Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
УО "МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ"
Методическая разработка практического занятия №1 для учащихся отделения «Лечебное дело» по дисциплине
«Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии».
Тема занятия: «Устройство микробиологической лаборатории, правила работы в ней. Микроскопический метод исследования. Окраска препаратов простым методом и по Граму»
Составила преподаватель Якимова Л.М.
Минск 2007г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №1, №2
Тема: «Устройство микробиологической лаборатории, правила работы в ней.
Микроскопический метод исследования. Окраска препаратов простым методом и по Граму»
Цель занятия: Ознакомить учащихся с устройством бактериологической лаборатории, правилами работы в ней. Изучить устройство микроскопа. Отработать технику микроскопирования. Ознакомить с этапами приготовления окрашенного препарата. Отработать технику простого метода окраски. Освоить методику окраски препаратов по Граму.
Самостоятельная работа:
1. Знакомство с устройством бактериологической лаборатории, правилами работы в ней
2. Изучение устройства микроскопа
3. Знакомство с основными формами микроорганизмов. Микроскопия музейных препаратов, окрашенных по Гинсу-Бурри
4. Приготовление мазков из культур микроорганизмов, выращенных на жидких и плотных питательных средах
5. Высушивание мазков
6. Фиксация мазков
7. Окраска мазков простым методом
8. Окраска мазков по Граму
9. Микроскопия окрашенных препаратов
Методические указания к практической работе
Бактериологическая лаборатория предназначена для проведения микробиологических исследований в профилактических и диагностических целях. В структуру бактериологической лаборатории входят следующие помещения: гардероб для персонала, лабораторные комнаты (для проведения микробиологических исследований), боксы для работы с отдельными группами бактерий и вирусов, средоварочная (для приготовления питательных сред), стерилизационная (для стерилизации различных объектов и обеззараживания отработанного материала), моечная (для мытья лабораторной посуды), материальная, термальная (для выращивая микроорганизмов), может быть виварий (для содержания экспериментальных животных). Методы исследования, используемые в микробиологической практике: микроскопический, бактериологический, серологический, аллергический, биологический, молекулярно-генетический. В качестве исследуемого материала используют биоматериал от больного, который зависит от места локализации патологического процесса (кровь, моча, СМЖ, испражнения, мокрота, гной и т.д.).
Правила работы в бактериологической лаборатории:
1. К работе допускаются лица, прошедшие специальный инструктаж о правилах работы в баклаборатории.
2. Каждый сотрудник должен иметь индивидуальную спецодежду (халат, шапочку)
3. Запрещено выходить из лаборатории в спецодежде и надевать поверх неё верхнюю одежду
4. Обязательное выполнение правил личной гигиены
5. Не допускается прием пищи и курение в баклаборатории
6. Хранение личных вещей должно быть организовано в комнате для медперсонала
7. После окончания работы обязательно проводится влажная уборка всех помещений с применением дезрастворов
8. При загрязнении патогенным материалом необходимо: а) мебель обработать дезраствором, б) лабораторную посуду стерилизовать, в) руки сначала обработать дезраствором, а затем тщательно вымыть с мылом.
9. Не допускать лишних хождений, резких движений, посторонних разговоров.
Правила работы с культурой патогенных микроорганизмов:
1. Доставлять инфицированный материал в лабораторию и переносить его из одной лаборатории в другую на территории учреждения нужно в специально приспособленной посуде (металлических биксах, ящиках, баках)
2. Весь материал, поступивший в баклабораторию, должен рассматриваться как инфицированный
3. При распаковке присланного заразного материала необходимо соблюдать осторожность. Банки, содержащие материал для исследования, при получении обтирают снаружи дезраствором и ставят на подносы или кюветы.
4. О случаях аварии с посудой, содержащей патогенный материал, следует немедленно сообщить зав. лабораторией и немедленно провести обеззараживание объектов и обеззараживание рук, других частей тела и спецодежду.
5. При работе с культурой патогенных микроорганизмов необходимо строго соблюдать общепринятые в бактериологической практике технические приемы, исключающие возможность соприкосновения рук с заразным материалом:
- с инфицированным материалом работают только с помощью инструментов (пинцеты, петли, корнцанги),
- прикасаться руками к исследуемому материалу и конденсату в засеянных чашках запрещается,
- перед работой тщательно проверяют целостность стеклянной посуды, проходимость игл и надежность поршней шприцев,
- при посеве материала делают надпись на пробирках, чашках Петри, колбах, флаконах с указанием номера анализа (культуры) и даты посева,
- в пробирки и чашки Петри материал высевают вблизи от огня горелки с обжиганием петли, шпателя, краев пробирки,
- растворы, содержащие патогенные микроорганизмы, набирают пипеткой с помощью резинового баллона,
- насасывать ртом и переливать растворы из сосуда в сосуд через край нельзя
- по окончанию работы запрещается оставлять на рабочих столах нефиксированные мазки, чашки Петри, пробирки и другую посуду с инфицированным материалом
6. Заразный материал и отработанные культуры подлежат обязательному уничтожению. Инструменты, используемые в работе с заразным материалом и рабочее место дезинфицируют, руки после дезинфекции моют с мылом
7. Работники баклаборатории подлежат обязательной вакцинации против тех заболеваний, возбудители которых могут встречаться в исследуемых объектах
Для обнаружения микроорганизмов и изучения их морфологических свойств используют световые, бинокулярные, люминесцентные, фазово-контрастные, электронные микроскопы. Микроскоп состоит из оптической, осветительной системы и механической части. Механическая часть представлена основанием, тубусодержателем, предметным столиком, микровинтом и макровинтом, тубусом с револьвером. Оптическая система состоит из объектива и окуляра. Осветительная система включает в себя конденсор (обеспечивает фокусировку света в области рассматриваемого препарата), диафрагму (регулирует поток световых лучей) и зеркало (направляет свет от осветителя в конденсор). Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения окуляра и объектива.
Правила микроскопирования:
Работа с микроскопом требует строгого соблюдения правил работы с ним. При микроскопировании в качестве источника света используется естественное освещение и искусственные источники света. При рассматривании неокрашенных препаратов пользуются суженой диафрагмой и опущенным конденсором. Окрашенные препараты микроскопируют при поднятом конденсоре и открытой диафрагме.
1. С помощью зеркала, конденсора и диафрагмы обеспечивают хорошее освещение.
2. Помещают препарат на предметный столик микроскопа и, используя объектив х8, получают четкое изображение
3. После смены объектива х8 на х90 (иммерсионный объектив) и под контролем глаза с боку, осторожно отпускают его до прикосновения с покровным стеклом
4. Глядя в окуляр, медленно с помощью макровинта поднимают тубус микроскопа до получения четкого изображения, после чего с помощью микровинта (пол-оборота в одну сторону или другую) добиваются наилучшего изображения.
