Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
Лекция №7. Строение и механизм действия лизоцима
План лекции
Субстраты, на которые действует лизоцим. Гидролитическая и трансферазная активность лизоцима. Выяснение роли функциональных групп активного центра лизоцима. Возможные механизмы действия лизоцима.
Лизоци́м (мурамидаза) — антибактериальный агент, фермент класса гидролаз, разрушающий клеточные оболочки бактерий путём гидролиза мурамилглюкозамина клеточной стенки грам-положительных бактерий. Лизоцим содержится, в первую очередь, в местах соприкосновения организма животных с окружающей средой — в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, слёзной жидкости, слюне, слизи носоглотки и т. д. В больших количествах лизоцим содержится в слюне, чем объясняются ее антибактериальные свойства.
Открыт в 1922 Александром Флемингом.
В пищевой промышленности зарегистрирован в качестве пищевой добавки E1105.
Фермент атакует пептидогликаны (в частности, муреин), входящие в состав клеточных стенок бактерий (особенно Грам-положительных). Лизоцим гидролизует (1,4)-гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином. Пептидогликан при этом связывается с активным центром фермента (в форме кармана), расположенным между двумя его структурными доменами. Молекула субстрата в активном центре принимает конформацию, близкую к конформации переходного состояния. В соответствии с механизмом Филлипса, лизоцим связывается с гексасахаридом, затем переводит 4-й остаток в цепи в конформацию твист-кресла. В этом напряженном состоянии гликозидная связь легко разрушается.
Остатки глутаминовой кислоты (Glu35) и аспарагиновой кислоты (Asp52) критичны для функционирования фермента. Glu35 выступает в качестве донора протона при разрыве гликозидной связи субстрата, разрушая связь, а Asp52 выступает в роли нуклеофила, при образовании интермедиата — гликозил-фермента. Затем гликозил-фермент реагирует с молекулой воды, в результате чего фермент возвращается в исходное состояние и образуется продукт гидролиза.
ЛИЗОЦИМ (мурамидаза), фермент класса гидролаз, катализирующий гидролиз -1 : 4-гликозидной связи между остатками N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмураминовой к-ты (см. ф-лу) пептидогликана клеточной стенки бактерий. Гидролизует также такую же связь в полимере, состоящем из остатков N-
ацетилглюкозамина (хитине), но со значительно меньшей скоростью. Лизоцим обнаружен практически во всех организмах. У позвоночных содержится гл. обр. в слезах, слюне, селезенке, легких, почках и лейкоцитах; в тканях локализуется в лизосомах.
Выделено и изучено более 50 лизоцимов из разных источников. Все они состоят из одной полипептидной цепи и являются сильно основными белками (рI 10,5-11). Hаиб. изучен лизоцим белка куриных яиц (мол. м. 14306). Полностью определено его строение, в т.ч. третичная структура. Молекула лизоцима имеет форму, близкую к форме эллипсоида с осями 3,0 и 4,5 нм. Ее пересекает косая щель, в к-рой происходит сорбция и гидролиз субстрата (в ней м. б. связано 6 гликопиранозных звеньев). Щель имеет гидрофобный карман, в к-ром локализуется ацетамидная группа N-ацетилглюкозамина. Важную роль в механизме гидролиза гликозидной связи играют группа С(О)О остатка аспарагиновой к-ты (поляризует связь) и недиссоциированный карбоксил остатка глутаминовой к-ты (донор протона). Оптим. условия для лизиса (разрушения) микробов Microccocus lysodeikticus (обычного тест-субстрата лизоцима) - рН 6-7, ионная сила р-ра 0,1. Ионы Сlнесколько активируют лизоцим; в отсутствие солей его активность резко падает. Повышение т-ры вплоть до 60 °С увеличивает активность лизоцима; дальнейшее нагревание обратимо инактивирует фермент. В р-ре (особенно в кислой среде при рН 2-3) лизоцим выдерживает без необратимой денатурации кратковременное кипячение. В сухом виде фермент выдерживает нагревание при 160°С в течение 1 ч. Конкурентные ингибиторы лизоцима - близкие по строению к субстрату олигосахариды с небольшим числом звеньев или моносахариды, напр. N-ацетилглюкозамин и олигомер, содержащий 2 или 3 его остатка. У позвоночных лизоцим выполняет ф-ции неспецифич. антибактериального барьера. Механизм действия обусловлен способностью фермента нарушать клеточную стенку бактерий и вызывать их лизис. Лизоцим применяют в медицине как противомикробное ср-во (в т.ч. как добавка в продукты питания для детей).
===
Исп. литература для статьи «ЛИЗОЦИМ»: Бухарин О. В., Васильев Н. В., Лизоцим и его роль в биологии и медицине, Томск, 1974; Основы биохимии, пер. с англ., т. I, M., 1981, с. 313-17; Lisozyme, ed. by E. F. Osserman, R. E, Canfield, S. Beychok, N.Y., 1974; Jolles P., Jolles J., "Molec. and Cell Biochem.", 1984, v. 63, № 2, p. 165-89. Н. А. Кравченко.
