Будь умным!

У вас вопросы?
У нас ответы:) SamZan.net

1708408533 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ ВИКОРИСТАННЯ ЛІПОСОМ ТА МАЗЕВИХ ПРЕПАРАТІВ З ЛЕВОМІЦЕТИНОМ Д

Работа добавлена на сайт samzan.net:


ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА

АМН УКРАЇНИ

ТКАЧЕНКО Вікторія Леонідівна

УДК 616.0-02-001.17-084-085.33

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ ВИКОРИСТАННЯ ЛІПОСОМ ТА МАЗЕВИХ ПРЕПАРАТІВ З ЛЕВОМІЦЕТИНОМ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ І ЛІКУВАННЯ СИНЬОГНІЙНОЇ ОПІКОВОЇ ІНФЕКЦІЇ

03.00.07 - мікробіологія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

ХАРКІВ-2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Циганенко Анатолій Якович, Харківський державний медичний університет, ректор, завідувач кафедрою мікробіології, вірусології та імунології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, Українська фармацевтична академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.

доктор медичних наук, професор Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна медична академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології .

Провідна установа - Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, кафедра мікробіології, МОЗ України, м. Київ.

Захист відбудеться “__25__” __січня_ 2001 року о _1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 02.41.01. при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057, м. Харків, МСП, вул. Пушкінська, 14.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України (61057, м. Харків, МСП, вул. Пушкінська, 14).

Автореферат розісланий “__25__” __грудня__ 2000 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради ____________    І.Ю.Кучма

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Вступ. В структурі сучасних госпітальних інфекцій провідне місце посідають гнійно-септичні інфекції (ГГСІ) (В.И.Стручков с соавт., 1991; Е.П.Безуглая с соавт., 1995; Н.Ф.Калиниченко с соавт., 1999). Серед умовно-патогенних збудників ранових опікових інфекцій зростає роль грамнегативних бактерій, особливо Pseudomonas aeruginosa (В.В.Минухин с соавт., 1992; Н.И.Балаклиец, Т.И.Балаклиец, 1999; R.N.Jones et al., 1997; T.Shannon et al., 1997; De Vas D. et al., 1997; M.A.Walton et al., 1997; A.C.Colsky, 1998). Профілактика і лікування синьогнійної опікової інфекції викликає суттєві труднощі із-за наявності у P.aeruginosa різноманітних факторів патогенності; високої природної та придбаної резистентності до багатьох антибактеріальних препаратів; антагоністичної активності по відношенню до інших видів мікроорганізмів - збудників ГГСІ (А.Ф.Мороз с соавт., 1988; И.И.Долгушин, 1989; В.Д.Беляков с соавт., 1990; Т.А.Макаренко с соавт., 1996; H.Y.Chen et al., 1995; C.Jia et al., 1995; I.A.Holder et al., 1995; M.A.Walton et al., 1997; A.C.Colsky, 1998).

Вищесказане свідчить про актуальність та важливість створення високоефективних імунопрепаратів для профілактики синьогнійної опікової інфекції.

З даних літератури відомо, що існує можливість використання ліпосом –штучних фосфоліпідних везикул, як носіїв антигенів і ад’ювантів (C.R.Alving, 1992). Внесення імунопрепаратів до складу ліпосом дозволяє підняти напруження імунітету, а також знизити токсичність і алергенність вищеназваних препаратів (A.S.Janoff, 1999).

В умовах зростання антибіотикорезистентності гноєродної мікрофлори і змінної реактивності організму, коли загальне використання імунологічних і антибактеріальних препаратів не завжди можливе із-за суттєвих побічних ефектів, проблема медикаментозного лікування інфікованих ран і опіків стає все більш складною. Сучасній хірургії, і частково комбустіології, необхідні нові раноживлячі препарати, які мають широкий спектр антимікробної дії (М.И.Кузин с соавт., 1985, 1987, 1990). Одним з напрямків створення таких препаратів є використання традиційних антибіотиків з модифікацією складу допоміжних речовин в мазевих основах, яка враховує механізм виробки резистентності бактерій до цих антибіотиків. (М.О.Ляпунов та ін., 1994; О.І.Тихонов та ін., 1997; Л.В.Яковлєва та ін., 1998, 1999).

Актуальність теми. Профілактика і лікування госпітальної синьогнійної опікової інфекції - серйозна проблема сьогодення. Арсенал антимікробних засобів, що використовуються для профілактики і лікування опікової Pseudomonas-інфекції, не задовольняє щоденні потреби медичних закладів України. Створення і впровадження нових, більш ефективних препаратів для специфічної профілактики й антибактеріальної терапії даної інфекції є актуальним питанням сучасної медицини, особливо мікробіології, і потребує нових підходів для рішення цієї проблеми.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до державної комплексної міжвідомчої програми “Профілактика захворювань і формування здорового способу життя населення України на період до 2000 року”, плану наукових досліджень  кафедри мікробіології, вірусології та імунології Харківського державного медичного університету (№ держреєстрації 01980002613).

Мета роботи. Метою роботи було експериментальне обгрунтування використання ліпосомальної форми анатоксину синьогнійної палички для профілактики опікової Pseudomonas-інфекції, а гелю і крему левоміцетину 1%-го для місцевого лікування опіків, котрі інфіковані паличкою синьо-зеленого гною.