РЕКОМЕНДУЕТСЯ во избежание утомления зрения оба глаза держать открытыми.
5. По окончании микроскопирования поднимают тубус и снимают препарат. Мягкой чистой салфеткой вытирают иммерсионный объектив, в случае засыхания масла линзу вытирают спиртом или бензином. Конденсор опускают. Микроскоп покрывают чехлом или хранят в футляре для защиты его от света, пыли, влаги. Необходимо бережно обращаться с объективом и другими оптическими частями. При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия, нельзя пальцами касаться линз. РАЗБИРАТЬ И СОБИРАТЬ ОБЪЕКТИВЫ ЗАПРЕЩЕННО!
Изучение морфологии микроорганизмов в окрашенном состоянии является наиболее распространенным в микробиологии методом. Этот метод имеет много достоинств:
- позволяет изучить морфологические особенности микроорганизмов и дает возможность в некоторых случаях точно определить изучаемый микроорганизм.
- удобен в практической работе, так как значительно легче производить исследования, пользуясь убитыми микроорганизмами, чем живыми.
- легко доступен, благодаря технике окрашивания
Приготовление окрашенного препарата включает:
1. приготовление мазка; 2. высушивание мазка; 3. фиксация мазка; 4. окраска
Для того чтобы приготовить мазок из микробных культур с жидкой питательной среды необходимо бактериальной петлей маленькую каплю исследуемой культуры нанести на обезжиренное предметное стекло и круговыми движениями петли распределить равномерным слоем в виде кружка диаметром в 1-2-копеечную монету. Чтобы приготовить мазок из культуры, выращенной на плотной питательной среде, необходимо на середину стекла нанести каплю физ. раствора или дистиллированной воды, после чего внести в неё бактериальную культуру (петлю с небольшим количеством микробной культуры) так, чтобы капля стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и готовят мазок по описанному выше способу.
Высушивание проводят при комнатной температуре.
Фиксация препарата преследует следующие цели:
- убить микроорганизмы и сделать безопасной работу с ними
- прикрепить мазок к стеклу, чтобы он не смывался при дальнейших манипуляциях
- сделать микроорганизмы более восприимчивыми к окраске, так как убитые микроорганизмы окрашиваются лучше, чем живые
Различают физические и химические методы фиксации
Физический способ фиксации: предметное стекло с препаратом мазком к верху плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки.
Химический способ: на высушенный мазок капают (или опускают мазок в стакан)
1. безводный метиловый спирт на 5 минут
2. этиловый спирт, либо жидкость Никифорова, либо жидкость Карнуа на 10-15 минут
3. ацетон на 5 минут
Техника простого метода окраски:
Фиксированный препарат помещают мазком вверх на подставку. На мазок пипеткой наносят раствор красителя (синь Леффлера на 3-5 минут или раствор фуксина на 1-2 минуты) так, чтобы он весь был покрыт красителем.
После окраски краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают между листами фильтровальной бумаги. На высушенный мазок капают каплю иммерсионного масла и микроскопируют. Простые методы окраски являются ориентировочными в то время как сложные (дифференциальные) методы позволяют выявить физико-химические особенности микробной клетки. В отличие от простых методов при сложных методах окраски используется для окрашивания нескольких красителей и обесцвечивающие вещества.
Окраска по Граму (классический вариант)
Метод окраски по Граму является самым универсальным из сложных методов окраски. Отношение к окраске по Граму является важным опознавательным признаком бактерий. Микроорганизмы, входящие в группу грамположительных, имеют многослойную клеточную стенку с большим содержанием пептидогликана и образуют прочное соединение его и основных красителей (генцианвиолета и раствора Люголя), которое не обесцвечивается при воздействии на них спирта. Вследствие чего при дополнительном окрашивании фуксином грамположительные микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы, имеющие в клеточной стенке меньше пептидогликана, образуют с генцианвиолетом и Люголем не прочный комплекс, легко разрушающийся под воздействием спирта, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином, приобретая розовый цвет.
Методика окраски по Граму:
1. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу и наносят каплю генцианового фиолетового на 1-2 минуты.
2. Снимают фильтровальную бумагу, не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения на 1-2 минуты, затем сливают краситель.
3. Не промывая водой, наносят 96% спирт на 30 секунд-1 минуту.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают фуксином Пфейффера в течение 1- 3 минут.
6. Промывают водой и высушивают между листами фильтровальной бумаги.
Задание на дом: учебник С.А. Павлович «Медицинская микробиология»
Мн. 1997 стр. 26-34, повторить стр. 9-23
УО "МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ"
Методическая разработка практического занятия №2 для учащихся отделения «Лечебное дело» по дисциплине
«Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии».
Тема занятия: «Основы приготовления питательных сред. Техника посева микроорганизмов на питательные среды. Бактериологический метод исследования»
Составила преподаватель Якимова Л.М.
Минск 2007г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №3, №4
Тема занятия: «Основы приготовления питательных сред. Техника посева микроорганизмов на питательные среды. Бактериологический метод исследования»
Цели занятия: знакомство с классификацией питательных сред, этапами их приготовления, требованиями, предъявляемыми к ним.
Освоение техники посева микроорганизмов на питательные среды
Знакомство с бактериологическим методом исследования.
Самостоятельная работа:
1. Знакомство с классификацией питательных сред, этапами их приготовления, требованиями, предъявляемыми к ним.
2. Освоение техники посева на пластинчатые питательные среды петлей, шпателем, тампоном
3. Посев культур микроорганизмов из пробирки в пробирку с жидкими, полужидкими питательными средами, на скошенный МПА
4. Посев культуры микроорганизмов «газоном»
5. Знакомство с бактериологическим методом исследования
Методические указания:
Питательные среды предназначены для культивирования микроорганизмов. Требования, предъявляемые к питательным средам:
Среды должны быть:
Классификация питательных сред:
По происхождению:
По консистенции:
1. плотные; 2. жидкие; 3. полужидкие
Основой для приготовления плотных и полужидких сред являются жидкие, к которым добавляют уплотнители: желатин (используется и как уплотнитель, и усваивается микроорганизмами как питательное вещество), агар-агар (используется только как уплотнитель). При приготовлении плотных сред количество уплотнителя составляет 2-3%, а полужидких сред 0,2-0,5%.
По составу:
По назначению:
Этапы приготовления питательных сред: варка, определение рН, осветление, фильтрация, разлив, стерилизация, контроль готовых сред (включает в себя химический, биологический и контроль стерильности сред). Химический контроль предусматривает определение рН, количества NaCl, пептона, азота и др. Биологический контроль определяет ростовые свойства среды, контроль стерильности – отсутствие микроорганизмов в среде.
