Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна
Репницька Олена Петрівна
УДК 577.32
Структурні особливості нуклеїнових кислот
з опромінених та пухлинних тканин
03.00.02 – біофізика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фізико-математичних наук
Харків – 2002
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті фізики НАН України.
Науковий керівник кандидат фізико-математичних наук
Довбешко Галина Іванівна,
Інститут фізики НАН України,
старший науковий співробітник відділу фізики
біологічних систем
Офіційні опоненти:
доктор фізико-математичних наук, професор
Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та
електроніки ім. О.Я. Усікова НАН України, провідний науковий
співробітник відділу біофізики (м. Харків);
кандидат фізико-математичних наук, старший науковий співробітник
Зозуля Віктор Миколайович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, старший науковий співробітник відділу молекулярної біофізики (м. Харків).
Провідна установа:
Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України, м. Київ.
Захист відбудеться 24.05.2002 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна,
61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий 22.04.2002 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.
1
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Вивчення структурних особливостей нуклеїнових кислот, зумовлених впливом радіаційного опромінення та процесами злоякісного перетворення клітини, є надзвичайно актуальною задачею на сьогодні. Нагальність цієї проблеми зумовлена тим, що внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС і пов'язаній з нею складної екологічної ситуації в Україні, дії іонізуючого опромінення зазнають дедалі більше людей. Сьогодні ми зіткнулись з віддаленими наслідками аварії, що проявляються в значному зростанні тяжких хвороб генетичної природи, в число яких входять і онкологічні захворювання.
Однією з важливих проблем сучасної онкології є дослідження процесів трансформації пухлини з чутливої в резистентну, нечутливу до дії протипухлинних препаратів, причому резистентність, як правило, має комплексний характер. Набування клітиною резистентності виникає в результаті одного або кількох курсів хіміотерапії. Аналіз інфрачервоних (ІЧ) спектрів поглинання нуклеїнових кислот з різних штамів пухлинних тканин, а також на різних стадіях розвитку пухлини, дозволить глибше зрозуміти процеси, що відбуваються в клітині внаслідок її злоякісної трансформації, а отже і вказати новий напрямок в пошуку методик лікування. Крім того, вивчення конформаційних станів і форм нуклеїнових кислот має важливе фундаментальне значення для розуміння процесів їх функціонування.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планами наукової діяльності відділу фізики біологічних систем Інституту фізики НАН України в рамках теми: “Експериментальне та теоретичне дослідження фізичних механізмів функціонування біологічних макромолекул та їх комплексів в нерівноважних умовах та під дією зовнішніх чинників” (1999-2001 рр., № держреєстрації 0199U000657).
Мета і задачі дослідження. Метою даної дисертаційної роботи було дослідження характерних особливостей у структурі нуклеїнових кислот, що виникають внаслідок дії різних зовнішніх чинників, зокрема іонізуючого радіаційного опромінення, канцерогенних процесів у клітині, а також в результаті взаємодії з протипухлинними препаратами.
Для досягнення даної мети розв'язувались наступні задачі:
1) розробка чутливої методики для реєстрації ІЧ-спектрів біологічних молекул на базі серійного фур'є-інтерферометра з використанням приставки на відбивання. У якості підкладок були використані скляні пластини з напиленим шаром золота товщиною 200-500 Е. Дослідження правомірності використання даної методики стосовно ДНК;
2) комплексні дослідження ДНК з тканин експериментальних тварин, що перебували під дією слабких доз іонізуючого радіаційного опромінення в Чорнобильській зоні відчуження протягом тривалого часу за допомогою ІЧ-, УФ- спектроскопії та аналізу спектрів ІЧ-поглинання за допомогою алгоритму нейронних мереж;
3) дослідження ІЧ-спектрів поглинання ДНК з тканин рослин, що опромінювались сильними дозами g-опромінення в лабораторних умовах, для встановлення характеру пошкоджень в структурі ДНК;
4) узагальнення результатів спектроскопічних досліджень ДНК з опромінених тканин та
2
побудова кореляційних залежностей спектральних параметрів від дози опромінення;
5) ІЧ-спектроскопічні дослідження РНК з тканин злоякісних пухлин на різній стадії розвитку та ДНК з чутливих і резистентних штамів пухлинних тканин. Встановлення характерних спектральних особливостей, що можуть бути маркерами пухлинних процесів. Дослідження впливу доксорубіцину і цис-диамінодихлорплатини (цис-платини) на структуру і конформаційні властивості ДНК з тканин чутливих і резистентних штамів карциноми Герена після одноразового введення препаратів експериментальним тваринам.
Об'єктом дослідження були нуклеїнові кислоти, виділені з тканин рослин і експериментальних тварин (щурів), що зазнали впливу різних доз іонізуючого опромінення. Крім того, ДНК з чутливих і резистентних до дії доксорубіцину і цис-платини пухлинних тканин до і після введення даних препаратів експериментальним тваринам, а також РНК з пухлинних тканин на різних стадіях розвитку пухлини.
Предметом дослідження були особливості молекулярної структури нуклеїнових кислот з пухлинних і опромінених тканин, а також характер взаємодії протипухлинних препаратів з ДНК чутливих і резистентних штамів пухлинних тканин.
Для досягнення поставленої мети були застосовані наступні методи дослідження: ІЧ-фур'є-спектроскопія поглинання та відбивання; спектроскопія підсиленого металевою поверхнею інфрачервоного поглинання (SEIRA- Surface enhanced infrared absorption); ультрафіолетова (УФ) спектроскопія в діапазоні температур 35-80°С для побудови кривих плавлення ДНК, а також для перевірки чистоти препаратів нуклеїнових кислот та для розрахунку концентрацій розчинів нуклеїнових кислот; алгоритм нейронних мереж для розпізнавання спектрів ІЧ-поглинання ДНК з опромінених тканин; аналіз спектрів за допомогою розкладу контуру на компоненти за алгоритмом Левенберга-Марквардта; гель-електрофорез; мікроскопія атомних сил для встановлення величини шорсткості поверхні золота.
Наукова новизна одержаних результатів
1. Виявлено ряд особливостей у спектрах інфрачервоного поглинання нуклеїнових кислот з тканин, опромінених різними дозами радіації, а також проведено віднесення даних особливостей до певного типу пошкоджень просторової структури. Показано, що слабкі дози опромінення призводять до розупорядкування вторинної структури, ослаблення зв'язків, появи потенційних місць розривів. Вплив великих доз опромінення викликає розриви цукрофосфатного остову, зміни конформації окремих ділянок молекули нуклеїнової кислоти.
2. Показано відмінності в структурі нуклеїнових кислот з пухлинних тканин на різних стадіях злоякісності, а також з тканин чутливих і резистентних штамів пухлин. Знайдено ряд спектральних ознак, що можуть бути використані як маркери пухлинного процесу. Показано, що цукри в ДНК і РНК з пухлинних тканин можуть перебувати в конформаційних станах, не характерних для нормальної тканини.
3. Застосовано алгоритм нейронних мереж для розпізнавання спектрів нуклеїнових кислот з опромінених та пухлинних тканин.
4. Всі експерименти з опромінення та дослідження пухлин та впливу протипухлинних препаратів проводились не на модельних системах, а на живих об'єктах (рослинах, тваринах), що зумовлює цінність і унікальність отриманих результатів.
