Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
PAGE 12
Республиканская олимпиада школьников 2006
КАБИНЕТ №3 (52 балла)
МИКРОБИОЛОГИЯ
ЗАДАНИЕ 1. (44 балла). Идентификация микроорганизмов по микроскопическим и физиолого-биохимическим свойствам.
Для идентификации микроорганизмов используют совокупность микроскопических и физиолого-биохимических свойств. Вам предлагается идентифицировать 5 групп микроорганизмов, выращенных на поверхности питательной среды в чашке Петри, с использованием различных способов окрашивания клеток, а также путем определения их грампринадлежности.
Идентификация будет осуществляться последовательно в 3 этапа:
Этап 1. Окрашивание клеток микроорганизмов.
Этап 2. Определение грампринадлежности микроорганизмов.
Этап 3. Определение образования спор у микроорганизмов.
Правильно идентифицировать группы микроорганизмов Вам поможет “Схема идентификации микроорганизмов”, на которой отражены последовательные этапы идентификации. Дополнительная информация, имеющая вспомогательное значение, содержится в “Описании групп микроорганизмов”.
Результаты идентификации вносите в соответствующие графы таблицы 1 «Идентификация микроорганизмов».
При выполнении работы будьте осторожны и не допускайте попадания реактивов на кожу и одежду. Использованные деревянные шпильки, предметные стекла складывайте в чашку Петри для грязной посуды, которая находится на Вашем столе.
Этап 1. Окрашивание клеток микроорганизмов.
Для окрашивания клеток Вам необходимы:
1. Бактериальные штаммы №№ 1-5 в чашке Петри «Штаммы» с агаризованной средой.
2. Предметные стекла.
3. Пипетка.
4. Раствор красителя “Фуксин” с пипеткой.
5. Спиртовка.
6. Микроскоп.
7. Деревянные палочки (зубочистки).
8. Иммерсионное масло.
9. Маркер по стеклу.
10.Спички.
11.Кусочек мыла.
12.Бинт.
13.Фильтровальная бумага.
14.Лоток для окрашивания и промывания препаратов.
15.Вода.
16.Пинцет.
В микробиологической практике для изучения морфологии микроорганизмов используют окрашенные препараты (мазки), приготовленные из естественных образцов либо из колоний выросших микроорганизмов. Поскольку размеры клеток бактерий малы, для увеличения разрешения микроскопа используют окуляр «х15», объектив «х90» и масляную иммерсионную систему.
В ходе выполнения данного задания Вам необходимо приготовить пять окрашенных препаратов штаммов №№ 1-5 (чашка Петри «Штаммы»), произвести микроскопирование полученных препаратов с иммерсионной системой, рассмотреть и определить форму клеток микроорганизмов, результаты идентификации внести в соответствующие графы таблицы 1 «Идентификация микроорганизмов».
Окрашенные препараты бактерий готовят в следующей последовательности:
Внимание! Каждый из нижеперечисленных этапов приготовления окрашенных препаратов проводите одновременно для всех исследуемых штаммов микроорганизмов.
Ход работы:
Для обезжиривания предметного стекла одну из его сторон потрите кусочком мыла до возникновения равномерного белого слоя. После этого протрите его с помощью сухого бинта (стекло должно быть чистое и прозрачное). С помощью маркера пометьте обезжиренную поверхность, подписав номер штамма в любом из углов стекла. С помощью пипетки нанесите небольшую каплю воды примерно в центр обезжиренной поверхности. Внесите в каплю с помощью деревянной шпильки биомассу соответствующего штамма (№№ 1-5) с чашки Петри «Штаммы», стараясь не зацепить агаризованную среду. Тщательно перемешайте взвесь и распределите полученную суспензию на площади диаметром 1-2 см.
Проводят мазком вверх при комнатной температуре или высоко над пламенем спиртовки, не допуская нагревания препарата. Препарат высушивают до полного испарения воды.
Внимание! При работе со спиртовкой будьте осторожны!
Фиксация необходима для закрепления микроорганизмов на поверхности стекла и повышения восприимчивости клеток к красителю. Фиксация осуществляется термически над пламенем спиртовки. Для этого пронесите препарат 3-4 раза над пламенем спиртовки мазком вверх (стекло должно нагреться до такой степени, что бы при прикосновении к тыльной стороне ладони вызывало легкое жжение).
Расположите фиксированный препарат мазком вверх на параллельные стеклянные рейки, которые лежат над кюветой. На мазок положите кусочек фильтровальной бумаги, на который нанесите раствор красителя “Фуксин” на 1-2 мин. После завершения окрашивания бумагу снимите пинцетом, а препарат, не снимая с реек, промойте водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем высушите препарат, аккуратно промокая его фильтровальной бумагой.
