Если у вас возникли сложности с курсовой, контрольной, дипломной, рефератом, отчетом по практике, научно-исследовательской и любой другой работой - мы готовы помочь.
Предоплата всего
Подписываем
12
Національна академія наук україни
інститут фізіології ім. о.о. богомольця
Шиш анжела михайлівна
удк 616.127+577.115.3:6616-005.4+616-009
Дослідження механізмів кардіопротекторного впливу омега-3 поліненасичених жирних кислот рослинного походження при пошкодженні міокарда різного генезу
.03.04 - патологічна фізіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2006
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі експериментальної кардіології
Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, академік НАН України,
Мойбенко Олексій Олексійович,
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
завідувач відділу експериментальної кардіології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
Янчій Роман Іванович,
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
провідний науковий співробітник відділу імунології і
цитотоксичних сироваток
доктор медичних наук,
Ткаченко Михайло Миколайович
завідувач кафедри радіології з курсом
радіаційної медицини
Національного медичного університету
імені О.О. Богомольця
Провідна установа: Національний науковий центр “Інститут кардіології
ім. М.Д. Стражеска” АМН України
Захист відбудеться “_16_”січня_ 2007 р. о _14.00_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богогмольця, 4.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.
Автореферат розісланий “_15_”грудня_ 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01
доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Серцево-судинні захворювання займають перше місце в структурі смертності в Україні. За даними ВООЗ захворювання серцево-судинної системи, зокрема ішемічна хвороба серця, гострий інфаркт міокарда, захворювання периферичних та вінцевих артерій, займають провідне місце серед причин смертності у більшості розвинутих країн. В Україні серцево-судинна патологія складає 62,8 % серед усіх причин смерті. Це один із самих високих показників в світі і, безумовно, необхідно прагнути до його зниження [Коваленко В.М., 2004]. З розвитком нового напрямку в медицині по вивченню ролі -3 поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) відкриваються нові можливості в корекції функціонального стану серцево-судинної системи шляхом впливу на природні механізми його регуляції.
Численні дослідження, проведені у різних країнах світу, достатньо переконливо показали, що у народів, які споживають велику кількість морських продуктів, збагачених на -3 ПНЖК, дуже низький рівень серцево-судинних захворювань (Dyerberg J. et al., 1975; Kromhout D. еt al., 1985; Wijendran V. еt al., 2004; Breslow J.L. еt al., 2006). Наявність конкурентних взаємовідношень між -3 ПНЖК та -6 ПНЖК, зокрема арахідоновою кислотою (АК), дозволяє впливати на вміст ейкозаноїдів –похідних АК та таким чином на процес агрегації тромбоцитів, тонус судин, запалення (Yin K. еt al., 1991; Abeywardena M.Y. et al., 2001; Holub B.J. et al, 2002). Модифікація жирнокислотного складу фосфоліпідів клітинних мембран з метою гальмування виділення АК за несприятливих умов може мати позитивні наслідки, дозволяючи попереджувати утворення патогенних речовин. Також встановлено, що ω-3 ПНЖК наряду з гіполіпідемічним ефектом мають гіпокоагуляційну, гіпотензивну, антиагрегантну, протизапальну та імуномоделюючу дію (Фещенко Ю.І. та ін., 1999; Амосова К.М. та ін., 2000; Simopoulos A.P. et al., 2002; Rupp H. et al., 2004). Не дивлячись на широке застосування ω-3 ПНЖК, механізми їх дії ще до кінця не вивчені.
Недостатньо вивчені або суперечливі дані про участь у механізмах кардіопротекторної дії -3 ПНЖК вільних радикалів кисню, системи оксиду азоту, зокрема різних NO-синтаз (сNOS та іNOS), зміни реактивності серця та судин до біологічно активних речовин –регуляторів діяльності серцево-судиної системи. Невідомий вплив ω-3 ПНЖК на серце та систему оксиду азоту за умов гострого стресорного пошкодження. Тому вивчення механізмів, за рахунок яких реалізується захисний ефект -3 ПНЖК, має важливе значення.