Задачі дослідження. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання:

  1.  Вивчити етіологічну структуру інфікованих опікових ран і чутливість виділених культур мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів.
  2.  Дослідити імунологічний статус здорових мишей і тварин із термічною травмою, яких імунізували ліпосомальною формою анатоксину P.aeruginosa.
  3.  Визначити антибактеріальну активність препаратів із левоміцетином у дослідах in vitro у відношенні до стандартних і клінічних штамів P.aeruginosa, а також інших факультативно-анаеробних мікроорганізмів, що інфікують опікову поверхню.
  4.  Дослідити терапевтичну ефективність крему і гелю левоміцетину 1% на експериментальній моделі синьогнійної опікової інфекції у тварин.

Об’єкт дослідження. Синьогнійна опікова інфекція.

Предмет дослідження: Фосфатидилетаноламінові ліпосоми та ліпосомальна форма анатоксину P.aeruginosa, які призначені для профілактики синьогнійної опікової інфекції.

Препарати крему й гелю левоміцетину 1% на гідрофільних основах, які призначені для місцевого лікування опіків, інфікованих синьогнійною паличкою.

Методи дослідження. Виділення мікроорганізмів і їх ідентифікацію проводили відповідно до Розпоряджень МОЗ СРСР № 250 від 13.12.75, № 535 від 22.04.85 і методичних рекомендацій (Москва, 1984; Харків 1991).

 Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків визначали методом дисків відповідно до методичних рекомендацій (Б.М.Даценко с соавт., 1989).

Визначення антибактеріальної активності левоміцетину, крему і гелю левоміцетину 1%, а також основ мазевих форм проводили методом дифузії в агар відповідно до методичних рекомендацій (Н.Ф.Калиниченко с соавт., 1991).

Для одержання ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину (ЛФА) використовували нейтральні мультиламелярні фосфатидилетаноламінові ліпосоми (за технологією, розробленою Івановою Н.М. з спіавт., 1984, 1986 на Харківському підприємстві “Біолік”) і синьогнійний анатоксин, розроблений у лабораторії опікових інфекцій НДІЕМ ім. М.Ф.Гамалеї АМН Росії (Н.С.Бродинова с соавт., 1987, 1989).

Форму ліпосом вивчали за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (Н.С.Пушкарь, А.С.Капрельянц, 1982; Г.Грегориадис, А.Аллисон, 1983; В.Я.Карупу, 1984). Електронно-мікроскопічні дослідження ліпосом робили за допомогою мікроскопа JEM-7A фірми “JEOL” (Японія).

Для вивчення імуномодулюючих властивостей ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину і дослідження терапевтичної активності мазевих препаратів із левоміцетином використовувалася контактна модель термічного опіку за Ц.К.Чантурією (1982) у модифікації В.В.Мінухіна із співавт. (1985) і експериментальна модель синьогнійної опікової інфекції (В.В.Минухин с соавт., 1992). Специфічну дію препаратів левоміцетину в дослідах in vivo вивчали також на експериментальній моделі місцевої раневої інфекції, викликаної стандартним штамом P.aeruginosa АТСС 27853, на кролях породи шиншилла (Б.М.Даценко із співавт., 1989).

Вплив ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину на імунологічний статус здорових тварин і мишей із термічною травмою вивчали за їх реакцією на введення Т-залежного антигену - еритроцитів барана (ЕБ) (Иммунологические методы/ Под. ред. М.Фримеля, 1987; H. V. Dijk, N. Bloksma, 1977).

Аналіз функціонального стану нейтрофілів крові тварин оцінювали за спроможністю поглинати частки латексу (В.Н.Федосеева с соавт., 1989).

Матеріал для морфологічного дослідження одержували за М.В.Войно-Ясенецьким, Ю.М.Жаботинським (1970) та Г.А.Меркуловим (1969). Гістохімічне виявлення в гістологічних препаратах рибонуклеїнової кислоти (РНК) проводили за допомогою реакції Браше (В.Г.Елесеева; 1967; Г.А.Меркулов, 1969).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було визначено широкий спектр імуномодулюючих властивостей фосфатидилетаноламінових ліпосом і ліпосомальної форми анатоксину синьогнійної палички при опіках у мишей.

Вперше у вітчизняній і зарубіжній практиці теоретичними й експериментальними дослідженнями, з мікробіологічної точки зору, обгрунтовано склади двох препаратів: гелю левоміцетину 1% (на гідрофільній водорозчинній основі) і крему левоміцетину 1% (на гідрофільній емульсійній основі) для лікування синьогнійної опікової інфекції.

В дослідах in vitro та in vivo виявлена висока антибактеріальна активність розроблених мазевих препаратів порівняно з існуючими аналогами, особливо у відношенні стійких до левоміцетину клінічних штамів.

Практичне значення одержаних результатів. Для лікування синьогнійної опікової інфекції запропоновано два антибактеріальних препарати на гідрофільних основах із левоміцетином: гель левоміцетину 1% для застосування в фазі запалення та ексудації і крем левоміцетину 1% для використання в фазі регенерації. Виробництво вищезазначених препаратів у даний час, згідно Реєстраційного посвідчення № Р.02.00/01402 від 02.02.00 МОЗ України для гелю левоміцетину 1% та Реєстраційного посвідчення № Р.02.00/01494 від 24.02.00 МОЗ України для крему левоміцетину 1%, почалося на ЗАТ “Фармацевтична фірма “Дарниця” (м. Київ). Перші партії антибактеріального та гіперосмолярного засобу гелю левоміцетину 1% поступили у аптечну мережу України.

