Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
6.11.2012 г
ЛЕКЦИЯ
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ
Материальными носителями наследственности являются хромосомы и гены. В 1879 году Флеминг обнаружил в ядре темно окрашивающиеся структуры, которые он назвал хроматином. Зоолог Вейсман в книге «Зародышевая плазма. Теория наследственности» привел аргументы, что наследственное вещество находится в ядре.
В 1902 году Бовери и Сеттон установили, что менделеевские закономерности наследования точно соответствуют закономерностям поведения хромосом. Таким образом, основное назначение хромосом – передача точной информации от поколения к поколению. Врач Мишер (1868 год) используя гнойный материал после операционных повязок, выделил из ядер погибших лейкоцитов вещество, которое назвал нуклеин. В 1914 году доцент Петербургского университета Щепотьев доказал, что это кислоты – нуклеиновые кислоты. Кольцов представляет гипотезу об удвоении (редупликации) хромосом. Работа Эвери и Гриффита раскрыло химическую основу ДНК - наличие азотистых оснований. Одной из главных достижений позволивших построить модель ДНК было правило Эрвина Чаргаффа о комплементарности пуриновых и пиримединовых азотистых оснований. Комплементарность – это способность образовывать водородные связи. По этому правилу количество аденина + гуанина = количеству цитозина + тимина.
Прямым доказательством генетической роли ДНК способность ДНК трансформировать пневмококки одного типа в другой – работа Эвери 1944 года по размножению бактериальных вирусов – фагов.
Рентгеноструктурный анализ (методика дифракции рентгеновских лучей) и методы кристаллографии позволили Максу Перутцу и Морису Уилкинсу практически создать модель ДНК. Однако первенство в создании модели ДНК и Нобелевская премия были присуждены Френсису Крику и Джеймсу Уотсону, которые 25 апреля 1953 года в журнале «Нейчур» опубликовали небольшую статью (900 слов) «Молекулярная структура нуклеиновых кислот» о модели ДНК.
Молекула ДНК являются линейными макромолекулами, пред ставляющими собой длинные двойные цепи (тяжи) полимеров, составленных из мономеров, получивших название нуклеотидов (малых органических молекул) и являющихся строительными бло ками ДНК.
У всех живых существ макромолекулы ДНК построены по од ному и тому же плану. Они слагаются в основном из одних и тех же нуклеотидов, каждый из которых содержит по одной молекуле фосфорной кислоты и сахара, а также одно из четырех азотистых оснований — аденин, гуанин, цитозин или тимин. Аденин и гуа нин являются пуриновыми основаниями, тогда как тимин и цитозин — пиримидиновыми. Пурины и пиримидины называют осно ваниями по той причине, что в кислой среде они способны присое динять к себе ион Н+. Пиримидины являются производными шестичленного пиримидинового кольца, тогда как пурины представляют основания, у которых второе пятичленное кольцо слито с шестичленным кольцом.
Сахаром в ДНК является 2-дезокси-D-рибоза, отличающаяся от глюкозы тем, что в ее молекуле не 6, а 5 атомов углерода, т. е. является пятиуглеродным сахаром (пентозой). Особенностью этого сахара является также то, что он имеет атом водорода (Н), присое диненный к одному (специфическому) из атомов углерода, но не гидроксильную группу. Следовательно, этот сахар представляет собой дезоксирибозу, т. к. он является рибозой, лишенной кисло рода.
Сахарофосфат соединяется с азотистым основанием посредством β-гликозидной связи. Основание прикрепляется к I положению де-зоксирибозы. Структура, образованная соединением азотистого ос нования и сахара, носит название нуклеозида. Таким образом, хи мическими группами, которые образуют ДНК, являются пуриновые и пиримидиновые азотистые основания (аденин, гуанин, тимин и цитозин), сахар (2-дезокси-D-рибоза) и фосфорная кислота.
РНК характеризуется такой же структурой, как и ДНК. Одна ко в отличие от ДНК в РНК сахаром является рибоза с кислоро дом, представляющая собой сахар с 5 атомами углерода, к одному из которых прикреплена 2'-гидроксильная группа (-ОН). Кроме того, в РНК тимин не имеет метильной группы и является урацилом, т. е, в РНК тимин заменен на урацил, также являющийся пиримидиновым основанием.
Нуклеиновые кислоты называют кислотами по той причине, что их фосфатные группы освобождают в растворах ионы водо рода.
Для состава ДНК характерны закономерности, известные в ка честве правил А. Чаргаффа, а именно:
1. Сумма нуклеотидов, содержащих пуриновые азотистые ос нования, равна сумме нуклеотидов, содержащих пиримидиновые азотистые основания
2. Содержание аденина равно содержанию тимина, а гуани на — цитозину
3. ДНК из разных источников может иметь различия, обус ловленные в одних случаях преобладанием аденина над гуани ном и тимина над цитозином (А + Т > Г + Ц), в других случа ях — преобладанием гуанина и цитозина над аденином и тимином (Г + Ц > А + Т).