3
5. Запропоновано нову, більш чутливу методику для реєстрації ІЧ-спектрів нуклеїнових кислот на основі ефекту підсилення шорсткою золотою поверхнею інфрачервоного поглинання. Проведено дослідження коефіцієнту підсилення в залежності від товщини шару напиленого золота. Доведено правомірність застосування даної методики до такого роду задач.
Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що в дисертаційній роботі встановлено ряд характерних спектральних особливостей ДНК з опромінених тканин та проведено віднесення їх до типів структурних пошкоджень, індукованих впливом різних доз іонізуючого опромінення. Показано відмінності в структурі нуклеїнових кислот з пухлинних та нормальних тканин, а також з чутливих та резистентних пухлинних тканин, та встановлено ряд спектральних особливостей, що можуть бути маркерами злоякісного перетворення клітини. Показано, що більш суттєво процеси канцерогенезу відбиваються на структурі РНК. Ґрунтуючись на отриманих результатах, може бути створена діагностична методика для визначення ступеня злоякісності пухлини та впливу протипухлинного препарату на її трансформацію. Запропонована нова експериментальна методика реєстрації ІЧ-спектрів нуклеїнових кислот характеризується зручністю використання і може бути чутливою для дослідження інших біологічних молекул.
Особистий внесок здобувача. В опублікованих зі співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає:
у роботах [1, 3, 7, 8] в аналізі літературних джерел, проведенні віднесення смуг поглинання до коливань певних молекулярних груп в ДНК, проведенні вимірювань і обробці експериментальних результатів, розробці моделі для розкладу широких складних смуг поглинання на окремі компоненти; у роботах [2, 9, 10, 12] у проведенні вимірювань, обробці експериментальних даних, обговоренні отриманих результатів і побудові феноменологічної моделі пухлинної РНК та опроміненої ДНК; у роботі [4] в аналізі літературних джерел, обговоренні результатів теоретичних розрахунків і проведенні кореляції з отриманими експериментальними даними; у роботі [11] у постановці експерименту, вирощуванні експериментальних рослин, проведенні вимірювань, обробці експериментальних результатів та встановленні кореляційних залежностей спектральних параметрів від дози опромінення; у роботах [5, 15, 18] у постановці і проведенні методичного експерименту, обробці експериментальних даних; у роботах [6, 13, 14, 16, 17, 19, 20] у постановці біофізичного експерименту, проведенні вимірювань і обробці експериментальних результатів, в обговоренні та інтерпретації отриманих результатів.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені та доповідались на:
XIV школі-семінарі зі спектроскопії молекул і кристалів (1999, Одеса); ХХХІ Міжнародному спектроскопічному колоквіумі (1999, Анкара, Турція); Міжнародній конференції з конформацій, модифікацій і впізнавання ДНК в біомедицині, (2000, Брно, Чеська Республіка); XXV Європейському конгресі з молекулярної спектроскопії (2000, Коімбра, Португалія); конференції молодих вчених “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття”, (2000, Київ); конференції з нелінійної оптики рідких і фоторефрактивних кристалів (2000, Алушта, Крим); Першій російсько- українсько-
4
польській конференції з молекулярних взаємодій (2001, Гданськ, Польща); Першій міжнародній конференції молодих вчених “Конференція з прикладної фізики” (2001, Київ); XV школі-семінарі зі спектроскопії молекул і кристалів (2001, Чернігів); Осінній школі NATO “Горизонти молекулярної структури та технології фулеренів, нанотрубок, наносиліконів, мультифункціональних наносистем та біополімерів (ДНК, протеїни)” (2001, Київ); XIV конференції “Горизонти в дослідженнях водневого зв'язку”, (2001, Турін, Італія).
Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковані в 20 роботах, у тому числі в 6 статтях у наукових фахових журналах та в 14 тезах доповідей на міжнародних і національних конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, шести розділів і висновків. Повний обсяг дисертації складає 166 с., містить 48 рисунків і 12 таблиць, з яких 17 рисунків і 6 таблиць розміщені на окремих сторінках. Список використаних літературних джерел – 175 найменувань на 16 сторінках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми дисертації, сформульовано мету та перелічені задачі, які необхідно розв'язати для її досягнення, визначено наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів, наведено загальну структуру дисертації.
У розділі 1 проведено огляд літератури за темою дослідження. У ньому викладено сучасні уявлення про структуру та стабільність нуклеїнових кислот. Детально розглянуто вплив зовнішніх умов (вологість, іони металів, рН та ін.) на формування конформаційних станів основ та цукрів, а також їх спектральні прояви. Ґрунтуючись на літературних даних, проведено віднесення смуг поглинання в ІЧ-спектрах нуклеїнових кислот до коливань певних молекулярних груп, а також визначено ряд коливань в області поглинання основ та цукрів, що можуть бути маркерами конформаційних станів нуклеїнових кислот.
Зроблено огляд результатів досліджень впливу іонізуючого опромінення на структуру ДНК та її складових, а також проаналізовано типи можливих структурних пошкоджень. Зокрема зазначено, що реакція організму на опромінення має системний характер і включає в себе як наслідки прямого влучання іонізуючого опромінення в мішені, якими є молекули нуклеїнових кислот, так і взаємодії з продуктами радіолізу компонент клітини. Особлива увага звертається на дію слабких доз іонізуючого опромінення та відзначається її можлива роль у процесах канцерогенезу.
Згідно з мутаційною теорією канцерогенезу показано, що геном пухлинної клітини характеризується наявністю мутацій, які можна розділити на два основних класи: мутації в генах, що призводять до зростання активності протеїнів, які вони кодують, (онкогени), та мутації, що призводять до інактивації функції окремих генів (гени-супресори). Охарактеризовано можливі причини їх утворення, серед них як помилки в процесі реплікації, так і мутації, викликані зовнішніми чинниками (вільні радикали, канцерогени, іонізуюче опромінення та ін.). Показано можливість застосування ІЧ фур'є-спектроскопії для аналізу структурних особливостей нуклеїнових кислот з пухлинних та опромінених тканин.
5
У розділі 2 наведено характеристику методів та об'єктів досліджень. Основною використаною в роботі експериментальною методикою була ІЧ-фур'є-спектроскопія. Спектри поглинання реєструвались на фур'є-спектрометрі IFS-48 фірми Брукер (Німеччина) у стандартній геометрії на пропускання. Прилади такого класу характеризуються високою чутливістю (кількість досліджуваної речовини становила 20-50 мкг), роздільною здатністю (порядку 1 см-1) та метрологічною точністю (точність визначення хвильового числа 0,05 см-1).
Для аналізу зразків особливо малої кількості нами була запропонована модифікована методика реєстрації спектрів на основі ефекту підсилення шорсткою металевою поверхнею ІЧ-поглинання (SEIRA). Теоретична інтерпретація ефекту підсилення представлена в літературі в загальному вигляді і включає два можливих шляхи: це підсилення електромагнітного поля внаслідок взаємодії з локальними (поверхневими) плазмонними коливаннями, що виникають на неоднорідностях металевої поверхні, та специфічне зростання дипольних моментів переходів адсорбованих на металеву поверхню молекул. За порядком величини підсилення можна охарактеризувати співвідношенням, що показує залежність поперечного перерізу поглинання від усереднених за тензорними індексами коефіцієнтів підсилення електричного поля g і дипольного моменту переходу h поблизу металевої поверхні:
sa(r,w)=Ѕ<fЅH(r,w)Ѕi>Ѕ2d [h(w-wfi)]~sa(0)Ѕg(r,w)Ѕ2Ѕh(r)Ѕ2,
де sa(0) – ефективний переріз поглинання за відсутності металу (d=d0, E=E0).
