Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Протокол метода “TUNEL” (ApopTag Fluorescein in situ Apoptosis Detection kit,
S7110, Chemicon International) для парафиновых блоков
1. Депарафинизация среза:
1.1. 3 смены ксилола по 5 минут;
1.2. 2 смены абсолютного этанола по 5 минут;
1.3. 1 смена 95% этанола и 1 смена 79% этанола по 3 минуты;
1.4. 1 смена PBS по 5 минут.
2. Предобработка среза:
2.1. на срез нанести 15 мкл раствора протеиназы К (предварительно готовится stock solution: 5 мг/мл протеиназы К в PBS, который разливается по аликвотам (по 10 мкл) и замораживается; при использовании этот раствор разводится до концентрации 20 мкг/мл в PBS (разведение 250 раз: 2 мкл stock solution + 498 мкл PBS);
2.2. инкубировать срез 15 минут при комнатной температуре во влажной камере;
2.3. промыть срез 2-мя сменами PBS по 2 минуты.
3. Добавление эквилибрационного буфера:
3.1. осторожно удалить остатки PBS со среза;
3.2. немедленно добавить 15 мкл Equilibration buffer на срез;
3.3. инкубировать срез не менее 10 секунд при комнатной температуре.
4. Добавление TdT фермента:
4.1. осторожно удалить остатки буфера со среза;
4.2. немедленно нанести на срез 15 мкл рабочего раствора TdT (предварительно смешать в эппендорфе 42 мкл Reaction buffer и 3 мкл TdT , хорошо перемешать на вортексе, полученный раствор может храниться в холодильнике не более 6 часов, этого количества достаточно для 3-х срезов);
4.3. инкубировать во влажной камере в термостате при +37оС 1 час.
5. Добавление останавливающего буфера:
5.1. поместить срез в рабочий раствор Stop/Wash Buffer (предварительно смешать в пластиковой пробирке (на 50 мл) 1 мл Stop/Wash Buffer и 34 мл дистиллированной воды, полученный раствор может храниться в холодильнике до 1 года (аликвотировать!);
5.2. прополоскать срез в растворе 15 секунд;
5.3. инкубировать срез в растворе 10 минут при комнатной температуре.
6. Достать из пробирки Anti-Digoxygenin conjugate (18 мкл) и оставить в эппендорфе согреваться до комнатной температуры в темноте.
7. Добавление Anti-Digoxygenin conjugate:
7.1. промыть срез в 3-х сменах PBS по 1 минуте;
7.2. осторожно удалить остатки PBS со среза;
7.3. добавить 15 мкл рабочего раствора Anti-Digoxygenin conjugate (предварительно смешать в эппендорфе в темноте 27 мкл Blocking Solution и 18 мкл подогретого до комнатной температуры (п.7) Anti-Digoxygenin conjugate, тщательно перемешать на вортексе, до использования хранить в темноте в холодильнике не более 3 часов) – полученного количества достаточно для 3 срезов;
7.4. инкубировать во влажной камере 30 минут при комнатной температуре в темноте.
8. Промывка срезов:
8.1. промыть срез в 4-х сменах PBS по 2 минуты при комнатной температуре в темноте.
9. Контр-окрашивание и монтирование:
9.1. добавить на срез монтирующую жидкость, содержащую 0,5-1,0 мкп/мл пропидия йодида, по 15 мкл на срез (прим. на 3 среза 3-5 мкл ПЙ и 40-42 икл монтирующей жидкости);
9.2. накрыть срез покровным стеклом;
9.3. микроскопировать.