Якщо на теперішній час відносно протекторної дії ω-3 ΟНЖК, які входять до складу риб'ячого жиру, накопичено досить великий експериментальний та клінічний матеріал, то -3 ПНЖК рослинного походження в цьому відношенні мало досліджені, тому доцільно було дослідити кардіопротекторну ефективність нової субстанції ω-3 ΟНЖК (63%) з доступної рослинної сировини (насіння льону), яку синтезовано в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України. Тому детальне порівняльне дослідження кардіопротекторної дії -3 ПНЖК, як нової вітчизняної субстанції -3 ПНЖК рослинного походження, так і існуючого препарату епадолу, який синтезовано з жирів глибоководних риб (Фещенко Ю.І. та ін., 1999), за різних патологічних умов серцево-судинної системи нам здається актуальним.
Метою дослідження було дослідження механізмів кардіопротекторної дії -3 ПНЖК рослинного та тваринного походження при патології міокарда різного генезу (ішемія-реперфузія, гострий іммобілізаційний стрес). Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:
Об`єкт дослідження: ізольовані серця щурів, ізольовані препарати аорти щурів.
Предмет дослідження: механізми кардіопротекції при модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою субстанцій -3 ПНЖК рослинного та тваринного походження, кардіодинаміка, скоротливі реакції судинних гладеньких м`язів, метаболічні зміни при ішемії-реперфузії та стресорних ураженнях міокарда.
Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках плану наукових досліджень відділу експериментальної кардіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця за темою "Дослідження механізмів розвитку та попередження порушень діяльності серцево-судинної системи при ішемічно-реперфузійному синдромі, розробка методів їх корекції" (№ державної реєстрації 0102U000827) та в рамках наукового проекту "Дослідження механізмів кардіопротекторної дії омега-3 поліненасичених жирних кислот" комплексної програми НАН України “Новітні медико-біологічні проблеми та оточуюче середовище людини” (№ державної реєстрації 0104U008944).
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні отримано спільно з Інститутом біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України та досліджено нову субстанцію до складу якої входять -3 ПНЖК рослинного походження. Вміст -3 ПНЖК у субстанції рослинного походження складає до 63% - α-λіноленової кислоти.
У роботі встановлено, що застосування нової рослинної субстанції -3 ПНЖК обумовлює підвищення рівню -3 ПНЖК в мембранах тканини та зменшення вмісту ω-6 ΟНЖК, зокрема, рівню АК та її активних метаболітів: ТхВ (індуктора агрегації тромбоцитів), та ЛТС, які поряд з судиннозвужуючим ефектом, мають прозапальну дію. Показано, що застосування нової субстанції -3 ПНЖК рослинного походження за своїм впливом на жирнокислотний склад клітинних мембран не поступається тваринному препарату “епадол”, що містить -3 ПНЖК тваринного походження і вже застосовується в клініці як лікувальний та профілактичний засіб.
З`ясовано, що модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран суттєво впливає на реактивність ізольованого серця до дії адренергічних подразників як за фізіологічних, так і патологічних умов.
Вперше показано, що модифікація жирнокислотного складу клітинних мембран міокарда в значній мірі попереджує ураження серця при гострому іммобілізаційному стресі.
З`ясовано, що захисними механізмами дії ω-3 ПНЖК можуть бути: гальмування прооксидантних процесів, підвищення активності сNOS та збільшення продукції оксиду азоту (NO), зменшення можливості адренергічних уражень серця.
Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Отримані результати надають нову достовірну інформацію про вплив зміни жирнокислотного складу клітинних мембран за допомогою субстанції рослинного походження вітчизняного виробництва на перебіг патологічних процесів у серцево-судинній системі. Вивчення кардіопротекторної дії -3 ПНЖК у є перспективним напрямком наукових досліджень у медицині. У роботі показана можливість попереджувати негативний вплив ішемії-реперфузії та гострого іммобілізаційного стресу, обмежувати активність перекисних процесів, зменшувати реакції серця та судин при дії адренергічних подразників, впливати на продукцію NO за рахунок модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран в бік збільшення в них -3 ПНЖК. Це є основою для розробки перспективних шляхів, направлених на зменшення ризику розвитку ішемічної хвороби серця та дає змогу рекомендувати застосування як тваринної, так і нової рослинної субстанції -3 ПНЖК для профілактики та лікування ішемічних та стресорних станів.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено науковий пошук та обґрунтування напрямку досліджень, проведено аналіз наукової літератури, проведена систематизація даних наукової літератури. Самостійно проведені експериментальні дослідження, статистична обробка одержаних результатів, аналіз результатів, сформульовані основні висновки роботи, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень.