Експеримент проводився на базі фур'є-інтерферометра з використанням приставки на відбивання. При цьому зразки нуклеїнових кислот наносились на позолочені скляні пластини з шаром напиленого золота товщиною 200-500 Е. Шорсткість поверхні була близько 50 Е та контролювалась за допомогою мікроскопу атомних сил (рис. 1) (AFM, серійний наноскоп ІІІа, Digital Instrument, Santa Barbara, CA) із застосуванням серійного вістря з нітриду кремнію в неконтактному режимі. Частота сканування складала 1 Гц. Дослідження показали, що величина підсилення є оптимальною, коли шорсткість поверхні знаходиться в межах 50-100 Е, а товщина шару напиленого золота порядку 200 Е.
Отримані в експерименті коефіцієнти підсилення інтегральної інтенсивності смуг поглинання, що відповідають коливанням різних молекулярних груп ДНК, склали від 3 до 5 в залежності від товщини шару напиленого золота.
Результати свідчать про те, що внаслідок використання методу SEIRA для дослідження ІЧ-поглинання нуклеїнових кислот не спостерігається деформації контуру смуг поглинання, порівняно зі спектром на нейтральній підкладці CaF2 (рис. 2). Деякі частотні зсуви присутні, але для більшості смуг вони незначні (1-2 см-1). Це дозволяє зробити висновок про можливість використання даного методу для такого роду задач.
Криві плавлення в УФ-діапазоні реєструвались за допомогою спектрометра Specord M-40 в діапазоні температур 35-80°С (pH 7.2), використовуючи кварцові термостабільні кювети товщиною 10 мм. Було досліджено розчини контрольної і опроміненої ДНК та їх суміші з біологічно активними нуклеозидами (лігандами) цитозин арабінозид (Ara-C),
6
Рис. 1. AFM зображення золотої поверхні товщиною 400 Е. Величина шорсткості 50 Е. Рис. 2. SEIRA-спектри ДНК: 1 – на золотій підкладці товщиною 200 Е; 2 – 300 Е, 3 – 400 Е, 4 – на підкладці CaF2.
та 6-азацитідін (6AZC). Концентрації лігандів і ДНК складали відповідно С=(6-10)*10-5М і Ср(7-10)*10-5М в перерахунку на фосфатну молекулярну групу.
Для аналізу спектрів поглинання ДНК з тканин тварин, що перебували під впливом слабких доз опромінення, а також спектрів РНК з пухлинних тканин на різних стадіях злоякісності був застосований метод розпізнавання зображення за допомогою нейронних мереж на основі алгоритму Кохонена. У процесі обробки були розраховані такі параметри: чутливість, специфічність та імовірність правильного розпізнавання.
Для визначення спектральних параметрів окремих смуг проводився розклад складних контурів на компоненти методом найменших квадратів за алгоритмом Левенберга - Марквардта. Контур апроксимувався сумою або згорткою функцій Лоренца і Гауса. У даній роботі число компонент і їх орієнтовне положення попередньо визначались методом другої похідної на основі особливостей експериментального контуру (наявність “плеч” та перегинів у спектрі) з врахуванням літературних даних. При обробці близьких контурів, як це було у випадку спектрів ДНК з тканин, опромінених слабкими дозами радіації, використовувалась однакова модель для розкладу контрольних і опромінених зразків, тобто число компонент, їх положення і півширини задавались однаковими.
У розділі 3 представлені результати дослідження методом ІЧ-фур'є-спектроскопії особливостей структури ДНК, виділеної з тканин придатків сім'яників щурів лінії Вістар, що перебували під впливом хронічного зовнішнього комбінованого (a, b, g) іонізуючого опромінення (40-60 mР/год) і внутрішнього опромінення в умовах зони відчуження Чорнобильської АЕС протягом 4 місяців і 12 місяців. Тварини отримували корм і питну воду, забруднену радіонуклідами Sr90 і Cs137+134. Загальні поглинуті дози радіації склали: для 12 місячних щурів – 5,7 та 57 сГр, для 4 місячних – 0,7, 2 і 25 сГр.
Для 4 місячних зразків спостерігаються лише слабкі зміни в ІЧ-спектрах поглинання, що свідчить про початкові перебудови у вторинній структурі ДНК, тоді як
7
Рис. 3. ІЧ-фур'є-спектри ДНК (на підкладці CaF2) в області 1140 – 1800 см-1 з тканин тварин, що перебували під впливом радіаційного опромінення в Чорнобильській зоні протягом 12 місяців. Різницеві спектри: опромінена ДНК—контроль.
для 12-місячних зразків зміни мають більш яскравий характер. В області валентних коливань OН, NH та CH молекулярних груп (3700 - 2800 см-1) в усіх опромінених зразках, порівняно з контролем, зареєстровано зменшення інтегральної інтенсивності валентних коливань молекулярних груп ОН, пов'язаних сильними водневими зв'язками, та зростання вкладу слабо водневозв'язаних ОН разом зі збільшенням інтенсивності валентних коливань водневозв'язаних молекулярних груп NH. Це може свідчити про перебудову сітки водневих зв'язків та можливу зміну типу водневого спарювання основ. Характерне зростання інтенсивності валентних СН коливань в опромінених зразках може відображати появу розривів у ланцюгу ДНК разом з модифікацією основ та цукрів. Про появу потенційних місць розривів свідчить також ослаблення і низькочастотний зсув смуги фосфату антисиметричного в опромінених зразках, порівняно з контролем (див. різницеві спектри).
В області 1800-1000 см-1 (рис. 3) аналіз різницевих спектрів та компонентний аналіз смуг виявив зміни в області С=О коливань основ (1716, 1688, 1655 см-1 та 1601 см-1), у кільцевих коливаннях всіх основ, а також в області поглинання фосфатів.
Присутність чіткого плеча в області 1716 – 1706 см-1 для всіх досліджуваних зразків свідчить про те, що спіральна структура ДНК зберігається.
Проте спостерігається перерозподіл вкладів С=О коливань тиміну на 1716 та 1706 см-1, що є маркерами В- та А- конформації ДНК відповідно.
Для зразка, опроміненого дозою 5,7 сГр, спостерігається зростання майже в два рази плеч в області подвійних зв'язків С=N (цитозин, аденін 1601 см-1 та 1575 см-1 гуанін), що характеризують водневе спарювання. Це може бути пов'язано з утворенням частково вільних основ, або змін у водневому зв'язуванні.
Для виявлення можливих розривів та додаткових місць зв'язування в структурі ДНК, що виникають в результаті дії опромінення, був проведений аналіз кривих плавлення розчинів ДНК з аномальними нуклеозидами Ara-C і 6AZC. Показано, що температури плавлення розчину контрольної ДНК чистої та її суміші з Ara-C і з 6AZC мало відрізняються (DТ менше 0,5°), тоді як температури плавлення розчинів
8
опроміненої ДНК в суміші з лігандами зсунуті в область високих температур на DТ=2-5°, причому максимальний зсув (DТ=5°) спостерігався для зразка 57 сГр. Результати показали також, що 6AZC є більш чутливою до пошкоджень у структурі ДНК.