Техника посева микроорганизмов на питательные среды:
Все существующие методы посева преследуют одну цель: посеять материал так, чтобы из окружающей среды в него не попали посторонние микроорганизмы (в асептических условиях). Поэтому сеять надо быстро, но без резких движений, чтобы не усилить движение воздуха. Во время посева нельзя разговаривать. Посевы лучше проводить в боксе.
ПОСЕВ ИЗ ПРОБИРКИ В ПРОБИРКУ: Пробирку с посевным материалом и пробирку с питательной средой держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцем так, чтобы края пробирки были на одном уровне, а их основания находились поверх кисти. В правой руке, как перо держат бактериальную петлю. Петлю вертикально прожигают в пламени спиртовки. Пробки из пробирки вынимают правой рукой, зажимая их между мизинцем и ладонью. Извлекают пробки плавно, легкими винтовыми движениями, края пробирок сразу обжигают в пламени горелки. Прокаленную петлю вводят через пламя горелки в пробирку с посевным материалом, охлаждают и набирают небольшое количество посевного материала, осторожно перенося его в пробирку со средой.
При посеве на жидкую среду петлю с посевным материалом слегка погружают в жидкость и растирают посевной материал на стекле пробирки, после чего смывают его средой.
При посеве на скошенный агар материал растирают петлей на поверхности среды зигзагообразным движением снизу вверх, начиная от границы конденсационной воды.
Если посев производят в полужидкую среду, разлитую в пробирку столбиком (полужидкий агар, сахарный ряд), то петлей с посевным материалом делают прокол столбика среды до дна, производят так называемый посев уколом. После посева петлю извлекают из пробирки, обжигают и, проводя пробирки через пламя спиртовки, закрывают пробками.
ПЕРЕСЕВ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПЛАСТИНЧАТОЙ СРЕДЫ В ЧАШКЕ ПЕТРИ В СРЕДЫ, РАЗЛИТЫЕ В ПРОБИРКИ: Чашку с посевным материалом ставят перед собой крышкой кверху. Первым и вторым пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку, вводят под неё прокаленную петлю. Набрав посевной материал петлей из чашки закрывают крышку. В левую руку берут пробирку со средой. Посев производят так же, как с пробирки на пробирку. После посева чашку поворачивают вверх дном.
ПОСЕВ ШПАТЕЛЕМ НА ЧАШКИ ПЕТРИ С АГАРОМ: шпатель – это стеклянная или металлическая палочка или трубка, конец которой загнут в виде треугольника. Левой рукой слегка приоткрывают крышку, петлей или пипеткой наносят на поверхность среды посевной материал и тщательно втирают его круговыми движениями шпателя до тех пор, пока не перестанет свободно скользить по поверхности агара, левой рукой при этом придерживают крышку и одновременно вращают чашку. По окончании посева шпатель вынимают из чашки, закрывают крышку, стеклянный шпатель опускают в дез. раствор, а металлический прокалывают в пламени горелки. Засеянную чашку поворачивают вверх дном и помещают в термостат.
ПОСЕВ НА АГАРОВЫЕ СРЕДЫ ГАЗОНОМ: примерно 1 мл жидкой культуры микроорганизмов (если культура выращена на плотной питательной среде, её эмульгируют в физ. растворе или бульоне) наносят пипеткой на поверхность агара и тщательно распределяют жидкость по поверхности среды. Чашку слегка наклоняют и избыток посевного материла отсасывают пипеткой, выливая его в дезраствор. Туда же помещают пипетку.
ПОСЕВ НА АГАРОВЫЕ СРЕДЫ ТАМПОНОМ: тампон с посевным материалом вносят в слегка приоткрытую чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, вращая при этом тампон и чашку. Иногда посевной материал с тампона втирают на небольшой площадке питательной среды, а далее стерильной петлей рассевают его с площадки по оставшейся части среды зигзагообразными движениями.
ПОСЕВ НА АГАРОВЫЕ СРЕДЫ ПЕТЛЕЙ: небольшое количество посевного материала (иногда его предварительно эмульгируют в стерильном ИХН или бульоне) втирают петлей в поверхность среды у края чашки, несколько раз проводя петлей из стороны в сторону. Затем у того места, где закончились штрихи, агар прокалывают петлей, снимая избыток посевного материла. Оставшийся на петле посевной материал зигзагообразными движениями распределяют по всей поверхности среды. По окончании посева закрывают чашку и прожигают петлю.
Бактериологический метод исследования основан на выделении из исследуемого материала чистой культуры микроорганизмов, накоплении её, изучении её свойств (морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных) с целью последующей её идентификации. Чистая культура микроорганизмов – это популяция микроорганизмов одного вида, полученная из изолированной колонии. Изолированная колония – это потомство микроорганизмов, выросшее из одной микробной клетки.
Бактериологический метод включает 3 этапа исследования.
Цель 1 этапа – выделение из исследуемого материала чистой культуры микроорганизмов
Сущность 1 этапа: 1. приготовление мазка из исследуемого материала, окраска по Граму, микроскопия; 2. посев на пластинчатые питательные среды (метод механического разъединения) для выделения чистой культуры (либо биологический метод, либо использование устойчивости микроорганизмов к тем или иным факторам внешней среды).
Цель 2 этапа – накопление чистой культуры (биомассы)
Сущность 2 этапа: 1. характеристика изолированной колонии (форма, размер, поверхность, рельеф, контур края, структура, консистенция и цвет). Характер роста микроорганизмов на питательных средах называется культуральными свойствами.
Макроскопически в проходящем свете изучают а) форму колонии (правильная – круглая, овальная и неправильная – амебовидная, корневидная); б) размер (крупные 4-6 мм, средние 2-4 мм, мелкие 1-2 мм и точечные менее 1 мм); в) поверхность (гладкая или шероховатая, влажная или сухая, блестящая или матовая); г) рельеф (выпуклые, плоские, конусообразные, куполообразные, с центром приподнятым в виде соска и с валиком по периферии); д) цвет (неокрашенные и пигментированные). Микроскопически (с помощью лупы или микроскопа х8) изучают контур края (ровный и неровный – волнистый, зазубренный, эрозированный, бахромчатый), структуру (однородная, неоднородная, гиалиновая, зернистая и нитевидная)
Консистенцию колоний определяют посредством прикосновения бактериальной петлей (пастообразные, слизистые, волокнистые, хрупкие); 2. приготовление мазка из ½ части подозрительной колонии, окраска по Граму, микроскопия для изучения морфологических и тинкториальных свойств; 3. отсев оставшейся ½ части подозрительной колонии на среду накопления биомассы (скошенный МПА).