Апробація результатів дисертації. Основні положення й окремі фрагменти дисертації доповідалися та обговорювалися на конгресах та конференціях: 5th International Congress on Coronary Artery Disease - From Prevention to Intervention - ICCAD. (Florence, Italy, 2003); 24th ISHR-European Section Meeting (Dresden, Germany, 2004); III Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, Россия, 2004); Workshop in cardiovascular physiology (Warsaw, Poland, 2004); ІІ Міжнародній науковій конференції “Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка” (Одеса, 2005); Всероссийской конференции молодых исследователей “Физиология и медицина” (Санкт-Петербург, Россия, 2005); 9-ой международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, Россия, 2005); European Physiological Meeting (Munich, 2006).
Публікації. Матеріали дисертації викладено в 7 статтях у наукових фахових виданнях та 8 тезах доповідей на наукових конференціях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 158 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 25 рисунками та 5 таблицями. Робота складається зі вступу, огляду літератури, розділу опису матеріалів і методів дослідження, розділу результатів дослідження та їх обговорення, розділу аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаної літератури, що нараховує 275 найменувань.
Матеріали та методи досліджень.
Напівхронічні експерименти були проведені на білих щурах-самцях лінії Вістар вагою 280-300 г з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (міжнародна конвенція, Страсбург, 1986) в два етапи. На першому етапі проводили модифікацію клітинних мембран шляхом додавання до стандартного раціону віварію субстанцій ω-3 ПНЖК в хронічних дослідах. На другому етапі в гострому експерименті на ізольованому перфузованому серці та тваринах з іммобілізаційним стресом досліджували кардіопротекторні ефекти ω-3 ПНЖК.
Модифікація клітинних мембран: тварини отримували препарат “епадол”, що містить 45% ω-3 ПНЖК тваринного походження, виробництва Київського вітамінного заводу, або субстанцію ω-3 ПНЖК рослинного походження, яка містить -ЛК (63%). Ця субстанція була розроблена спільно з співробітниками лабораторії хімічної ензимології Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (при допомозі к.м.н. Харченко О.В.). Тварини отримували -3 ПНЖК у дозі 0,1 мг/100 г маси тіла протягом 4 тижнів, як додаток до стандартного раціону віварію Інституту фізіології ім. О.О.Богогмольця.
Зміни жирнокислотного складу фосфоліпідів мембран визначали в ліпідному екстракті гомогенатів тканини міокарда та печінки, оцінюючи вміст ω-6 ПНЖК (АК та ЛК) та ω-3 ПНЖК (ЕПК, ДГК та α-ЛК), за методом високоефективної рідинної зворотньої хроматографії з використанням рефрактометричного детектора (Кейтс М. 1975). Вміст омега-3 та омега-6 ПНЖК виражали у відсотковому співвідношенні до загального вмісту жирних кислот. Матеріал для дослідження забирали в контролі, після 4 тижнів застосування ω-3 ПНЖК, після відтворення ішемії-реперфузії ізольованого серця щура, після 4 тижнів застосування ω-3 ПНЖК та відтворення ішемії-реперфузії ізольованого серця щура.