Результати отриманих наукових досліджень використовуються в навчальному процесі на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Харківського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Аналіз літератури по темі дисертації, вивчення етіологічної структури ГГСІ, планування і виконання експерименту, статистичне опрацювання матеріалу, аналіз результатів дослідження й оформлення роботи виконані автором самостійно. Усі положення та висновки дисертації належать авторові. Автором написано особисто, або у співавторстві з д.мед.н. А.Я.Циганенко, д.мед.н. В.В.Мінухіним, д.фарм.н. М.О.Ляпуновим, к.мед.н. В.М.Васильченко, к.мед.н. Н.І.Коваленко, к.мед.н. В.І.Кравцовою, к.мед.н. Н.М.Івановою. к.мед.н. О.П.Безуглою, Д.В.Мінухіним усі друковані матеріали, що мають відношення до теми роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати дисертації були повідомлені на Всесоюзній конференції “Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций” (Москва, 1991); Першому Російському національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва, 1992); 2-й Всеросійській конференції “Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей, клеток человека и животных” (Саратов, 1993); Міжнародній науково-практичній конференції “Оптимальные средства и методы иммунокорригирующей, противовоспалительной и противомикробной терапии” (Харків , 1993), Міжнародному симпозіумі “Lipid and Surfactant Dispersed Systems” (Москва, 1999); Fourth International Conference “Liposome Advances: Progress in Drug and Vaccine Delivery” (London, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 робіт (4 самостійних публікації), із них 6 - у наукових і науково-практичних часописах, що рекомендовані ВАКом України, 1 - у науковому збірнику, 1 - у матеріалах міжнародної наукової конференції.

Обсяг і структура дисертації. Робота складається зі вступу, огляду літератури, розділу “Об'єкти і методи дослідження”, 3 розділів власних досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел та додатків (2 сторінки). Дисертація викладена на 115 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 24 таблицями і 7 малюнками. Список використаної літератури містить 275 джерела, у тому числі 132 українсько- і російськомовних і 143 англомовних публікацій.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи. У роботі були використані такі методи дослідження:

. Мікробіологічні методи. Обстежено 547 хворих з опіковими інфекціями, від яких виділено 690 штамів умовно-патогенних мікроорганізмів. Виділення мікроорганізмів і їх ідентифікацію проводили відповідно до Розпоряджень МОЗ СРСР № 250 від 13.12.75, № 535 від 22.04.85 і методичних рекомендацій (Москва, 1984; Харків 1991).

 Чутливість мікроорганізмів до антибіотиків визначали методом дисків відповідно до методичних рекомендацій (Б.М.Даценко с соавт., 1989).

Визначення антибактеріальної активності левоміцетину, крему і гелю левоміцетину 1%, а також основ мазевих форм проводили методом дифузії в агар відповідно до методичних рекомендацій (Н.Ф.Калиниченко с соавт., 1991). У якості тест-культур використані еталонні штами - Staphylococcus aureus 209-Р і АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Pseudomonas aeruginosa PA-103, Proteus vulgaris XZ 4636, а також клінічні штами бактерій, не чутливі до левоміцетину (метод дисків, Б.М.Даценко, 1989), виділені з патологічного матеріалу опікових хворих: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Proteus vulgaris . Еталонні штами отримані з ДІСК ім. Л.А.Тарасевича (Росія), клінічні штами - виділені від пацієнтів опікового центру 4-ї лікарні м. Харкова.

2. Біотехнологічні методи. Для одержання ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину (ЛФА) використовували нейтральні мультиламелярні фосфатидилетаноламінові ліпосоми (ФЕЛ), розроблені на Харківському підприємстві “Біолік” (Н.Н.Иванова с соавт., 1984, 1986) і синьогнійний анатоксин, розроблений у лабораторії опікових інфекцій НДІЕМ ім. М.Ф.Гамалеї АМН Росії (Н.С.Бродинова с соавт., 1987, 1989). ФЕЛ одержували з полярних ліпідів спинного мозку великої рогатої худоби за технологією, розробленою Івановою Н.М. (1984).

Форму ліпосом вивчали за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (Н.С.Пушкарь, А.С.Капрельянц, 1982; Г.Грегориадис, А.Аллисон, 1983; В.Я.Карупу, 1984). Електронно-мікроскопічні дослідження ліпосом робили за допомогою мікроскопа JEM-7A фірми “JEOL” (Японія).

3. Експериментальні моделі інфекційних захворювань. Для вивчення  імуномодулюючих властивостей ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину і дослідження терапевтичної активності мазевих препаратів із левоміцетином використовувалася контактна модель термічного опіку за Ц.К.Чантурією (1982) у модифікації В.В.Мінухіна із співавт. (1985). У результаті одержували асептичні опіки Ш-Б ступеня 10% поверхні тіла тварин. Інфіковані опіки одержували в результаті зараження лабораторних тварин добовою агаровою культурою токсигенного штаму синьогнійної палички РА-103, шляхом інстиляції 0,05 мл мікробної суспензії в дозі 1,02х10 КУО/мл, що відповідає LD50 для нашкірного застосування.

Імунізацію опечених мишей починали відразу після нанесення термічного ушкодження і (або) зараження. Препарат вводили одноразово підшкірно в дозі 15 мкг/мишу (750 мкг/кг) анатоксину і 0,75 мг/мишу (37,5 мг/кг) ліпосом, що містилися в об’ємі 0,5 мл (В.В.Минухин с соавт., 1992).

Лікування мазями починали через 24 години після опіку або після опіку і зараження. Препарати застосовувалися у кількості 0,5 мл 2 рази на добу у виді аплікації протягом 18 діб.

