Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Подготовка стекол
Мазки крови делают на предметных стеклах с помощью более узкого шлифованного предметного стекла.
Подготовка стекол.
1. С предметных стекол, бывших в употреблении и соприкасавшихся с иммерсионным маслом, последнее удаляют сухой тряпкой или бензином. Затем стекла кипятят без мыла и соды в течение 15—20 мин, промывают чистой водой и погружают на 1 ч в насыщенный раствор двухромовокислого калия в серной кислоте. Обработанные таким образом стекла промывают в течение не менее 1 ч под струей водопроводной воды и насухо вытирают чистым поло тенцем.
2. При отсутствии двухромовокислого калия и серной кислоты стекла, бывшие в употреблении, кладут в мыльный раствор и выдерживают в нем 8—10 ч, а затем в том же растворе кипятят их 5—10 мин.
От более длительного кипячения стекла делаются мутными.
После кипячения стекла вынимают и тщательно промывают под струей водопроводной воды, а затем насухо вытирают.
3. Стекла, не бывшие в употреблении, промывают в горячей воде и насухо вытирают. Хранят стекла в стеклянной широкогорлой банке с крышкой.
Приготовление мазков.
Взяв предметное стекло за длинные края, прикасаются его поверхностью (отступя 0,5—1 см от узкого края) к капле крови (но не к коже). Предметное стекло держат на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставляют шлифованное стекло узким краем к стеклу с кровью слева от капли под углом 45° и продвигают его вправо до соприкосновения с кровью.
Выжидают, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением ведут его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерена так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1—1,5 см до его края. Нельзя прекращать размазывание и отнимать стекло раньше, чем капля будет исчерпана. Нельзя также сильно нажимать на стекло, так как многие клетки могут оказаться поврежденными. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается «метелочкой».
Густо-розовые и красноватые мазки непригодны для счета, так как они слишком толсты и клеточные элементы при этом дифференцировать невозможно. После приготовления мазки быстро сушат на воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток.
На высушенном мазке уголком предметного стекла или карандашом (только не химическим) пишут фамилию, инициалы больного, дату.
Фиксация мазков.
Принцип.
Обработка мазков фиксирующими жидкостями, придающими форменным элементам стойкость по отношению к содержащейся в красках воде, которая без фиксации мазков гемолизирует эритроциты и изменяет строение лейкоцитов. Кроме того, фиксация, вызывая коагуляцию белка, прикрепляет препарат к стеклу.
Посуда и аппаратура.
1. Пинцет.
2. Специальная посуда для фиксации или стаканы, обрезанные до высоты 6—6,5 см.
3. Штатив для сушки мазков на воздухе.
4. Предметные стекла.
Реактивы.
Химически чистый метиловый спирт (метанол) или 96° этиловый спирт, или денатурированный спирт, или смесь Никифорова, состоящая из равных количеств этилового спирта и серного эфира.
Лучшим фиксатором является метиловый спирт.
Методика.
Высохшие на воздухе мазки крови, сложенные попарно (мазками наружу), опускают пинцетом в специальную посуду для фиксации или в обыкновенные стеклянные стаканы, обрезанные до 6—6,5 см и наполненные до определенной высоты фиксирующей жидкостью. В последнем случае для обеспечения свободного соприкосновения намазанных сторон препаратов с фиксатором сверху, между попарно сложенными мазками, прокладывают предметные стекла, опирающиеся своими ребрами на верхнюю часть стакана. В метиловом спирте мазки выдерживают не менее 5 мин, а в этиловом и денатурированном спирте и смеси Никифорова — не менее 30 мин.
По окончании срока фиксации препараты вынимают пинцетом, сушат на воздухе или ополаскивают в банке с нейтрализованной дистиллированной водой и укладывают мазками кверху на стеклянный мостик для окраски.
|
Техника проведения окраски
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
Для окраски по Граму чаще используют анилиновые красители трифенилметановой группы: генциановый,метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.
Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Подготовка материала для окраски
Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.
Фиксация
При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
Физический способ фиксации
Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.
Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80 °С).
Химический способ фиксации
Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %), спирт-формол (40% формалин 5 мл, этиловый спирт 96° - 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40% формалина в течение нескольких секунд.
Процесс окрашивания мазков