Цель 3 этапа – изучение свойств выделенной культуры с целью последующей идентификации.
Сущность 3 этапа: 1. проверка чистоты выделенной культуры – приготовление мазка, окраска по Граму, микроскопия (культура считается чистой, если в мазке обнаруживаются микроорганизмы одинаковой формы с одинаковым отношением к окраске по Граму); 2. изучение биохимических свойств: а) сахаролитических – способности ферментировать углеводы и многоатомные спирты (изучаются при посеве на сахарный ряд по изменению цвета среды и образованию пузырьков газа в толще среды); б) протеолитических – способности ферментировать белки ( изучается при посеве на желатин, молоко, сыворотку, путем обнаружения выделения H2S, индола, аммиака и др.); в) окислительно-восстановительных свойств (пробы на каталазу, оксидазу, редуцирующую способность); 3. изучение антигенных свойств путем постановки РА, РП и др. серологических реакций.
УО "МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ"
Методическая разработка практического занятия №3 для учащихся отделения «Лечебное дело» по дисциплине:
«Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии».
Тема занятия: «Стерилизация и дезинфекция»
Составила преподаватель Якимова Л.М.
Минск 2007г.
Практическая работа №5, №6
Тема занятия: «Стерилизация и дезинфекция»
Цели занятия: Познакомиться с основными принципами использования физических и химических факторов, оказывающих бактерицидное действие, устройством и режимами работы аппаратуры, предназначенной для стерилизации; научиться готовить посуду к стерилизации, проводить стерилизацию адекватными способами; освоить технику приготовления матричных и рабочих растворов дезинфектантов; закрепить навыки по технике дезинфекции рабочего места, рук, инструментария.
Самостоятельная работа:
знакомство с устройством и режимами работы аппаратуры, предназначенной для стерилизации
научиться готовить посуду к стерилизации
проведение стерилизации адекватными способами
освоение техники приготовления матричных и рабочих растворов дезинфектантов
закрепление навыков по технике дезинфекции рабочего места, рук, инструментария
Стерилизация – это совокупность физических и химических способов полного освобождения объектов внешней среды от вегетативных и покоящихся форм микроорганизмов. Таким образом, стерилизация – это обеспложивание, обеззараживание.
Стерилизующие агенты, аппараты для стерилизации и её способы разнообразны.
Стерилизацию проводят различными способами:
физические – воздействие высоких температур, УФО, аэроионов, ультразвука, гамма-лучей, бактериальных фильтров.
химические – использование различных дезинфектантов, антисептиков.
биологические – применение антибиотиков, бактериофагов, микробов-антагонистов.
Физические способы:
прокаливание в пламени горелки или фламбирование используется для стерилизации бактериальных петель, пинцетов, шпателей и других мелких предметов. Прокаливанием огня не пользуются для стерилизации предметов из горючих материалов, а также ножниц и скальпелей, т.к. последние тупятся.
стерилизация сухим жаром или горячим воздухом проводится в печах Пастера (сушильных, сухожаровых шкафах, электровоздушных стерилизаторах, аэростерилах). Шкафы снабжены терморегуляторами, обеспечивающими необходимую температуру. Для контроля температуры имеется термометр, вставленный в отверстие в верхней стенке шкафа. Этим методом стерилизуют в основном лабораторную посуду, предметы из стекла, различные наборы термостабильных инструментов, гидрофобные материалы (тальк, вазелин, масла), загружая их так, чтобы обеспечить равномерный прогрев стерилизуемого материала. Жидкости, предметы из резины и синтетических материалов стерилизовать сухим жаром нельзя, т.к. жидкости вскипают и разливаются, а резина и синтетические материалы плавятся.
Перед стерилизацией чашки Петри, пипетки заворачивают в плотную бумагу. По отраслевому стандарту стерилизация и дезинфекции изделий медицинского назначения (ост 42-21-2-85) режим стерилизации в сухожаровом шкафу при 1800С – экспозиция 1 час, при 1600С – экспозиция – 150 мин (2,5 часа). Временем стерилизации считается время от набора аппаратом необходимой Т. Контроль за работой сушильных шкафов производится:
1.с помощью максимальных термометров, которые закладывают на 3 уровня
2.с помощью химических реактивов, температура плавления которых приближается к Т, на режиме которой производится стерилизация (сахароза карамелизуется при температуре 1600). После стерилизации этим методом посуда в крафт бумаге может храниться 3 суток. Изделия, простерилизованные без упаковки, должны быть использованы непосредственно после стерилизации.
3. Стерилизация паром под давлением происходит в автоклаве. Этот способ стерилизации основан на воздействии на стерилизуемые объекты насыщенного водяного пара при давлениивыше атмосферного, в результате чего погибают как вегетативные, так и споровые микроорганизмы.
Автоклав – массивный котел, снаружи покрыт металлическим кожухом, герметически закрыт крышкой, которая плотно привинчивается к котлу откидывающимися болтами. В наружный котел вставлен другой (стерилизационная камера), меньшего размера, в который помещают предметы, подлежащие стерилизации. Между 2-мя камерами имеется пространство (водопаровая камера), куда через воронку наливают определенное количество дистиллированной воды. При кипячении воды в этой камере образуется пар, создающий повышенное давление, которое регистрируется манометром. Автоклав снабжен также электроконтактный манометр, который препятствует увеличению давление выше заданной величины. В автоклаве возможна стерилизация почти всех малогабаритных материалов. Для этого способа стерилизации характерны надёжность, доступность, экономичность, высокая степень автоматизации. В зависимости от вида стерилизуемых материалов температура пара в автоклаве устанавливается от 1100-1380С, давление от 40- 250П, экспозиция 15-60 минут.
Обезвреживание отработанного материала (чашки, пробирки с посевами) стерилизуют в специальных емкостях с отверстиями при 1320, - 200 П. 1 час. К работе с автоклавами допускаются лица, прошедшие специальное обучение.
Контроль за работой автоклава осуществляется разными способами:
- проверка температуры внутри автоклава а) с помощью максимальных термометров, заложенных на трёх разных уровнях. б) температура так же может быть проверена с помощью хим. веществ, имеющих определенную точку плавления: бензонафтол – 1100, антипирин – 1130, резорцин – и сера – 1190, бензойная кислота – 1200, мочевина – 1320, при достижении определенной температуры вещество плавится и переходит из порошкообразного состояния в жидкое.