Отримані результати свідчать про те, що здатність до зв'язування лігандів з опроміненою ДНК вища, ніж з контрольною. Це, імовірно, пов'язано з вищою доступністю місць зв'язування для лігандів в опроміненій ДНК, а також з можливою появою нових місць зв'язування, які можуть виникати внаслідок змін в структурі ДНК під впливом радіаційного опромінення.
Рис. 4. Залежність DТ від дози опромінення.
Узагальнення результатів досліджень кривих плавлення ДНК з тканин тварин, що отримали різні сумарні дози опромінення (від 0 до 60 сГр), дозволило виявити залежність між сумарною поглинутою дозою опромінення і DТ (рис. 4). Зі збільшенням дози опромінення виявлено зростання температури плавлення, причому найбільш сильний скачок спостерігається для слабких доз (до 40-50 сГр). Значення температури плавлення мають властивість осцилювати навколо апроксимованої кривої, що свідчить про стохастичний характер впливу слабких доз опромінення на структуру ДНК.
Аналіз спектрів поглинання ДНК з тканин тварин, що перебували під впливом слабких доз опромінення за допомогою методу нейронних мереж показав, що спектри контрольної і опроміненої ДНК достовірно відрізняються, незважаючи на незначні відмінності спектральних параметрів. Імовірність правильного розпізнавання контрольних спектрів ДНК була вищою, ніж опромінених, а спектрів 12-місячних зразків вища, ніж 4-місячних, що свідчить про вищу варіабельність опромінених зразків порівняно з контрольними та 4-місячних зразків порівняно з 12-місячними. Результат узгоджується з висновками, зробленими з розкладів смуг на компоненти і аналізу спектральних характеристик.
У розділі 4 представлено результати дослідження методом ІЧ-фур'є-спектроскопії впливу сильних доз g-опромінення на структуру ДНК. Зразки ДНК виділялись з паростків пшениці, опромінених в лабораторних умовах джерелом високоенергетичного випромінювання на основі ізотопу Со60. Загальні поглинуті дози склали: 2, 20 і 200 Гр. Реєстрація спектрів ДНК проводилась методом SEIRA, що дало змогу отримати підсилений сигнал та виявити відмінності в області цукрів.
У спектрах всіх досліджуваних зразків змінюється співвідношення між вкладами водневопов'язаних молекулярних груп ОН з різними енергетичними характеристиками водневого зв'язку та зростання низькочастотного плеча на 2800-2700 см-1, що відносимо до валентних коливань водневопов'язаних молекулярних груп NH. Дані результати можуть свідчити про ослаблення водневого зв'язування ОН і підсилення водневого зв'язування NH з можливою перебудовою сітки водневих зв'язків. Крім того, для зразків 20 Гр і 200 Гр спостерігається перерозподіл вкладів коливань СН2 і СН3
9
молекулярних груп у напрямку зростання вкладу СН2, може бути пов'язаний з хімічною модифікацією основ, а також з наявністю розривів в ДНК.
Для зразка контрольної та опроміненої з дозою 2 Гр ДНК спостерігається чітке плече на частоті близько 1706 см-1 (С=О тиміну), що є маркером А-конформації ДНК і свідчить про збереження спіральної структури, тоді як для зразків 20 і 200 Гр інтенсивність цього плеча різко зменшується. Цей факт, а також збільшення в даних зразках інтенсивності смуги біля 1690-1695 см-1, яку відносимо до Z-форми, вказують на порушення вторинної структури та розриви водневих зв'язків. Крім того, значне зростання інтенсивності плеча в області 1605-1575 см-1, що характеризує поглинання С=N молекулярних груп основ, свідчить про зміни у водневому зв'язуванні А-Т і Г-Ц пар та часткову денатурацію ДНК.
Поглинання, відн.од. Частота, см-1
Рис. 5. SEIRA-спектри ДНК з паростків пшениці в області 980-1350 см-1: 1-контроль, 2 – 2 Гр, 3 – 20 Гр, 4 – 200 Гр.
Суттєві відмінності виявлені в області коливань фосфатних груп (рис. 5). Спостерігається низькочастотний зсув максимуму смуги валентних антисиметричних коливань РО2- на 6 см-1 для зразка ДНК, опроміненого дозою 20 Гр і на 7 см-1 для 200 Гр та зменшення відносної інтенсивності цієї смуги з І1242=0,80 для контролю до І1236=0,63 для 20 Гр і І1236=0,64 для 200 Гр. Такі особливості можуть свідчити про ослаблення зв'язків і появу потенційних місць розривів. Зафіксовано також зменшення інтенсивності смуги з максимумом на 1276 см-1, що відповідає поглинанню N-H молекулярних груп тиміну для А-конформації, разом із зростанням вкладу N-H тиміну в В-конформаційному стані в області 1295 см-1. Для інших зразків зафіксовано смугу з максимумом на 1286 см-1 у випадку 20 Гр і 1280 см-1 для 200 Гр, яка займає проміжне положення між конформаційними станами А і В та може бути пов'язана з появою інших конформацій. Крім того, в опромінених зразках з'являється смуга на частоті 1258 (20 Гр) і 1260 см-1 (200 Гр), що за літературними даними може бути зумовлена появою Z-конформації.
В області симетричних коливань молекулярної групи РО2- в результаті різкого зниження інтенсивності смуги з максимумом близько 1123 см-1, проявляється у вигляді окремої компоненти коливання С-О молекулярних груп дезоксирибози, максимум якої знаходиться для контролю на 1143, 2 Гр - 1146, 20 Гр - 1145, 200 Гр - 1147 см-1. Як бачимо, спостерігається також високочастотний зсув цієї смуги. Зв'язки С-О є одними з
10
основоположних в структурі цукрофосфатного остову, тому такі зміни можуть свідчити про пошкодження первинної структури, появу потенційних місць розривів, або характеризувати наявність розривів. Ще однією характерною особливістю спектрів ДНК з опромінених тканин є перерозподіл вкладів коливань С-О дезоксирибози в області 1050 см-1 (впорядкована структура ДНК) та 1069 см-1 (розупорядкована структура) у напрямку зростання останньої.
В області поглинання цукрів для зразка контрольної ДНК ми знаходимо маркерні смуги, що відповідають С2ў-ендо конформації цукрів: 964, 807, та 780 см-1, тоді як в опромінених зразках виявлено присутність маркерних смуг, які за літературними даними можна віднести до С3ў-ендо конформації цукрів: 935, 868 та 833 см-1. Ми припускаємо, що ДНК з g-опромінених тканин є структурою, в якій можна спостерігати елементи А, В, Z та інших конформаційних станів, а також невпорядкованої форми. Короткотривалий вплив опромінення призводить до сильних змін у структурі, що можуть частково відновлюватись репаративними механізмами клітини.
У розділі 5 представлені результати аналізу ІЧ-спектрів поглинання РНК з пухлинних тканин на різній стадії злоякісності пухлини. Загальна фракція РНК виділялась з тканин пухлин головного мозку щурів лінії Вістар (штам 101,8 гліобластоми) та з пухлинних тканин головного мозку людей на різних стадіях злоякісності. Контрольною була РНК, виділена з тканин головного мозку здорових тварин. ІЧ- спектри РНК були зареєстровані, використовуючи стандартну методику на пропускання, а також методику SEIRA.