Для ДНК характерна структура трех видов — первичная, вто ричная и третичная. Первичная структура ДНК заключается в том, что ДНК состоит из нуклеотидных цепей, у которых скелетную основу составляют чередующиеся сахарные и фосфатные группы, объединенные ковалентными 3'-, 5'-фосфодиэфирными, скелетны ми связями, а боковые группы представлены тем или иным осно ванием (одним из четырех) и присоединяются одна к другой моле кулой сахара. Последовательно располагающиеся нуклеотиды ковалентно связаны фосфодиэфирными связями между сахарным остатком и фосфатом, и в результате этого объединены в полинуклеотидную цепь. Таким образом, первичная структура ДНК (как и РНК) определяется последовательностью нуклеотидов и характе ром их связей между сахарным остатком и фосфатом.
Представления о вторичной структуре ДНК были сфор мулированы Д. Уотсоном и Ф. Криком еще в 1953 г. На основе данных об Х-дифракции молекул ДНК, структуре оснований и пра вил А. Чаргаффа эти представления сводятся к следующему:
1. По Уотсону и Крику (1953 год) молекула ДНК (форма В) построена из двух скрученных направо спи ралевидных полинуклеотидных цепей, причем каждый виток спи рали соответствует 10 азотистым основаниям или расстоянию в 3,4 нм. Молекулы ДНК, цепи которых скручены направо, перво начально назвали В-формой.
2. Обе цепи объединены в результате закручивания одной цепи вокруг другой по общей оси. Из-за противоположной последова тельности атомов в каждой цепи обе цепи инвертированы относи тельно одна другой, т. е. направление вдоль дуплекса есть 3'→5' для одной цепи и 5'~» 3' для другой.
3. Сахарофосфатные группы располагаются на внешней стороне двойной спирали, тогда как основания находятся внутри спирали под прямым углом и вдоль ее оси. Диаметр молекулы составляет 2 нм, расстояния между отдельными азотистыми основаниями в молекуле равны 0,34 нм. Таким образом, ДНК представляет собой скрученную в правостороннем направлении двойную спираль, в которой пары азотистых оснований А-Т и Г-Ц в комплементар ных полинуклеотидных цепях подобны перекладинам в лестнице, а сахарофосфатные цепи являются каркасом этой лестницы.
4. Цепи в молекуле не идентичны, но комплементарны и удер живаются слабыми водородными связями между азотистыми осно ваниями, причем спаривание азотистых оснований для связывания цепей имеет специфический характер. Водородные связи устанав ливаются не просто между азотистыми основаниями цепей, а спе цифически между пуриновым азотистым основанием одной цепи и пиримидиновым азотистым основанием другой. В результате это го аденин одной из цепей связывается с тимином другой цепи двумя водородными связями, тогда как гуанин одной из цепей связывается с цитозином, находящимся в другой цепи, посредством трех водородных связей.
СВОЙСТВА РАЗНЫХ КОНФОРМАЦИОННЫХ ФОРМ ДНК
Дезоксирибозные остатки пар А-Т и Г-Ц разделены одинаковы ми расстояниями. Для сахарофосфатных скелетных связей харак терна полярность, поскольку фосфат связывает группу З'-ОН од ной дезоксирибозы с группой 5'-0Н другой, тогда как комплементарные цепи имеют противоположную полярность.
Двойная спираль имеет упорядоченный характер, поскольку каждая связь основание-сахар имеет одинаковое расстояние от оси спирали и перевернута на 36°. Как видно, вторичная структура отражает собой форму нуклеиновой кислоты.
Исследования рентгеновской дифракции молекул ДНК показа ли, что количество оснований в витках закрученной направо спирали может составлять не только 10, как у В-формы, но и 11, а то и 9 1/3 оснований. Эти формы спиралей получили название А- и С-форм. Установлено также, что в молекулах ДНК встречаются районы, цепи в которых закручены налево. Эти районы получили название Z-форм. Различия между А-, В-, С- и Z-формами приведе ны в табл. 12, однако степень регулярности и конформации Z-формы еще не выяснена.
Степень суперскручивания ДНК зависит от ферментов, в част ности от динамического баланса между взаимоантагонистически ми ферментами ДНК — гиразой, которая ответственна за супер скручивание и ДНК — топоизомеразой I, которая устраняет суперскручивание.
Третичная структура ДНК связана с трехмерной пространствен ной конфигурацией молекул и зависит от внутримолекулярных ус ловий. Однако эта структура достаточно еще не изучена.