Для микроскопирования препаратов используют микроскоп с объективом «х90» (его легко узнать по черной полосе, окаймляющей объектив) и искусственный осветитель, который должен быть включен на момент микроскопирования препарата.
Микроскопирование проводится с помощью иммерсионной системы, для чего на предметное стекло в центр исследуемого препарата нанесите каплю иммерсионного масла и расположите препарат на предметном столике микроскопа. С помощью макровинта осторожно опустите объектив в иммерсионное масло таким образом, чтобы дотронуться до предметного стекла. Затем, глядя в окуляр, медленно поднимайте объектив вверх с помощью макровинта до появления в поле зрения окрашенных микроорганизмов. С помощью микровинта добейтесь максимальной четкости изображения. Двигая предметный столик, найдите изолированные окрашенные клетки микроорганизмов.
Рассмотрите поочередно препараты штамма №№ 1-5. Определите особенности морфологии клеток микроорганизмов и сделайте рисунок в соответствующей графе “Рисунок окрашенных клеток” таблицы 1 «Идентификация микроорганизмов».
После этого внимательно изучите “Схему идентификации микроорганизмов” и прочитайте “Описание групп микроорганизмов”. В том случае, если какие-либо из микроорганизмов идентифицированы Вами как “дрожжи” и (или) “актиномицеты” внесите эти слова в соответствующую графу “Результаты идентификации” таблицы 1 «Идентификация микроорганизмов». Для идентификации остальных микроорганизмов переходите к этапу 2.
Этап 2. Определение грампринадлежности микроорганизмов.
1. Биомасса бактериальных штаммов в чашке Петри «Штаммы»).
2. Раствор КОН (3 % КОН).
3. Кусочек полиэтиленовой пленки.
4. Деревянные шпильки.
Ход работы:
Нанесите на кусочек полиэтиленовой пленки небольшую каплю 3 %-ого раствора КОН, используя капельницу. Затем в каплю с помощью деревянной шпильки внесите биомассу исследуемого штамма микроорганизма. Для этого аккуратно захватите с поверхности агара биомассу (количество ее должно примерно соответствовать размеру спичечной головки), стараясь не зацепить сам агар. Этой же шпилькой на предметном стекле тщательно перемешайте взвесь. Если культура образует тянущуюся за шпилькой субстанцию, то бактерии исследуемого штамма являются грамотрицательными, если нет – грамположительными.
Пользуясь каждый раз новой шпилькой, проделайте те же манипуляции с остальными штаммами. Результаты внесите в соответствующую графу “Грампринадлежность” таблицы 1 «Идентификация микроорганизмов». Необходимо поставить «+» в случае грамположительных бактерий и «–» – в случае грамотрицательных.
Используя результаты этапа 1 и полученные на этапе 2 данные изучите “Схему идентификации микроорганизмов” и прочитайте “Описание групп микроорганизмов”. В том случае, если какие-либо из микроорганизмов идентифицированы Вами как “псевдомонады” и (или) “паракокки” внесите эти слова в соответствующую графу “Результаты идентификации” таблицы 1 «Идентификация микроорганизмов». Для идентификации остальных микроорганизмов переходите к этапу 3.
Этап 3. Определение образования спор у микроорганизмов.
Для окрашивания клеток и спор Вам необходимы:
1. Бактериальные штаммы в чашке Петри «Штаммы».
2.Предметное(ые) стекла.
3.Пипетка.
4.Раствор красителя “Фуксин” с пипеткой.
5.Раствор красителя “Малахитовый зеленый” с пипеткой.
6.Спиртовка.
7.Микроскоп.
8.Деревянные палочки (зубочистки).
9.Иммерсионное масло.
10.Маркер по стеклу.
11.Спички.
12.Кусочек мыла.
13.Бинт.
14.Фильтровальная бумага.
15.Лоток для окрашивания и промывания препаратов.
16.Вода.
17.Пинцет.
Спорообразование свойственно многим грамположительным бактериям. Обычно внутри каждой клетки образуется одна спора, которая может располагаться центрально или быть смещена к полюсу бактериальной клетки. В мазках бактериальных культур, находящихся на поздних стадиях спорообразования, часто фиксируются споры, находящиеся за пределами клеток. Бактериальные споры выявляются с использованием сложных методов окраски, когда на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами. Наиболее используемым сложным методом окраски эндоспор является метод Шефера-Фултона, которым и предлагается Вам воспользоваться.
Все процедуры приготовления, высушивания, фиксации мазка и его последующего микроскопирования подробно описаны в “Ходе работы” этапа 1, поэтому здесь приводиться не будут. Ниже приведена только методика окрашивания препарата.
Внимание! В случае анализа более одного штамма бактерий все процедуры окрашивания препаратов проводите одновременно для всех исследуемых штаммов микроорганизмов.