Широко распространен в природе. Яичный белок до 3%, молоко, носовая слизь, слезная жидкость. В барьерных органах: печени, селезенке, легких, почках. В зонах активного клетчного деления: в щитовидной железе, в хрящах. В растениях: репе млечном соке дынного дерева.
Функция:
Поскольку лизоцим широко распространен в природе – от бактерий до высших организмов, то должен иметь фундаментальное значение, но полностью его роль пока не изучена.
Применение.
При лечении кишечных заболеваний, воспаления легких.
История открытии лизоцима.
В 90-х гг.XIX столетия было обнаружено, что яичный белок способен тормозить рост некоторых микроорганизмов.
В 1909 г. профессором Томского университета медицинского факультета Лащенковым опубликованы результаты наблюдений за бактериолитическим действием яичного белка и высказал мысль о наличии в нем особого энзима. Работа не была им продолжена и он остановился на пороге открытия сделанного Флемингом 12 лет спустя (1922 г.)
В 1922 году лондонский бактериолог Александр Флеминг, несмотря на простуду, работал в своей лаборатории и будучи любознательным, добавил немного носовой слизи к бактериальной культуре. Через некоторое время он обнаружил, что вокруг слизистых выделений бактерии растворились. Он предположил, что в слизи содержится универсальный антибиотик, поиском которого он как раз занимался. Исследуя природу этого антибактериального вещества, он установил, что это фермент, который он назвал лизоцимом (лизо – потому что он растворял (или лизировал) бактерии; цим (зим) – потому что он был ферментом). Кроме того Флеминг открыл новый вид бактерий, особенно чувствительных к лизоциму и назвал их Micrococcus lysodeikticus (“deiktikos” – способный показывать). Флеминг обнаружил лизоцим во всех секреторных выделениях организма, в том числе и в слезах. Слезы получали от добровольцев, которых подвергали «испытанию лимоном»: закапывали в глаз немного лимонного сока. Особенно богатым лизоцимом оказался белок куриных яиц. Можно было предположить, что лизоцим играет важную роль в определенном защитном механизме эмбриона от поражения бактериями. Флеминг, однако, был разочарован, когда обнаружил, что лизоцим не эффективен в отношении наиболее опасных микробов. Спустя 7 лет он все же открыл эффективный антибиотик – пенициллин, поразительным образом подтвердив замечание Пастера, что случай является к тому, кто его ищет.
Структура. В 1965 г. была расшифрована первичная структура лизоцима из яичного белка (129 аминокислот). Тольо РСА позволил выяснить пространственную структуру лизоцима. В 1965 г. это был третий белок (после гемоглобина, красного пигмента крови, и миоглобина, мышечного белка) и первый фермент, пространственная структура которого была установлена с помощью этого метода. Было получено изображение лизоцима, на котором было видно, что данный фермент не строго вытянутый нитевидный, а является скрученной молекулой. Это компактная структура эллипсоидной формы, посередине которой проходит глубокая щель. 4 – S – S – важные опоры пространственной структуры лизоцима. С помощью пространственной модели лизоцим легко показать, каким образом благодаря наличию полярных и неполярных боковых групп аминокислот стабилизируется глобулярная структура в водной среде.
Полярные боковые группы (СОО–, NH3+) несут электрический заряд. Молекула воды полярна (О несет отрицательный заряд, а Н несет положительный заряд), вода сразу вступает во взаимодействие с полярными боковыми группами аминокислот. Неполярные боковые группы (СН3) напротив не несут электрического заряда и не взаимодействуют с Н2О. Полярные группы гидрофильны поэтому они обращены наружу в воду. Неполярные гидрофобные, поэтому они стремятся обособиться от водной среды. Благодаря этому молекула сохраняет свою глобулярную структуру. Имеется α-спирали и β-структура складчатого слоя.
Субстраты. 1) Лизоцим расщепляет полисахаридный (природный субстрат) компонент клеточных стенок. Бактерия, лишенная клеточной стенки, обычно лопается из-за высокого осмотического давления.
Полисахарид клеточной стенки – мукополисахарид – содержит 2 типа сахаров: N-ацетилглюкозамин (N-АГ) и N-ацетилмурановую кислоту (N-АМК). Оба сахара являются производными глюкозаминами с ацетилированной аминогруппой. В N-АМК углерод С-3 углеводного кольца образует эфирную связь с боковой цепью лактата. Все гликозидные связи в полисахаридах клеточных стенок имеют β-конфигурацию.
N-АГ и N-АМК расположены поочередно, соединены гликозидными связями β (1→4). Далее, отдельные цепи полисахаридов соединяются поперечными сшивками из коротких пептидов, прикрепляющихся к остаткам N-АМК.
Лизоцим гидролизует гликозидную связь между С-1 N-АМК и С4-N-АГ. Другая связь между С1-N-АГ и С4-N-АМК при этом не расщепляется.