Специфічну дію препаратів левоміцетину в дослідах in vivo вивчали також на експериментальній моделі місцевої раневої інфекції, викликаної стандартним штамом P.aeruginosa АТСС 27853, на кролях породи шиншилла (Б.М.Даценко із співавт., 1989).

4. Імунологічні методи. Вплив ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину на імунологічний статус здорових тварин і мишей із термічною травмою вивчали за реакцією на введення Т-залежного антигену - еритроцитів барана (ЕБ) (Иммунологические методы/ Под. ред. М.Фримеля, 1987; H. V. Dijk, N. Bloksma, 1977).

Аналіз функціонального стану нейтрофілів крові оцінювали за спроможністю поглинати частки латексу (В.Н.Федосеева с соавт., 1989).

. Гістологічні і гістохімічні методи. Матеріал для морфологічного дослідження одержували за М.В.Войно-Ясенецьким, Ю.М.Жаботинським, (1970) та Г.А.Меркуловим (1969). Гістохімічне виявлення в гістологічних препаратах рибонуклеїнової кислоти (РНК) проводили за допомогою реакції Браше (В.Г.Елесеева; 1967; Г.А.Меркулов, 1969).

6. Статистичні методи. Отриманий цифровий матеріал оброблено методом варіаційної статистики (Д.Поллард, 1982), який розроблено для комп'ютерів типу IBM PC/AT.

7. Кількісна характеристика, загальні принципи і методи роботи з лабораторними тваринами. Усього в дисертаційній роботі було використано 1629 мишей і 14 кролів.

При роботі з лабораторними тваринами керувалися “Європейською конвенцією по захисту хребетних тварин, що використовуються в експериментальних і других наукових цілях” (Страсбург, 18.03.86 р.); “Директивою Ради Європейського співтовариства від 24.11.86 р.”; “Goad Laboratory Practices”, FDA, 1987; Розпорядженням МОЗ УРСР № 32 від 22 лютого 1988 р. та ін.

Результати власних досліджень. 1. Вивчення етіологічної структури інфікованих опікових ран і чутливості виділених культур мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів.

Від 547 хворих, що знаходилися на лікуванні в опіковому відділенні багатопрофільного стаціонару м. Харкова, було виділено 690 штамів умовно-патогенних мікроорганізмів, які були ідентифіковані як Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniaе, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, гриби роду Candida.

При аналізі етіологічної структури ГГСІ у хворих із термічною травмою встановлено, що збудниками більшості (96,8% виділених штамів) опікових інфекцій є бактерії. Аналіз мікробного пейзажу опікових ран пацієнтів показав незначне переваження грампозитивної мікрофлори (57,5%) над грамнегативною (42,5%) (мал. 1). Серед грампозитивних мікроорганізмів головне місце займають стафілококи (42,4%), а серед грамнегативних - синьогнійна паличка (28,6%).

Мал. 1. Етіологічна структура госпітальної опікової інфекції

              - грампозитивні мікроорганізми: 1 - S.aureus; 2 - S.epidermidis, 3 - S.faecalis, 4 - S.faecium, 5 - B.subtilis;

              - грамнегативні мікроорганізми: 6 - P.aeruginosa, 7 - E.coli, 8 - K.pneumoniaе, 9 - P.vulgaris, 10 - P.mirabilis.

Моноінфекція зустрічається частіше (76,5%) ніж змішана інфекція (23,5%). Найчастіше ізолюються такі асоціації мікроорганізмів: S.aureus із P.vulgaris, K.pneumoniaе або E.coli; P.aeruginosa із S.aureus або K.pneumoniaе.

 Аналіз чутливості виділеної мікрофлори до антибактеріальних препаратів показав, що P.aeruginosa проявляє високу резистентність до застосованих в даній клініці антибіотиків. Кількість резистентних штамів синьогнійної палички до більшості досліджуваних антибіотиків коливалася від 85,5% до 100,0%. Ефективність левоміцетину і гентаміцину була вище і склала 22,7% і 36,4% чутливих штамів відповідно, і тільки поліміксин був активний у відношенні 72,2% клінічних штамів палички синьо-зеленого гною.

Таким чином, пошук нових засобів профілактики і лікування синьогнійної опікової інфекції залишається актуальною проблемою сучасної медицини.

2. Експериментальне обгрунтування застосування фосфатидилетанол-амінових ліпосом і ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину для профілактики опікової Pseudomonas-інфекції.

Було проведено електронно-мікроскопічне вивчення отриманих мультиламелярних ліпосом, що являють собою гетерогенні смектичні мезофази, де фосфоліпідні прошарки розділені водою. Ліпосоми, які досліджувались, мають великий обсяг внутрішнього простору, що дозволило включити до них значну кількість анатоксину.

 Застосування фосфатидилетаноламінових ліпосом у якості ад’юванта при імунізації мишей із термічною травмою сприяє формуванню повноцінної імунної відповіді на введення Т-залежного антигену (еритроцитів барана). Це виражається в більш швидкій нормалізації гемолізинпродукуючої і розеткоутворюючої функцій спленоцитів мишей, імунізованих ліпосомальною формою анатоксину синьогнійної палички (ЛФА) у порівнянні з опіковим контролем, а також з анатоксином, який сорбовано на гідроокисі алюмінію.