Ход работы:
Расположите фиксированный препарат мазком вверх на параллельные стеклянные рейки, которые лежат над кюветой. На мазок положите кусочек фильтровальной бумаги, на который нанесите раствор красителя “Малахитовый зеленый”. Нагрейте препарат в пламени спиртовки до появления паров. Для этого пронесите препарат несколько раз над пламенем спиртовки мазком вверх до видимого глазу образования паров на поверхности фильтровальной бумаги. После этого бумагу снимите пинцетом, а препарат промойте водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Далее на мазок положите кусочек фильтровальной бумаги, на который нанесите раствор красителя “Фуксин” на 1-2 мин. После завершения окрашивания бумагу снимите пинцетом, а препарат промойте водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем высушите препарат, аккуратно промокая его фильтровальной бумагой. Проведите микроскопирование мазка. Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки – в красный.
Результаты внесите в соответствующую графу “Наличие спор” таблицы 1 «Идентификация микроорганизмов». Необходимо поставить «+» в случае наличия спор и «–» – в их отсутствия. Используя результаты этапов 1 и 2 и полученные на этапе 3 данные, изучите “Схему идентификации микроорганизмов” и прочитайте “Описание групп микроорганизмов”. В том случае, если какие-либо из микроорганизмов идентифицированы Вами как “бациллы”, “лактобациллы”, “споросарцины” и (или) “стафилококки” внесите эти слова в соответствующую графу “Результаты идентификации” таблицы 1 «Идентификация микроорганизмов».
Таблица 1. Идентификация микроорганизмов.
|
Штамм |
Рисунок окрашенных клеток |
Грампринад-лежность |
Наличие спор |
Результат идентификации |
|
1 |
||||
|
2 |
||||
|
3 |
||||
|
4 |
||||
|
5 |
СХЕМА ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
ОПИСАНИЕ ГРУПП МИКРООРГАНИЗМОВ
Дрожжи.
Сборная группа одноклеточных микроскопических микроорганизмов, относящихся к разным классам грибов, преимущественно – к классу аскомицетов. Диаметр клеток дрожжей колеблется от 8 до 15 мкм. Форма их разнообразна: эллипсовидная, грушевидная, округлая, цилиндрическая. Размножаются вегетативным и половым путем. Вегетативные способы размножения – почкование и деление. Почкующиеся формы располагаются поодиночке, часто встречаются материнские клетки с “почками” – дочерними клетками, которые по размеру меньше материнской. При микроскопировании в мелкозернистом содержимом живых дрожжей при незначительном изменении четкости с помощью микровинта хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие центральное положение. Клетки дрожжей хорошо отличимы от бактериальных клеток благодаря своим крупным размерам.
Актиномицеты.
Эта группа микроорганизмов занимает промежуточное положение между бактериями и грибами. Они одноклеточные как бактерии, но образуют мицелий как грибы. Диаметр нитей у них очень мал, как и у бактерий (0,5-1 мкм), но гифы мицелия ветвистые и длинные, как у грибов.С грибами актиномицетов объединяет также способность размножаться спорами. На питательных средах актиномицеты образуют плотные колонии, срастающиеся с субстратом. При микроскопировании окрашенных фуксином препаратов обнаруживаются ветвящиеся нити, отдельные клетки и короткие цепочки. Часто в препаратах обнаруживаются морфологически разнородные клетки и цепочки, отличающиеся друг от друга по диаметру клеток. Иногда в окрашенных препаратах могут быть заметны споры в виде кокковидных форм, рассеянных среди мицелиальных форм.
Род Staphylococcus (стафилококки).
Грамположительные неподвижные бактерии кокковидной (сферической) формы. Метаболизм бродильный. Клетки 0,5-1,5 мкм в диаметре. Клетки встречаются поодиночке и в парах, но чаще в результате характерного деления более чем в одной плоскости образуют неправильные скопления. Спор не образуют.
Род Bacillus (бациллы).
Грамположительные подвижные бактерии палочковидной формы, в окрашенных препаратах встречающиеся поодиночно или в цепочках. Размеры 0,5-1х2-4 мкм. Аэробы или факультативные анаэробы. Образуют термоустойчивые споры, не более одной в клетке. При окрашивании спор также часто можно наблюдать отдельные споры, расположенные среди вегетативных клеток.
Род Pseudomonas (псевдомонады).
Грамотрицательные подвижные бактерии палочковидной формы, в окрашенных препаратах встречающиеся поодиночно или попарно. Размеры 0,5-1х2-4 мкм. Аэробы, метаболизм дыхательный. Спор не образуют.
Род Sporosarcina (споросарцины).
Грамположительные неподвижные бактерии кокковидной (сферической) формы. Метаболизм дыхательный Клетки 0,5-3 мкм в диаметре. Для них характерно деление в более чем одной плоскости с образованием правильных пакетов из 4, 8 или более клеток или неправильных скоплений, как у стафилококков. Иногда встречаются одиночные клетки. Образуют эндоспоры, не более одной в клетке.