Дослідження функцій ізольованого серця за методом Лангендорфа. Тварин анестезували уретаном (1,9 г/кг маси тіла) та вводили гепарин (250 од/кг) за 10 хв до вилучення серця. Серце перфузували ретроградно за класичним методом Лангендорфа модифікованим розчином Кребса-Хензеляйта (Doring H.J., 1990). Розчин насичували газовою сумішшю 95% О і 5% CO, підтримували температуру в системі на рівні 37°С та подавали в аорту перистальтичним насосом. Швидкість перфузуючого потоку встановлювали так, щоб перфузійний тиск в коронарних судинах досягав у середньому 70-75 мм рт.ст. Реєстрували такі показники: перфузійний тиск у коронарних судинах (КПТ); тиск у лівому шлуночку (ТЛШ), першу похідну цього тиску –dР/dt, про який судили за змінами тиску у латексному балончику, який вводили у лівий шлуночок; частоту серцевих скорочень (ЧСС). Додатково обраховували кількість екстрасистол на ділянках, де протягом 1 хв їх кількість була максимальною, а також час до зупинки серця під час ішемії та час до відновлення повноцінних серцевих скорочень після початку реперфузії.
В експериментах моделювали ішемію шляхом зупинки перфузії серця протягом 20 хв та наступну реперфузію протягом 40 хв. Гострий іммобілізаційний стрес моделювали шляхом фіксації тварин на спині у стані нерухомості протягом 6 годин.
Для електронномікроскопічних досліджень використовували рутинний метод заливки тканини в епоксидні смоли в модифікації Шарова В.Г. (1985) .
Дослідження вазомоторних реакцій ізольованих препаратів судин. Ізольовані кільцеві препарати аорти щурів (діаметр 2 мм, ширина 1,5 мм) перфузували при 37С розчином Кребса. Усі тестування судинних препаратів здійснювали в ізометричному режимі (при початково заданій напруженості). Перед вимірюванням судинні препарати витримували протягом 60 хв у нормальному розчині Кребса. НА подавали у розчин протягом 3 хв, його концентрація у розчині становила 1 нмоль –мкмоль. Напруженість судинної смужки розраховували у Ньютонах на 1 м.. Цілісність судинного ендотеліального шару клітин визначали за наявністю ендотелій-залежних реакцій на ацетилхолін (1 мкмоль/л).
Зміни реактивності ізольованого серця щура вивчали за величиною адренергічної реакції при додаванні норадреналіну (НА) у перфузуючий розчин Кребса-Хензелейта. Концентрація останнього у перфузуючому розчині була від 1 нмоль до 1 мкмоль.
Біохімічні методи: Активність NOS-синтаз у гомогенатах тканин міокарда визначали спектрофотометрично за зміною вмісту нітрит-аніона (Yan L., 1994). Вміст нітританіону (NO— ) визначали в безбілкових розчинах гомогенатів тканини серця в колориметричній реакції за допомогою реактиву Гріса методом Гріна в модифікації, захищеною патентом України (Коцюруба А.В. та ін., 2000). Визначали вміст малонового диальдегіду (МДА) (Стальная И.Д. и др., 1977), вміст дієнових кон`югатів (спектрофотометричним методом за УФ-поглинанням гептанових екстрактів проб). Активність супероксиддисмутази (СОД) вивчали за методом Чевари С. и др. (1985). Активність каталази вивчали за методом Королюк М.А. зі співав. (1988). Для визначення сумарної оцінки інтенсивності вільнорадикального окиснення при модифікації жирнокислотного складу клітинних мембран використовували метод НО–індукованої хемілюмінесценції (Владимиров Ю.Л. и др., 1989). Вміст ТхВ та LTC у тканині міокарда визначали радіоімунним методом згідно методичних рекомендацій, що додаються до стандартного набору реактивів ([H] ТхВ RIA kit, “Amersham” та [H] LTC RIA kit, “Du Pont”). Статистичну обробку даних у всіх дослідженнях проводили з використанням t-критерію Стьюдента для оцінки достовірності відмінностей. Статистично вірогідними вважалися значення Р<0,05.