Відзначається імуностимулючий ефект при застосуванні фосфати-дилетаноламінових ліпосом, особливо у випадку введення ЛФА, що виражається в збільшенні селезінкового індексу в 2-4 рази в порівнянні з нормою протягом усього терміна спостереження у піддослідних тварин, імунізованих ЛФА й у 2,5-6 разів у мишей, яким вводили анатоксин у комбінації з ФЕЛ. Спостерігається також збільшення тимусного індексу у 2-3 рази серед мишей вищевказаних груп на 1-7 добу спостереження. З 3-ї доби відзначалося збільшення кількості літичних концентрацій (КЛК) у 2-6 разів (у різні терміни спостереження) в експериментальних тварин, що імунізували ЛФА.

При вивченні функціональної активності нейтрофілів крові мишей із термічною травмою встановлено, що в ранні терміни спостереження кількість нейтрофілів, що беруть участь у фагоцитозі у тварин із термічною травмою (опіковий контроль) вірогідно зменшується. На 7-у добу після нанесення опіку їх кількість майже в 2,5 разу менша, ніж у здорових мишей (без впливу продигіозану). На 14-у добу кількість клітин крові, що беруть участь у фагоцитозі збільшується, але залишається нижчою контрольних показників (р<0,001). До 21-ї доби спостереження активність фагоцитозу (як із стимуляцією продигіозаном, так і без неї) у мишей із групи опікового контролю не відрізняється від аналогічних показників у здорових тварин. У експериментальних тварин із термічною травмою, що імунізували ЛФА, нормалізація активності фагоцитозу відбувається швидше (14 доба).

При аналізі інтенсивності фагоцитозу нейтрофілів крові піддослідних тварин встановлено, що на 7-у добу спостереження цей показник у групі опікового контролю в 1,9 рази (не стимульовані продигіозаном клітини) і в 1,5 рази (стимульовані продигіозаном клітини) нижче, ніж у здорових тварин. У більш пізні терміни спостереження інтенсивність фагоцитозу нейтрофілів крові опечених і не імунізованих мишей не відрізняється від показників здорового контролю. У групі тварин, імунізованих ЛФА, даний показник протягом усього терміну спостереження не відрізнявся від контрольних цифр.

Таким чином, імунізація лабораторних тварин із термічною травмою ліпосомальною формою синьогнійного анатоксину нівелює супресивну дію опіку на фагоцитарну спроможність нейтрофілів крові, що сприяє більш швидкій нормалізації функціональних можливостей цих клітин, які порушуються під впливом опікової травми.

Застосування ліпосомального анатоксину синьогнійної палички активізує імунні реакції в організмі мишей, що виражається в посиленні проліферативних і гіперпластичних процесів у тимусі, селезінці, лімфатичних вузлах, печінці, із приєднанням макрофагально-плазмоцитарної реакції. У той же час, введення ліпосомальної форми анатоксину P.aeruginosa у дозах - анатоксину 15 мкг/мишу, фосфатидилетаноламінових ліпосом - 0,75 мг/мишу, не викликає дистрофічних і деструктивних змін в імунокомпетентних органах піддослідних тварин.

3. Експериментальне обгрунтування застосування гелю і крему левоміцетину 1% при опіковій інфекції.

Були розроблені раціональні склади двох мазей із левоміцетином - гель левоміцетину 1% (на гідрофільній водорозчинній основі) і крем левоміцетину 1% (на гідрофільній водоемульсійній основі).

Препарати мають широкий спектр антибактеріальної дії в дослідах in vitro на еталонні штами мікроорганізмів: Staphylococcus aureus 209-Р і АТСС 25923, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Pseudomonas aeruginosa PA-103, Proteus vulgaris XZ 4636, а також на клінічні штами бактерій, що були виділені з патологічного матеріалу хворих із раневою опіковою інфекцією - Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Streptococcus faecalis, Proteus vulgaris. Антимікробна активність препаратів не залежить від чутливості цих мікроорганізмів до левоміцетину (відсутність зон затримки росту навколо стандартних дисків із левоміцетином) (табл. 1).

Таблиця 1

Діаметри зон затримки росту госпітальних штамів мікроорганізмів препаратами з левоміцетином

Препарати

Вид мікроорганізму

S. au-reus

E. coli

P. aeru-ginosa

P. vul-garis

S. epi-der-midis

S. fae-calis

Гель левоміцетину 1%

26+0,9

+1,2

+1,0

+1,0

+0,9

+1,4

Гель левоміцетину 1% (без ЕДТА)

22+1,2

+1,1

+1,1

+1,5

+1,4

+0,9

Мазь “Левомеколь”

20+1,9

+1,8

+2,3

+2,5

+1,9

+1,2

Крем левоміцетину 1%

28+0,8

+0,8

+1,0

+1,7

+1,3

+1,3

Крем левоміцетину 1% (без ЕДТА)

24+0,9

+1,1

+1,5

+1,1

+1,7

+1,4

Лінімент синтоміцину 5%

18+2,1

+2,4

+3,7

+2,9

+2,3

+1,6

Диск левоміцетину

ріст

ріст

ріст

ріст

ріст

ріст

Відзначається потенціювання антибактеріальної дії крему і гелю левоміцетину 1% при введенні в дані лікарські форми 0,5% трилону Б (ЕДТА) (різниця діаметрів зон затримки росту в діапазоні від 3 до 9 мм) (див. табл. 1).

По ефективності антибактеріальної дії в дослідах in vitro дані препарати мають переваги перед аналогами - маззю "Левомеколь" і лініментом синтоміцину 5%, що особливо очевидні у випадку госпітальних штамів мікроорганізмів.