Род Lactobacillus (лактобациллы).
Грамположительные неподвижные бактерии палочковидной формы, в окрашенных препаратах встречающиеся поодиночно или в цепочках. Размеры 0,5-1х2-4 мкм. Факультативные анаэробы. Спор не образуют.
Род Paracoccus (паракокки).
Грамотрицательные неподвижные бактерии кокковидной (сферической) формы. Метаболизм дыхательный. Клетки 0,5-1 мкм в диаметре. Клетки встречаются поодиночке и в парах, но чаще в результате характерного деления более чем в одной плоскости образуют неправильные скопления. Спор не образуют.
ЗАДАНИЕ 2. (8 баллов). Определение количества клеток бактерий.
2.1. (5 баллов). По калибровочному графику.
В микробиологических исследованиях для подсчета количества клеток бактерий, выращенных в жидких средах, используется ряд методов. Одним из них является калориметрический метод, суть которого заключается в том, что определенному количеству клеток соответствует конкретное значение оптической плотности культуры, которую можно измерить на ряде приборов (спектрофотометры, фотоэлектрокалориметры). В основе метода лежит измерение количества света, рассеянного взвесью клеток. Рассеивание света пропорционально их численности. Светорассеяние зависит от размеров клетки и будет тем большим, чем крупнее клетки. Количество клеток определяют по калибровочной кривой, отображающей зависимость между значением оптической плотности и числом клеток в единице объема исследуемой взвеси. Характер получаемых в таких исследованиях калибровочных графиков видоспецифичен, то есть зависит от вида исследуемых бактерий.
Измерение оптической плотности культур некоторых видов бактерий сопряжено с некоторыми трудностями, поскольку измерительные приборы имеют минимальную и максимальную разрешающую способность.
В случае плохо растущих культур значения оптической плотности могут быть меньше минимальной разрешающей способности прибора, что не позволяет достоверно провести измерения. В этом случае клетки из большего объема культуры концентрируют в меньшем объеме, после чего проводят измерения.
В случае очень хорошо растущих культур значения оптической плотности могут быть больше максимальной разрешающей способности прибора. В этом случае культуру клеток разводят в большем объеме, после чего проводят измерения. Разведения бактерий производят в физиологическом растворе, используя шаги разведения 10-1 (в 10 раз), 10-2 (в 100 раз) и т.д.
На рисунке приведены два калибровочных графика зависимости количества клеток культуры от оптической плотности (D) культуры для двух видов бактерий (вид А и вид Б). Необходимо определить количество клеток бактерий в 1 мл культуры, если известно:
Таблица 2. Количественный учет микроорганизмов
|
Вид бактерий |
D600 |
Количество клеток в 1 мл культуры |
|
А |
0,4 |
|
|
Б |
1,0 |
2.2. (3 балла). Путем высева на питательные среды (метод Коха).
Сущность этого метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на агаризованную питательную среду в чашках Петри и подсчете формирующихся колоний, принимая во внимание, что каждая клетка – потомство одной жизнеспособной клетки. Для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений, так как численность микробных популяций достаточна велика.
В эксперименте использовали культуру бактерий Escherichia coli, выращенных в питательном бульоне в объеме 20 мл. Разведения культуры готовили в физрастворе. Для этого 0,5 мл культуры вносили в пробирку с 4,5 мл физраствора (разведение – 10-1). Содержимое пробирки тщательно перемешивали и 0,5 мл суспензии переносили в другую пробирку с 4,5 мл физраствора (разведение – 10-2). Таким же образом готовили и последующие разведения. Из разведения 10-7 провели высев на поверхность агаризованной питательной среды параллельно в 2 чашки Петри, используя для посева в каждую чашку по 0,1 мл клеточной суспензии. Через сутки наблюдали формирование изолированных колоний на поверхности среды в чашках Петри. Результаты представлены на рисунке.
Используя приведенные на рисунке данные, определите среднее количество клеток Escherichia coli в 1 мл исходной культуры:
разведение – 10-7
0,1 мл
лактобациллы
споросарцины
стафилококки
бациллы
нет спор
ет спор
есть споры
есть споры
Определение образования спор
Определение образования спор
паракокки
псевдомонады
Г+ - кокки
Г– - кокки
Г+ - палочки
Г– - палочки
Определение грампринадлежности
Определение грампринадлежности
кокки
палочки
бактерии
актиномицеты
дрожжи
Палочки или кокки
Нити, цепочки и отдельные клетки
Крупные почкующиеся клетки
Окрашивание клеток
Количество клеток в 1 мл культуры
Оптическая плотность культуры (D600).
2•108
2,5•108
1,5•108
1•108
5•107
0
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
1•107
0,1 мл
Код:
Место для баллов:
Оценка