Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
?
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
НІКІТСЬКИЙ БОТАНІЧНИЙ САД –НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР
Людмила Львівна
УДК 577.114:633:57.086.83
РІСТРЕГУЛЮЮЧИЙ ТА ЕЛІСІТОРНИЙ ВПЛИВ ФУКОЗОВМІСНИХ ОЛІГОСАХАРИНІВ НА РОСЛИННІ ОБ'ЄКТИ В УМОВАХ IN VITRO
03.00.20 –біотехнологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Ялта –
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у лабораторії біотехнології Херсонського державного педагогічного університету Міністерства освіти і науки України.
Науковий керівник –доктор біологічних наук, старший науковий співробітник,
Горбатенко Ігор Юрійович,
Херсонський державний педагогічний університет,
завідувач міжвідомчої лабораторії біотехнології
Офіційні опоненти –доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Митрофанова Ольга Володимирівна,
Нікітський ботанічний сад - Національний
науковий центр УААН,
завідувач відділу біотехнології і вірусології рослин
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Кравець Володимир Степанович,
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
завідувач відділу фізіології стійкості рослин,
заступник директора
Провідна установа –
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,
відділ молекулярної генетики
Захист відбудеться “ ” __травня_______2002 р. о “ ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 у Нікітському ботанічному саду - Національному науковому центрі УААН за адресою: 98648, Автономна Республіка Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр УААН, Україна.
Факс: (0654) 33-53-86,
E-mail:nbs1812@ukr.net
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці НБС-ННЦ за адресою: 98648, Автономна Республіка Крим, м. Ялта, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр, Україна.
Автореферат розіслано “ ”__квітня______ 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Садогурський С.Ю.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи. Сучасна біотехнологія сформувалась на базі молекулярної біології, клітинної і генетичної інженерії та при широкому використанні методів біоорганічної хімії, фізіології та інших наук (Герасименко, 1989). Одним з головних завдань біотехнології рослин є одержання та клональне мікророзмноження нових високопродуктивних сортів рослин. Головним методом вирішення цієї проблеми є культура тканин і клітин in vitro. Для інтенсифікації клонального мікророзмноження можна використовувати речовини, які прискорюють і регулюють окремі етапи онтогенезу і підвищують стійкість рослинних об'єктів до біотичних та абіотичних факторів. До таких сполук можна віднести олігосахарини –речовини ендогенного походження, що мають досить високу біологічну активність при дуже низьких концентраціях і не акумулюються рослинами (Ayers et al.,1976; Albersheim et al., 1983; 1992).
Олігосахарини (біологічно активні олігосахариди) –це клас специфічних вуглеводних молекул, які здатні змінювати метаболізм рослинних клітин і організму в цілому, що допомагає йому адаптуватися до змін навколишнього середовища (Леонтьева и др., 1993). У рослинах олігосахарини виконують роль сигнальних молекул у процесах міжклітинних комунікацій (Mohnen, Hahn, 1993; Vargas-Rechia et al., 1998; та інші), стимулюють їхній ріст та розвиток (Aldington, Fry, 1993; Creelman, Mullet, 1997; та інші), індукують велику кількість захисних реакцій проти фітопатогенів (Barber et al., 1989; Felix et al., 1993; Stratmann et al., 2000; та інші). Більшість олігосахаринів мають антиауксинову дію (York et al., 1984; Augur et al., 1992; Павлова, 1995; та інші). Проте механізми їх дії практично не досліджені.
Для з’ясування шляхів взаємодії молекул олігосахаринів з рецепторами плазмалеми необхідно встановити вплив їхнього моносахаридного складу і просторової будови на біологічну активність. Для вирішення цієї проблеми велике значення має вивчення природних олігосахаринів різного походження. Олігосахарини рослинного і грибного походження останні двадцять років дуже активно досліджуються вченими усього світу (Albersheim et al., 1983; 1992; Schweizer et al., 1996; Umemoto et al., 1997; та інші). Недослідженими залишаються олігосахарини з жіночого молока, у якому їх міститься декілька десятків. Їх розділяють на дві групи: фукозовмісні та олігосахарини, що мають у своєму складі сиалову кислоту (Химия биологически активных природных соединений, 1976). Застосування методів біотехнології дає змогу досліджувати сигнальну активність олігосахаринів на тканинному та клітинному рівнях в умовах in vitro.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано на базі лабораторії біотехнології Херсонського державного педагогічного університету в період з 1997 р. по 2001 р. Тема дисертації тісно пов'язана з державною науковою темою "Застосування природних біологічно активних речовин з елісіторною та рістрегулюючою дією для стимулювання росту рослин і підвищення їхнього імунітету", реєстраційний номер 0199U002722.