Виявлено значне зростання відносної інтегральної інтенсивності валентних коливань СН у зразках РНК з пухлинних тканин і з тканин, взятих біля пухлини. В області валентних коливань OH, NH та CH в пухлинній РНК спостерігається суттєве зменшення відносної інтегральної інтенсивності валентних коливань молекулярних груп OH, пов'язаних слабкими водневими зв'язками та зростання вкладу поглинання водневопов'язаних молекулярних груп NH. Ці особливості можуть свідчити про перебудову сітки водневих зв'язків з можливим утворенням неканонічних типів водневого спарювання.
В області поглинання основ спостерігається перерозподіл вкладів С=О та С=N подвійних зв'язків, що відносяться до різних основ. У контрольному зразку ми спостерігаємо інтенсивне плече в області 1705 см-1, що характеризує вторинну структуру в нативній РНК. Зменшення його інтенсивності для РНК з пухлинних тканин та тканин біля пухлини свідчить про порушення спіральної структури. Також спостерігається зростання інтенсивності плеча, що відноситься до поглинання С=N основ (цитозин та аденін на 1604 см-1, гуанін та аденін на 1574 см-1) у зразках РНК з пухлинних тканин і тканин поблизу пухлини порівняно з контролем. Результати корелюють з літературними даними про зменшення температури плавлення пухлинної РНК, що, як відомо, пов'язано зі зменшенням вкладу Г-Ц пар порівняно з А-Т.
Для РНК з пухлинних тканин зафіксовано значне ослаблення валентного антисиметричного коливання РО2- та перерозподіл інтенсивностей основних складових цієї смуги (близько 1243 cм-1 та 1223 cм-1 у контрольної РНК) у бік зростання низькочастотної компоненти (рис. 6, а). Крім того, виявлено збільшення кількості розділених смуг поглинання для РНК з пухлинних тканин.
11
а
б
Рис. 6. SEIRA-спектри РНК з пухлинних тканин на різних стадіях злоякісності: 1 - контроль, 2, 3-астроцитома, 4 - гліобластома, а - область антисиметричних і симетричних коливань РО2- молекулярних груп, б - область поглинання цукрів.
Ще однією характерною особливістю є поява у спектрах пухлинної РНК смуги на 1147-1155 cм-1, інтенсивність якої зростає у випадку більш злоякісної пухлини (рис. 6 а, крива 4).
У спектрах контрольної РНК ця смуга практично відсутня. У спектрах РНК з пухлинних тканин в області 600-900 см-1 (рис. 6, б) ми спостерігаємо значне ослаблення смуги С-О дезоксирибози в області 966 см-1, появу ряду нових смуг та маркерних смуг не тільки C3'-ендо конформації цукрів (882, 863, 812 см-1), але і C2'-ендо (929, 841, 838 та 802 см-1). Разом з тим відомо, що відповідно до структурних особливостей, цукри в РНК можуть перебувати лише в C3'-ендо конформації.
Результати свідчать, що просторова структура РНК в пухлинній клітині відрізняється від нормальної. Оскільки РНК виконує роль адаптора в процесі передачі генетичної інформації від ДНК до синтезу білків, всі особливості пухлинної ДНК переносяться на РНК, причому у зв'язку з меншою молекулярною масою і більш жорсткою структурою РНК, ці особливості проявляються сильніше.
У розділі 6 приведені результати дослідження ДНК, виділеної з тканин чутливого і резистентного до доксорубіцину і цис-платини штамів карциноми Герена, привитих щурам лінії Вістар, а також ДНК з цих пухлин, через 1 годину після одноразового введення 9.5 мг\кг доксорубіцину чи 6 мг\кг цис-платини (максимальна одноразова доза препарату, що не викликає загибелі тварин) методом SEIRA-спектроскопії.
Показано, що формування резистентності як до доксорубіцину, так і до цис-платини супроводжується змінами в інфрачервоних спектрах ДНК у широкому спектральному діапазоні. В області поглинання водневопов'язаних молекулярних груп ОН, NH та CH спостерігається зменшення, порівняно з контрольним зразком, вкладу високочастотного плеча в області 3400-3600 см-1, а також паралельне збільшення вкладу валентних коливань водневопов'язаних NH груп. У комплексі ці два ефекти призводять до зсуву максимуму всієї широкої смуги поглинання з 3400 см-1 в контролі до 3329 см-1 в зразку
12
ДНК з чутливої та 3345 см-1 з резистентної до доксорубіцину пухлини. Означений перерозподіл може свідчити про зміни в характері водневого зв'язування в ДНК з пухлин чутливих і резистентних штамів. Змінюється також співвідношення між інтегральними інтенсивностями СН2 і СН3 молекулярних груп у випадку ДНК з пухлинних тканин обох штамів у бік підвищення СН2, що може говорити про наявність розривів у цукрофосфатному остові, а також можливу модифікацію основ.
Рис. 7. FTIR-SEIRA спектри ДНК з резистентних і чутливих до доксорубіцину штамів пухлинних тканин: 1 - контроль (ДНК з нормальної тканини), 2 - резистентна пухлина, 3 - чутлива пухлина.
Рис. 8. SEIRA-FTIR спектри ДНК з резистентних (2,3) і чутливих (4,5) до доксорубіцину пухлинних тканин до (2,4) і після (3,5) застосування доксорубіцину, 1-контроль
Підтвердження цьому знаходимо в області поглинання основ (рис. 7). У зразках ДНК з пухлинних тканин спостерігається низькочастотний зсув смуги поглинання С=О тиміну і гуаніну для ДНК з резистентної до доксорубіцину пухлини на 8 см-1 та для чутливої і резистентної до цис-платини на 7 см-1. За положенням ця смуга стає близькою до маркера Z-конформації ДНК: 1698 см-1 – чутлива і 1692 см-1 – резистентна до доксорубіцину, 1693 см-1 – чутлива і резистентна до цис-платини, тоді як в контролі це 1700 см-1. В області поглинання C=N молекулярних груп цитозину і аденіну (в контролі 1609 см-1) та гуаніну (в контролі 1578 см-1) теж спостерігається низькочастотний зсув на 2-5 см-1 і зменшення вкладу плеча близько 1609 см-1.
Ґрунтуючись на цих даних, можна припустити, що в ДНК з пухлинних тканин поряд з канонічними типами спіральних структур (А, В, Z) може реалізувати інші конформаційні стани, не характерні для даних зовнішніх умов (вологість 60 - 65% і температура порядку 26°С).
Всі процеси модифікації водневого спарювання основ та конформаційного стану ДНК є взаємопов'язаними зі змінами конформації цукрів і проявляються у вигляді ослаблення (для зразка ДНК з чутливої до
13
доксорубіцину пухлини в 1,7 рази,а в чутливої до цис-платини в 1,3 рази) та зсуву в низькочастотну область максимуму смуги фосфату антисиметричного. Для ДНК з чутливої до доксорубіцину пухлини зсув складає 5 см-1, для інших зразків - до 4 см-1. У зразках ДНК з резистентних пухлин спостерігається аналогічна тенденція, проте слабше виражена. Такого роду особливості можуть свідчити про ослаблення відповідних зв'язків і появу потенційних місць розривів.