- при втором способе проверяют качество работы автоклава, помещая внутрь споровый материал и выясняя затем стерилизующий эффект. Готовят специальные тесты, отрабатывая живыми споровыми культурами специальный материал, который помещается в автоклав и автоклавируется, а затем засевают тесты на питательные среды. Если после инкубации роста вокруг тестов нет, автоклав работает эффективно и достигается эффект стерилизации.
В лаборатории должно быть не меньше двух автоклавов для раздельной стерилизации – «чистого» и отработанного материала. Обязательно должны вестись журналы работы стерилизационной аппаратуры с отметками о качестве стерилизации.
Кипячение в воде, даже в натрия бикарбонате, не обеспечивает полного уничтожения микроорганизмов и поэтому не может быть отнесено с современных позиций к способам стерилизации.
4. Стерилизация УФ облучением производится с помощью бактерицидных ламп. УФ лучи вызывают гибель как вегетативных клеток, так и спор. Этот метод применим для стерилизации воздуха в операционных блоках, родильных залах, перевязочных, процедурных, детских учреждений, боксах в бактериологических лабораториях и инфекционных больницах. Каждая бактерицидная лампа имеет указанный в инструкции срок работы. Время эксплуатации не должно превышать этот срок, иначе работа лампы становится неэффективной.
5. Антибактериальное действие обнаружено и у аэроионов – больше у отрицательнозаряженных, менее – у несущих положительный заряд. Это используется для стерилизации воздуха с помощью ионизаторов (озонаторов).
6. Микробоцидное действие ультразвука применяется для консервации пищевых продуктов.
7. Высоким антимикробным действием обладает гамма-излучение. Однако, микробоцидные дозы его очень высоки (0,2 – 4,5 Мрад), что приводит к быстрому разрушению объекта и требует создания сложных и дорогих систем защиты обслуживающего персонала от радиации. Тем не менее, в заводских условиях гамма-излучения с успехом используют для стерилизации медицинских материалов, особенно одноразового пользования (шприцы, капельницы, эндопротезы).
8. Механическая стерилизация предусматривает фильтрование жидкостей через мелкопористые фильтры, пропускание воздуха через бактерицидные фильтры, «промывание» какого-либо помещения, пространства (например, бокса) ламинарным потоком стерильного воздуха.
Для стерилизации крупногабаритных объектов, предметов из термолабильных и разнородных материалов применяют химическую (холодную) стерилизацию. Различают газовый и погружной способы химической стерилизации. Предметы помещают в герметические контейнеры заполненные газообразным стерилизующим веществом – стерилизантом (формальдегид, окись этилена с углекислым газом), при повышении или снижении давления бактерицидный эффект этих газов усиливается. При погружном способе объект стерилизации погружается в раствор формалинэтил – алкоголя или формалин – изопропанол на 24 часа. Главный недостаток химических методов стерилизации – необходимость освобождения (отмывания) простерилизованного объекта от остатков стерилизующего вещества, во время которого возможно повторная контаминация объекта. Распространению этого способа препятствуют длительность стерилизации, высокая стоимость, возможность побочного действия на медперсонал и на больного. Тем не менее, для ряда сложных диагностических и лечебных аппаратов это единственно надежный способ стерилизации в современных условиях.
Дезинфекция – совокупность способов полного, частичного или селективного уничтожения потенциально патогенных для человека микроорганизмов на объектах внешней среды с целью разрыва путей передачи возбудителей инфекционных заболеваний от источников инфекции к восприимчивым людям.
Цель дезинфекции в очагах инфекционных заболеваний – селективное уничтожение возбудителя конкретной болезни, здесь дезинфицируются объекты, служащие фактором передачи возбудителя этой болезни. Выделяют два типа дезинфекции в очаге: а) текущая - проводится с целью снизить массивность микробной обсемененности и число обсемененных объектов, таким образом прервать или затормозить процесс передачи возбудителя. Текущей дезинфекции подлежат бельё, посуда, инструменты, приборы, воздух, сточные воды и др. Это многократная дезинфекция, проводится силами самого больного, его родственников либо медперсонала; б) заключительная - это полное уничтожение возбудителя болезни в помещении, где находился инфекционный больной, она проводиться после выписки больного, перевода его или смерти, а также временного закрытия больницы или отделения по эпидпоказаниям, эта дезинфекция однократная и проводится силами дезстанции.
Дезинфицирующие средства многообразны. Дезинфицирующий эффект может быть достигнут при сжигании объекта, прокаливании на пламени, воздействии ультразвука, горячего воздуха в сухожаровых камерах, проточного или концентрированного пара в паровых дезинфекционных камерах, кипячении в воде (особенно с ПАВ), УФО. Очистка, стирка, мытьё, протирание, проветривание, вытряхивание, выколачивыание и другие механические способы снижения микробной обсемененности также могут быть отнесены к дезинфицирующим мерам при оппортунистических инфекциях. Однако, в большинстве случаев для целей дезинфекции используют химические вещества – дезинфектанты. По механизму действия на микроорганизмы их разделяют на несколько групп: 1. денатурирующие (коагулирующие) белки – фенол, лизолы, соли тяжелых металлов, спирты, кислоты; 2. омыляющие (растворяющие) белки – щелочи; 3. окисляющие белки – хлорная известь, хлорамин, калия перманганат, пероксиды; 4. поверхностно-активные вещества (ПАВ), вызывающие повреждение клеточной стенки бактерий, - мыла, детергенты. В западной Европе для дезинфекции обычно применяют комплексные препараты, содержащие чаще всего четвертично-аммониевые соединения (ЧАС), альдегиды, алкоголи.
УО "МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ"
Методическая разработка практического занятия №4 для учащихся отделения «Лечебное дело» по дисциплине
«Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии».
Тема занятия: «Учение об иммунитете. Серологические реакции»
Составила преподаватель Якимова Л.М.
Минск 2007г.
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №7, №8
Тема занятия: «Учение об иммунитете. Серологические реакции»
Цели занятия: закрепить знания по вопросам иммунитета, познакомиться с механизмами и освоить методики постановки ориентировочной реакции агглютинации на стекsле, развернутой реакции агглютинации, реакции непрямой гемагглютинации, реакции кольцепреципитации, основного опыта реакции связывания комплемента, научиться учитывать результаты.
Самостоятельная работа:
Методические указания к практической работе:
Реакции между антителами и антигенами in vitro или серологические реакции широко используются в микробиологических и серологических лабораториях с самыми разнообразными целями:
а) серодиагностику проводят для определения природы антител в сыворотке больного с помощью диагностикумов, представляющих собой взвесь убитых или живых организмов. По результатам этих реакций судят о динамике накопления антител в процессе заболевания, о напряженности постинфекционного либо поствакцинального иммунитета.
б) сероидентификацию микробных культур проводят для определения их вида, серовара с помощью наборов специфических иммунных сывороток.