Мета і завдання роботи. Метою дослідження є вивчення рістрегулюючого та елісіторного впливу фукозовмісних олігосахаринів на рослинні об'єкти в умовах in vitro.
Для досягнення мети поставлено такі завдання:
Об'єкт досліджень – фукозовмісні олігосахарини і їхня біологічна активність у рослинах.
Предмет досліджень – рістрегулюючий і елісіторний вплив фукозовмісних олігосахаринів на рослинні об'єкти в умовах in vitro.
Методи досліджень. Використовували загальноприйняті в біотехнології методи культури тканин, вирощування асептичних проростків в умовах in vitro і стерилізації рослинного матеріалу (Бутенко, 1964; Калинин и др., 1980; Митрофанова и др., 1997; та інші), біотести (Павлова, 1995; Hahn, 1981; 1992; та інші).
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначено біологічну активність фукозовмісних олігосахаринів та їхній вплив на рослинні об'єкти в умовах in vitro. Установлено, що вони стимулюють проростання насіння, розвиток проростків однодольних і дводольних рослин, процеси регенерації, калюсоутворення і ризогенезу в експлантів томата. З’ясовано їхню регуляторну та сигнальну дію на амілолітичну активність алейронового шару ендосперму ячменю, а також ефект синергізму в біотестах з ауксинами. Вперше показано антистресову активність олігосахаринів в умовах сольового стресу та стресу, викликаного йонами Купруму. Встановлено, що фукозовмісні олігосахарини виявляють елісіторні властивості в рослинних організмах. Проведено паралелі між хімічною будовою і біологічною активністю олігосахаринів тваринного, рослинного і грибного походження.
Практичне значення одержаних результатів. Проведені дослідження дають змогу розширити знання про вплив моносахаридного складу і будови олігосахаринів на їхню біологічну активність, що сприятиме вивченню механізму їхньої дії в рослинних організмах, процесу передачі сигналу при міжклітинній взаємодії і при взаємозв’язку рослин із навколишнім середовищем. Одержані результати дозволяють рекомендувати використання олігосахаринів як регуляторів росту в біотехнологічних, генетичних, біохімічних і фізіологічних дослідженнях, а також як речовини, які мають фітогормональну активність, при складанні живильних середовищ для клонального мікророзмноження. Крім цього, олігосахарини можна використовувати для підвищення імунітету цінних рослинних об'єктів.
Результати дисертаційного дослідження включено в лекційні і практичні курси "Основи сучасного хімічного виробництва і біотехнології", "Біохімія" і "Оргбіохімія" для студентів психолого-природничого факультету Херсонського державного педагогічного університету.