Для з'ясування можливості використання гелю і крему левоміцетину 1% у хворих з опіками були проведені серії експериментів на моделях термічної неінфікованої травми і експериментальної синьогнійної опікової інфекції у тварин.

Так, застосування гелю і крему левоміцетину 1% при неінфікованому опіку у мишей на 3-8 діб скорочує перехід від фази запалення у фазу репарації і попереджає інфікування опікової рани умовно-патогенною мікрофлорою.

При вивченні специфічної дії препаратів на моделі синьогнійної опікової інфекції у мишей, крем і гель левоміцетину 1% виявилися більш ефективними лікарськими засобами, ніж препарати порівняння - лінімент синтоміцину 5% для крему і мазь “Левомеколь” для гелю відповідно. Так, при застосуванні гелю левоміцетину 1% розходження у швидкості репарації раневої поверхні в порівнянні з контролем стає очевидним уже на 6-у добу спостереження, а в порівнянні з препаратом аналогом - на 12-у добу. Площа опікової поверхні у тварин, яких лікували кремом левоміцетину 1%, із 8-ї доби і до кінця терміну спостереження вірогідно менше, ніж у контрольних тварин і мишей, яких лікували лініментом синтоміцину 5%.

При вивченні антибактеріальної дії препаратів у дослідах in vivo уже на 4-у добу спостереження відзначається елімінація збудника з поверхні опікових ран експериментальних тварин, а повна санація ушкоджень забезпечується на 12-у добу лікування при застосуванні гелю левоміцетину 1% і на 15-у добу при використанні крему левоміцетину 1% (табл. 2). 

При лікуванні мишей маззю “Левомеколь” на 15-у добу експерименту P.aeruginosa не висівалася у 50% лабораторних тварин, а у випадку застосування лініменту синтоміцину 5%-го опікові рани були вільні від синьогнійної палички у такої ж кількості піддослідних тварин лише на 21-у добу лікування. У контролі синьогнійна паличка висівалася протягом усього терміну спостереження в 100% випадках.

Таблиця 2

Відсоток висівання P.aeruginosa PA-103 з опікової поверхні при лікуванні препаратами з левоміцетином

До-би

Гель левоміце-тину 1%

Крем левоміце-тину 1%

Мазь

“Левоме-коль"

Лінімент синтомі-цину 5%

Контроль

2

4

6

8

12

-

15

-

-

18

-

-

21

-

-

-

Результати досліджень свідчать, що обидва препарати в дослідах in vivo на моделі опікової інфекції в кролів виявляють виражений антибактеріальний ефект, що сприяє елімінації синьогнійної палички з рани. У першій фазі раневого процесу –фазі запалення, більш ефективно застосування гелю левоміцетину 1%. Крем левоміцетину 1% у цій фазі не робить настільки вираженої протизапальної дії і менше ефективний у якості антибактеріального препарату, що пояснюється його більш низькою гіперосмолярною активністю. Після зниження кількості мікробів у рані нижче критичного рівня і при переході до фази репарації більш раціонально застосовувати крем левоміцетину 1%, що у цій фазі виявляє ефективну бактерицидну дію і сприяє більш швидкому загоєнню ран.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, яка полягала в експериментальному обгрунтуванні застосування ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину для профілактики опікової Pseudomonas-інфекції, а гелю і крему левоміцетину 1%-го для місцевого лікування ран і опіків, інфікованих паличкою синьо-зеленого гною. Для її вирішення було вивчено етіологічну структуру інфікованих опікових ран і чутливість виділених культур мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів. Досліджено імунологічний статус здорових мишей і тварин із термічною травмою, яких імунізували ліпосомальною формою анатоксину P.aeruginosa. Визначено антибактеріальну активність препаратів із левоміцетином у дослідах in vitro у відношенні до стандартних і клінічних штамів P.aeruginosa, а також вивчено терапевтичну ефективність крему і гелю левоміцетину 1% на експериментальній моделі синьогнійної опікової інфекції у тварин.

На підставі одержаних результатів дослідження були зроблені наступні висновки:

  1.  У структурі гнійно-септичних ускладнень, що виникають у пацієнтів опікового відділення багатопрофільного стаціонару м. Харкова, одне з перших місць займає P.aeruginosa, штами якої мають множинну стійкість до антибактеріальних препаратів, які застосовуються в даній лікарні.
  2.  Застосування фосфатидилетаноламінових ліпосом і ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину зменшує пригнічуючу дію термічної травми на імунну систему, що виражається в більш швидкій нормалізації досліджуваних імунологічних показників у піддослідних мишей у порівнянні з контрольними цифрами.
  3.  Введення ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину в дозах - анатоксину 15 мкг/мишу, фосфатидилетаноаламінових ліпосом - 0,75 мг/мишу, не викликає дистрофічних і деструктивних змін в імунокомпетентних органах експериментальних тварин.
  4.  У дослідах in vitro показано, що крем і гель левоміцетину 1% мають широкий спектр антибактеріальної дії. Завдяки введенню до складу кремової і гелевої основ трилону Б (ЕДТА), до препаратів виявилися чутливі бактерії, які були резистентні до левоміцетину. За ефективністю антибактеріальної дії в дослідах in vitro дані препарати мають переваги перед аналогами - маззю "Левомеколь" і лініментом синтоміцину 5%.
  5.  Лікування експериментальних тварин із синьогнійною опіковою інфекцією гелем і кремом левоміцетину 1% сприяє швидкому очищенню ран від P.aeruginosa і зменшує запальну реакцію в осередку ураження. Застосування розроблених препаратів із левоміцетином при неінфікованій термічній травмі у мишей попереджає колонізацію опікової поверхні умовно-патогенною мікрофлорою.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

  1.  Для підвищення ефективності місцевої терапії синьогнійної опікової інфекції і запобіганню розвитку сепсису у фазі запалення і ексудації рекомендується застосування гелю левоміцетину 1%, який має високу антибактеріальну та гіперосмолярну активність.
  2.  Для лікування опіків, інфікованих P.aeruginosa, у фазі регенерації або ран із помірною гнійною ексудацією рекомендується застосовувати крем левоміцетину 1%, що сприяє більш швидкій репарації опікової поверхні.