Каждая серологическая реакция характеризуется специфичностью и чувствительностью (способность антител или антигенов реагировать только с гомологичными антителами, содержащимися в сыворотке крови, либо с гомологичными антигенами соответственно)
В серологических реакциях участвуют антитела, принадлежащие главным образом к иммуноглобулинам класса IgG и IgM.
Реакции иммунитета бывают
Серодиагностика – самостоятельный метод диагностики инфекционных заболеваний. Его цель – обнаружение в сыворотке обследуемого антител и нарастание его титра. Известный компонент реакции – диагностикум (микробный, эритроцитарный, латексный). Диагностическое значение имеет не столько сам факт обнаружения антител, сколько нарастание их количества (для этого используют парные сыворотки, взятые в разные сроки болезни)
Иммуноиндикация – метод диагностики, имеющий целью обнаружение микробных (или иных) антигенов в исследуемом материале с помощью иммунных сывороток.
Реакция агглютинации (РА)
Агглютинация – склеивание и выпадение в осадок корпускулярных антигенов: (бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсорбированными на них антигенами) под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы:
РА применяют для обнаружения специфических антител в сыворотке крови больного и, наоборот, при помощи стандартной агглютинирующей сыворотки можно идентифицировать выделенные микроорганизмы.
Характер и скорость реакции зависят от антигенного строения бактериальной клетки. Мелкозернистую О-агглютинацию дают бактерии, лишенные жгутиков. О-агглютинация протекает медленно. При наличии Н-антигена реакция проявляется в образовании крупно-хлопьевидного осадка и протекает значительно быстрее.
Реакция агглютинации недостаточна специфична и чувствительна. Повысить специфичность
и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до её титра или половины титра. Титром сыворотки называется то её максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр сыворотки, тем достовернее результаты реакции. Существуют два метода постановки РА:
Ориентировочная РА на стекле:
На обезжиренное предметное стекло наносят две отдельные капли иммунной сыворотки и каплю физ. раствора. В одну из капель иммунной сыворотки и в каплю с физ. раствором бактериальной петлей вносят культуру испытуемого микроорганизма и тщательно перемешивают. При этом нельзя переносить культуру из капли с сывороткой в каплю с физ. раствором, которая является контролем антигена. Капля сыворотки, в которую ничего не вносили, является контролем сыворотки. Капля сыворотки, в которую внесена микробная культура, является опытной.
Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 минут. Учет реакции начинают с учета контролей: контроль антигена должен быть равномерно мутным, контроль сыворотки прозрачным.Если в опытной капле мы наблюдаем образование осадка в виде хлопьев на фоне просветления жидкости, то РА считается положительной, если же в опытной капле мы наблюдаем равномерное помутнение – РА отрицательна.
Методика постановки развернутой РА
|
№ пробирок ингредиенты |
ОПЫТ |
КС |
КА |
||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
|
ИХН |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
|
Сыворотка больного 1:50 (1:100) |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
1 мл |
_ |
|
Разведение сыворотки |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
1:1600 |
1:100 |
_ |
|
Диагностикум |
2 к |
2 к |
2 к |
2 к |
2 к |
_ |
2 к |
Учет результатов: КС (№6) – прозрачен, КА (№7) – легкая опалесценция.
При отрицательном результате в опытных пробирках – легкая опалесценция, при положительном результате – осадок из хлопьев и прозрачная надосадочная жидкость. В результатах реакции обязательно отмечают титр РА.
Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА, РПГА)
Это реакция, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на клетках и частицах. В качестве сорбентов чаще всего применяют эритроциты различных животных, частицы целлюлозы, бентонита или латекса. В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, т.е. адсорбируют на эритроцитах или иных частицах не антигены, а антитела. Антигены, адсорбированные на эритроцитах, называются эритроцитарными диагностикумами. При соответствии антигенов эритроцитарных диагностикумов антителам в сыворотке больного (положительный результат) происходит склеивание эритроцитарных диагностикумов под действием антител и образования гемагглютината («зонтик»). При отрицательном результате эритроцитарные диагностикумы не склеиваются, а оседают на дно лунки в виде «пуговки».
Методика постановки РНГА.
|
№ проб ингре- диенты |
опытные |
контрольные |
||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
|
ИХН |
0,5 мл |
0,5 мл |
0,5 мл |
0,5 мл |
0,5 мл |
0,5 мл |
0,5 мл |
0,5 мл |
0,5 мл |
0,5 мл |
- |
- |
|
Сыворотка больного 1:50 |
0,5 мл
→ |
0,5 мл
→ |
0,5 мл
→ |
0,5 мл
→ |
0,5 мл
→ |
0,5 мл → |
0,5 мл
→ |
0,5 мл
→ |
0,5 мл
↓ |
0,5 мл
↓ |
||
|
Разведение сыворотки |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
1:1600 |
1:3200 |
1:6400 |
1:12800 |
1:25600 |
1:100 |
||
|
Заведомо положитель- ная сыворотка |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
0,5 мл |
- |
|
Нормальная сыворотка |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
0,5 мл |
|
Эритроцитар-ный диагно- стикум |
0,25 мл |
0,25 мл |
0,25 мл |
0,25 мл |
0,25 мл |
0,25 мл |
0,25 мл |
0,25 мл |
0,25 мл |
- |
0,25 мл |
0,25 мл |
|
Нормальн.Еr. |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
0,25 |
- |
- |
Учет результатов РНГА: контрольные лунки – 10-я лунка – «пуговка», 11-я лунка – «зонтик», 12-я лунка – «пуговка». Опытные лунки: а) отрицательный результат – «пуговки», б) положительный результат – «зонтики». Титр РНГА – максимальное разведение сыворотки, при котором еще образуется «зонтик».
Реакция связывания комплемента (РСК)
РСК широко используется для лабораторной диагностики венерических болезней, риккетсиозов, вирусных инфекций. Реакция протекает в две фазы: Первая фаза – взаимодействие антигена и антител при обязательном присутствии комплемента, вторая фаза – выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе АТ+АГ, то гемолиз эритроцитов не наступает.
Ввиду сложности реакции все компоненты участвуют в ней, должны быть оттитрованы и взяты в реакцию в равных объемах.