Особистий внесок здобувача. Вивчення рістрегулюючого та елісіторного впливу фукозовмісних олігосахаринів на рослинні об'єкти в умовах in vitro проведено автором самостійно. Дисертант оволодів методиками культивування рослинних об'єктів in vitro та проведення біотестів. Проведено аналіз 206 літературних джерел, з них 162 англійською мовою. Встановлено біологічну активність одинадцяти олігосахаринів у різних біологічних процесах. Зроблено математичну обробку одержаних результатів. Проаналізовано вплив моносахаридного складу та просторової будови фукозовмісних олігосахаринів на їхню біологічну активність. Дано порівняльну оцінку біологічної активності олігосахаринів тваринного, рослинного та грибного походження. Результати досліджень відображено в публікаціях та дисертації.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на: науково-методичних семінарах кафедри хімії Херсонського державного педагогічного університету (Херсон, 1998-2001); Міжнародному регіональному семінарі ”Environment protection: Modern Studies in Ecology and Microbiology” (Ужгород, 1997); 11-ому Конгресі Федерації Європейського товариства Фізіологів рослин (Варна, 1998); Конференції молодих вчених ”Актуальні питання ботаніки та екології” (Херсон, 1998); Міжнародній конференції ”Проблеми екологічної стабільності Східних Карпат” (Синевір, 1999); Міжнародній конференції ”Фальцфейнівські читання” (Херсон, 2001); Всеукраїнській конференції молодих вчених ”Актуальные вопросы современного естествознания” (Сімферополь, 2001); Міжнародному симпозіумі ”Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems” (Київ, 2001); Міжнародній конференції молодих вчених з молекулярної біології та генетики (Київ, 2001).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових робіт: 7 статей (3 з них у виданнях, затверджених ВАК України як спеціалізовані за біологічним напрямком) та 5 тез.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, шести розділів, висновків, списку використаних джерел, практичних рекомендацій та додатків. Загальний обсяг дисертаційної роботи становить 171 сторінку машинописного тексту, з них 119 сторінок основного тексту. Робота містить 22 рисунка, 44 таблиці, 3 додатки (27 сторінок). Бібліографія роботи налічує 206 літературних джерел, з них 162 –іноземною мовою.
ЛІТЕРАТУРНИЙ ОГЛЯД
Ряд вчених (Creelman and Mullet, 1997; Рудишин, 1998) відносять олігосахарини до одного з нетрадиційних класів фітогормонів. Проте, механізми впливу цих речовин на рослинні організми практично не досліджені. Рослинні олігосахарини стимулюють калюсо- та ризогенез (Павлова, 1995), впливають на ріст та розвиток рослин (Mohnen, Hahn, 1993), взаємодіють з іншими фітогормонами (York et al., 1984; 1993; Augur et al., 1992; 1995; та інші) і здатні індукувати процеси регенерації у рослин (Eberhard et al., 1989; Павлова, 1995; та інші).
У рослинах олігосахарини виконують роль молекул-посередників у процесах міжклітинних комунікацій, стимулюють ріст та розвиток (Albersheim et al., 1983; 1992; Павлова, 1995; та інші), захисну реакцію рослин, тобто виявляють елісіторну дію, включаючи накопичення фітоалексинів (Yamaguchi et al., 2000; та інші) та інгібіторів протеїназ (Thain et al., 1990; та інші), індукцію глюканаз та хітиназ, відкладення лігнінів (Barber et al., 1989), підвищення рН живильного середовища (Felix et al., 1993; та інші) і біосинтезу етилену, крім того, вони сприяють утворенню НО, а також викликають некрози та реакцію гіперчутливості (Slovacova et al., 1994; та інші).
Олігосахарини класифікують на декілька груп, залежно від джерела походження: β-глюканові, пектинові, ксилоглюканові, хітозани, ліпополісахариди, глікопротеїни, олігосахарини з жіночого молока та штучно синтезовані. Молоко ссавців містить у своєму складі кілька десятків олігосахаринів. Деякі з них відносяться до антигенів системи крові Lewis (Химия биологически активных природных соединений, 1976). На поверхні рослинних клітин у багатьох видів рослин знайдено N-глікани, до складу яких входить Lewis-а антиген (він міститься в жіночому молоці), що може бути пов'язано з міжклітинною взаємодією (Fitchette-Laine et al., 1997; Wilson et al., 2001). Це дає змогу припустити, що інші олігосахарини з жіночого молока також будуть мати біологічну активність у рослинних організмах.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Фукозовмісні олігосахарини з жіночого молока отримано в Інституті елемент-органічних сполук РАН.