Аналіз області поглинання цукрів (рис. 8) підтверджує наявність різних конформаційних станів у пухлинній ДНК, для якої ми фіксуємо маркерні смуги поглинання як С3?-ендо, (859 см-1), так і С2?-ендо (832 см-1) конформації цукрів. Крім того, характерною особливістю ДНК з пухлинних тканин є значне ослаблення коливання С-С, С-O дезоксирибози на 964 см-1. У ДНК з чутливої пухлини (рис.8, крива 4) спостерігається також підвищення інтенсивності смуги на 832 см-1, порівняно з контролем. Отримані результати свідчать, що ДНК з чутливих штамів пухлинних тканин характеризується різноманітністю структурних форм, тоді як ДНК з резистентних штамів є більш жорсткою молекулою, і за своїми спектральними ознаками є близькою до канонічної спіральної структури.
Дослідження впливу протипухлинних препаратів на структуру ДНК показує різну реакцію чутливої і резистентної пухлини на дію ліків. У випадку чутливого штаму спостерігаються сильніші зміни спектральних параметрів ДНК, порівняно з резистентним. Введення експериментальним тваринам доксорубіцину індукує зміни в структурі ДНК, що найбільш яскраво проявляються в області поглинання цукрофосфатного остову. Показано значне зростання інтегральної інтенсивності смуги фосфату антисиметричного після дії препарату для ДНК з обох досліджуваних штамів (для ДНК з чутливої пухлини в 1,5 рази, з резистентної – в 1,2 рази). Це імовірно може бути пов'язано з інтеркаляцією доксорубіцину і утворенням водневих зв'язків молекулярною групою РО2- з С14-ОН групою доксорубіцину, що корелює з результатами робіт інших авторів. У ДНК з чутливого штаму препарат індукує зміни, які призводять до стабілізації її просторової структури, зменшення вкладу розупорядкування і наближення до канонічної спіральної структури, про що свідчить зокрема компонентний аналіз смуги фосфату антисиметричного. У ДНК з резистентного штаму лікування призводить до порушення цілісності структури ДНК, до зростання розупорядкування та змін у водневому зв'язуванні.
У випадку застосування цис-платини до обох штамів пухлинних тканин, зміни в ІЧ-спектрах ДНК проявляються слабше, порівняно з дією доксорубіцину. Це може бути пов'язано з частковою затримкою цис-платини плазматичними мембранами пухлинних клітин, як показують наші та літературні дані. Однак, можна відмітити тенденцію до стабілізації структури ДНК з чутливої пухлини, що проявляється у вигляді зменшення інтенсивності смуги С-О дезоксирибози на 1070 см-1 (розупорядкована структура ДНК) порівняно з 1053 см-1 (впорядкована спіральна структура ДНК). В спектрах ДНК з резистентної пухлини препарат індукує перерозподіл інтенсивностей коливань С-О дезоксирибози в напрямку збільшення смуги на 1070 см-1, а також зменшення інтегральної інтенсивності смуги фосфату антисиметричного та його низькочастотний зсув (до лікування - 1242 см-1 та після лікування – 1239 см-1), що може свідчити про ковалентне зв'язування цис-платини з компонентами ДНК.
14
висновки
1. Методом інфрачервоної коливальної фур'є-спектроскопії виявлено ряд спектральних проявів структурних пошкоджень нуклеїнових кислот, що виникають у результаті дії радіаційного опромінення, канцерогенних процесів, а також при застосуванні протипухлинних препаратів.
2. Вперше застосовано методику підсиленого металевою поверхнею інфрачервоного поглинання для дослідження нуклеїнових кислот з пухлинних та опромінених тканин. Доведено високу чутливість даного методу, а також правомірність його використання для спектроскопічних досліджень біологічних об'єктів.
3. Виявлено, що в результаті дії на ДНК слабких доз (1-50 сГр) радіаційного опромінення виникають пошкодження її просторової структури. Вони полягають у перебудові сітки водневих зв'язків з можливою зміною типів спарювання основ, про що свідчить перерозподіл вкладів інтенсивностей смуг валентних коливань О-Н, N-H і C-H в області 2300-3800 см-1 та С=О, С=N в області 1550-1800 см-1. Можлива модифікація основ та цукрів, а також розриви проявляються у вигляді зростання інтенсивності С-Н валентних коливань. Низькочастотні зсуви та зменшення інтенсивностей смуг, зокрема РО2- близько 1239 см-1, вказують на ослаблення зв'язків та появу потенційних місць розривів. Такі структурні пошкодження можуть призводити до локальних змін конформації молекули ДНК – розупорядкування просторової структури. Висновки корелюють з даними, отриманими з аналізу кривих плавлення ДНК з біологічно-активними нуклеозидами та результатами обробки ІЧ-фур'є-спектрів ДНК методом нейронних мереж.
4. Сильні одноразові дози (2-200 Гр) опромінення призводять до значних ушкоджень структури ДНК, таких як розриви цукрово-фосфатного остову, про що свідчить ослаблення та низькочастотний зсув смуги РО2- близько 1240 см-1, виділення в окрему смугу коливання молекулярної групи С-О близько 1146 см-1, а також зростання інтенсивності валентних коливань СН в області 2850-2950 см-1, зокрема компоненти СН2. Зміни у вторинній структурі полягають у порушенні сітки водневих зв'язків та спарювання основ, на що вказує перерозподіл інтенсивностей смуг С=О, С=N в області 1550-1800 см-1 та валентних коливань ОН, NH в області 2300-3800 см-1. Збільшення інтенсивності поглинання в області 1069 см-1 та присутність в області поглинання цукрів маркерних смуг А, В, Z конформацій ДНК свідчить про розупорядкування в структурі та зміну конформації компонент ДНК.
5. Показано спектроскопічні прояви структурних особливостей РНК з пухлинних тканин різного ступеня злоякісності та визначено їх характер. Зміни в області поглинання фосфатів, а саме ослаблення (на 20-50%) і зсув (на 3-5 см-1) смуги фосфату антисиметричного, перерозподіл внесків основних компонент фосфату симетричного та його уширення на 20-30%, а також поява нової смуги близько 1150 см-1, яку відносимо до коливань С-О молекулярної групи, свідчать про можливість розривів цукрофосфатного остову. Поява маркерних смуг поглинання С3ґ-ендо та С2ґ-ендо конформацій цукрів разом з ослабленням коливань цукрів, збільшення кількості розділених смуг поглинання в усьому досліджуваному частотному інтервалі вказують на розупорядкування в структурі РНК.
15
6. штамів пухлин, що полягають у зменшенні, порівняно з контролем, інтегральної інтенсивності антисиметричних коливань РО2- в 1,2-1,3 рази для резистентного і в 1,5-2 рази для чутливого штаму пухлинних тканин. Поява маркерних смуг С3ґ-ендо та С2ґ-ендо конформацій цукрів разом із зростанням вкладу поглинання в області 1070 см-1 свідчить про збільшення вкладу розупорядкування в структурі ДНК з пухлинних тканин, що сильніше проявляється для чутливого штаму пухлин. Структуру ДНК з резистентних пухлин можна охарактеризувати більшим рівнем впорядкування, вона є більш жорсткою і за спектральними ознаками є близькою до канонічної спіральної структури і менше змінюється під дією зовнішніх чинників. Структура ДНК з чутливих штамів пухлин є більш гнучкою, характеризується вищим рівнем розупорядкування та наявністю неканонічних конформаційних станів.