ПЕРЕЛІК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

  1.  Ткаченко В.Л. Действие липосомальной формы анатоксина синегнойной палочки на структурные преобразования иммунной системы мышей// Медицина сьогодні і завтра. - 1998. - № 1 (4). - С. 46-48.
  2.  Ткаченко В.Л. Функциональное состояние нейтрофилов крови мышей с термической травмой, иммунизированных липосомальной формой синегнойного анатоксина// Медицина сьогодні і завтра. - 1999. - № 1. - С. 9-10.
  3.  Цыганенко А.Я., Минухин В.В., Ткаченко В.Л., Коваленко Н.И., Васильченко В.Н., Иванова Н.Н., Минухин Д.В. Экспериментальное применение липосом// Експериментальна і клінічна медицина. - 1999. - № 2. - С. 9-10.
  4.  Ткаченко В.Л. Изучение антимикробной активности мазевых препаратов с левомицетином// Вісник проблем біології і медицини. - 1999. - № 2. - С. 91-93.
  5.  Ткаченко В.Л., Цыганенко А.Я, Ляпунов Н.А, Безуглая Е.П., Минухин В.В. Экспериментальное обоснование применение препаратов с левомицетином для лечения ожогов, инфицированных Pseudomonas aeruginosa// Мікробіологічний журнал. - 1999. - Т. 61. - № 3. - С. 30-36.
  6.  Ткаченко В.Л. Иммунопрепараты для профилактики синегнойной инфекции/ Врачебная практика. - 1999. - № 3. - С. 66-68.
  7.  Ткаченко В.Л., Цыганенко А.Я, Кравцова В.И., Минухин В.В. Этиология гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами у пациентов с ожогами// Микробиология, эпидемиология и клиника инфекционных болезней. - Сб. научных трудов ХМИ. –Харьков. - 1993. - С. 68-72.
  8.  Tsyganenko A.Ya., Tkachenko V.L., Minukhin V.V., Ivanova N.N. Protective and immunogenic properties of liposomes and liposomal form of Pseudomonas aeruginosa toxoid in burnt mice// Fourth International Conference “Liposome Advances: Progress in Drug and Vaccine Delivery”. Abstracts. 13-17 December 1999. –London. –. - Р. 133.

АНОТАЦІЯ

Ткаченко В.Л. Експериментальне обгрунтування використання ліпосом та мазевих препаратів з левоміцетином для профілактики і лікування синьогнійної опікової інфекції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеню кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 –мікробіологія. Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. Харків, 2001.

З метою профілактики синьогнійної інфекції у хворих з опіками рекомендується застосування ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину. Показано, що використання фосфатидилетаноламінових ліпосом та ліпосомальної форми синьогнійного анатоксину активізує імунні реакції в організмі експериментальних тварин.

Вивчено можливість застосування гелю та крему левоміцетину 1% для місцевого лікування експериментальної синьогнійної опікової інфекції.

В дослідах in vivo було доведено, що гель та крем левоміцетину 1% справляють виражений терапевтичний ефект, сприяють звільненню ран від синьогнійної палички і зменшують запальну реакцію у вогнищі ураження. Застосування крему та гелю левоміцетину 1% при неінфікованій термічній травмі у лабораторних тварин скорочує на 3-8 діб перехід від фази запалення у фазу репарації і запобігає інфікуванню опікової рани умовно-патогенною мікрофлорою.

Ключові слова: Pseudomonas aeruginosa, опіки, ліпосоми, левоміцетин.

АННОТАЦИЯ

Ткаченко В.Л. Экспериментальное обоснование применения липосом и мазевых препаратов с левомицетином для профилактики и лечения синегнойной ожоговой инфекции. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 –микробиология. Институт микробиологии и иммунологии им. И.И.Мечникова АМН Украины. Харьков, 2001.

Цель работы состоит в экспериментальном обосновании применения липосомальной формы синегнойного анатоксина для профилактики ожоговой Pseudomonas-инфекции, а геля и крема левомицетина 1%-го для местного лечения ран и ожогов, инфицированных палочкой сине-зеленого гноя.

Для определения роли и места синегнойной палочки в структуре госпитальных гнойно-септических инфекций (ГГСИ) нами была изучена их этиология у пациентов ожогового отделения многопрофильного стационара г. Харькова. От больных выделили 690 штаммов условно-патогенных микроорганизмов. Анализ микробного пейзажа ожоговых ран пациентов показал незначительное преобладание грамположительной микрофлоры (57,5%) над грамотрицательной (42,5%). Среди грампозитивных микроорганизмов ведущее место занимают стафилококки (42,4%), а среди грамнегативных - синегнойная палочка (28,6%).