Формули фукозовмісних сполук:
FG –фукозилгалактоза α-Fuc-(1→2)-β-Gal;
FGN –N-ацетилфукозилглюкозамін α-Fuc-(1→6)-β-GlcNAc;
DFL –дифукозиллактоза α-Fuc-(1→2)-β-Gal-(1→4)-β-Glc-(3→1)-α-Fuc;
FGGn-ol –фукогалактозилгалакто-N-ол α-Fuc-(1→2)-β-Gal-(1→3)-GalNAc-ol;
LNFP 1 –лакто-N-фукопентаоза 1
α-Fuc-(1→2)-β-Gal-(1→3)-β-GlcNAc-(1→3)-β-Gal-(1→4)Glc;
LNFP 2 –лакто-N-фукопентаоза-2 –Lewis-а пентасахарид
β-Gal-(1→3)[α-Fuc-(1→4)]β-GlcNAc-(1→3)-β-Gal-(1→4)Glc;
LNFP 3 –лакто-N-фукопентаоза-3 –Lewis-х пентасахарид
β-Gal-(1→3)-β-GlcNAc-(1→3)[α-Fuc-(1→3)]β-Gal-(1→4)Glc ;
LNDFH 1 –лакто-N-дифукозилгексаоза 1 –Lewis-b гексасахарид
α-Fuc(1→2)Gal-β(1→3)[Fuc-α(1→4)]GlcNAc-β(1→3)-Gal-β(1→4)Glc;
DFLNH(b) –дифукозиллакто-N-гексаоза (b)
β-Gal-(1→4)[α-Fuc-(1→3)]β-GlcNAc-(1→6)[Glc(4→1)]β-Gal-(3→1)[α-Fuc-(1→4)]β-GlcNAc-(3→1)-β-Gal;
TFLNH –трифукозиллакто-N-гексаоза
β-Gal-(1→4)[α-Fuc-(1→3)]β-GlcNAc-(1→6)[Glc(4→1)]β-Gal-(3→1)[α-Fuc-(1→4)]β-GlcNAc-(3→1)[α-Fuc-(1→4)]β-Gal;
LNT –лакто-N-тетраоза
β-Gal-(1→3)-β-GlcNAc-(1→3)-β-Gal-(1→4)-Glc.
Єдиний відновлений олігосахарин FGGn-ol, виділений із крові свиней, використовувався нами для вивчення розбіжності у біологічній активності відновлених та невідновлених олігосахаринів. LNT, яка не містить фукозильного залишку, досліджувалася для з'ясування залежності біологічної активності від наявності фукози. Схему дослідження зображено на рисунку 1. Як об'єкти дослідження використовували проростки, експланти мікропагонів, гіпокотилів та сім'ядолей томата (Lycopersicon esculentum Mill., с. Новичок), проростки озимої пшениці (Triticum aestivum L., с. Херсонська 86), сім'ядолі та сегменти гіпокотилів (Cucumis sativus L., с. Парад), ендосперм ячменю (Hordeum sativum Lessen., с. Южний), сім'ядолі сої (Glycine max (L.) Merr., Юг 30).
Стерилізацію рослинного матеріалу проводили за загальноприйнятими у біотехнології методами (Бутенко, 1962; Калинин и др., 1980; Митрофанова и др., 1997; та інші). Для визначення біологічної активності фукозовмісних олігосахаринів, їх додавали у живильні середовища для вирощування експлантів та проростків L. esculentum в умовах in vitro. Передобробку насіння L. esculentum та T. aestivum розчинами олігосахаринів здійснювали способом замочування протягом 4 годин. Біотести на спільну дію з фітогормонами, активність -амілази і біосинтез фітоалексинів проводили за методиками Павлової (1995) та Йорка (1982). У більшості дослідів використовувалися такі концентрації олігосахаринів: 10-15, 10-13, 10-11, 10-9, 10-7, 10-5, а в деяких випадках 10-6 моль/л. Усі дослідження проводили в асептичних умовах. Живильні середовища Мурасіге і Скуга (1962), Кнопа (1865), розчини олігосахаринів стерилізували у автоклаві, далі змішували їх в умовах ламінарного боксу. Математична обробка одержаних результатів включала обчислення середньої арифметичної величини, середньоквадратичного відхилення, коефіцієнта варіації, похибки середньої арифметичної. Достовірність середніх величин і різниці між дослідними та контрольними варіантами оцінювалась за критерієм Стьюдента (Доспехов, 1979).
cc (, , )
c5
ca
c0
ca
c7 ,
d7 ,