результати досліджень та їх обговорення
Зміни жирнокислотного складу фосфоліпідів клітинних мембран під впливом -3 ПНЖК рослинного та тваринного походження. Вплив нової субстанції ω-3 ПНЖК рослинного, а також тваринного походження на жирнокислотний склад клітинних мембран серця щурів досліджували у контролі та за умов ішемії-реперфузії ізольованого серця щурів. Встановлено, що ω-3 ПНЖК тваринного (І група) та рослинного (ІІ група) походження суттєво впливають на жирнокислотний склад мембран тканини серця, заміщуючи в них ПНЖК з сімейства ω-6 на ПНЖК з сімейства ω-3. Зокрема, у гомогенатах тканини міокарда вміст АК у обох групах знижувався, але субстанція рослинного походження була навіть більш ефективною (табл. 1). Ішемія та наступна реперфузія призводили до збільшення вмісту АК у контрольних серцях, тоді як у І та ІІ групах її рівень достовірно зменшувався. Застосування субстанції рослинного походження і в цьому відношенні було більш ефективним (див. табл. 1). Вміст -ЛК у ІІ групі збільшувався (в 1,5 рази, Р<0,05) більш значно як у контролі, так і при ішемії-реперфузії. Вміст ЕПК в обох групах був більшим як за умов контролю, так і при ішемії-реперфузії (див. табл. 1).
Таким чином, застосування -3 ПНЖК як рослинного, так і тваринного походження достовірно підвищує рівень -3 ПНЖК в клітинах тканини міокарда та знижує рівень ω-6 ПНЖК, зокрема АК, але субстанція рослинного походження знижує рівень АК значно більше, особливо при ішемії-реперфузії.
Таблиця 1.
Вміст омега-3 та омега-6 ПНЖК в гомогенаті тканини міокарда щурів у контролі та за умов ішемії-реперфузії (%) М±m, (n=10)
|
ПНЖК |
Контроль |
I - група |
II - група |
Ішемія-реперфузія |
І - група+ ішемія-реперфузія |
ІІ - група+ ішемія-реперфузія |
|
Лінолева кислота C18:2 |
,27±1,0 |
,0±0,14* |
,15±2,38* |
,65±1,62 |
16,17±0,5** |
,67±1,7** |
|
Арахідоно-ва кислота С20:4 |
,42±0,93 |
,69±0,90* |
,68±0,71* |
,08±0,60* |
,29±0,3** |
,14±1,3** |
|
-ліноленова кислота C18:3 |
,76±0,19 |
,77±0,11 |
,18±0,1* |
,69±0,12 |
,95±0,02** |
1,14 ± 0,05** |
|
Ейкозапен-таєнова кислота С20:5 |
,23±0,06 |
,59±0,17* |
,8±0,06* |
,33±0,20 |
,87±0,06** |
,8±0,06** |
|
Докозагек-саєнова кислота С22:6 |
,65±0,94 |
,97±0,60* |
,05±0,44 |
,51±0,11 |
,49±0,20 |
13,23±0,13** |
I група - ω-3 ΟНЖК тваринного походження; ІІ група –ω-3 ПНЖК рослинного походження; * - порівнянно з контролем; ** - порівнянно з групою „ішемія-реперфузія”; P< 0,05. Загальний вміст кислот прийнято за 100%
Функціональні та ультраструктурні зміни серця за умов ішемії-реперфузії та вплив модифікації жирнокислотного складу мембран клітин на перебіг цих процесів. Результати експериментів показують, що 20-хв ішемія та наступна 40-хв реперфузія призводить до підвищення перфузійного тиску у коронарних судинах на 32,3%, Р<0,05 (на 40-й хв реперфузії). Починаючи з 1-2 хв після початку реперфузії ішемізованого серця тиск у лівому шлуночку (ТЛШ) максимально знижується (у 2,2 рази) та по відношенню до вихідного рівня (рис. 1 А). Також неухильно знижується швидкість скорочення та розслаблення серцевого м`яза. Разом з цим, ішемія та наступна реперфузія призводять до суттєвого підвищення кінцево-діастолічного тиску (КДТ) у лівому шлуночку, що може свідчити про порушення процесу розслаблення та наявність контрактурних процесів у міокарді. Відразу після закінчення ішемії та відновленні перфузії серця спостерігались суттєві порушення
-1000
+1000
50
100 ec
b3
d2
ca
проведено при консультативній допомозі н.с. Л.В. Тумановської.