2) Субстратом лизоцима служит также хитин (но слабо гидролизуется) – полисахарид панциря ракообразных. Хитин состоит только из остатков N-АГ, соединенных между собой гликозидными связями β (1→4).
3) бактериальный полисахарид является весьма сложным нерастворимым соединением, в связи с чем в качестве субстратов лизоцима часто используется хорошо гидролизируемые олигосахариды, образованные остатками N-АГ.
Активный центр. У лизоцима – сильноосновные белки в активном центре кислые группы. Этерификация их полностью нарушала активность, хотя связывание субстрата сохранялось.
Поиски каталитической группы. Оказались вблизи расепляемой связи – аспартат и глютамат. Они лежат по разные стороны от расщепляемой гликозильной связи (на разных сторонах щели). Окружение у них различно: Асп. – 52 – в полярном окружении – при рН 5, оптимально для гидролиза лизоцимом, Глу – 35 – в неполярной области – в неионной форме.
Оказалось что три-N-АГ присоединяется к лизоциму в щели, занимая половину щели. Связывание за счет воородных связей и вандерваальсовых взаимодействий. Электростатическое взаимодействие отсутствует, так как в три N-АГ нет ионных групп. После присоединяется три N-АГ, остается место в щели еще для трех остатков. Действительно гексамер N-АГ быстро гидролизуется лизоцимом.
(от греч. lýsis — растворение, распад и zýme — закваска), мурамидаза, фермент класса гидролаз; разрушает стенку бактериальной клетки, в результате чего происходит её растворение (лизис). В организме играет роль неспецифического антибактериального барьера, особенно в местах контакта с внешней средой (слёзы, слюна, слизистая оболочка носа). Лизоцим открыт в 1922 А. Флемингом в слизи из полости носа и затем обнаружен во многих тканях и жидкостях человеческого организма (хрящи, селезёнка, лейкоциты, слёзы), в растениях (капуста, репа, редька, хрен), в некоторых бактериях и фагах и, в наибольшем количестве, в яичном белке. Лизоцим из разных источников различаются по строению, но близки по действию. Лизоцим яичного белка — первый фермент, для которого методом рентгеноструктурного анализа установлена трёхмерная структура и выявлена связь между строением и механизмом действия (1965); эти исследования — существенный вклад в представления о механизмах ферментативного катализа в целом.
Лизоцим — белок с молекулярной массой около 14 000; единственная полипептидная цепь состоит из 129 аминокислотных остатков и свёрнута в компактную глобулу (30´30´45 ). Трёхмерная конформация полипептидной цепи (см. Белки, Биополимеры) поддерживается 4 дисульфидными ( — S — S — ) связями. (В Лизоцим молока человека их 3, яичного белка гуся — 2, в Лизоцим фага Т4 их нет; чем больше дисульфидных групп, тем Лизоцим более устойчив, но менее активен.) Глобула Лизоцим состоит из двух частей, разделённых щелью; в одной части большинство аминокислот (лейцин, изолейцин, триптофан и др.) содержит гидрофобные группы, в др. преобладают аминокислоты (лизин, аргинин, аспарагиновая к-та и др.) с полярными группами. Полярность окружения влияет на ионизацию двух карбоксильных групп ( — СООН), расположенных на поверхности щели молекулы с разных её сторон (см. рис.). Лизоцим действует на один из основных компонентов бактериальной стенки — сложный полисахарид, состоящий из двух типов аминосахаров. Полисахарид сорбируется на молекуле Лизоцим в щели на границе гидрофобной и гидрофильной её частей таким образом, что с ферментом связывается 6 колец аминосахаров, а одна из соединяющих их гликозидных связей (между 4 и 5 кольцами) оказывается между карбоксилами. Благодаря взаимодействиям между карбоксилами Лизоцим и атомами, образующими гликозидную связь, а также искажению валентных углов субстрата, происходит активация и разрыв связи. Это ведёт к разрушению оболочки бактериальной клетки.
Препарат Лизоцим применяют при лечении глаз, носоглотки, дёсен, ожогах, в акушерстве и др.
Лит.: Филлипс Д., Трехмерная структура молекулы фермента, в сборнике: Молекулы и клетки, пер. с англ., в. 3, М., 1968; Химия белка, М., 1969; Бернхард С., Структура и функция ферментов, пер. с англ., М., 1971.
Н. А. Кравченко.
Механизм гидролиза полисахарида лизоцимом. Показаны 3 из 6 колец, помещающихся в щели фермента. Гликозидная связь между кольцами 4 и 5 активируется взаимодействием между остатками аспарагиновой (А) и глутаминовой (Г) кислот главной цепи лнзоцима и атомами углерода кольца 4 и кислорода, связывающего кольца 4 и 5. После разрыва связи две части молекулы субстрата освобождаются, и фермент получает возможность расщеплять следующий участок полисахаридной цепи.
Трансферразная функция лизоцима
«Парадоксальное ингибирование лизиса избытком фермента» - образование полисахарида и выпадает в осадок – оболочка не растворилась, накопился полисахарид и выпал в осадок.
5