7. Застосування цис-платини до пухлинних тканин викликає менш яскраві зміни в ІЧ- спектрах ДНК, порівняно з дією доксорубіцину, що може бути пов'язане з частковою затримкою цис-платини плазматичними мембранами пухлинних клітин. Дія протипухлинних препаратів на чутливий штам пухлинних тканин викликає сильніші зміни спектральних параметрів ДНК, порівняно з резистентним. В ДНК з чутливих пухлин лікування призводить до стабілізації структури ДНК, що проявляється як в зменшення кількості розділених смуг поглинання, так і в перерозподілі їх інтенсивностей. У ДНК з резистентних пухлин навпаки, спостерігається зростання розупорядкування .
Список опублікованих праць за темою дисертації
1. Круглова Е.Б., Довбешко Г.И., Крутько Н.А., Пащук Е.П., Карпенко Н.А., Алесина М.Ю., Красницкая А.А. Исследование структурных повреждений в молекулах ДНК из гамма-облученных крыс // Вісник Харківського університету. –1999. –№450. Біофізичний Вісник. –Вип.4(2). –С.92-95.
2. Dovbeshko Galina I., Gridina Nina Ya., Kruglova Elena B., Paschuk Olena P. FTIR spectroscopy studies of nucleic acid damage // Talanta. –2000. –Vol.53. –P.233-246.
3. Dovbeshko G.I., Kruglova E.B., Paschuk O.P., Alesina M., Karpenko N.Ya., Mysnyk A., Novoselets M. FTIR spectroscopy studies of DNA from low-dose irradiated tissue // Visnyk Kharkivskogo universytetu. –2000. –№497. Biophysical Bulletin. –Issue 2(7). –P.65-73.
4. Бережинський Л.Й., Довбешко Г.І., Сєкірін І.В., Пащук О.П. Можлива роль біфуркованих водневих зв'язків у формуванні низькочастотних спектрів амінокислот // Український Фізичний Журнал. –2001. –Т46, №5-6. –C.541-545.
5. Dovbeshko G.I., Chegel V.I., Gridina N.Y., Repnytska O.P., Sekirin I.V., Shirshov Y.M. Surface enhanced infrared absorption of nucleic acids on gold substrate in FTIR reflectance mode // Proceedings of SPIE, Ed. S. Sveshnikov, S. Kostyukevich. –2001. –V.4425. –P.158-162.
6. Dovbeshko G.I., Chegel V.I., Gridina N.Y., Repnytska O.P., Shirshov Y.M., Tryndiak V.P., Todor I.M. Surface enhanced infrared absorption of nucleic acids on gold substrate // Semiconductor Physics, Quantum Electronics and Optoelectronics, –2001. – V.4, №3. –P.202-206.
16
7. Berezetskya N.M., Dovbeshko G.I., Kruglova E.B., Paschuk O.P., Krasnitskaya А.А., Alesina M.Yu. FTIR-spectroscopic studies of weak gamma-irradiated DNA // Proc. International conf. on Spectroscopy of Molecules and Crystals. –Odessa. –1999. –P.135.
8. Dovbeshko G.I., Gridina N.Ya., Kruglova E.B., Paschuk O.P. FTIR spectroscopy studies of nucleic acid damages // Proc. International conf. “Colloquium Spectroscopicum Internationale ХХХІ”. –Ankara (Turkey). –1999. –P.139.
9. Dovbeshko G.I., Gridina N.Ya., Kruglova E.B., Paschuk O.P. Nucleic acid show a numerous conformational states in tumour and irradiated cells // Proc. International Conference on DNA conformation, Modification and Recognition in Biomedicine. –Brno (Czech Republic). –2000. –P.12.
10. Dovbeshko G.I., Gridina N.Ya., Paschuk O.P. FTIR spectroscopy studies of tumour nucleic acids // Proc. XXV European Congress on Molecular Spectroscopy. –Coimbra (Portugal). –2000. –P.324.
11. Пащук О.П., Довбешко Г.І., Тищенко О.М., Уманець Н.О. Радіаційні пошкодження в структурі ДНК з паростків пшениці // Праці міжнародної конференції “Проблеми фізіології рослин і генетики на рубежі третього тисячоліття”. –2000. –Киів. –C.104.
12. Dovbeshko G.I., Paschuk O.P., Gridina N.Ya., Kruglova E.B. Nucleic acid molecules show numerous conformational states in tumour and irradiated cells // Proc. International conf. “Nonlinear Optics of Liquid and Photorefractive Crystals”. –Alushta (Crimea). –2000. –P.27.
13. Repnytska O.P., Dovbeshko G.I., Tryndiak V.P., Todor I.M. Nucleic acid interaction with anti-cancer drugs // Proc. First Russian-Ukrainian-Polish Conference on Molecular Interactions, School of Physical Organic Chemistry. –Gdansk (Poland) –2001. –P. 206.
14. Dovbeshko G.I., Repnytska O.P., Tryndiak V.P., Todor I.M., Solyanik G.I. Spectroscopic studies of structural peculiarities of DNA and lipids from resistant and sensitive cancer tissues // Proc. XV International School-Seminar on Spectroscopy of Molecules and Crystals. –Chernihiv. –2001. –P. 199.
15. Dovbeshko G.I., Chegel V.I., Olenchuk M., Repnytska O.P., Sekirin I.V., Shyrshov Yu. Surface Enhanced Infra-red Absorption (SEIRA) of macromolecules on gold substrate: effect, mechanism and application // Proc. XV International School-Seminar on Spectroscopy of Molecules and Crystals. –Chernihiv. –2001. –P. 58.
16. Repnytska O.P. SEIRA Spectroscopy studies of nucleic acids from resistant and sensitive tumour cells // Proc. The First International Young Scientists Conference on Applied Physics. –Kyiv. –2001. –P.156.
17. Repnytska O.P., Dovbesko G.I., Tryndiak V.P., Todor I.M., Solyanik G.I. Surface enhanced infrared absorption (SEIRA) studies of nucleic acid from tumour cells // Proc. The First International Conference on Advanced Vibrational Spectroscopy ICAVS – 1. –Turka (Finland). –2001. –P.2.14.
18. Dovbesko G.I., Chegel V.I., Repnytska O.P., Shirshov Yu. Surface enhanced infra-red absorption (SEIRA) of macromolecules on gold substrate: effect, mechanism and application // Proc. The First International Conference on Advanced Vibrational Spectroscopy ICAVS – 1. –Turka (Finland). –2001. –P.18.217.
19. Dovbesko G.I., Repnytska O.P., Tryndiak V.P., Todor I.M., Solyanik G.I. Interaction of nucleic acids and lipids from tumour cells with anticancer drugs: SEIRA spectroscopy data //
17
Proc. NATO Advanced Research Workshop Autumn School, Frontiers in Molecular – scale science and technology of fullerene, nanotube, nanosilicon and biopolymer (DNA, Protein) multifunctional nanosystems. Kyiv: Institute of the Continue Education of Kiev National Taras Shevchenko University. –2001. –P.SC-RI.
20. Dovbeshko G.I., Repnytska O.P., Tryndiak V.P., Todor I.M. Nucleic acid H-bond transformation in tumour tissues and those after application of anti-cancer drags // Proc. XIVth Conference-Workshop “Horizons in Hydrogen-Bond Research”. –Italy (Torino). –2001. –P.MS5-P4.
Анотація
Репницька О.П. Структурні особливості нуклеїнових кислот з опромінених та пухлинних тканин. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, м. Харків, 2002.
