преимущественное делетирование чужеродной ДНК в плазмидах большого размера связано с тем, что в бактериальных клетках селективное преимущество получают те плазмиды, время репликации которых минимально. Поэтому нуклеотидные последовательности ДНК, не участвующие в репликации векторных плазмид, постепенно элиминируются посредством делеций при длительном культивировании рекомбинантных бактерий.