Размеры молекул ДНК обычно устанавливают определением мо лекулярной массы в дальтонах и длины в количестве пар основа ний. Молекулярная масса пары А—Т составляет 617 дальтон, пары Г-Ц — 618 дальтон. Молекулярная масса 1000 пар азотистых ос нований (1 килобаса) составляет 617 500 дальтон или 6,175 х 105/ 6,02 х 1023 г = 1,026 х 10~18 г = 1,026 х 10"в пикограммов (пг), 1 пг ДНК = 9,75 х 105 килобасов = 0,975 х 10е килобасов.
Препараты ДНК, выделяемой из клеток с помощью обычных методов, имеют молекулярную массу порядка 1,0 х 107. Длина витка по оси ДНК В-формы равна 34 А. Расстояние между парами осно ваний в ДНК В-формы Е. coli равно 0,34 нм.
Для характеристики строения ДНК используют также такие фи зические константы, как плотность ее при центрифугировании в градиенте тяжелых металлов, а также температура плавления; пер вая константа отражает полидисперсность препаратов ДНК, тогда как вторая — их гетерогенность. Нагревание ДНК в растворах раз рывает водородные связи между основаниями в парах и разрушает вторичную структуру ДНК, т. е. вызывает плавление ДНК. В 0,1 М раствора NaCl плавление наступает при 95°С.
Плавление ДНК есть ее денатурация. Однако замечательное свой ство денатурированной ДНК заключается в том, что она способна к денатурации in vitro, т. е. способна восстанавливать двухцепочечную структуру, причем ренатурация является очень точной. Две цепи де натурированной ДНК могут ренатурировать в природную двухцепо чечную спиральную форму, если их последовательности комплемен тарны или, другими словами, если последовательности цепей позволяют формирование пар оснований, соединенных водородными связями. Ренатурацию можно оценить и в качестве гибридизации ДНК.
Между тем способность самокомплементарных последователь ностей к гибридизации и формированию двухцепочечной спирали присуща на только ДНК, но и РНК. В результате этого in vitro можно конструировать двухцепочечные гибридные структуры РНК-РНК или РНК-ДНК. Способность нуклеиновых кислот к ренатурации имеет значение в изучении специфики отдельных по следовательностей, а также в таксономии.
В зависимости от локализации ДНК в клетке различают ядер ные (хромосомные) и экстраядерные (экстрахромосомные) детерми нанты наследственности. Кроме того, известны транспозируемые ге нетические элементы (инсерционные последовательности, транспозоны и др.).
ЯДЕРНЫЕ (ХРОМОСОМНЫЕ)
ДЕТЕРМИНАНТЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ
С учетом эволюционного уровня организмов существует несколь ко форм организации ядерных генетических детерминантов.
Вирусный геном. Наиболее простой формой ядерной организа ции генома вообще является вирусный геном, который, как уже отмечено, очень условно часто называют вирусной хромосомой. Ге ном самых малых РНК-овых вирусов представлен последователь ностями, состоящими из нескольких тысяч нуклеотидов, что соот ветствует нескольким генам.
Гетерогенность молекулы ДНК
При биохимическом анализе ДНК клеток эукариот выделяют три фракции, содержащие уникальные умеренно повторяющиеся и высокая повторяющиеся последовательностей нуклеотида.
Уникальные повторы (45-56%) представлены в молекуле ДНК один или несколько раз. Это гены второго класса – структурные гены в которых записано информация о белках.
Умеренные повторы (8-30%) Повторы в среднем 350 раз. Это гены первого класса, в которых записана информация о всех видах РНК.
Высокие повторы (12-25%) это так называемая сателлитная ДНК. Повторы более 500 тыс.раз. Эти участки отвечают за экспрессию генов, за «узнавание» гомологичных хромосом в процессе конъюгации. Они состоят из сходных но не идентичных последовательностей и называются простыми последовательностями. У человека участки умеренно повторяющихся последовательностей ДНК длиной 300 пн чередуются с участками не повторяющейся ДНК длиной 800-1500 пм.
Уникальные повторы и умеренно повторяющиеся последовательности ДНК содержат структурные гены, псевдогены, семейство генов, кодирующих одинаковые или сходные белки.
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ АППАРАТ
РЕПЛИКАЦИИ. ТОПОГРАФИЯ РЕПЛИКАЦИИ.
МОДЕЛИ РЕПЛИКАЦИИ
Репликация ДНК является фундаментальным генетическим процессом, так как генетическая информация закодированная в последовательности нуклеотидов родительской ДНК передается с максимальной точностью дочерней молекуле ДНК. Значит дочерние клетки, организмы получают одинаковую наследственность. Следствием этого является стабильность вида, непрерывность жизни.