В первой серии экспериментов нами было показано, что применение липосомальной формы синегнойного анатоксина активизирует иммунные реакции в организме мышей, что выражается в усилении пролиферативных и гиперпластических процессов в тимусе, селезенке, лимфатических узлах, печени экспериментальных животных, с присоединением макрофагально-плазмоцитарной реакции. Иммунизация лабораторных животных с термической травмой липосомальной формой анатоксина нивелирует супрессивное действие ожога на фагоцитарную способность нейтрофилов крови экспериментальных мышей, способствуя более быстрой нормализации показателей функциональной активности этих клеток.

Применение фосфатидилэтаноламиновых липосом в качестве адъюванта при иммунизации мышей с термической травмой, способствует формированию полноценного иммунного ответа на введение Т-зависимого антигена (эритроцитов барана), нормализуя гемолизинпродуцирующую и розеткообразующую функции спленоцитов мышей, иммунизированных липосомальной формой синегнойного анатоксина, как по сравнению с ожоговым контролем, так и с анатоксином, сорбированном на гидроокиси алюминия.

Изучена возможность использования геля и крема левомицетина 1% для местного лечения экспериментальной синегнойной ожоговой инфекции.

В опытах in vitro показано, что крем и гель левомицетина 1% обладают широким спектром антибактериального действия. Благодаря включению в составы кремовой и гелевой основ трилона Б (ЭДТА), к препаратам оказались чувствительны бактерии, резистентные к левомицетину.

В опытах in vivo было показано, что гель и крем левомицетина 1% обладают высокой терапевтической активностью. Применение крема и геля левомицетина 1% при неинфицированной термической травме у лабораторных животных на 3-8 суток сокращает переход от фазы воспаления в фазу репарации и предупреждает инфицирование ожоговой раны условно-патогенной микрофлорой.

Применение мазевых форм с левомицетином у животных с экспериментальной синегнойной ожоговой инфекцией способствует быстрому очищению ран от P.aeruginosa и уменьшает воспалительную реакцию в очаге поражения. Лечение экспериментальных животных с термической травмой гелем и кремом левомицетина 1% более эффективно, чем препаратами сравнения –мазью “Левомеколь” и линиментом синтомицина 5%.

На основании полученных результатов, для лечения синегнойной ожоговой инфекции предложены два препарата на гидрофильных основах с левомицетином. Гель левомицетина 1% - для лечения ожогов в фазе воспаления и экссудации, а крем левомицетина 1% - в фазе регенерации или для лечения ран с умеренной гнойной экссудацией. Производство вышеупомянутых препаратов в данное время, в соответствии с Регистрационным удостоверением № Р.02.00/01402 от 02.02.00 МЗ Украины для геля левомицетина 1% и Регистрационным удостоверением № Р.02.00/01494 от 24.02.00 МЗ Украины для крема левомицетина 1%, началось на ЗАО “Фармацевтическая фирма “Дарница” (г. Киев).

Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, ожоги, липосомы, левомицетин.

SUMMARY

Tkachenko V.L. Experimental substantiation for use of liposomes and ointment preparations with chloramphenicol for prevention and treatment of Pseudomonas aeruginosa burn infections. –Manuscript.

The thesis on obtaining of scientific degree of Candidate of Medical Science in speciality No. 03.00.07. – Microbiology. Institute of Microbiology and Immunology named after I.I.Mechnikov AMS Ukraine. Kharkov, 2001.

Liposomal form of Pseudomonas aeruginosa toxoid is recommended for the prophylaxis of Pseudomonas aeruginosa infection in the patients with the burn wounds. It is established, that the use of phosphatidilethanolamine liposomes and liposomal form of Pseudomonas aeruginosa toxoid activate immune reactions in organism of experimental animals.

Application of 1% of chloramphenicol (gel and cream) for local treatment of Pseudomonas aeruginosa burn infection has been studied in experiment.

In vivo, both medical forms show pronounced therapeutic effect; they promote elimination of Pseudomonas aeruginosa from wounds and decrease inflammation. In noninfected thermal trauma in laboratory animals application of gel and cream of chloramphenicol reduces transition from the phase of inflammation to the phase of reparation by 3-8 days and prevents infection of the burn wound by opportunistic microbes.

Key words: Pseudomonas aeruginosa, burns, liposomes, and chloramphenicol.




1. Ssesment of the possibilities of lunching new hotel complex to the N
2. Лекция 13 Учет расчетов с бюджетом Учет расчетов с бюджетом Учет расчетов по НДС Учет расчето
3. Тема- Приборные методы диагностирования систем газоснабжения
4. Отражение данных о государственной помощи в отчетности организации
5. тематика раздел Основы информатики по теме Табличный процессор Excel для студентов всех форм обуче
6. Русская музыка 19 века
7. Поліцейський менеджмент в Швеції.html
8. Федерико Гарсиа Лорка.html
9. реферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук Севастопол
10. задание по объектноориентированному программированию Факультет- ПМИ Группа- ПМИ 21 Ст
11. Отчет по лабораторной работе ’2 Табулирование значений функций Вариант ’20 Преподаватель.html
12. В Лесной стране под Новый Год
13. Меры поощрения осужденных
14. .Культура речи ~ это особая научная дисциплина изучающая и регламентирующая правила связанные с функционир
15. 7 золотых правил начинающего цветовода
16. Новгород
17. Курсовая работа- Стан та напрями удосконалення первинного обліку оплати праці
18. Организационный проект совершенствования кадрового обеспечения системы управления организации
19. Тема 6. Виробнича потужність підприємства Яке визначення розкриває сутність виробничої потужності підприє
20. История экономики России

Материалы собраны группой SamZan и находятся в свободном доступе