Методами ІЧ-фур'є-спектроскопії поглинання та відбивання , SEIRA-спектроскопії та УФ-спектроскопії досліджено особливості в структурі нуклеїнових кислот, що виникають внаслідок дії іонізуючого опромінення, канцерогенних процесів та після застосування протипухлинних препаратів. Запропоновано нову методику підсиленого металевою поверхнею інфрачервоного поглинання для реєстрації ІЧ-спектрів нуклеїнових кислот, доведено високу чутливість даного методу, а також правомірність його використання для спектроскопічних досліджень біологічних об'єктів. Виявлено, що у випадку дії слабких доз іонізуючого опромінення (1-50 сГр) виникають пошкодження вторинної структури, що полягають у перерозподілі сітки водневих зв'язків, розупорядкуванні в структурі, ослабленні зв'язків та появі потенційних місць розривів, тоді як виплив сильних доз опромінення призводить до розривів цукрово-фосфатного остову та можливої зміни конформації окремих ділянок ДНК. Показано спектроскопічні прояви відмінностей в структурі РНК з пухлинних тканин різного ступеня злоякісності, а також в структурі ДНК з чутливих та резистентних штамів пухлин. Ґрунтуючись на спектральних особливостях, сформульовано ознаки структурних пошкоджень нуклеїнових кислот з пухлинних тканин. Досліджено вплив протипухлинних препаратів на структуру ДНК з різних штамів пухлинних тканин.
Ключові слова: ІЧ-фур'є-спектроскопія, SEIRA-спектроскопія, РНК, ДНК, іонізуюче опромінення, канцерогенез, структурні пошкодження, протипухлинні препарати.
Аннотация
Репницкая Е.П. Структурные особенности нуклеиновых кислот из облучённых и опухолевых тканей. – Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата фико-математических наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина, г. Харьков, 2002.2002.
18
Методами ИК-фурьє-спектроскопии поглощения и отражения, SEIRA-спектроскопии и УФ-спектроскопии исследованы особенности в структуре нуклеиновых кислот, возникающие в результате воздействия ионизирующего излучения, канцерогенных процессов, а также после использования противоопухолевых препаратов. Предложена новая методика усиленного металлической поверхностью инфракрасного поглощения для регистрации ИК-спектров нуклеиновых кислот, доказана высокая чувствительность этой методики, а также правомерность её использования для спектроскопических исследований биологических объектов. Показано, что в случае воздействия слабых доз ионизирующего облучения (1-50 сГр) возникают повреждения вторичной структуры, которые заключаются в перераспределении сетки водородных связей, разупорядочении в структуре, ослаблении связей и появлении потенциальных мест разрывов. Влияние сильных доз облучения приводит к разрывам в сахарофосфатном остове и к возможным изменениям конформаций отдельных областей ДНК. Найдены спектроскопические проявления отличий в структуре РНК из опухолевых тканей на разной стадии злокачественности, а также в структуре ДНК из чувствительных и резистентных штаммов опухолей. Основываясь на спектральных особенностях, сформулированы признаки структурных повреждений нуклеиновых кислот из опухолевых тканей. Исследовано влияние противоопухолевых препаратов на структуру ДНК из разных штаммов опухолевых клеток.
Ключевые слова: ИК-фурьє -спектроскопия, SEIRA-спектроскопия, РНК, ДНК,
ионизирующее облучение, канцерогенез, структурные повреждения, противоопухолевые препараты.
Summary
Repnytska O.P. Structural peculiarities of nucleic acids from irradiated and tumour tissues. – Manuscript.
Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.02 – Biophysics. – V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv 2002.
A study of genome damages and modification of the structure of nucleic acids molecules induced by such different stimuli as irradiation, tumour progression, chemicals reagents are the subject of great interest both for basic knowledge and biomedical application. This is due to the fact that a lot of people are living now under the action of permanent radiation in the territories polluted with radionuclides after Chernobyl disaster. In accordance with modern radiobiological theory, the most fatal result for cell is DNA molecule damage. These genetic abnormalities lead to different diseases, including tumour.
FTIR-spectroscopy is one of the sensitive methods for application in the genetic investigations for the analysis of nucleic acid. Along with traditional geometry for registration IR-spectra (transmittance mode) we proposed to apply of surface enhanced infrared spectroscopy (SEIRA) of nucleic acids on gold substrate in reflectance mode and essentially increased the sensitivity of IR spectroscopy. A gold film of 200-400 Е thickness on a glass plate was the metal substrate. The enhancement factor of SEIRA for different vibrations of
nucleic acids in our experimental conditions was 3-5. Application of this method to nucleic
19
acids isolated from irradiated and tumour cells revealed some possible peculiarities of their structural organization. Deconvolution and curve decomposition of complex bands has been applied to the evaluation of the DNA spectra.
The changes in the structure of the DNA isolated from low-dose (1-50 cGy) irradiated samples have been observed for both 4 month and 12-month rats with FTIR and UV spectra. Slight random changes on initial stage have been observed in the DNA from 4-month rats and more changes have been observed in 12-month rats, which can be connected with arising changes in the spatial structure of the DNA. It is shown that influence of low-doses ionizing radiation lead to damage in secondary structure as redistribution H-bonds net, disordering in structure, weakening of bonds, appearance of potential cites of breaks. The results are in accordance with the investigation of melting curves of DNA with biological-active nucleosides. Comparison analysis of UV melting curves of free irradiated DNA and their mixture with NUC allows one to find differences in the conformation of DNA under the prolonged irradiation of low dozes. The authenticity of results are proved by algorithm of neural networks. The probability of right recognition of all spectra under study was more than 86%. The high impulse doses of irradiation (2-200 Cy) lead to disordering in spatial structure, single and double strand breaks in sugar-phosphate backbone, possible changes in conformational states of different parts of DNA molecule.
The first time it was showed the difference between IR-spectra of RNA from normal and tumour tissues as well as the spectral peculiarities of RNA from tumour tissues at different stage of malignancy. It was found the number of bands that could be used as markers of tumour process. SEIRA spectra of RNA from tumour cells showed more sensitivity to the grade of tumour malignancy than the spectra of DNA.
DNA is a macromolecular receptor for many important anticancer drugs (for instance, cisplatin forms covalent linkages with DNA while doxorubicin forms more noncovalent complexes with this macromolecule). The changes in DNA structure is considered to play crucial role in the mechanisms of tumour drug resistance.
We observed a numerous changes in infrared spectra of DNA from sensitive and resistant cells that reflect drastic changes in molecular structure of DNA from tumour cells. The DNA from resistant cancer cells could be characterised as rigid structure, the structure of DNA from sensitive cancer strain seems to be flexible and after application of anticancer drugs drastically changes and approaches to the structure of helix forms. After application of anti-cancer drug to sensitive and resistant strains, the DNA, isolated from these strains, had different spectral features, especially in the region of Phosphate I and II bands. The conformation changes induced by anti-cancer drugs in the DNA from resistant and sensitive cancer strains could be characterized with different level of structure disordering.
Keywords: FTIR-spectroscopy, SEIRA-spectroscopy, RNA, DNA, ionizing radiation, cancerogenesis, structural damages, anti - cancer drugs.
Підписано до друку 15.03.2002 р. Формат паперу 60х84/16
Папір офсетний 80 гр/м2. Офсетний друк. Ум. –др. аркушів 1.0.
Обл.-вид. аркушів 0.8. Тираж 100 примірників. Замовлення №17
03039, Інститут фізики НАН України, ВНТІ,
Київ, Проспект Науки 46