СХЕМА ОСНОВНОГО ОПЫТА РСК.
|
№ пробирки ингредиенты |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
Опыт |
Контроль |
||||||
|
Сыворотки |
Антигена |
Гемолит. системы |
Комплемента в дозе |
||||
|
1/2 |
1 |
2 |
|||||
|
1 фаза Изотонический р-р хлорида натрия |
___ |
0,5 |
0,5 |
1,5 |
1,25 |
1,0 |
0,5 |
|
Испытуемая сыворотка 1:10 |
0,5 |
0,5 |
___ |
___ |
___ |
___ |
___ |
|
Антиген, рабочая доза |
0,5 |
___ |
0,5 |
___ |
___ |
___ |
___ |
|
Комплемент, рабочая доза |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
___ |
0,25 |
0,5 |
1,0 |
|
Инкубация при 370 С 1 час или при 40 С 18 часов |
|||||||
|
II фаза Гемолитическая |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
|
Инкубация при 370С 30-60 мин. до полного гемолиза в пробирках № 2, 3, 6 и 7 |
|||||||
|
Результат |
+ или - |
- |
- |
+ |
+ или- |
- |
- |
ПРИМЕЧАНИЕ: «+» - нет гемолиза
«-» - гемолиз
Реакция преципитации (РП)
Сущность данной реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена, находящегося в дисперсном коллоидном состоянии, воздействием специфических антител в растворе электролита.
Реакция преципитации является высокочувствительным тестом, так как позволяет обнаружить малые количества антигена или гаптена. Высокая чувствительность РП позволяет использовать её для выявления антигенов с помощью известных иммунных сывороток. В одном из вариантов последовательные разведения антигена наслаивают на стандартное разведение диагностической сыворотки в пробирках, при этом осадок образуется в виде кольца на грани двух сред (кольцепреципитация). Реакцию оценивают по максимальному разведению антигена, при котором наблюдается кольцо преципитации визуально. Важным условием образования нерастворимого компонента АТ+АГ является полная прозрачность жидкостей и эквивалентное соотношение ингредиентов, т.к. образующийся комплекс растворяется в избытке антитела или антигена.
РП применяется в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белков, в частности кровяных пятен, спермы и т.д. С помощью этой реакции в санитарной практике определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий. Методика постановки реакции кольцепреципитации: в первые четыре преципитационные пробирки вносят по 0,3 мл (6 капель) иммунной преципитирующей сыворотки, а в пятую – 0,3 мл нормальной сыворотки. Затем на сыворотку наслаивают по 0,3 мл соответствующего антигена: в первую и пятую пробирки – исследуемый антиген, во вторую – антиген, одноименный преципитирующей сыворотке, в третью – чужеродный антиген и в четвертую – ИХН. Учет результатов начинают с учета контролей: во второй пробирке на границе двух жидкостей всегда будет наличие молочно-мутного кольца, в третьей, четвертой, пятой – кольцо отсутствует. В первой (опытной) пробирке при положительном результате молочно-мутное кольцо, при отрицательном – кольцо отсутствует.
Задание на дом: учебник С.А. Павлович «Медицинская микробиология» 1997.
Страницы 81-85
УО "МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ КОЛЛЕДЖ"
Методическая разработка практического занятия №6 для учащихся отделения «Лечебное дело» по дисциплине:
«Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии».
Тема занятия: «Патогенные кокки, правила забора исследуемого материала, методы микробиологической диагностики»
Составила преподаватель Якимова Л.М.
wМинск 2007г.
Тема занятия: «Патогенные кокки, правила забора исследуемого материала, методы микробиологической диагностики»
Цели занятия: познакомиться с правилами забора и транспортировки в баклабораторию исследуемого материала при инфекциях, вызванных патогенными кокками, и методами микробиологической диагностики; освоить навыки по оформлению направления на исследование; научиться забирать слизистое отделяемое из зева с помощью ватного тампона и производить посев его на питательные среды, изучать культуральные свойства патогенных кокков на питательных средах; познакомиться с морфологией представителей группы патогенных кокков, освоить методику постановки реакции плазмокоагуляции
Самостоятельная работа:
знакомство с правилами забора и транспортировки в баклабораторию исследуемого материала при инфекциях, вызванных патогенными кокками, и методами микробиологической диагностики
освоение навыков по оформлению направления на исследование
освоение техники забора слизистого отделяемого из зева с помощью ватного тампона и посева его на питательные среды (ЖСА, КА)
изучение культуральных свойств патогенных кокков на питательных средах
приготовление препаратов из чистой культуры стафилококка и из гноя, окраска их простым методом и по Граму.
постановка реакции плазмокоагуляции
7. знакомство с морфологией представителей группы патогенных кокков путем микро
скопии музейных препаратов
8. дезинфекция рабочего места и рук
Методические указания.
Материал для бактериологического исследования определяется клиническим проявлением гнойно-воспалительного заболевания. Это может быть раневое отделяемое, гной, мокрота, содержимое абсцесса, спинномозговая жидкость, кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, остатки пищи. Правильность взятия материала для бактериологического исследования определяет эффективность работы баклаборатории. Забор материала осуществляют до начала антибиотикотерапии, исключая контакт с дезинфицирующими средствами и контаминацию микроорганизмами из смежных частей тела, слизистых и окружающей среды.
Правила забора материала при заболеваниях, вызванных патогенными кокками:
1. Кровь на стерильность: кожу над пунктируемой веной обрабатывают 70% спиртом, затем 5% настойкой йода, затем снова 70% спиртом. Взятие крови проводят стерильным шприцем в упаковке (нельзя пользоваться шприцем со стерильных лотков и нельзя проверять проходимость иглы воздухом) в количестве 10 мл у взрослых и 5 мл у детей. Кровь у постели больного над пламенем спиртовки засевают на питательную среду в соотношении 1:10 (стерильный флакон, содержащий 100 мл сахарного бульона или на двухфазную питательную среду, содержащую сахарный бульон и мясопептонный агар) по методу Кастанеда. Содержимое флакона перемешивают и немедленно доставляют в баклабораторию.
2. Мазок из зева на микрофлору: больного усаживают на стул против света и предлагают широко раскрыть рот. Корень языка придавливают шпателем, который вводят в рот обследуемого левой рукой, так чтобы введенный конец был несколько ниже того, за который его держат. Язык стараются придавить книзу и придвинуть кпереди, чтобы лучше осмотреть зев. Тампон в полость рта вводят правой рукой и снимают налет и слизь с миндалин, дужек мягкого неба и задней стенки глотки, не касаясь языка и слизистой оболочки внутренней поверхности щек. Тампон поместить в пробирку и доставить в баклабораторию.
3. Мазок из носа патогенный стафилококк: забор материала производят стерильным ватным тампоном из глубины носовых ходов одним тампоном из обеих половин носа. Тампон помещают в пробирку и доставляют в баклабораторию.
4. Мокрота на микрофлору: утреннюю мокроту, выделившуюся при кашле, собирают в стерильную посуду. Перед откашливанием больной чистит зубы и прополаскивает рот кипяченой водой. Больному следует объяснить, чтобы он собирал мокроту, а не слюну. Материал доставляют в баклабораторию в течение часа от момента забора материала.