Репликация (повторение, от лат), редупликация, ауторепликация - процесс самовоспроизведения макромолекул нуклеиновых кислот, обеспечивающий точное копирование наследственной информации.
Репликация базируется на свойстве азотистых оснований к комплементарному спариванию.
У бактерий и эукариот репликация осуществляется полуконсервативным путем. Дочерние молекулы ДНК содержат по одной цепи материнской и по одной цепи родительской молекулы.
Репликация - это ферментативный процесс синтеза ДНК на матрице ДНК или РНК на матрице РНК.
Репликация ДНК у эукариот происходит в синтетический период митотического цикла. Начинается редупликация под воздействием S-активаторного фактора, который синтезируется и содержится только в S периоде и который, по мнению исследователей, ингибирует наступление митоза. По завершению редупликации ДНК исчезает и S-актпваторный белок.
В репликации хромосом различают:
а) раннюю фазу, в которую реплицируется эухроматин, содержащий активные гены;
б) позднюю фазу, в которую реплицируется гетерохроматин, более компактизированная часть хроматина.
Репликация ДНК стала бурно изучаться с момента конца 50-ых годов, когда лауреат Нобелевской премии Артур Корнберг выделил из E.coli первый фермент биосинтеза ДНК: полимеразу I. Группа Корнберга является определяющей в изучении репликации ДНК. Более полно репликация изучена у бактерий, однако, многие, действующие лица и звенья были обнаружены и у эукариот.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПЛИКАЦИИ ДНК ЭУКАРИОТ:
1. Осуществляется полуконсервативным способом.
2. Происходит одновременно на многих участках ДНК. Один такой самореплицирующийся участок ДНК, содержащий точку инициации репликации называют репликоном (понятие сформулировали Якоб, Бреннер и Кузин в 60-ые годы). Репликон включает точку инициации и два терминуса (окончание репликации). В клетке человека 46 хромосом содержит ДНК в 180 см и репликонов насчитывают от 10.000 до 50.000. У прокариот всего один репликон.
3. Репликация начинается в специфических точках инициации, названных ori (origin) с образованием репликационной вилки. Репликационная вилка - это часть молекулы ДНК расплетенная, с разъединенными цепями, где идет синтез фрагментов новых молекул ДНК.
4. Репликация бывает однонаправленная у вирусов (редко) и чаще двунаправленная.
5. Репликация обеих цепей всегда идет в направлении от 51 конца к 31 концу (дочерняя цепь) из-за свойства фермента ДНК полимеразы присоединять к З1 ОН концу дезоксинуклеотидных остатков, образующихся из дезокеннуклеозид 51 трифосфатов.
6. Так как цепи антипараллельны, то на материнской цепи З1 →51 дочерняя цгпь 51→ 3' синтезируется непрерывно лидирующая: На другой материнской цепи 51 —> З1 дочерняя цепь З1 —> 5 синтезируется прерывисто, репликонами опаздывающая. Длина фрагментов Оказаки (по имени впервые их описавшего) от 100 до 3000 нуклеотидов.
7. Репликация прерывистых цепей осуществляется при инициации каждого фрагмента Оказаки. Но ДНК - полимераза может только катализировать присоединение следующего нуклеотида к свободному З1ОН концу, т.е. только так может продолжать присоединение нуклеотидов. Поэтому в начале каждого репликона (фрагмента Оказаки) с участием праймазы из рибо-нуклеотидов комплементарно матрице синтезируется затравка-праймер. точнее рибо-праймер.
Праймеры (затравки) синтезируются на материнских молекулах ДНК под действием полимеразы α, и дочерние цепи в направлении 51→ 3'.
β-полимераза синтезирует лидирующую цепь непрерывно, а ε- полимераза фрагментарно отстающую цепь. После удаления праймеров с отстающей цепи, заполнение брешей происходит под действием β-полимеразы. ДНК- лигаза связывает фрагменты Оказаки в единую цепь.
Сырьем для синтеза ДНК являются d АТФ, d ГТФ, d ТТФ и d УТФ одновременно они обеспечивают энергией этот процесс, т.к. полимеразы разрушают вторую макроэргическую связь трифосфатов в результате нуклеофильной атаки - ОН при Сз-конце на а- фосфат трифосфата.
После завершения репликации происходит метилирование аденина в -ГАТЦ - последовательностях с образованием N6 - метиладенина. Однако до появления этих групп возможна репарация для исправления ошибок.
Система репарации ошибок репликации состоит из комплекса белков; mut-s узнает место ошибки (по С6 – NH2 аденину), mut-H присоединяется к метиллированному ГАТЦ, ближайшему к ошибке; mut- L выщепляет поврежденную часть, после чего (3- полимераза заполняет брешь и ДНК-лигаза соединяет синтезированный участок с основной цепью.