5. Рвотные массы и промывные воды желудка: в количестве 50-100 мл собирают в стерильную широкогорлую банку, отверстие её закрывают вощаной бумагой, обвязывают ниткой и доставляют в баклабораторию.
6. Экссудаты и транссудаты (плевральная, асцитическая жидкости и др. выпоты) материал собирают в стерильную посуду с антикоагулянтом и немедленно доставляют в баклабораторию.
7. Моча на бактериурию: после тщательного туалета наружных половых органов собирают среднюю порцию утренней мочи в количестве 50 мл в стерильную посуду и доставляют в баклабораторию в течение часа от момента забора материала.
8. Отделяемое ран на микрофлору: взятие материала производит врач с соблюдением правил асептики и антисептики. Кожу вокруг раны обрабатывают 70% спиртом, некротические массы, гной, детрит удаляют стерильной салфеткой. Материал забирают стерильным тампоном и помещают в стерильную пробирку. Доставляют в баклабораторию в течение 1 часа от момента забора материала.
9. Спинномозговая жидкость на менингококк: взятие спинномозговой жидкости производит врач. Свежевзятый ликвор из шприца без иглы над пламенем спиртовки помещают в стерильную пробирку. Материал немедленно доставляют в баклабораторию в специальном контейнере, избегая охлаждения (в термосе или на грелке с температурой 37 С)
10. Слизь из носоглотки на менингококк: забор материала производят с задней стенки носоглотки натощак или через 2-4 часа после еды стерильным ватным тампоном, укрепленным на легко гнущейся алюминиевой проволоке. Перед употреблением конец проволоки на 2-3 см от края сгибают о край пробирки под тупым углом (1350) в широко раскрытый рот больного вводят сначала шпатель, прижимая язык книзу, а затем тампон. Тампон вводят концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2-3 раза по задней стенке. При извлечении тампон не должен касаться зубов, слизистых щек, языка. Материал может быть засеян на месте его взятия на питательную среду в чашке Петри или погружен в пробирку с транспортной средой или средой обогащения, или взят увлажненным тампоном. Материал доставляют в баклабораторию немедленно, в специальном контейнере, избегая охлаждения.
11. Отделяемое половых органов на гонококк: материал получают из уретры до мочеиспускания (у мужчин), из влагалища и канала шейки матки у женщин. Головку полового члена очищают стерильным ватным тампоном, смоченным в физ. растворе, затем просушивают стерильным ватным тампоном. Материал берут петлей или ложкой Фолькмана и сразу засевают в пробирку с питательной средой для культивирования гонококка. Доставляют в баклабораторию немедленно, избегая охлаждения (либо помещают в эксикатор с горящей свечей и в термостат – при заборе материала в женской консультации).
Патологический материал, направляемый в лабораторию для бактериологического исследования, должен иметь направление содержащее следующие сведения:
фамилия, имя, отчество и возраст больного
день заболевания. Температура тела
предполагаемый на основании клинических данных диагноз или повод для исследования (по эпидпоказаниям, предполагаемое бактерионосительство)
наименование объекта, направляемого на бакисследование (кал, кровь, мокрота). При консервировании материала указать, какой консервант употреблен, время забора материала
цель исследования
наименование учреждения и фамилия врача, направляющего материал на исследование
Для диагностики гнойно-воспалительных заболеваний используют бактериоскопический и бактериологический методы. Учитывая результаты первичной микроскопии, исследуемый материал засевают на соответствующие среды (сахарный бульон, кровяной агар, ЖСА, шоколадный агар, сывороточный агар с ристомицином, среду для гонококков). Выделенную чистую культуру идентифицируют до рода и вида, определяют антибиотикограмму, а у стафилококков ещё определяют продукцию ферментов агрессии и защиты.
Схема бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях:
1-ый день исследования. Материал:
гной, спинномозговая жидкость – первичная микроскопия обязательна:
мокрота – первичная микроскопия проводится только из разведений в физ. растворе 10-4 - 10-5, высев делают из исходной взвеси бактерий
кровь – первичная микроскопия не проводится, непосредственно у постели больного кровь засевают на двухфазную среду в соотношении 1:10
моча – первичная микроскопия не проводится, высев чаще делают на МПА, кровяной агар и среду Эндо
мазок из зева – первичная микроскопия не проводится, а высев чаще делают на кровяной агар и ЖСА.
Исходя из результатов первичной микроскопии гноя, спинномозговой жидкости, посевов крови в сахарных бульон (через 24 часа культивирования), исследуемым материал засевают на соответствующие среды: стрептококки на кровяной агар, стафилококки на желточно-солевой агар, грамотрицательные бактерии (представители семейств Enterоbacteriaceae, Pseudomonadaceae) – на среду Эндо для выделения чистой культуры возбудителя.
2-ой день исследования. 1. Проводят учет роста колоний на питательных средах (изучают культуральные свойства). 2. Определяют морфологические и тинкториальные свойства путем микроскопии мазка из подозрительной колонии, окрашенного по Граму. 3. Осуществляют посев подозрительной колонии на скошенный агар для накопления чистой культуры. Колонии с кровяного агара (по результатам микроскопии), содержащие стрептококк, для накопления пересевают в сахарный бульон.
3-ий день исследования. Определение оксидазной активности, подвижности бактерий. Постановка биохимических тестов для родовой и видовой идентификации накопленной чистой культурой.
4-ый день исследования. Окончательная идентификация культур на основании результатов биохимических тестов. Учет чувствительности к антибиотикам. Фаготипирование Staph. aureus. Сероидентификация культур грамотрицательных палочек.
Этиологическую значимость условно-патогенных бактерий оценивают с учетом соответствующих критериев.
Методика постановки пробы на плазмокоагулазу:
В три преципитационные пробирки вносят по 0,3-0,5 мл цитратной плазмы кролика, разведенной ИХН в соотношении 1:4. Затем бактериальной петлей в первую пробирку (опыт) добавляют петлю исследуемой культуры, во вторую – петлю культуры коагулазоположительного стафилококка (вторая и третья пробирки – контрольные). Пробирки помещают в термостат при t 370С. Учет реакции производят через 2-3 ч. При отсутствии свертывания плазмы посевы оставляют при комнатной температуре на 24 ч., после чего учитывают реакцию: во второй пробирке плазма свертывается (не выливается из перевернутой пробирки), в третьей пробирке плазма не свертывается (выливается), в первой (опытной) пробирке – плазма свертывается при наличии у исследуемого стафилококка фермента плазмокоагулазы (РКП+) и не свертывается при отсутствии этого фермента (РКП-).